Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA
AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
AREQUIPA-PERÚ-2019
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
AGUSTÍN DE AREQUIPA
AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal
AREQUIPA-PERÚ-2019
3
PROLOGO
Los Autores
4
ÍNDICE
PROLOGO
ÍNDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES… ................................................................................................... 6
PRÁCTICA 1 : BIOSEGURIDAD y MICROSCOPIA .................................................................... 7
PRÁCTICA 2 : RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS
IN VIVO, COLORACION VITAL ...................................................................... 12
PRÁCTICA 3 : PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES:
SIMPLE Y DIFERENCIAL, TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS .................................................................................................................... 17
PRÁCTICA 4 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO
Y ESTERILIZACIÓN ............................................................................................ 31
PRÁCTICA 5 : MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................ 36
PRÁCTICA 6 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS ............................................................... 48
PRÁCTICA 7 : CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE
COLONIAS……........................................................................................................ 57
PRÁCTICA 8 : CURVA DE CRECIMIENTO ............................................................................... 62
PRÁCTICA 9 : CONTEO DIRECTO DE CÉLULAS MICROBIANAS .................................. 67
PRÁCTICA 10 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN EN
PLACA.......................................................................................................................... 70
PRÁCTICA 11 : OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA Lessonia 70
PRÁCTICA 12 : AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE
INTERÉS INDUSTRIAL......................................................................................... 70
PRÁCTICA 13 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL rhizobium..................................................... 81
PRÁCTICA 14 : OBTENCION DE ALCOHOL POR Sacharomyces cerevisae ................................ 83
PRÁCTICA 15 : DESARROLLO DE TRABAJOS DE INVESTIGACION FORMATIVA .. 86
5
Recomendaciones Generales
6
INFORME DE PRACTICAS.
REPORTE DE RESULTADOS.
Se deberá tener en cuenta la estructura del reporte: I. Introducción II. Objetivos, III. Material
y Método, IV. Resultados V. Discusión, VI. Referencias.
I.- Introducción.
En este punto el profesor tomará una prueba de entrada, cuya calificación quedará
registrada en la guía para la obtención del promedio final de prácticas.
La prueba versará sobre los siguientes temas:
- Resumen del marco teórico del tema.
- Objetivos de la práctica.
- Métodos a emplear y su relación con los objetivos planteados.
II. Resultados. Como producto de la observación posiblemente tendrá esquemas o dibujos
con notas, comentarios y anotaciones. Dichas anotaciones deberán hacer referencias a
estructuras características, modo de observación (con o sin microscopio, lentes objetivo
usados, origen del organismo u hábitat del que fue tomado). Organice sus esquemas y
notas de clase de acuerdo a lo que se le pide observar para alcanzar los objetivos
planteados en cada una de las prácticas. Una vez hecho eso, lo obtenido constituye “Los
Resultados” de su práctica o investigación. Preséntelos de manera clara y ordenada.
III. Discusión
¿Alcanzó los objetivos planteados? ¿Siente que ahora sabe algo que no sabía?, trate de
explicar qué es ese “algo”. ¿Siente que ahora tiene dudas que no existían? Diga a que se
debe y como cree que podría superarlas. Explíquese. No olvide nunca describir QUÉ USÓ
y OBSERVÓ durante la Práctica.
IV. Recomendaciones.
7
Indique, si el material usado fue el idóneo, si la observación fue la correcta, y que propone
para mejorar la practica u obtener mayores o mejores conclusiones.
V. Referencias. Si necesitó libros, artículos y páginas web para la práctica, debe hacer
referencia a ellos en el texto del reporte de resultados, aquí es donde debe escribir las “citas
bibliográficas”.
• Cuando la obra a la que se hace referencia corresponde a un solo autor se cita entre
paréntesis el primer apellido del autor y el año de la obra (Fujii, 1990), algunos autores
suelen utilizar ambos apellidos, en estos casos se separa con un guion medio (León-
Álvarez, 1996). Separar con una coma el apellido del año es opcional, lo importante es ser
consistente cada vez que se cita a lo largo del texto.
• Cuando la obra a la que se hace referencia corresponde a dos autores se cita a ambos
de la misma forma en que se describió arriba (Fujii & Sentíes, 2005; Fujii & Cordeiro-Marino
1996).
• Cuando la obra a la que se hace referencia corresponde a más de dos autores se cita al
primer autor acompañado por el prefijo latino “et al.” (resaltado en letra cursiva ya que se
trata de un idioma distinto al idioma en que se está escribiendo el reporte) y seguido por el
año de la obra (Cassano et al., 2009; Machín-Sánchez et al., 2012).
• Si a lo largo del texto se hace referencia a diferentes obras de un mismo autor y año, se
cita al autor o autores de acuerdo al número como se explicó arriba, seguido del año y junto
a este una letra minúscula en orden ascendente de acuerdo al orden de aparición en el
texto para diferenciarlas (Dawson, 1954a; Dawson, 1954b; Tanaka & Chihara, 1980a;
Tanaka & Chihara 1980b; Tanaka & Chihara, 1980c).
Al escribir la referencia completa de una obra citada en el texto, se debe escribir el apellido
del autor o los autores (a diferencia de las citas, en la referencia completa se enlista a todos
los autores de la obra, aquí NUNCA se utiliza el prefijo “et al.”), acompañado de las iniciales
de su segundo apellido, en caso de autores hispanos, y nombre(s). Al final de todos ellos
el año de la obra, seguido por el título de la obra, editorial o revista, volumen o edición, lugar
de impresión y páginas.
8
Estos datos varían de acuerdo al tipo de publicación de la que se trate. Ejemplos: En caso
de libro:
- Bold, H.C. & M.J. Wynne. 1985. Introduction to the Algae. Structure and
Reproduction. Second Edition. Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N.J. En caso de
capítulo de libro:
- Coomans, R.J. & M.H. Hommersand. 1990. Vegetative growth and organization.
Chapter 12 (Pp: 275-304). In: K.M. Cole & Robert G. Sheath (Eds.) Biology of the
Red Algae. Cambridge University Press. Cambridge. En caso de tesis:
- Dreckmann, K.M. 1997. Evaluación taxonómica del género Gracilaria Greville
(Gracilariales, Rhodophyceae) en el Pacífico tropical mexicano. Tesis de Maestría,
Facultad de Ciencias, UNAM. México, D.F.
- En caso de artículo de revista:
- Norris, J.N. & S. Fredericq. 1990. Studies on cylindrical species of western Atlantic
Gracilaria (Gracilariales, Rhodophyceae): G. cylindrical Borgesen and G. blodgettii
Hervey. Journal of Phycologia 33: 420-433. En caso de página web:
- Dallwitz, M.J., T.A. Paine & E.J. Zurcher. (2000 onwards). Principles of interactive
keys. http://biodiversity.uno.edu/delta
9
PRÁCTICA
BIOSEGURIDAD y MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común que tienen la finalidad de
proteger la salud, la integridad física, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a
diferentes riesgos biológicos físicos, psicológicos y mecánicos.
2. La piel
10
• Cortaduras o rasguños.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados
(lápices, bolígrafos, etc.).
3. Los ojos
• Salpicaduras de materiales infecciosos.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados.
4. Los pulmones
• Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).
2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no pueden ser vistas a
simple vista. El poder de resolución de un microscopio está en relación inversa a la longitud de onda
de la luz usada.
1. Parte mecánica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revólver
- Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido
- Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales
- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma
iris y soporte para el espejo
11
2. Parte óptica del Microscopio:
- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador
- Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes características:
o Magnificación: Ej. x 25
o Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45
o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromático
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminación. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma
IV. CUESTIONARIO
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
14
PRÁCTICA
RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y
CIANOBACTERIAS IN VIVO
I. OBJETIVOS
b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un
portaobjetos (de forma invertida) con una excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar
la preparación con vaselina alrededor de la excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.
2. Coloraciones Vitales
Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como técnicas
intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y coloreadas.
Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello colorantes (azul de metileno, rojo
neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observación,
mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin provocar alteraciones
celulares ni destruir la bacteria.
3. Observacion de cianobacterias
Las bacterias y cianobacterias carecen de muchas de las estructuras internas propias de las células
eucarióticas. Así, el citoplasma de las procarióticas está rodeado por una membrana plasmática y una
pared celular (como en las células vegetales), pero no hay membrana nuclear ni, por tanto, núcleo
15
diferenciado. Las moléculas de ADN están en contacto directo con el citoplasma. Además carecen
de mitocondrias, retículo endoplasmático, cloroplastos y aparato de Golgi. Aunque, en general, las
células procarióticas carecen de estructuras internas delimitadas por membrana, las cianobacterias,
sí contienen numerosas membranas llamadas tilacoides, que contienen clorofila y pigmentos
fotosintéticos que utilizan para captar la energía de la luz solar y sintetizar azúcares (fotosíntesis).
