TÉCNICAS PARA LA SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE

IMPORTANCIA INDUSTRIAL
INTRODUCCIÓN
Desde tiempos prehistóricos, los humanos han explotado microorganismos para su propio
uso. Por medio de prueba y error, las personas desarrollaron cepas de microbios que se
utilizaron en la producción de bebidas, alimentos, textiles y antibióticos. Sin saber que los
microbios eran el agente responsable. Con el descubrimiento de que existían
microorganismos y el posterior desarrollo de métodos de cultivo, surgió la moderna
tecnología biológica o la biotecnología. El desarrollo ampliado del cribado microbiano y las
técnicas culturales nos han llevado a un punto donde los productos producidos por microbios
son una parte importante de nuestra vida. Si bien la producción de alimentos, bebidas y
textiles sigue siendo una gran parte de la industria de la biotecnología, el descubrimiento de
la penicilina en la primera mitad de este siglo revolucionó el análisis microbiano de otros
productos útiles, como antibióticos, enzimas y productos químicos especializados. Durante
los últimos 40-50 años, la detección de microorganismos industrialmente importantes ha
evolucionado de manera constante, aunque algo descuidada, a la vez que confía en las
técnicas subyacentes originales de enriquecimiento, cultivo puro, mutagénesis y trabajo de
parto. Los métodos clásicos todavía se usan ampliamente con modificaciones resultantes del
uso de análogos químicos, reacciones colorimétricas acopladas, tecnología de membrana,
técnicas inmunológicas y avances en instrumentación. Esta revisión se centra en el desarrollo
de técnicas de detección primaria durante las últimas dos décadas mediante modificaciones
de técnicas clásicas, junto con avances en la comprensión básica de la fisiología microbiana
y el crecimiento.
PERSPECTIVA HISTORICA
Si bien muchas personas han contribuido al avance de la microbiología, algunas han sido
particularmente instrumentales en el desarrollo de ideas y técnicas que son cruciales para la
microbiología industrial moderna. Los inicios de la microbiología industrial están arraigados
en el descubrimiento de Louis Pasteur de que los microorganismos eran responsables del
proceso fermentativo, lo que hacía que la teoría de la generación espontánea fuera inválida.
Pasteur continuó contribuyendo a la ciencia de la producción de alimentos y bebidas, incluido
el descubrimiento de que el calor podría usarse para matar microorganismos contaminantes.
Un contemporáneo de Pasteur, Robert Koch, desarrolló los primeros medios de cultivo
sólido, proporcionando así los medios para obtener fácilmente cultivos puros de bacterias.
Koch también proporcionó pruebas de que los microorganismos son los agentes causantes de
muchas enfermedades, estableciendo firmemente la teoría de los gérmenes de la enfermedad.
Los postulados de Koch con respecto al aislamiento de microorganismos causantes de
enfermedades y la reinfección posterior de un huésped han impactado enormemente no solo
en la microbiología médica, sino también en otras áreas. Este concepto de asociar actividades
específicas con cultivos puros de microorganismos es la base de la investigación
microbiológica moderna. Paul Ehrlich, uno de los compañeros de trabajo de Koch, utilizó
este concepto al realizar una de las primeras búsquedas sistemáticas de selección de
sustancias antimicrobianas específicas.
Ninguna discusión sobre la diversidad microbiana y la selección de organismos específicos
estaría completa sin mencionar las contribuciones de la Escuela de Delft y hombres como
Martinis W. Beijerinck y Albert J. Kluyver. Nuestra comprensión del papel del microbio en
la naturaleza comenzó con la introducción de Beijerinck del concepto de cultura de
enriquecimiento. El concepto de bioquímica comparativa de Kluyver abrió la puerta a la
comprensión de la relación entre todos los seres vivos e inició los primeros estudios
verdaderos sobre fisiología microbiana. Estos conceptos han afectado profundamente la
ciencia de la microbiología, particularmente en relación con el aislamiento de bacterias que
ocupan nichos específicos en el medio ambiente. El principio de Martinis Beijerinck de la
cultura de enriquecimiento permitió el aislamiento de microbios con propiedades metabólicas
específicas. Otros, incluido Sergei Winogradsky, difundieron y utilizaron sus ideas, lo que
resultó en una explosión de información sobre el papel del microbio en las conversiones
geoquímicas en el medio ambiente. El concepto y la utilización de la cultura de
enriquecimiento continúan creciendo y ahora es la piedra angular de muchos programas
modernos de detección microbiológica. Si bien algunos programas pueden incluir la
selección simple de colecciones de cultivos existentes, la cultura de enriquecimiento ha
demostrado ser una técnica confiable para el aislamiento de microbios que presentan rasgos
específicos. Por lo general, cuanto más estricto sea el requisito, más exitoso será el
enriquecimiento para eliminar los organismos no objetivo.
