ANTECEDENTES

Los bacteriófagos poseen enzimas que les permiten lisar a su hospedero bacteriano una

vez que ha culminado su ciclo de replicación y se han formado los viriones dentro de la

célula. Proteínas denominadas holinas forman poros en la membrana plasmática de la

bacteria, por lo cuales se liberan enzimas líticas con actividad de lisozima, que degradan

la pared de peptidoglicano. Los bacteriófagos ФITL-1 y ФRSP infectan al fitopatógeno

Ralstonia solanacearum. En su genoma se han identificado genes que poseen dominios

de lisozima, los cuales se buscará clonar, para su eventual expresión y evaluación de su

actividad lítica. Se han diseñado los oligonucleótidos LzR-f/LzR-r y LzI-f/LzI-r, que

amplifican estos genes. Los oligonucleótidos se encuentran flanqueando a los genes

correspondientes, como se muestra en las figuras 1 y 2.

Adicionalmente, se utilizará el par de oligonucleótidos fi-F/fi-R como control de

amplificación, el cual no posee sitios de restricción y genera un amplicón de 613 pb. La

Tm teórica de estos oligonucleótidos es de 59-60 °C, se correrán reacciones a 60 °C, la

cual previamente se ha identificado como la mejor Tm.

Los oligonucleótidos que se utilizan para clonar fragmentos de PCR, generalmente

tienen sitios de restricción palindrómicos, algunos de ellos ricos en GC, lo que favorece

interacciones homodiméricas de importancia práctica y reducen la eficiencia de la

reacción. Existen reactivos como el dimetilsulfóxido (DMSO), que pueden favorecer la

unión de los oligonucleótidos a su sitio blanco. Este reactivo se utilizará en la reacción

de PCR.
Metodologia

PREPARACIÓN DE LOS TUBOS DE PCR.

Se correrán 4 reacciones (tres con oligonucleótidos y un control negativo) con DMSO al 2%.

Cada equipo etiquetará sus tubos EN LA PARED LATERAL, NO EN LA TAPA, con:

- un número inicial que indicará el equipo

- una letra que indicará los oligonucleótidos (A: fi, B: LzR, C: LzI, D: control neg.)

De esta manera, por grupo se tendrán 24 tubos, cuatro por equipo, de acuerdo a lo

señalado en la tabla 1.

Tabla 1. Identificador de cada tubo utilizado en la reacción de PCR.

ID del tubo Oligonucleótidos Equipo

3A fi
3B LzR
3
3C LzI
3D Control neg

PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOR.

El programa de PCR a utilizar se indica en la tabla 2. Este programa se cargar en el

termociclador, PERO NO SE INICIA, solo se deja listo para iniciar la reacción.

Tabla 2. Programa para la reacción de PCR punto final a utilizar en este protocolo.
Ciclos Segmento Temperatura Tiempo de incubación
Pre incubación 1 95°C 1 min
Desnaturalización 95°C 10 s
Amplificación 35 Alineamiento 60°C 15 s
Extensión 72°C 30s
Extensión final 1 72°C 5 min

ADICIÓN DE LOS OLIGONUCLEÓTIDOS A LOS TUBOS DE PCR.

  Se tendrán tres mezclas de oligonucleótidos, una para cada par a utilizar, con las

etiquetas “LzI 10 uM", “LzR 10 uM" y “fi 10 uM". Todas contienen cada

oligonucleótido a una concentración de 10 uM, de cada una de ellas se tomará 1 uL

y se añadirá a los tubos correspondientes, de acuerdo a lo indicado en la siguiente

tabla:

Letra en la etiqueta del tubo Oligonucleótidos

A fi
B LzR
C LzI
D --- (ninguno, 1 uL de agua grado BM)

Al colocar cada uno de los oligonucleótidos, los demás tubos deben estar cerrados, para
evitar contaminación cruzada.

ADICIÓN DE DNA MOLDE A LOS TUBOS DE PCR.

 Se utilizará como DNA molde, DNA genómico de los fagos RSP e ITL-1. De la

solución de DNA genómico, se adicionará a cada tubo de PCR 1 uL del DNA molde:

Letra en la etiqueta del tubo DNA genómico

A 1 uL
B 1 uL
C 1 uL
D 1 uL

PREPARACIÓN DE LA MEZCLA DE REACCIÓN

Volumen para
Concentración Concentración de Volumen para 4.5
Reactivo una reacción de
del stock trabajo reacciones
10 uL
MgCl2 25 mM 1.5 mM 0.6 µL 2.7 µL
DMSO 100% 2% 0.2 µL 0.9 µL
dNTP’s 25 mM 0.200 mM 0.08 µL 0.4 µL
Agua PCR -- -- 5.62 µL 25.3 µL
 Buffer Taq 10X 1X 1.0 µL 4.5 µL
Taq pol 1 U/µL 0.05 U/uL 0.5 µL 2.3 µL
Vol. Final --- --- 8.0 µL 36.1 µL

Preparacion de la mezcla de reacción:

1. Se inicia el programa en el termociclador, y se pausa una vez que esté por iniciar la

primera etapa.

2. Se colocan 8 uL de la mezcla de reacción en los tubos de PCR.

3. Se colocan los tubos en la parte central de la placa del termociclador

4. Se quita la pausa al termociclador y se corre la reacción.

Electroforesis de ácidos nucleicos.

Preparación del gel.

1. Se prepararán tres geles, cada uno con doble peine. Cada peine será de ocho pozos.

2. Utilizando agua y el molde del gel con cinta masking para que contenga el agua,

determine el volumen que se necesita para preparar un gel de aproximadamente 0.5 cm

de grosor.

3. Con base en el volumen determinado, pese la cantidad de agarosa necesaria para

preparar un gel al 2%.

4. Se coloco la agarosa en el matraz Erlenmeyer y adicione TAE 0.5x, utilice el volumen

necesario que determinó previamente. Adicione 10 mL extra de agua destilada, esto para

reponer el agua que se evapore durante el calentamiento necesario para fundir la

agarosa.

5. Se coloco el matraz en el horno de microondas y caliente por 2 minutos.

6. Con cuidado y con la ayuda de guantes protectores, saque el matraz del horno.
7. Verifique que no quedan restos de agarosa sin fundir (vea a contraluz el contenido del

matraz, no debe observar partículas que dejen un rastro en la solución).

8. Si es necesario, vuelva a calentar el matraz hasta fundir totalmente la agarosa.

9. Enfríe el contenido sumergiendo las paredes del matraz en agua de grifo, con agitación

constante y cuidando que no entre agua al matraz, hasta que el dorso de la mano

soporte la temperatura del líquido.

10. Coloque los peines y vierta la agarosa en el molde del gel.

11. Deje solidificar por al menos 20 minutos.