Material
- Microscopio
- Láminas cubreobjetos
- Láminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Muestra de levaduras in vivo
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos
Metodología
Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una gota de líquido sobre
un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.
Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina de manera que la luz del
Microscopio la atraviese.
Ilumine correctamente su Microscopio.
Proceda a enfocar con el lente objetivo de menor aumento y observará que tiene exceso de
iluminación y poca visión de la muestra corrija éste defecto bajando el condensador y
cerrando un poco el diafragma iris.
Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen características
especiales y un fondo de partículas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeñas
escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las distingue porque son brillantes,
amarillentas, poco móviles; van desde la forma de un barril pequeño hasta cigarros o
prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observación.
Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar
su cuerpo rodeado de cilios. En su interior observar el núcleo y vacuolas.
- También puede observarse a la stilonichia, más pequeña que el Parameccium y con
un pelo o cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un
flagelo largo (Protozoario flagelado).
- La ameba, difícil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y
se desplaza lentamente emitiendo pseudópodos en la superficie de su cuerpo.
- También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cáliz, con un pedicelo largo y
delgado, generalmente viven en colonias. La superficie del “cáliz” está rodeada de
cilios.
16
Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y
observe nuevamente los organismos unicelulares.
Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.
-
Grafique la Observación y Resultados
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir
el procedimiento (muestra liquida o sólida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
Procedimiento Experimental
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
IV. CUESTIONARIO
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
18
PRÁCTICA
COLORACION SIMPLE -
TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS
I. OBJETIVOS
- Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración.
- Distinguir las características macroscópicas y las estructuras microscópicas de los Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las especies de Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.
2.1.1.- ASPERGILLUS
Caracteristicas microbiologicas
Características morfológicas del hongo: tamaño y forma de las cabezas conidiales, Morfología de los
conidióforos, fiàlides y metulas, y en la presencia de células de Hulle y de esclerocios. En la siguiente
figura se muestra las principales estructuras morfológicas del género Aspergillus:
19
Aplicaciones industriales
Invertasa o sacarasa.
Origen y acción'. La hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azúcar invertido) puede ser realizada
por dos enzimas: la betafructosidasa, que actúa sobre el extremo fructosa de la molécula de sacarosa,
y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente
por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae,
Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de
hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.
• Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lípidos para romperlos por hidrólisis, pero las
lipasas son solubles en agua y los lípidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrólisis sólo
ocurre en la interfase entre la gota lipídica y la fase acuosa, lo que causa que la reacción sea
relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remoción de manchas
de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinación de búsqueda y manipulación genética
ha conducido a la introducción reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa
Hamicola , que se logró producir en Aspergillus otyzae y que se conoce como "Lipolasa".
El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente
celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extracción
de aceite a partir de las semillas de ajonjolí, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de
aceite extraído fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjolí, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite
de cacahuate y de 55.3 a 57.1 %
2.1.2.- PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras de la espora-
cojinete.
20
Los conidióforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fíales en forma de
botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora
más joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes.
La ramificación es una característica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no
ramificados y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estípite. Otros pueden tener un
racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda
pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete
de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rápido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca,
a 25 °C (no crecen o crecen pobremente a 37 °C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la
superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulación abundante. Olor
aromático, especiado o afrutado (a manzanao a pina).
Ecologia
El Penicillium es género grande y difícil encontrado casi por todas partes, y generalmente el género más
abundante de hongos en suelos. La ocurrencia común de la especie del Penicillium en alimento es un
problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible
o aún peligroso. Es una buena práctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier
moho.
Se le encuentra en el polvo doméstico, en los edificios húmedos y mohosos donde deteriora diferentes
materiales de construcción, entre los que resaltan el papel de decoración (crece bien en la cola empleada
para su adhesión a las paredes). No muestra una notable variación estacional. Las máximas
concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las áreas urbanas
que en las rurales).
2.1.3.- RHYZOPUS
21
Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que
se decae y las heces del vehículo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son
causas ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo
fatales) en seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rápida. En ciertas especies
son patógeno de la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la producción del tempeh,
un alimento fermentado derivado de las sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son
el interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son genético idénticos a su
padre, los zygospores se producen después de que dos mycelia se fundan durante la reproducción
sexual, y dan lugar a las colonias que pueden ser genético diferentes de sus padres.
El género mucor
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden
lentamente los medios de cultivo.
aplicaciones industriales
Importancia económica, síntesis de productos industriales: producción de ácidos láctico, cítrico,
succínico, oxálico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe
Mucor racemosus: Se presenta en dos formas según el medio en que se desarrolle. Una forma
típica o filamentosa, en medios sólidos y otra forma atípica o levaduriforme que por lo general
aparece en los medios líquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por
fermentación de mostos azucarados, en cambio, la forma típica se usa para obtener enzimas
(amilasas).
22
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS
A. MATERIAL
B. MATERIAL BIOLOGICO
Muestras de alimentos con hongos
Cultivo de Aspergillus niger
Cultivo de Penicillium
C. REACTIVOS
I. RESULTADOS
A. ASPEGILLUS
B. PENICILLIUM
23
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos
..................................................................................... .....................................................................................
..................................................................................... .....................................................................................
..................................................................................... .....................................................................................
..................................................................................... .....................................................................................
c.- MUCOR
24
IV. OBSERVACIONES
V. CONCLUSIONES
25
PRÁCTICA
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL
VI. OBJETIVOS
- Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración.
- Distinguir las características macroscópicas y las estructuras microscópicas de los Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las especies de Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasto posee un índice
de refracción cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biológicas para visualizarlos
adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren uno de otro en
cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución de los átomos de hidrógeno por
otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos más comunes hallados en los colorantes son:
C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales cromóforos del
compuesto.
Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son:
c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del material a
estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rápida de
los microorganismos, debida a la coagulación de las albúminas protoplásmicas. Existe un gran
número de fijadores, tanto en forma simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales
de fijación son: por el calor y alcohol en frío.
a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfología
y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de metileno, Tinción fucsina.
b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto las
características de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tinción Gram,
Tinción ácido-alcohol resistente.
TINCIÓN GRAM
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana
luego de un tratamiento con una solución débil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias
debido a su naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el
cristal violeta, aún luego del tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla
de alcohol y acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular,
pierden la coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El
colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas
que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo
fijado la safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben
el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.
27
Gramnegativas. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa, estas
incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que
contiene el antígeno o somático conocido como lipopolisacárido LPS, una capa densa
intermedia, y la membrana plasmática interna. Un espesor de 0.0075 m.
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con él esa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
TINCIÓN DE SAFRANINA
28
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se deja actuar de unos
5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram, Asas de platino,
Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión.
Reactivos
- Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
- Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada=
100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) ó Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml)
Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas
y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso
de tinción.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución de
cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas del
decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante violeta. Se requiere unos 10
29
segundos más o menos. También puede utilizar etanol comercial como decolorante , en
este caso dar más tiempo aproximadamente 1 minuto.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de caño.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
1. ¿Por qué es necesario utilizar métodos de tinción para visualizar a las bacterias?
2. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos
3. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales
4. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos grampositivos y explique
la función que cumple cada uno de ellos.
5. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gramnegativos y explique
la función que cumple cada uno de ellos.
6. ¿A qué se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?
7. ¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?
30
PRÁCTICA
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN DEL EQUIPO
Y MATERIAL DE LABORATORIO
I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y esterilización de materiales y
equipos más empleados en un laboratorio de microbiología industrial.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco
debido a la desecación en general, lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos.
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de
kolhe, espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar
rápidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.
31
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno Pasteur, donde se esteriliza
el material a temperaturas de 170º-180ºC por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar
material de vidrio.
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran
húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas
partes del recipiente de esterilización, el vapor debe conservarse a una presión de 1000g/cm3 sobre
la presión atmosférica para obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de
cadena única en el ADN, y la pérdida de la viabilidad de las células expuestas a calor leve puede
correlacionarse con la introducción de estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática,
como resultado de activación o liberación de una nucleasa.
a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100ºC) por 15-35 minutos.
b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la acción del vapor de agua y a
temperatura no mayor de 100ºC; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta.
Se utiliza para materiales termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo.
c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presión y 121ºC por 15-
20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no
pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización.
♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una camisa metálica cilíndrica.
♠ Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas, electricidad o vapor de agua).
♠ Orificios superiores para purga de gases de combustión.
♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar.
Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través de membranas porosas
que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilización de sustancias termolábiles. El
material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.
Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente
bactericida en la región espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, éste método
presenta muchas dificultades técnicas.
32
- Material de vidrio: pipetas, palcas Petri
- Erlenmeyer, tubos de ensayo
- Papel craff, algodón, gasa, tijeras
- Mechero de Bunsen
- Horno Pasteur de aire caliente
- Autoclave
- Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben llevar sus tapones de algodón
respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos
ni cortos, preparados según el método siguiente:
- De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodón de
fibra, extendida, rectangular
- Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
- Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud.
- Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para dársele la forma de cono
truncado, con el diámetro a la medida del recipiente a taponar, el tapón debe entrar en el
recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones
envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y
amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel sólo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con papel kraft y se amarra con
hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo
- Rotular la fecha de preparación.
El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con utensilios de vidrio
o metal.
34
V. CUESTIONARIO
2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control
microbiológico, por qué?
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el
autoclave.
4. Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a
que se debe tal diferencia.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
35
PRÁCTICA
MEDIOS DE CULTIVO
I. OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un
crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo más empleados en bacteriología.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo más corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboración de cualquier medio de cultivo.
El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con
esto, siempre se requerirá una fuente de energía y una fuente no energética como son las sales,
factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energía son necesarias para su desarrollo.
A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azúcares en forma de mono o
disacáridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar
azúcares más complejas para obtener energía., como es el caso del almidón.
Existen también bacterias capaces de utilizar el gas carbónico CO2 hecho que es característico de
las bacterias fotosintetizantes y quimiolitótrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos
como fuente de energía: Ejemplo: Cladosporium.
Por último, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energía un gran
número de componentes hidrocarbonados diferentes.
B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como proteínas completas, que sería el caso de la gelatina o incluso proteínas
aún más complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas
etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrógeno que corresponden a péptidos o
polipéptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son también proteínas que
están parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominación comercial correspondiente a una peptona pépsica de carne.
La caseína en forma de peptona tripsica de caseína se usa para estudiar la formación de indol por
parte de la bacteria debido al alto contenido de triptófano que posee este tipo de peptona. También
es utilizada para estudiar la reducción de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos.
36
La peptona papaínica de soja, es una fuente de nitrógeno especialmente para hongos y ciertos
gérmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrógeno serian: nitratos, nitrógeno orgánico, amoniaco, sales de amonio,
aminoácidos, etc.
A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en
forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir
de algún aminoácido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.
B. FUENTE DE FÓSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fósforo lo suelen hacer en forma de fosfato.
C. IONES METÁLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio,
el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
También se encuentra otro tipo de iones metálicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentración
pueden inhibir el ‘crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe
el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus.
D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que aún con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy
lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta además una serie de componentes definidos que
no son capaces de fabricar por sí solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algún tipo
de aminoácido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases púricas o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, ácido glutámico y ácido nicotinico para el crecimiento
de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias húmedas, lisas y grises del Haemophylus
influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y está enriquecido con otros cofactores,
como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella
pertusis. Se observa colonias en “gotas de mercurio” brillantes es fácil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrógeno suplementario y vitaminas del complejo B para el
crecimiento del Flavobacterium.
E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algún tipo de microorganismo por bloqueo
de sus procesos metabólicos.
Los antibióticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.
La azida sódica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los
Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
37
Las sustancias inhibidoras son muy útiles para la identificación y tipificación de pruebas
bioquímicas de las bacterias.
B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.
En general, cualquier medio sólido o líquido requiere cierta proporción de agua.
38
En medios sin agua es muy difícil el crecimiento bacteriano: de ahí que la liofilización y cualquier
método de deshidratación, sea un buen medio de conservación.
C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH óptimo de crecimiento.
- Los acidófilos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrófilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalófilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayoría de las bacterias y protozoos son neutrófilos.
La mayoría de hongos prefieren medios ligeramente ácidos, con valores de pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos alterando la membrana plasmática
o inhibiendo la actividad de las enzimas y las proteínas transportadoras.
El pH óptimo en la mayoría de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy ácido, a pH próximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos
que se producen por la degradación de los nutrientes por parte de las bacterias. Es típico que en la
fermentación glucídica se produzca acidificación del medio o en la degradación proteica utilizando la
bacteria sales amónicas como fuente de energía se alcalinice el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro
de los límites fisiológicos.
Límite Límite
Microorganismo pH óptimo
inferior superior
Picrophilus oshimae 0 0.7 SD
Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0-3.5 6.0
Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.5 4.0
Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8-6.6 6.8
Staphylococcus aureus 4.2 7.0-7.5 9.3
Proteus vulgaris 4.4 6.0-7.0 8.4
Escherichia coli 4.4 6.0-7.0 9.0
Clostridium sporogenes 5.5-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0
Pseudomonas aeuriginosa 5.6 6.6-7.0 8.0
Nitrosomonas 7.0-7.6 8.0-8.8 9.4
Bacillus pasteurii 8.5 SD SD
Bacillus alcalophilus 8.5 10.6 11.5
D. PRESIÓN OSMÓTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliomoles) aunque existen muchas bacterias que
pueden crecer a concentraciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotónicos; este hecho es
debido a su pared rígida que permite que el agua no penetre en la bacteria y ésta se rompa.
En las bacterias halófilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de
cloruro sódico; Ej: Staphylococus.
Como la concentración osmótica de un hábitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos,
es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la
actividad de agua (aw).
39
1.00 (agua pura) Sangre Mayoría de Gramnegativos
no halófilos
0.95 Pan Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes
0.90 Jamón Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus
0.85 Salami Staphylococus, Saccharomyces
0.80 Conservas Penicillum
0.75 Lagos salados Halobacterium, Aspergillus
Pescado salado Actinospora
0.70 Cereales, dulces Aspergillus
0.60 Chocolate Saccharomyces
Leche Xeromyces
deshidratada
E. CONCENTRACION DE OXÍGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxígeno atmosférico es AEROBIO, mientras que
otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor
en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto
en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides.
Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia.
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energía mediante la respiración aerobia
y deben utilizar vías de fermentación o respiración anaerobia para este objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son
MICROAEROFILOS que son dañados por el nivel de oxigeno atmosférico 20% precisando para
su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxígeno.
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes clasificaciones. De acuerdo
con esto y según criterios se podrían dividir en:
A. MEDIOS SÓLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está siempre por encima del 15%.
La importancia, de los medios sólidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificación y
visualización del crecimiento en colonias, así como su posible identificación a través de medios
específicos y diferenciales de caracteres, sólidos elaboración de antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos.
- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfología de las colonias.
B. MEDIOS LÍQUIDOS
También denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realización de recuentos
bacteriológicos por turbidimetría, especialmente útil en levaduras, para la realización de inóculos, para
obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibióticos, ácidos
lácticos, etc.
40
Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradación de glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la producción de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formación de ácido y gas
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difíciles de cultivar.
C. MEDIOS SEMISÓLIDOS
Son medios intermedios entre los líquidos y los sólidos; su proporción en agar suele ser inferior al 5%
pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semisólida. Son útiles
para algunas pruebas bioquímicas:
- Agar SIM, estudiar movilidad, producción de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, producción de Indol y Ornitina.
41
C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante
períodos de tiempo relativamente largos manteniéndose tales medios generalmente a temperaturas lo
suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada
que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses.
a. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Espátula.
Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo.
b. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey
Agar Sabouraud. Agar LIA .
4.1. PREPARACIÓN
- Para la preparación de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, según la cantidad que está indicada en la
etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y añadir la mitad del volumen de agua que se
requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensión homogénea, después
incorporar el agua restante, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al
conjunto las partículas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared
interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolución.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolución completa, al agitar no debe adherirse el
medio a la pared interna del recipiente; la solución es viscosa y resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapón de algodón, envolver con papel Kraft y pabilos.
4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizará el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121ºC.
42
4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55ºC.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo haciéndolo oscilar en sentido circular su
recipiente para garantizar la homogeneidad del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en la
posición deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posición lograda.
- Repartir:
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo: (Una vez
que las placas de petri están esterilizadas, procedemos a crear un medio sólido en ellas,
en el cual poder cultivar. Para ello calentamos el caldo preparado y le añadimos el
agaragar suficiente (15g/l) para conseguir un medio sólido. Cuando tenemos
preparada esta mezcla la vertimos en las placas de petri y las cerramos para evitar que
se contaminen (siempre bajo un medio estéril, el cual se crea al encender una llama).