MICROORGANISMOS Y PRODUCTOS
Los microorganismos se utilizan para producir cientos de productos comerciales valorados
en decenas de miles de millones de dólares en todo el mundo. La tabla I muestra una muestra
de los tipos de productos fabricados por medios microbiológicos. Los productos producidos
por microbios naturales tienen la ventaja de ser considerados "naturales" por sí mismos y,
por lo tanto, son más fáciles de aprobar para la comercialización que los organismos
manipulados genéticamente. Por esta razón, la mayoría de las industrias favorecen la
selección de microorganismos naturales para fines de producción, lo que hace que un
programa de detección viable y eficiente sea una necesidad. La diversidad de
microorganismos mantiene la promesa de muchas tecnologías nuevas, incluidos los remedios
para disminuir la contaminación ambiental, que podrían afectar sustancialmente nuestro nivel
de vida. La creencia de que el microbio tiene la solución a muchos problemas se ejemplifica
en las "leyes de microbiología aplicada" de Perlman, en las que afirma que los
microorganismos son capaces de cualquier tarea y que "Si cuidas a tus amigos microbianos,
ellos cuidarán tu futuro".
ESTRATEGIA DE SELECCIÓN
Y TÉCNICAS
La selección de microorganismos
industriales se aborda
sistemáticamente mediante una
estrategia similar a la que se
muestra en la Figura 1. Los
elementos clave de una estrategia
de selección son: (a) definir la
actividad de interés; (b) encuestar a
los miembros conocidos con esa
actividad; (c) desarrollar
protocolos de enriquecimiento y
selección; (d) identificar fuentes de
nuevos microorganismos; y (e)
desarrollo de metodología de
cribado. La selección primaria es
predominantemente un esfuerzo
cualitativo en el que una gran
población de organismos se analiza
de forma directa o indirecta para un
tipo específico de actividad, la
selección secundaria es tanto
cualitativa como cuantitativa en
que su objetivo es determinar la
actividad precisa de los
organismos, para verificar
producción o degradación de
compuestos, y para evaluar el
potencial de producción de los
organismos identificados en la
pantalla primaria. Si bien se han
desarrollado nuevas técnicas para
la detección de microbios
específicos.
.
 El cribado secundario, es. tanto
cualitativo como cuantitativo, ya
que su objetivo es determinar la
actividad precisa de los organismos,
verificar la producción o
degradación de los compuestos y
evaluar el potencial de producción
de los organismos identificados en la
pantalla primaria.
Si bien se han desarrollado nuevas
técnicas para detectar microbios
específicos durante las últimas dos
décadas, la mayoría son
modificaciones de las técnicas
clásicas, como el cultivo de
enriquecimiento y los ensayos
enzimáticos o químicos asociados a
las reacciones colorimétricas. Las
técnicas analíticas altamente
sofisticadas que utilizan
cromatografía de gases y
espectrometría de masas también
han evolucionado, y aunque muchas
siguen siendo lentas, engorrosas y
caras, son las únicas técnicas
disponibles en algunos casos para la
detección de actividades
metabólicas específicas. A
continuación se analizan algunas de
las técnicas más importantes que se
utilizan, su evolución y su potencial para el futuro. Las asignaciones de espacio impiden la
cita de todas las técnicas en uso, pero hemos intentado dar una visión general de los conceptos
y técnicas representativos.
Fuentes de microorganismos
La tendencia más prometedora en la cultura de enriquecimiento es quizás el movimiento
hacia la investigación de entornos novedosos. En lugar de enriquecer a partir de muestras
anónimas de suelo o agua, los investigadores buscan cada vez más los enriquecimientos
naturales en el medio ambiente, como las fuentes termales, el hielo de los glaciares o las
instalaciones de tratamiento de desechos industriales, donde las poblaciones de
microorganismos abundan debido a la presión física o química. . Estos entornos proporcionan
un enriquecimiento continuo y una selección natural de organismos adaptados a condiciones
específicas. Cheetam especula que probablemente <1% de los microorganismos de la Tierra
han sido identificados y caracterizados. Por lo tanto, una amplia gama de organismos
potencialmente útiles probablemente todavía esperan ser descubiertos. En nuestra
experiencia, cuando se muestrea un nuevo entorno utilizando múltiples variaciones de
medios de cultivo y enriquecimientos, los nuevos organismos se aíslan con mayor frecuencia.
Nuestro laboratorio y otros han explorado el Parque Nacional Yellowstone durante varios
años en busca de microorganismos únicos. Aunque esta área ha sido estudiada por otros
grupos con gran detalle (4--6, 11), hemos aislado muchos microorganismos previamente
desconocidos, incluyendo termófilos, acidófilos y alcalófilos, muchos de los cuales producen
enzimas útiles y otros productos. Uno de estos organismos es una bacteria grampositiva con
forma de espiral que puede representar un nuevo género. Muchos ambientes novedosos como
Yellowstone esperan su examen. Nuestro laboratorio fue uno de los primeros en investigar
la diversidad microbiana de cuevas habitadas por murciélagos en busca de microorganismos
con potencial industrial. Los sitios como Bracken Cave en el centro-sur de Texas ofrecen un
ejemplo único de dicho ecosistema. Veinte millones de murciélagos mexicanos de cola libre
(Tadarida brasiliensis) utilizan este lugar como cueva de viveros cada verano. Estos
murciélagos comen aproximadamente 250,000 libras de insectos cada noche y han estado
depositando guano durante decenas de miles de años, lo que resulta en un suelo de cuevas
rico en nutrientes de 10 metros de profundidad. Este sitio es rico en microorganismos
alcalofílicos, oxidantes de amoniaco y quitinasas.
Uno de nuestros proyectos recientes involucró la búsqueda de microorganismos que exhiben
actividad "biológica del hielo", como la actividad de nucleación del hielo o anticongelante.
En este esfuerzo, viajamos a los Altos Andes de Perú y Bolivia, donde el ambiente se somete
a los extremos diarios de congelación y descongelación de la noche al día, lo que proporciona
un enriquecimiento natural para los organismos con mecanismos de protección contra la
congelación y descongelación. Este proyecto ha resultado en el aislamiento de un grupo
diverso de microorganismos que ahora se someten a una evaluación secundaria para detectar
nuevas capacidades de congelación y actividad anticongelante. Las fuentes de
enriquecimiento natural no siempre son tan exóticas como las espectaculares zonas termales
de Yellowstone o los Altos Andes. Muchos investigadores, incluidos nosotros, hemos aislado
con éxito organismos objetivo de las instalaciones de tratamiento de residuos industriales (9,
18). Los desechos de las instalaciones de procesamiento de papas y frutas han producido
organismos que producen amilasas con potencial industrial (Lauff et al utilizaron el inóculo
de una instalación que trata los residuos fotográficos para enriquecer y aislar un cultivo puro
capaz de degradar el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), un componente de los residuos
fotográficos. Muchas de estas instalaciones han estado en funcionamiento durante décadas y
proporcionan un enriquecimiento continuo para los organismos capaces de producir muchas
enzimas útiles y poseer capacidades degradativas.
Enriquecimiento y aislamiento
La cultura de enriquecimiento como concepto no ha variado mucho desde los días de
Beijerinck y Winogradsky. Sin embargo, las variaciones en su uso han evolucionado en la
detección de microorganismos industrialmente importantes. En esencia, el enriquecimiento
es el proceso de proporcionar un entorno adecuado para el crecimiento y la reproducción de
un microbio específico mientras es inhibidor o letal para los organismos no objetivo. La
formulación de medios de crecimiento para la selección de rasgos deseados se emplea de
manera más prominente. Estos incluyen el uso de compuestos particulares como fuentes
únicas de carbono cuando se analiza la utilización o degradación de dichos compuestos, los
inhibidores para bloquear vías bioquímicas específicas, los ajustes de pH, etc. Uno de los
enfoques más directos para el aislamiento de nuevos organismos es el uso de un Fuente
específica de carbono y / o energía para la selección de organismos específicos para su
utilización de estos compuestos. Este método ha producido organismos capaces de utilizar o
degradar compuestos tales como hidrocarburos clorados (42, 54, 59), benceno (56), anilina
(2) y otros compuestos recalcitrantes. Como se mencionó anteriormente, nuestro propio
laboratorio utilizó la misma técnica para el aislamiento de una nueva Agrobacterium sp.
capaz de degradar el EDTA férrico en concentraciones tan altas como 100 mM (33). La EDT
A se utiliza como quelante de metales en muchos productos industriales y, debido a su
recalcitación, representa una importante afluencia de la demanda química de oxígeno como
parte del efluente de residuos industriales. Los estudios iniciales muestran que este organismo
también tiene potencial en el tratamiento de material de desecho nuclear al degradar el EDT
A unido a los radionúclidos, inhibiendo así la migración de estos compuestos desde los sitios
de almacenamiento.