Agar nutritivo
Agar Mac Conkey
Agar EMB
Agar Sabouraud
o En Tubos: la posición de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)
Agar TSI
Agar LIA
o En Tubos: la posición de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
Agar Citrato de Simmons
o En tubos: la posición de Fondo (aproximadamente 3 ml)
Agar SIM
4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados deberán conservarse en lugar seco, protegidos contra
la luz, a una temperatura de 15ºC a 30ºC, y en envases bien cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un sólo tiempo limitado de
conservación. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservación
es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 – 8ºC.
- Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, deberán pre encintarse con cinta
adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa.
AGAR NUTRITIVO
Composición
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 m
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Según la composición
_________________________________________________________
Según su presentación
_________________________________________________________
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Según la composición
_________________________________________________________
Según su presentación
44
_________________________________________________________
AGAR TSI
Composición
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de sacarosa,
Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa,
Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar – Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 g
Agua destilada, 1000 ml
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
MEDIO EMB.
Composición
Fosfato dipotásico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa,
sacarosa, caseina, Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
V. CUESTIONARIO
1. Defina Ud. los siguientes términos y mencione 1 ejemplo de microorganismo: Aerobios obligados,
Anaerobio facultativo, Anaerobio aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo.
2. Cuáles son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo?
3. Cual es al función del agar-agar en los medios de cultivo?
4. ¿Por qué es difícil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw?
5. ¿A qué se denomina medio sintético o definido? De 3 ejemplos.
6. ¿Qué es un medio complejo?. De 3 ejemplos.
7. ¿Qué es un medio selectivo?. De 3 ejemplos.
8. ¿Qué es un medio diferencial?. De 3 ejemplos.
9. Realice una gráfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el crecimiento microbiano, y
clasifique en categorías diferentes según los rangos de temperatura de su crecimiento (psicrófilos.
Psicrótrofos, mesófilos, termófilos, Hipertermófilos?
10. ¿Con qué sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione por lo menos 4.
11. ¿Qué es un medio de transporte y para qué sirve? De 2 ejemplos.
12. ¿Qué medios diferenciales conoce? ¿Qué utilidades tienen?
13. ¿Qué es un medio selectivo y qué función tiene? Mencione por lo menos 3 y ¿qué sustancias se le
agregan para que cumpla esa función?
14. ¿Cómo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos?
15. ¿Cómo pueden incubarse los microorganismos microaerófilos?
16. ¿Para qué sirve utilizar un medio de cultivo semisólido? ¿Cómo se obtiene la consistencia del agar
blando?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
46
PRÁCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
I. OBJETIVOS
Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en
condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados.
Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas:
- Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca.
- Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son
contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros.
2.1. SIEMBRA
Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo adecuados
para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en
condiciones óptimas de temperatura y tiempo de inoculación, puedan desarrollarse y
multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades:
a. Para hacer un aislamiento.
b. Para hacer un transplante.
AISLAMIENTO
Permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra
problema. Se requiere un medio sólido con gran superficie para que los microorganismos al
ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por formación de colonias
separadas. Si se aíslan especies distintas, cada colonia tendrá características especiales, la
morfología bacteriana será también distintiva.
TRANSPLANTE
Significa la separación previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede
ser líquido o sólido.
ASAS DE SIEMBRA
El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en asa o recta
y en el otro extremo insertado con un mango cilíndrico para un uso sencillo.
Se utiliza para inoculación o siembra por estría en medios sólidos, presentan un arco bastante
cerrado en su extremo cuyo diámetro es más o menos específico es decir muchas asas son
calibradas y corresponden a un volumen determinado de siembra las más utilizadas son las de
0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.
ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de triángulo más o menos abierto. Se utiliza para extender el
inóculo líquido previamente adicionado en la placa, a través de una pipeta pasteur. Se esteriliza
en autoclave, aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y prendiendo la
llama hasta agotar el alcohol del asa.
HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra desecación,
deterioro o contaminación. Sirve para extender la muestra a través del hisopo en el medio de
cultivo. Se suele comercializar ya estéril listo para utilizar y desechables.
PIPETAS
48
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables por
esterilización o de plástico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen
volúmenes específicos), en cuyo caso su aspiración se realizará con aspiradores para pipeta tipo
pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene volúmenes graduados son muy utilizados en
bacteriología y cuya aspiración se realiza con chupetes de goma. También nos encontramos
con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un determinado medio
de cultivo.
Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un medio líquido se homogenizará
y se dejará crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para organismos patógenos
coincidirá con la temperatura corporal, dejándolos crecer aproximadamente 24 horas. En
ocasiones excepcionales se hace necesaria la utilización de un rotavapor para que el crecimiento
se establezca por igual en todo el medio líquido, aunque esto va a depender de su aplicación
posterior y de la cantidad de inóculo que se requiera.
Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un medio de cultivo sólido, se
utilizara diferentes técnicas de siembra y posteriormente se verificará el cultivo, ej. siembra por
agotamiento.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un medio liquido,
se homogenizará la mezcla inicial por agitación y se dejará crecer a una temperatura de 37ºC
por 24 horas. Es importante que los inóculos sean siempre jóvenes.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y ésta se añade a un medio sólido,
se extenderá con el asa de Digrasky, previamente estéril a través de toda la placa incubándose
a a temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren también cultivos jóvenes.
Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina estéril o caldo de cultivo
base.
49
A veces es necesario partir de un inóculo con un número aproximados de microorganismos
problema. En estos casos, los inóculos se establecen en medios líquidos y el número de
microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparación de medios líquidos con
diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una
batería de tubos cada uno de las cuales tiene distinta turbidez según la concentración de sulfato
bárico. Cada tubo corresponderá a una determinada concentración de microorganismos.
CLASES DE SIEMBRA
- Siembra por agotamiento o por estrías.
- Siembra por difusión.
- Siembra por diseminación.
50
- ESTRIA MÚLTIPLE
Se tomará la muestra problema con el asa de siembra previamente estéril y dicho inóculo se
depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un extremo a otro de ésta solo
en la parte superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa repetiremos
el proceso anterior que nos permitirá arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedó
la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de
platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma dirección se repite la
operación hasta un total de cuatro o cinco veces, que son los que tienen cabida
aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el
interior de la misma.
El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia de que cada vez que se
va arrastrando y separando más la muestra. Es importante que para separar estas colonias se
realice en cada estría un flameado previo del asa de siembra.
51
b. SIEMBRA POR DIFUSION (TÉCNICA DE BARRY)
En este método, el medio de cultivo se mezcla con el inóculo, al solidificar las colonias crecen
en diferentes niveles, los cuales servirán para contaje de colonias.
Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril y se dejará solidificar, la
mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenización en este
caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por ejemplo, para la determinación de CMI
(concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a determinados microorganismos.
La mayoría de los métodos de obtención de cultivos puros se basa en algún método de dilución.
El método más útil y práctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se
inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las células
individuales queden separadas una de otras. Cada célula aislada crece ahora para formar una
colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las células que componen la colonia
son la progenie de una única célula original.
Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y para mantener la
esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando asépticamente, el biotecnólogo tome
prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la contaminación o de las soluciones
con microorganismos no deseados.
53
III. MATERIALES Y EQUIPOS
54
4.3. TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES
Muestra: Muestra fermentada y de microorganismos
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Medio de cultivo: Agar nutritivo
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
V. CUESTIONARIO
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
55
PRÁCTICA
CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE
COLONIAS
I. OBJETIVOS
GENERALIDADES:
Para estudiar las características de los microorganismos (forma, estructura, tamaño, consistencia,
cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y cultivarlos en medios de cultivos apropiados según el
tipo de microorganismo, de tal forma que proporcione los nutrientes necesarios para su crecimiento y
desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en medios sólidos y líquidos.
Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de una Unidad
Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sólido; aunque varía de tamaño generalmente es visible a
simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie
como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los
estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color característicos, que
aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es constante bajo condiciones controladas
y depende de la especie bacteriana que la forme.
Debido a que las características de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones dependiendo
de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados.
Sin embargo, además de éstas características se requiere también estudiar la fisiología y propiedades
inmunológicas de las bacterias para poder realizar una identificación completa.
La morfología colonial es comparable a una estadística ya que se deriva de una célula individual pero es
la característica de la masa celular. Así pues, por ejemplo, la pigmentación es aparente en la colonia, pero
no en la célula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la
sustancia capsular en aquellas bacterias con cápsula muy grande.