Aunque el recalcitrance de la EDT A dificultó el aislamiento (solo se obtuvo un cultivo
positivo de más de 100 enriquecimientos), Shirai (56) ilustra la diversidad de
microorganismos y el potencial del cultivo de enriquecimiento al utilizar benceno como única
fuente de carbono en un enriquecimiento para el benceno. organismos De 150 muestras
tomadas de campos de arroz, huertas y bosques, Shirai observó un crecimiento microbiano
en 102 enriquecimientos y aisló 95 cepas de organismos que asimilan el benceno. Uno de los
problemas inherentes con el enriquecimiento y la selección de la utilización de un compuesto
como única fuente de carbono es el enriquecimiento concomitante de bacterias fijadoras de
dióxido de carbono. Strotmann y Roschenthaler (59) evitaron este problema al desarrollar un
ensayo que explotó la liberación de protones durante la degradación de hidrocarburos
clorados por bacterias. Al incorporar el indicador de pH, el bromotimol azul en el medio de
crecimiento, monitorearon la liberación de protones y la caída del pH para identificar la
degradación. Mientras que algunos organismos se aíslan fácilmente en cultivos discontinuos,
otros pueden requerir una selección más intensiva. A menudo, una población de microbios
puede contener un número relativamente pequeño de organismos con el genotipo objetivo,
los organismos pueden exhibir una expresión baja de una enzima en particular, o los
organismos pueden ser inhibidos por el compuesto que uno está buscando degradar. En tales
casos, los ajustes graduales a un cultivo quimiostático o continuo se pueden usar para
enriquecer lentamente un organismo específico. De esta manera, uno puede seleccionar
organismos en pequeños números y / o explotar mutaciones en la población general. Este
enriquecimiento progresivo es tedioso y puede requerir meses de cultivo continuo, pero
puede ser la técnica más efectiva en ciertos casos. Los investigadores han utilizado con éxito
el cultivo quimiostático para seleccionar un microbio específico de una población mixta para
aislar microbios capaces de crecer en ciertos herbicidas (29) y alcanos halogenados.
La manipulación del pH ha demostrado ser útil en el aislamiento de organismos capaces de
crecer en extremos de pH. Los medios alcalinos (pH <10) se emplean rutinariamente (31, 52,
58) para el aislamiento de bacterias alcalofílicas. Los organismos capaces de producir
enzimas activas alcalinas tienen un enorme potencial industrial en áreas como la formulación
de detergentes para ropa, la producción de pasta y papel y el procesamiento de alimentos (23,
31). Nuestro laboratorio utilizó un enriquecimiento alcalino (pH 10.5) para aislar un Bacillus
sp. de un manantial térmico que produce una proteasa única que exhibe una alta actividad
específica contra la elastina y otras proteínas insolubles (M. Fiske, D. B. Steele y S.
Middlebrook, en preparación). Otros investigadores aislaron con éxito una amplia variedad
de organismos alcalofílicos de una variedad de entornos que producen muchas enzimas
activas y estables, incluidas las proteasas (12, 62), las amilasas (22), las lipasas (63), las
celulasas (16,24) y las xilanasas. (21, 26). El aislamiento de los acidófilos ha logrado el
mismo éxito, descubriendo organismos capaces de crecer y produciendo enzimas activas a
bajos niveles de pH.

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Una comprensión incompleta de los requisitos metabólicos y fisiológicos puede impedir en
gran medida el progreso al diseñar procedimientos de detección. En presencia de un sistema
antiportador Na + IH +, el crecimiento de ciertos alcalofilos obligados depende de la
presencia de sodio en el medio de crecimiento (31, 38). Requisitos similares pueden ser
necesarios para el crecimiento de otros tipos de organismos cuando se utilizan fuentes de
energía o carbono particulares. La falta de calcio requerido para la estabilidad enzimática de
ciertas proteasas podría oscurecer los cultivos positivos durante el enriquecimiento y el
posterior cribado. Diferentes géneros de organismos pueden predominar en los
enriquecimientos del mismo entorno utilizando el mismo medio con el mismo pH,
simplemente cambiando el sistema de tamponamiento (D. B. Steele, datos no publicados).