Medida de las colonias. ésta característica es bastante constante dentro de las especies y puede ir desde
colonias muy diminutas hasta un diámetro de varios milímetros.
Forma. Está determinada por su borde y su espesor. En las siguientes figuras se pueden observar varias
formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.
56
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede
moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos
mucosos cuando se trata de separarla del agar..
La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas concéntricas
o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa.
Pigmentación. Esta característica es muy común en las bacterias saprófitas en las que las colonias
aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patógenos uno de los pigmentados
más importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se aprecia
en las células individuales a que se debe a gránulos intracelulares muy pequeños para verse con luz
transmitida.
57
SUPERFICIE
Lisa
Rugosa
Plegada
CARACTERÍSTICAS ÓPTICAS
CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios sólidos, en los medios líquidos las características de la
bacteria sembrada se reflejan en las características que presenta el caldo
Inoculado como son:
Turbidez: Opacidad más o menos densa, signo de crecimiento.
Película: Crecimiento casi continúo sobre el líquido
Sedimento: Depósito de células en el fondo del tubo que se resuspende al agitar
58
Crecimiento en medio semisólido
PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
Anote las características coloniales de cada cepa en la tabla, basándose en el Texto, las figuras:
AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria
Forma
Borde
Elevación
Superficie
Consistencia
Color
Luz
transmitida
Luz reflejada
59
MEDIO SEMISÓLIDO
Bacteria
Movilidad
IV. CUESTIONARIO
1. Qué método utilizaría para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo puro, joven, injuriado y
envejecido.
2. Por qué algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en caldo una característica
de forma de película.
3. ¿Cómo se visualiza el polisacárido extracelular y a qué bacteria puede corresponder?
4. ¿Qué es la prueba de catalasa, cómo se realiza y qué utilidad tiene?
5. ¿Cómo se interpretan los resultados de una prueba de fermentación de hidratos de carbono?
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
60
61
PRÁCTICA
OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA
Lessonia trabeculata
I. OBJETIVO
Aplicar técnicas de extracción de ácido alguinio a partir de algas.
Aplicar técnicas de purificación de ácido alguinio a partir de algas.
II. INTRODUCCIÓN.
Existen variedades de algas pardas que producen ácido algínico, que es la base para producir alginato de Sodio,
Potasio, Calcio, etc. El alga Lessonia trabeculata, crece en grandes cantidades en las costas de Arequipa.
En el litoral sur peruano se encuentran tres especies de algas pardas, tales como: Macrocystis pyrifera,
“sargazos” Lessonia trabeculata (“aracanto”, “palo”) y Lessonia nigrescens (“aracanto negra”), en ambientes
inter y submareales. Existen dos modos de su aprovechamiento: a) por medio de la extracción, y b)
mediante el recojo, colecta y acopio, por lo cual existen disposiciones normativas, que en resumen, en la
actualidad, prohíben la actividad extractiva a nivel de todo el litoral peruano (RM N° 839- 2008-
PRODUCE), y de otro lado, autorizan el recojo, colecta y acopio de algas varadas (RM N° 264-2009-
PRODUCE).
En las algas pardas, el ácido algínico es uno de los principales constituyentes de las paredes celulares,
casi siempre se encuentra con otros polisacáridos, como laminarina (5-30%), fucoidina (2-12%),
diferenciándose de estas dos últimas por la propiedad de insolubilidad en el agua y por encontrarse asociado con
varios cationes: calcio, magnesio y sodio. El ácido algínico es un polisacárido, de fórmula general: (C6H8O6)n,
donde «n» se repite de 80 a 83 veces., y compuesto de ácido manurónico y ácido gulurónico unidos con
enlaces -1,4, en su estado natural se encuentran formando geles con iones Ca+2, Na+, Mg+2, Sr+2 y Ba+
62
Fig… Moléculas constitutivas del ácido algínico.
El ácido algínico se solubiliza en medio alcalino (Na2CO3, NaOH) por intercambio iónico, formándose alginato
de sodio, que es soluble y de fácil extracción.
Al ácido algínico y los alginatos son bastante higroscópicos y un secado completo es muy lento, presentando
una humedad de un 15-25%.
La viscosidad de una solución de alginato es una propiedad que depende o deriva de su peso molecular del
polisacárido, y de la relación de ácido manurónico a ácido gulurónico (M/G).
Material de Laboratorio:
Termómetro, vasos de precipitación, probetas, telas de tocuyo, erlenmyers, fiolas, pH-metro, papeles filtrantes,
pipetas, embudos, etc.
Reactivos:
Ácido clorhídrico, carbonato de sodio anhidro, nitrato de plata, hipoclorito de sodio, etanol, etc.
Equipos:
Potenciómetro, balanza analítica, estufa graduada para baja temperatura.
1.- Pesar 20 gr de alga seca (tallos y hojas) y colocarla en un vaso de precipitados de 2 litros, con suficiente
cantidad de agua destilada que cubra las algas. Se produce un hinchamiento de las hojas y ablandamiento
de los tallos, el lavado se repite varias veces para eliminar las sales solubles hasta que los líquidos no den
precipitado con solución diluida de nitrato de plata.
2.- Para eliminar las impurezas, se hacen varios lavados con solución 0,2 N de HCl, los cuales terminan
cuando el líquido del lavado no da turbidez con etanol.
Así se transforman los alginatos en ácido algínico (insoluble).
MCl + HAlg --------HCl + MAlg.
3.- Cortar la muestra en pequeños trozos, agregar agua y calentar hasta 45 °C por 10 minutos.
5.- Las muestras lavadas se tratan con una solución de Na2CO3 al 10% en peso (ajustando el pH a 9-10),
se calienta hasta 70 °C agitando continuamente, luego dejar macerar hasta el día siguiente para solubilizar
el ácido algínico como alginato de sodio, dando una solución con aspecto lechoso parduzco y viscoso.
6.- Se filtra y el residuo se vuelve a tratar con Na2CO3 al 2% a 70 ºC por 10 minutos, se filtra y el filtrado
se agrega a la solución anterior y, si es necesario, se vuelve a filtrar.
7.- Los filtrados anteriores tienen un aspecto coloidal y de color pardo oscuro. Para blanquearlo o
decolorarlo se agrega solución de hipoclorito de sodio al 5.25% en la proporción de 1/10 del volumen
de los filtrados resultantes y se deja actuar unos 10 minutos. .
8.- Al filtrado total contenido en el vaso de precipitados se mide el pH y se acidifica con HCl concentrado,
agregando de 10 en 10 ml, midiendo su pH hasta llegar a pH=2:
Se observa la formación de una gran masa de precipitación blanquecina, que se deposita en el fondo del
recipiente. Se hace el filtrado empleando tela de tocuyo blanco, lavando el filtrado con ácido clorhídrico
diluido.
63
9.- La purificación consiste en cambiar de fase el compuesto de interés para eliminar con la otra fase los
contaminantes, en este caso se precipitará con cloruro de calcio el alginato quedando los contaminantes,
en su gran mayoría, en las aguas sobrenadantes.
2NaAlg + CaCl ----- CaAlg + 2NaCl
10.- El precipitado obtenido, Alginato de calcio, se blanquea y desodoriza mediante un lavado con
NaClO. El alginato de calcio es de interés comercial obtenido en forma purificada.
11.- A continuación, el alginato de Calcio se acidifica con ácido clorhídrico al 5%, para transformarse en
ácido algínico, como se muestra en la siguiente reacción:
CaAlg + 2HCl---- HAlg + CaCl
12.- El ácido algínico se escurre y se seca en estufa de vacío a 50°C hasta peso constante, por unas 5
horas, se enfría y se pesa.
El producto buscado es el alginato de sodio, que se consigue desde la solución ácida de ácido algínico
por alcalinización con NaOH 5 N, como este alginato es soluble en agua se seca en estufa de vacío a
50°C hasta peso constante.
HAlg + NaOH ---- NaAlg + H2O
V. CUESTIONARIO
1. Explique por qué es necesario tratar inicialmente las algas con acido clorhídrico.
2. Proponga métodos alternativos de purificación de alginato.
3. Investigue la diferencia en la estructura y composición de hojas y tallos de las algas pardas.
4. Investigue que método analítico podría servir para determinar la estructura del alginato
5. Explique el uso de alginatos como insumo en la industria textil.
6. Explique el uso de alginatos en la industria de helados.
VI. RESULTADOS
64
VII. OBSERVACIONES
VIII. CONCLUSIONES
65
PRÁCTICA
CONTEO DE CÉLULAS MICROBIANAS
I. OBJETIVO
Determinar el recuento directo de células microbianas con la cámara de contaje celular.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente
simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos
(cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el “Cell Coulter”.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos
basta con una cámara de contaje celular, por ej. La cámara de Neubauer, y un microscopio. Una
cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a
medir. El dispositivo presente unas señales que determina un volumen conocido (x microlitros).
Al contar bajo el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se pueden
determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen.
Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas,
la concentración en la suspensión celular será:
66
Concentración en la suspensión (células / mL) == 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el
microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado.
Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.
El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rápida de estimar la cantidad de
células microbianas, sin embargo, tiene algunas limitaciones:
1) No se distinguen las células muertas de las células vivas.
2) Las células pequeñas son difíciles de ver bajo el microscopio y posiblemente se omitan algunas
células.
3) La precisión es difícil de lograr
4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teñido la muestra.
5) El método no es adecuado para suspensiones de células de baja densidad. En el asa de bacterias,
en una suspensión de células con menos de 106 células por mililitro, se podran ver pocas o
ninguna bacteria.
IV. METODOLOGÍA
CARGANDO LA CÁMARA
Agita la suspensión celular con el vórtex. Aspira una pequeña cantidad de suspensión con
una pipeta Pasteur. Deposita una gota pequeña en la superficie pulida de la cámara de
recuento cerca del extremo del cubre. La suspensión entrará en la cámara por capilaridad.
Una cámara adecuadamente llenada contiene células solo en el espacio contenido entre el
cubre y la cámara de recuento. No debería sobrar fluido que cayera en los surcos.
V. CUESTIONARIO
67
1.- Investigue las características de:
Cámara de cuenta de Petroff – Hausser, equipos automáticos de Contaje celular, Otros métodos de
recuento celular
2.- Indique como diferencia las células viables de células totales.
3.- Describa los métodos directos e indirectos de contaje celular.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
68
PRÁCTICA
CURVA DE CRECIMIENTO
I. INTRODUCCIÓN
Los cultivos microbianos actúan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que
incide sobre ellos.
La turbidimetría mide la entidad de luz transmitida por la suspensión, mientras que la medida de la
luz difractada recibe el nombre de nefelometría. Por estos procedimientos se puede estimar el
número de microorganismos en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada
por una suspensión microbiana es directamente proporcional a la concentración de células en el
cultivo.
El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este aparato
proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de
onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensión microbiana es medida por una
célula fotoeléctrica e inversamente proporcional a la cantidad de microorganimos. Normalmente
la multiplicación bacteriana no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia),
sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta última es directamente
proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión. La relación entre la transmitancia
y la absorbancia se expresa matemáticamente de la siguiente manera:
Para el manejo práctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy útil el uso de
matraces con brazo lateral, ya que permite la realización de medidas sin necesidad de tomar
muestras del cultivo, evitando así el riesgo de contaminación por la manipulación.
II. OBJETIVOS
El intervalo para la formación de dos células a partir de una se llama generación y el tiempo
requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, entre los
69
microorganismos, algunos crecen rápidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros requieren
de una a tres horas o de varias horas o incluso días.
Fases de Crecimiento
Latencia Exponencial Estacionaria Muerte
Rezago Logaritmo Nutrientes se agotan
Declinación
Adaptación Divisón celular Acumulan metabolitos tóxicos
Crecimiento Sesa crecimiento
1
9,0
Log 10 organismos
Turbidez 0,75
viables/ml
Densidad óptica
8,0 Viables (densidad óptica)
0,5
7,0
0,25
6,0
5,0 0,1
Tiempo
Equipo
- Mechero Bunsen
- Estufa de incubación a 37ºC
- Microscopio
- Espectrofotómetro
70
V. METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO
Curva de Crecimiento.- Las células que están creciendo en un cultivo discontinuo (en un
matraz en agitación) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento:
una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las
células en fase de latencia, que proceden de una alícuota de un cultivo anterior que ha sido
transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida.
Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo rápido.
La duración de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y genotipo del
inóculo, de la temperatura, de la concentración en nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la
aireación, y de la concentración de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo.
Una vez que las células empiezan a crecer rápidamente, se dice que han entrado en la fase de
crecimiento logarítmica (log) o exponencial. En este estadio las células crecen rápidamente,
y a diferencia de las células de las fases de latencia y estacionaria, la mayoría de las células se
hallan en el mismo estado fisiológico. La velocidad de crecimiento durante la fase log
depende del nivel de nutrientes y de la aireación de cultivo. La constante de velocidad de
crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un
crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicación o tiempo de
generación).
Realización (Fig. 1)
(Todas las maniobras que se describen a continuación se deben realizar en condiciones de
esterilidad en las proximidades del mechero.)
2. Añadir solución salina estéril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3
ml) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación.
3. Tomar 0.5 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz
con 50 ml de Caldo nutritivo preparado por componentes, estéril.
4. Incubar el matraz en un baño termostatado a 37 ºC, con agitación (200 rpm).
5. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540
nm). Ajustar el espectrofotómetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo
Caldo Nutritivo estéril antes de cada medida.
6. Recoger alícuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubación y colocadas en
refrigeración hasta su lectura
7. Dibujar una curva de multiplicación con los datos obtenidos, colocando en el eje de
abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.
71
8. Construir una tabla con los siguientes datos.
VII. CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué se calibra el espectrofotómetro a 100% de transmitancia con medio de cultivo estéril?
2. Identificar en la gráfica las fases del desarrollo microbiano.
72
3. Como identifica los límites de la fase de crecimiento exponencial?
4. Determine los coeficientes de la ecuación de Lineweaber-Burk y los parámetros de la ecxuacion
de Monod.
5. Proponer otra técnica experimental de evaluación del crecimiento microbiano.
6. Explique porque se selecciona una longitud de onda de 540 nm.
7. Calcule el tiempo de generación microbiana.
VIII. OBSERVACIONES
IX. CONCLUSIONES
73
PRÁCTICA
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE
DILUCIÓN EN PLACA
I. OBJETIVOS
Aprender la técnica de dilución para el aislamiento y cuenta en placa de diferentes fuentes de inóculo.
II. INTRODUCCIÓN
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formación de colonias, la técnica por
vaciado en placa es la más utilizada. La muestra en cantidades conocidas se deposita en cajas petri estériles,
se adiciona el medio de cultivo fundido a una temperatura de 45°C y se mezcla con la muestra.
Después de la incubación se cuentan las colonias desarrolladas las que multiplicadas por el inverso de la
dilución que corresponda permite estimar el número de microorganismos viable por gramo o mL de
muestra, obviamente con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoquímicas y tipo
de colonias contadas), el recuento obtenido se referirá a determinado grupo de microorganismos. Esta
técnica permite la mayoría de las veces cuantificar la contaminación de una muestra.
74
Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de tinción de Gram, Cajas
Petri, Pipetas de 1 y 10 ml, 1 probeta de 100 ml,
Material que deben traer los alumnos: masking-tape, algodón, gasa, alcohol.
IV. METODOLOGÍA
75
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
Preparar las muestras según procedimientos recomendados para la preparación y dilución de muestras.
Pipetear a placas Petri estériles, alícuotas de 1 ml. A partir de las diluciones, dilución 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5, 10-6, 10-7.
Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y temperado a 45°C, mezclar
rápidamente con movimientos vaivén y rotación de la placa; dejar solidificar.
Incubar las placas en posición invertida a 37 °C por 48 horas.
Efectuar el recuento de microorganismos según:
a) Seleccionar dos placas correspondientes a una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias.
b) Tomar la media aritmética de dos recuentos y multiplicar por el factor de dilución utilizada. Reportar
el resultado como numero de m.o. aerobios mesofilos viables por gramo o mililitro, según el caso
c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y mayores que 300,
tomar el promedio de los dos recuentos y computar el recuento para cada una de las diluciones y
establecer la relación de los dos recuentos
V. RESULTADOS
VI. CUESTIONARIO
VII. OBSERVACIONES
VIII. CONCLUSIONES
76
PRÁCTICA
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE
MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL
I. OBJETIVOS
• Seleccionar microorganismos de diferentes fuentes, que puedan servir para la obtención de metabolitos
de interés industrial.
• Aplicar técnicas de purificación de microorganismos aprendidas previamente en microbiología general.
Las áreas de aplicación de la microbiología industrial son muy variadas, y de ellas surge la importancia y
el impacto que tiene esta disciplina en la actualidad.
En primer lugar, se debe destacar la importancia de la microbiología industrial en el mantenimiento de la
salud y tratamiento de enfermedades, fundamentalmente por su aplicación en la producción de
compuestos de actividad farmacológica y de vacunas.