Tales diferencias aparentemente menores subrayan la importancia de comprender los
mecanismos fisiológicos que operan en estos organismos. De hecho, el avance del
conocimiento en el área de la fisiología microbiana es fundamental para la mejora futura y el
éxito de la tecnología de enriquecimiento cultural (9, 41, 46, 48). La investigación sobre
produc :: m de L-fenilalanina por Hummel et al (25) ejemplifica cómo el conocimiento de la
fisiología microbiana puede ayudar a un programa de detección. Trabajos previos habían
establecido que el ácido acetamidocinámico (ACA) era un intermediario en la síntesis
química de la fenilalanina; por lo tanto, se esperaba que una acilasa de ACA se pudiera
utilizar en un esquema de producción alternativo. El uso de ACA como único
enriquecimiento de la fuente de carbono resultó infructuoso. Una doble pantalla que produjo
organismos capaces de crecer en ACA y L-fenilalanina (que indica catabolismo del
compuesto aromático a través de fenilpiruvato) tuvo éxito en el aislamiento de varios
Brevibacterium sp. Eso produjo la ACA-acilasa deseada

Los parámetros físicos, como la temperatura, pueden manipularse para el aislamiento de los
psicrófilos y los termófilos. Las enzimas que son estables y activas a temperaturas extremas
tienen una gran demanda de diversos procesos industriales. Las enzimas termoestables son
útiles en varios procesos de conversión utilizados para el procesamiento de frutas y verduras,
el procesamiento de almidón y la reducción estereoespecífica de alcoholes (9). Una
penicilina-acilasa termoactiva inmovilizada se produce actualmente a gran escala (66). Un
problema particular con el aislamiento y cultivo de termófilos es que el agar es un agente de
solidificación deficiente a altas temperaturas (70 ° C). El desarrollo de nuevos agentes
solidificantes como la goma de goma producida por Pseudomonas, Gelrite®, está facilitando
el aislamiento de dichos organismos
Quizás el mayor avance en la técnica de enriquecimiento sea el progreso en la comprensión
de varios rasgos metabólicos de los microorganismos. A medida que se aprende más sobre
vías específicas de degradación, por ejemplo, los microbios pueden seleccionarse utilizando
ensayos enzimáticos específicos, o los enriquecimientos pueden modificarse para aprovechar
el conocimiento específico de vías bioquímicas o mecanismos energéticos. La comprensión
de la vida bajo nutrientes bajos y otras condiciones difíciles está avanzando (19, 32, 70). El
desarrollo de los llamados medios de inanición y otros avances han permitido el aislamiento
de nuevas y novedosas bacterias de ambientes extremos como los lagos oligotróficos de la
Antártida (40). Las técnicas innovadoras de cultivo de enriquecimiento incluyen la
combinación de todos los elementos posibles para crear el entorno más estricto para la
selección del microorganismo deseado.

Selección primaria

Los ensayos para seleccionar una actividad particular desempeñan un papel importante en la
selección de microorganismos específicos. Los aspectos a considerar cuando se selecciona
un ensayo de cribado son la simplicidad, el costo, la velocidad y la especificidad. Este es a
menudo el paso que determinará si un programa de detección falla o tiene éxito. La mayoría
de los métodos de ensayo se pueden clasificar como directos (identificación específica del
producto objetivo) o indirectos, como la detección de enzimas a través de una reacción
colorimétrica o fluorimétrica acoplada que resulta de la actividad enzimática. Los avances en
la comprensión de la fisiología microbiana junto con el desarrollo de nuevos sustratos de
enzimas orogénicas cromogénicas y de gripe han mejorado los ensayos indirectos, mientras
que los avances en instrumentación analítica son responsables de la mayoría de las mejoras
para la detección directa de compuestos específicos

ENSAYOS INDIRECTOS
Los principios básicos de simplicidad y especificidad en el desarrollo de un ensayo apropiado
se ejemplifican mediante ensayos de selección primarios, tales como los empleados para
enzimas hidrolíticas tales como proteasas y amilasas. Un medio de placa de agar con el
compuesto sujeto incluido se usa para el crecimiento del organismo. Se utiliza una zona
transparente hidrolítica (es decir, la hidrólisis de la caseína) o una zona mejorada por alguna
reacción colorimétrica (es decir, la reacción del almidón y el yodo para producir un color
púrpura) para determinar la actividad cualitativa. Se han utilizado procedimientos similares
con gran éxito en el aislamiento y la detección de organismos que producen enzimas
industriales. En estos ensayos, manipular parámetros tales como la temperatura, el pH e
incluso el efecto de los inhibidores es simple. En consecuencia, la detección puede realizarse
de manera rápida y económica en muchos organismos. En algunos casos, la especificidad o
sensibilidad de este tipo de ensayo es inadecuada. La detección de lipasa presenta un
problema particular debido a la aparente falta de especificidad en lipasas conocidas y
problemas con la distinción entre lipasas verdaderas y esterasas. A menudo, se utilizó
tributirina como un sustrato de ensayo, aunque no es específico para la actividad de la lipasa,
simplemente porque era más fácil de dispersar en agua que los sustratos más deseables, como
la trioleína. Tweens también se utilizan como sustratos. Algunos ensayos de lipasa dependen
de la reacción de los ácidos grasos liberados con compuestos de calcio para formar un
precipitado; sin embargo, si el organismo también puede utilizar los ácidos grasos libres, se
producen resultados falsos negativos. Mientras los investigadores continúan desarrollando
nuevas combinaciones de sustratos y colorantes (51), la pantalla de la placa de lipasa sigue
siendo un problema.