En la industria de alimentos es también significativa la aplicación de la microbiología industrial, en la
producción de bebidas, enzimas, saborizantes, productos lácteos y muchas otras aplicaciones.
La producción agropecuaria se ve también favorecida en sus aspectos de producción vegetal y animal,
por un conjunto variado de procesos microbiológicos.
El área de aplicación en minería está relacionada con la biolixiviación, o sea, con la aplicación de
microorganismos en la extracción de metales de minerales de baja ley.
Finalmente, el área de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicación de microorganismos en la
purificación de efluentes, aspecto fundamental para el mantenimiento de la calidad de vida.
Debido a que el éxito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo utilizado,
para la elección del mismo se deben tener en cuenta los criterios generales que se indican a continuación:
77
Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de
fuentes naturales o de una colección de cultivos. En el ámbito industrial, en general, cada firma posee su
propia colección de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados por medio de técnicas clásicas
de mutación o de ingeniería genética. Sin embargo, estas cepas sólo son empleadas por la industria que
las posee, debido al gran valor comercial que representan. En algunos casos se dispone de organismos
modificados genéticamente para llevar a cabo reacciones específicas de biosíntesis, degradación o
biocatálisis, los cuales están protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos
aislados o modificados no está disponible para uso general en laboratorios.
Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales, como agua, suelo, plantas y desechos, la elección
del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo exprese en ese ambiente las
propiedades que son de interés.
Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas, se podrían encontrar organismos adaptados a la
degradación de estos productos químicos; o en larvas de insectos muertos, agentes causales de la muerte.
Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica elegida para el mismo;
en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, b) enriquecimiento del cultivo con o sin pre
tratamiento de la muestra.
Materiales y Reactivos
Asa.
Hisopos estériles.
Bolsas plásticas 1 l.
Cuchillo.
Caja Petri con agar nutritivo.
Caja Petri con agar papa dextrosa.
Caja Petri con agar YPD con 10 % de
Aceite de oliva.
Incubadora.
Mechero.
Balanza.
78
3. Incubar las cajas de APD a 30 °C y de AN a 37 °C.
Procedimiento para identificar los microorganismos de interés industrial
Dependiendo del uso que se esté buscando para los microorganismos y la industria donde se emplearán,
será el procedimiento a seguir.
1. En el queso se buscarán levaduras con actividad lipasa o esterasa, para eso se inocularán
diferentes colonias por picadura en la superficie de una caja de agar YPD
Con 10 % de aceite de oliva. De ser positivo, se observará un halo transparente, resultado de
la actividad lipasa positiva.
2. También en el queso se buscarán bacterias del genero Lactobacillus ácido-lácticas, con potencial
para ser utilizadas para la preparación de yogur. Se efectuarán las pruebas bioquímicas
pertinentes para su identificación.
3. En la piña se buscarán hongos del género Aspergillus, productoras de ácido acético, así como
bacterias ácido-acéticas para la producción de vinagre. La identificación del hongo se hará
con base en sus características macroscópicas y microscópicas, y para las bacterias se harán
pruebas bioquímicas.
4. Con la tierra se seguirá el procedimiento dependiendo lo que crezca en la caja de cultivo, ya
sea hongos, levaduras o bacterias. Para el caso de los hongos, se identificarán con base en sus
características macroscópicas y microscópicas; para las bacterias, se harán pruebas
bioquímicas. En el caso de las levaduras, se observarán las características morfológicas de las
colonias y un frotis en fresco al microscopio.
IV. CUESTIONARIO
79
V. RESULTADOS
Queso
Piña
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
80
PRÁCTICA
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
I. OBJETIVO
La fijación biológica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce a su hospedero, lo infecta
a través de los pelos radicales para que en la matriz de las células corticales induzca una meiosis y
mitosis acelerada que da lugar a un tejido hipetrofiado: El nódulo en el sistema radical de la
leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se ha transformado en un
bacteroide, mientras que por la enzima llamada nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en amonio,
que luego transfiere al ribosoma vegetal para la síntesis de proteínas vegetales; simultáneamente
por la fotosíntesis la leguminosa reduce el C02 en carbohidratos que servirán como fuente de
carbono y energía para Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo
activo en el nódulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta.
Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la aplicación de fertilizantes
químicos al suelo; incrementan el contenido de N en el cultivo vegetal, su peso seco y mantienen
el rendimiento en las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de producción y la
contaminación de mantos acuíferos y suelos, es vital para una agricultura sustentable.
81
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Material Biológico
- Raíces de alfalfa con nódulos
Matraces
- Placa Petri
- Pinzas bisturí
- Mecheros
- Vasos PP 100 ml
Reactivos
- Agua destilada estéril
- Hipoclorito de sodio 2.5%
- Bicloruro de Mercurio 0.2%
- Medio PSA (papa sacarsa agar)
IV. METODOLOGÍA
82
V. CUESTIONARIO
- Qué otros medios se utilizarían para el cultivo de Rhizobium.
- Cuál es la ruta metabólica que utiliza el Rhizobium.
- Cuál sería la importancia industrial del aislamiento y cultivo de Rhizobium.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
83
PRÁCTICA
OBTENCION DE ALCOHOL POR Sacharomyces cerevisiae
I. OBJETIVO
Estudiar el efecto de la temperatura de incubación en la cinética de la fermentación alcohólica de
un mosto azucarado, con Saccharomyces cerevisiae.
glucosa etanol
Los rendimientos de etanol y CO2 en la práctica son siempre menores a los valores teóricos. Estos
dependen del inóculo (tipo, actividad y concentración de la cepa de levadura), de la composición
del medio de cultivo (concentraciones de fuentes de macronutrientes, micronutrientes, factores de
crecimiento, e inhibidores), de las condiciones ambientales (temperatura, presencia o ausencia de
O2, pH y aW), del crecimiento microbiano, y de la formación de más de 800 metabolitos en pequeñas
cantidades (Quintero, 1981, Phaff y Amerine, 1979, Reyes et al., 1993).
Materiales:
1 asa bacteriológica
1 baño de temperatura controlada
1 charola profunda
2 embudos de 7 cm de diámetro
1 gradilla
1 mechero
1 piceta
2 pipetas graduadas de 1 ml,2 ml,10 ml.
1 probeta de 250 ml
1 termómetro de -10 a 50 oC
Reactivos:
Extracto de levadura
K2HPO4
K2SO3
MgSO47 H2O
MnSO4H2O
(NH4)2SO4
85
Soluciones amortiguadoras de referencia, pH 4.0 y 7.0
Solución de fenol al 1 % *
Solución de fenol al 5 % *
Solución de H2SO4 al 10 % *
Solución de NaOH al 10 % *
Un tubo con cultivo axénico de 48 h de una cepa de Saccharomyces cerevisiae, en medio complejo
sólido.
III. PROCEDIMIENTO
Se evaluaran dos niveles de temperatura en la fermentación alcohólica dentro del rango normal que
se utiliza en la industria, para la elaboración de las bebidas alcohólicas, propuestos de acuerdo al
Cuadro No. 1.1. Cada equipo de alumnos preparará su medio de cultivo y el inóculo; llevará a cabo
la fermentación de 3 – 5 días a una temperatura asignada. Se realizaran muestreos de acuerdo al
cronograma propuesto, y se realizará la evaluación de los cambios en las concentraciones de
levaduras, de etanol y de azúcares reductores. Después de efectuar los cálculos se realizará una
comparación de los resultados de dos equipos, cada uno con un nivel diferente de temperatura.
Cada equipo presentará un informe con los resultados de ambos equipos y escribirá su discusión.
Los resultados se discutirán en una sesión global.
86
Cuadro 1.1 Niveles de temperatura para la Fermentación Alcohólica
_________________________________________________________________________
Fermentación Temperatura
No. (oC )
______________________________________________________________________
1 24
2 30
Preparación de
Pipetas, tubos, frascos de
Materiales de muestreo muestreo y fermentador.
87
Informe de resultados Cálculos, gráficas, tablas y
dibujos; discusión y
conclusión.
Estructura
Se preparan 2 matraces erlenmeyer con caldo dextrosa–Sabouraud estéril.
Estructura
Esta actividad se realiza antes de la fermentación principal.
Los frascos de muestreo (120 ml) se hierven en baño maría, durante 30 min. Después se retiran del
agua con precaución, se escurren, se cierran y se dejan enfriar lentamente.
Se esterilizan 4 pipetas graduadas de 10 ml, 3 tubos de ensayo con tapón roscado vacíos y un
embudo chico, en autoclave a 121oC, durante 15 min.