Se analizan muchas otras enzimas con técnicas similares que examinan la actividad
hidrolítica en placas de agar, a menudo combinadas con manchas, incluidas las celulasas (10)
y las uricasas (34). Una vez más, se debe tener cuidado al diseñar un ensayo de este tipo. Un
ejemplo es el uso generalizado de congo-red para teñir celulosa y varias hemicelulosas para
determinar la degradación de estos compuestos. Sharma et al (55) encontraron que algunos
componentes menores de los medios, principalmente ciertos cloruros metálicos, podrían
interferir con el ensayo y generar falsos negativos o falsos positivos. De manera similar,
Zitomer y Eveleigh (68) encontraron que la tinción con yodo de celulosa produjo actividad
artificial debido a la contaminación del almidón en agar comercial. Estos ejemplos
ejemplifican la necesidad de un escrutinio cuidadoso de los mecanismos involucrados en los
ensayos particulares y de la precaución y el control apropiados que se deben usar en la
adaptación de un ensayo a una nueva situación. En una luz más positiva, recientemente se
han desarrollado algunos nuevos métodos de cribado de placas. Wikstrom (67) desarrolló
una pantalla de proteasa en la que se pulveriza una capa fina del sustrato sobre la superficie
interna de una placa de Petri de plástico, que luego se cubre con el medio de crecimiento
apropiado. Después del crecimiento, se retira el agar y la actividad de la proteasa se indica
por el aumento de la humectabilidad del plato de plástico. Las principales ventajas de este
método son la cantidad reducida de sustrato necesario, que resulta en un costo reducido y la
capacidad de usar cualquier medio de crecimiento requerido. La incompatibilidad de algunos
sustratos con ciertos medios de crecimiento hace que esta técnica sea particularmente útil.
Las reacciones colorimétricas o fluorescentes a menudo proporcionan un medio simple y
eficaz para identificar productos microbianos tanto en ensayos en placa como en análisis de
caldos de fermentación. Los ensayos se están utilizando ampliamente para identificar
microbios que producen enzimas como la glucosa-2-oxidasa que son capaces de generar
peróxido de hidrógeno a través de sus reacciones catalizadas con una producción de color
posterior de una reacción de peroxidasa acoplada (Patente de EE. UU. N. ° 4.568.638:
Nabisco Brands, Inc. , Parsippany, NJ). O'Connor & Somers (44) desarrollaron un método
para la detección de inhibidores de enzimas que convierten la angiotensina en un ensayo en
placa en el que se aplicó el inhibidor putativo a una capa que contiene enzimas y luego se
cubrió con una capa de agar que contiene el sustrato p-nitrobencil-oxicarbonilglicil (S-4-
nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazol) -L-cisteinil-glicina. La posterior inundación de la placa con
NaOH generó una reacción de color que se podía leer y fotografiar. Este sistema también era
adaptable a un ensayo espectrofotométrico cuantitativo para analizar caldos de fermentación.
Baker (3) explotó una diferencia en la intensidad de fluorescencia del ácido 6-
aminopenicilínico (6-APA) con fluorescamina a pH 4 para desarrollar una técnica de
detección mejorada para la penicilina amidasa. Antes de este trabajo, tales reacciones se
habían utilizado a pH 7; sin embargo, las fuertes reacciones de los aminoácidos y polipéptidos
a pH neutro a menudo interfirieron con el ensayo. El nuevo procedimiento demostró ser más
sensible y más sencillo de realizar que los ensayos anteriores. Cuando se buscan zonas de
actividad en una placa de agar, el grosor del sustrato puede reducir la sensibilidad. Una
técnica comúnmente utilizada para superar esto es la técnica de doble capa, en la cual una
capa delgada de sustrato se superpone sobre un medio de crecimiento solidificado con agar.
Aunque este desarrollo no es particularmente reciente, las variaciones de este método se han
utilizado ampliamente para evaluar las actividades enzimáticas, así como para la producción
de productos químicos especializados, como la lisina.
Las modificaciones de las técnicas de superposición incluyen el uso de membranas
microporosas en la separación de capas y en la separación del cultivo bacteriano del sustrato.