Estructura
Este medio de cultivo se prepara días antes del inicio de la fermentación y adicionando sobre el
vaso de precipitados primero el agua y poco a poco cada uno de los componentes con base al
siguiente cuadro:
Cuadro 1.2 Composición del caldo de glucosa para realizar la fermentación alcohólica
__________________________________________________________________
88
Componentes g L-1 H2O
____________________________________________________________
Orgánicos
Glucosa 120.0
Inorgánicos
K2HPO4 1.0
MgSO47H2O 0.4
MnSO4H2O 0.1
(NH4)2SO4 2.0
K2SO3* 0.05
_________________________________________________________________
El volumen de trabajo de cada fermentador es de 700 ml, el cual incluye al volumen del medio
(95%) y al volumen del inóculo (5%). En la preparación del medio se esterilizan por separado los
componentes orgánicos y los inorgánicos.
89
Se esteriliza el matraz erlenmeyer y el fermentador con los medios en el autoclave a 121oC, durante
15 min, y se enfría lentamente para evitar la ruptura del frasco.
Por separado se esteriliza el tapón de rosca del fermentador, un tramo de manguera esterilizable de
45 cm y 2 tramos de hilaza de 10 cm cada uno, envueltas separadamente en papel de kraf
Los extremos de los tubos que estén expuestos, se tapan externamente con algodón, amarrándolos
con hilo.
Antes de iniciar el cultivo se lavan las manos con etanol 70%, se ponen cubrebocas y se sanea la
mesa con etanol 70%. Se coloca el fermentador entre mecheros y sobre la mesa saneada, se vacía
la solución de componentes orgánicos estéril al fermentador, a través del orificio central con rosca,
con ayuda de un embudo estéril. Luego se retira el embudo y se adiciona el K2SO3 y se coloca de
nuevo el tapón de algodón.
Estructura
Antes de inocular el sistema de fermentación se debe verificar la pureza del inóculo, por medio de
la observación al microscopio de un frotis teñido con tinción simple de azul de metileno al 0.5 %
Los tubos y el frasco se etiquetan previamente indicando los siguientes datos: Número de la
fermentación, número del equipo, fecha, hora del muestreo y nombre de la persona que muestreó.
Después del muestreo se cierra el tubo con la pinza Mohr, se sacude el tubo y se sumerge en una
solución de Na2SO4 (50 mg L-1) contenida en un tubo de cultivo mediano sin rosca, durante 10
minutos.
90
El fermentador se coloca en un baño maría con temperatura controlada, muestreando
posteriormente en condiciones asépticas. Se anota primero la apariencia del mosto: color, turbidez,
intensidad de burbujeo, formación de natas y/o sedimentos. Posteriormente el mosto se agita sobre
una parrilla eléctrica a temperatura ambiente, se toman 15 ml que se vierten en el frasco de muestreo
y en el tubo, como se indicó previamente, anotando la hora exacta. Las muestras se congelan.
Estructura
Se determinarán los siguientes parámetros en cada muestra:
IV. RESULTADOS
Estructura
El informe debe constar de una carátula con los datos de la práctica y del equipo. En la segunda
página se escribe el objetivo de la práctica y la sección de Métodos, en donde se indican las
temperaturas de fermentación asignadas a cada equipo que se reporta. También debe incluirse en
esta sección cualquier actividad que haya sido realizada de manera diferente a lo indicado en el
protocolo.
Cuadros de resultados
Cuadros de resultados No. 1 y 2. Se presentan los resultados directos de los análisis de azúcares
reductores, de grado alcohólico y de conteo de levaduras viables y no viables de todas las muestra
y de cada condición de cultivo (T°C), indicando además las alícuotas y diluciones manejadas en
cada análisis.
Cuadro de resultados No. 3. Anotar los datos de la curva estándar que se realizó en el análisis de los
azúcares reductores, junto con la ecuación de la curva ajustada y el coeficiente de regresión.
Cuadros de resultados No. 4 y 5. Se anotan los datos calculados de cada condición de cultivo (T°C):
resultados de los conteos de levaduras viables y totales (viables + no-viables) en unidades de log
(# levaduras/ml) y ln (# levaduras/ml); concentración de azúcares reductores en % (p/v), y
contenido alcohólico, en grados Gay-Lussac (°G.L.) o en %, v/v.
91
Gráficas
Utilizando los datos calculados de los Cuadros de resultados No. 4 y 5 se realizarán las gráficas
indicadas en los siguientes incisos, con ayuda del programa de computación Excel, para graficar los
datos.
En cada figura se escribirá el titulo con el número correspondiente, los parámetros que se
presentan, el factor que se estudia (T°C), el microorganismo y el tipo de medio. Cada curva y
coordenada quedará bien identificado y con unidades.
Gráficas por cultivo. Se presentará una gráfica por cada cultivo realizado a diferente temperatura
(Figs. 1 y 2), indicando en abcisas el tiempo en h; y en las ordenadas, el contenido alcohólico en
°GL, la concentración de azúcares reductores en % (p/v), y el conteo de levaduras totales en log
(# m.o./ml), o ln (# m.o./ml).
Gráfica de crecimiento microbiano. Se presentarán en una sola figura (Fig. 3), las curvas de
crecimiento microbiano contra tiempo, de los cultivos provenientes de dos niveles de temperatura.
En esta gráfica se evaluará el efecto de la temperatura en cada fase de las curvas de crecimiento
microbiano.
Gráficas de producción de alcohol. En una sola figura (Fig. 5) se presentarán las curvas de
formación de alcohol de las dos fermentaciones, indicando en las abcisas el tiempo en h, y en las
ordenadas el contenido alcohólico en °G.L.
Estos se llevarán a cabo después de calcular las ecuaciones ajustadas de línea recta en cada cultivo,
utilizando solo los datos que corresponden a la fase exponencial de los Cuadros de resultados No.
4 y 5. Las ecuaciones ajustadas y los parámetros cinéticos que se indican a continuación se
escribirán en el Cuadro No. 6.
Tasas de rendimiento. Tomando los datos máximos y mínimos de los parámetros de cada cultivo,
se calcularán las tasas de rendimiento de producto con respecto a sustrato, de biomasa con respecto
a sustrato y de producto con respecto a biomasa.
92
Parámetros de velocidad del proceso. Con los datos ajustados de la fase exponencial de las
curvas de levaduras viables se calculará la velocidad específica de crecimiento microbiano. Con
datos obtenidos en el mismo intervalo de tiempo, se calcularán las velocidades específicas de
consumo de sustrato y de formación de producto (valores ajustados). En base a un análisis de la
gráfica de producción de alcohol se calcularán los valores de productividad máxima y productividad
total de etanol. Cada equipo calculará los parámetros de su cultivo, y se intercambiarán los
resultados con el equipo que trabajo a diferente temperatura.
V. DISCUSION
Analizando los resultados de los Cuadros No. 4 y 5 y de las Figs. 1 y 2 se pueden diferenciar las
fases de las curvas de crecimiento microbiano y las fases de producción, con especial énfasis en la
fase exponencial de crecimiento y la tropofase para etanol. En base a estas observaciones se decidirá
a qué modelo de formación de producto pertenece cada cultivo.
Las curvas de las Figs. 3 y 4 y los parámetros cinéticos calculados se analizarán para determinar el
efecto de la temperatura en las velocidades de consumo del substrato y formación de etanol, y sus
rendimientos. Se compararán los resultados experimentales con los de la bibliografía.
VI. CONCLUSIONES
Declare brevemente si se cumplieron los objetivos planteados al inicio de este protocolo y los
aspectos más importantes aprendidos en esta práctica
93
PRÁCTICA
DESARROLLO DE TRABAJOS DE INVESTIGACION
FORMATIVA)
94
FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS
USADOS EN LAS DIFERENTES PRÁCTICAS
96
BIBLIOGRAFÍA
CARPENTER, Philip. 1969. Microbiología. 2da Edición. Editorial Interamericana, S.H. México.
FARRAS, Ramón Parés J. “Bioquímica de los Microorganismos”. Ed. Reverté, S.A., España, 1997.
JAY, James M. “Microbiología Moderna de los Alimentos”, Ed. Acribia, S.A. España, 1992.
CAMACHO, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis
Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica del número mas
probable, detección de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli por el número mas
probable”
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. ed. Arlington, VA: AOAC.
Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed. 2006, pp 935-936
97
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiología Médica de Jawetz. Manual
Moderno 17a Edición 2002, pp 274-275
Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) “Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as
Quality and Safety Indicators”. In: Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
98