En 1983, se concedió una patente a Eberhard Breuker (Patente de Estados Unidos Nº
4.421.849) para un dispositivo en el que las bacterias incrustadas en una capa de agar se
separaron de una capa de reacción basada en agar. Los metabolitos de las bacterias podrían
difundirse a través de la barrera de la membrana y las reacciones subsiguientes podrían
notarse en la capa inferior. Muchos investigadores han desarrollado variaciones de esta
técnica. Miles Laboratories, Inc. (Elkhart, Indiana) presentó una solicitud de patente europea
(número 83110397.3) en 1983 para una técnica similar en la que se cultivaron bacterias sobre
una membrana que cubría un medio nutriente de agar con compuestos indicadores. Esta
modificación particular consistió en lisar las bacterias in situ sobre la membrana, permitiendo
la detección de la producción de enzimas no extracelulares.
BIO-ENSAYOS
Los bioensayos se desarrollan continuamente para la selección de organismos con actividad
antibiótica y antitumoral. Omura (46) y White (65) han contribuido con excelentes revisiones
actuales de este material. De interés en estas áreas es el nuevo enfoque en objetivos
específicos de actividad, como la síntesis de la pared celular (45) y las actividades
metabólicas o biosintéticas (46). Rake y cols. (49) describen un ejemplo de un enfoque de
este tipo en el que los investigadores emplearon un mimético del receptor de la pared celular
para detectar antibióticos glicopéptidos con una alta eficiencia. Se detectaron nuevos
compuestos a una tasa de 1 en cada 320 organismos seleccionados mediante esta técnica, en
oposición a la estimación de detección habitual de 10,000-100,000 organismos para un nuevo
compuesto. Otra área de la aplicación novedosa de los bioensayos es la detección de agentes
insecticidas. Dicha detección ha producido con éxito insecticidas microbianos como
nikkomycins (15), milbemycins (61), tetranactin (1) y avermectins (8). Fabre et al (13)
describieron un enfoque doble en el que la actividad antibacteriana se acopla con la actividad
insecticida para reducir el número de organismos seleccionados y eliminar la detección de
agentes antimicrobianos tóxicos y conocidos que poseen actividad insecticida.
Los investigadores de Boeringer Mannheim recibieron una patente para un método de
detección desarrollado para la detección de la actividad de la acéfase cefalosporina C. En el
ensayo, se usa un organismo indicador que es sensible al ácido 7-aminocefalosporánico pero
resistente a la cefalosporina C. El organismo indicador se incuba en un medio nutriente de
agar que contiene una cantidad tolerable de cefalosporina C y el caldo de prueba del
organismo que se está examinando. La producción de cefalosporina C acilasa produce la
inhibición del organismo indicador. Meevootisom et al (39) idearon un método similar en el
que las bacterias productoras de penicilina acilasa se seleccionaron utilizando un Serratia
marcescens sensible al ácido 6aminopenicilánico pero resistente a la bencilpenicilina. La
detección de la producción de biosurfactantes ha sido durante mucho tiempo un proceso
tedioso que involucra la medición de la tensión superficial de los caldos de cultivo. Tras la
observación de que la surfactina lipopeptídica de Bacillus subtilis rompería los eritrocitos,
Mulligan et al (43) desarrollaron un ensayo que empleaba placas de agar sanguíneo para el
cribado de la producción de surfactante por microorganismos. Aunque se produjeron algunos
falsos positivos debido a los productores de hemolisina, el ensayo redujo en gran medida el
número de organismos que se verificarían mediante la reducción de la tensión superficial.
Ensayos directos
Si bien esta revisión se ocupa de las técnicas de detección primaria, algunos comentarios
están justificados en relación con la selección secundaria. La selección secundaria es un
proceso importante en la selección de microorganismos industriales. Durante este proceso,
uno debe eliminar los organismos falsos negativos y falsos positivos rápidamente antes de
que se realicen los esfuerzos más costosos de la optimización de la producción y la
ampliación. En este sentido, los avances en instrumentación analítica tienen el mayor
impacto. Los avances progresivos en el desarrollo de microinstrumentos analíticos y, durante
los últimos 20 años, afectan profundamente la capacidad de la persona para detectar
compuestos específicos. La microinstrumentación es útil tanto en la selección secundaria
como en la selección primaria cuando no se dispone de técnicas más simples. La
instrumentación como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la cromatografía
de gases (GC), la espectrometría de masas (MS), la espectrometría de resonancia magnética
nuclear (RMN) y otras permiten una detección más rápida, selectiva y altamente sensible de
productos metabólicos. Un ejemplo es el uso de HPLC de Fiedler junto con un detector de
matriz de fotodiodos para detectar nuevos metabolitos microbianos (14). Esta técnica
compara los espectros UV-visibles de todos los picos del perfil de elución de HPLC en un
solo análisis cromatográfico, produciendo una gran cantidad de información útil, incluido el
descubrimiento de Fiedler de seis nikkomycins potencialmente nuevas. Los detectores de
plasma acoplados inductivamente, junto con la cromatografía iónica y los nebulizadores
ultrasónicos, ahora permiten rutinariamente la detección de varios metales en el rango de 5-
10 partes por billón. Este equipo y muchos otros tipos se combinan con dispositivos de
muestreo automático más avanzados e "más inteligentes" que proporcionan un análisis rápido
las 24 horas del día. La tecnología de automuestreo ha evolucionado en algunos casos a
sistemas robóticos más avanzados que no solo muestrean, sino que también realizan análisis
de enzimas, procedimientos de tinción y otras tareas rutinarias sin descanso. Este tipo de
tecnología es muy eficiente y productivo en casos en los que se deben analizar grandes
cantidades de muestras.
FUTURO POTENCIAL Y NECESIDADES.
El emocionante progreso que se está logrando en las áreas de proteínas e ingeniería genética
tendrá un impacto sustancial en los programas de detección en el futuro. Por ahora, la
ingeniería genética y la ingeniería de proteínas tienen un mayor impacto en la microbiología
industrial en el nivel de optimización del producto. Las proteínas microbianas, como la
subtilisina proteasa alcalina, se han diseñado para aumentar la estabilidad (7,69) y los
cambios en la especificidad del sustrato (64). Takagi et al (60) utilizaron con éxito la
mutagénesis dirigida al sitio para desarrollar una actividad mejorada en una proteasa de
subtilisina. Muchas corporaciones están trabajando extensamente para desarrollar
promotores genéticos mejorados para aumentar la expresión de genes y posteriormente
aumentar la formación de productos. Un ejemplo del tipo de técnicas que pueden resultar
útiles para el cribado es la utilización de hibridación de colonias por Sayler et al (53) para
detectar secuencias de ADN específicas para las vías hidrocarbono-catabólicas. Se puede
utilizar una pantalla similar basada en la hibridación del ADN extraído de muestras
ambientales (dot blot) para buscar microbios con secuencias de ADN particulares (20). Los
nuevos desarrollos con reacciones en cadena de la polimerasa deberían aumentar la
sensibilidad de tales técnicas en el futuro. El potencial del análisis microbiano para productos
industriales reside en la tremenda diversidad microbiana de la tierra. Los organismos están
allí; Debemos desarrollar las técnicas para seleccionarlas y aislarlas. El mayor impedimento
para esto es la falta de programas de investigación dedicados al desarrollo de técnicas de
detección. Este es un problema multidisciplinario que requiere la experiencia de químicos e
ingenieros, así como microbiólogos.
RESUMEN
La selección de microorganismos para la producción de productos útiles sigue siendo un
aspecto importante de la biotecnología. Aunque los avances en instrumentación, genética y
fisiología microbiana están teniendo un impacto, los programas de detección aún se basan
principalmente en las llamadas técnicas clásicas de enriquecimiento y mutagénesis. Un área
que necesita fortalecimiento es el avance del conocimiento en fisiología microbiana.
Encuestas recientes indican que los líderes de la industria ven a los fisiólogos microbianos
entrenados como el factor limitante en el desarrollo de la biotecnología en la próxima década.
El mayor impedimento para el desarrollo de nuevas técnicas de detección es la falta irónica
de programas dirigidos específicamente al desarrollo de nuevas técnicas. Se pone demasiado
énfasis en el uso de las técnicas disponibles y en la mano de obra y en la detección de un gran
número de organismos para producir productos novedosos. En este sentido, los japoneses son
la excepción y han demostrado que el establecimiento de nuevos programas vale el costo y
el esfuerzo. Sin duda, son los líderes mundiales en el desarrollo de técnicas de detección y,
en consecuencia, en el descubrimiento de nuevos productos. El aislamiento de los microbios
de ambientes nuevos y extremos es tremendamente prometedor en dos áreas. Primero, como
lo afirman Omura (46) y otros (9, 48, 65), los nuevos organismos producirán nuevos
productos. En segundo lugar, tales organismos sirven como modelos para la comprensión de
la estructura y la función que facilitarán la manipulación genética de los organismos y
mejorarán nuestra capacidad para diseñar nuevas enzimas. Esperamos que estos avances
permitan que la ingeniería genética y de proteínas tengan un mayor impacto en los programas
y técnicas de detección en el futuro. La tierra alberga una gran cantidad de entornos variados
y únicos, desde extremos naturales como desiertos de gran altitud y fuentes termales, hasta
entornos artificiales como las instalaciones de tratamiento de desechos industriales, de los
cuales, con los métodos y técnicas apropiados, podemos aislarlos. y evaluar nuevos productos
potenciales.