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ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL CHIMBORAZO

ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS

ING. BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

BIOTECNOLOGIA AMBIENTAL

INFORME DE PRACTICA #1: DETERMINACION DE MICROORGANISMOS


DE UNA MUESTRA DE AGUA.

Nombres: Códigos:

Amanda Mendoza 2797

Steeven Neto 2583

Nicolás Matamoros 2590

Fecha: 28 de Mayo de 2019

1. OBJETIVO GENERAL

-Determinar los microorganismos presentes en una muestra de agua tomada del rio
Chibunga a la altura del parque ecológico.

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

-Aislar los microorganismos presentes tomadas en la muestra de agua a diferentes


diluciones.

-Aplicar presiones selectivas de PCA NaCl a 36°C a los organismos anteriormente


aislados.

-Intensificar la presión selectiva de NaCl para poder determinar la cantidad de


microorganismos extremo-tolerantes y extremó filos.

-Comparar los resultados obtenidos con muestras del mismo rio a condiciones de
temperatura diferentes y con un diferente tramo de rio.

3. MARCO TEÓRICO

RIO CHIBUNGA
El río Chibunga nace de vertientes ubicadas en las faldas del Chimborazo y desciende
por los páramos de El Arenal hasta llegar a zonas agrícolas en el sector de la parroquia
San Juan, como Las Caleras y Shobol, entre otras.
El Chibunga recibe las descargas de las aguas servidas sin ningún tipo de tratamiento de
las ciudades y poblados que están en sus riberas. Además, una investigación del Centro
de Estudios y Acción Social (CEAS) de la Diócesis de Riobamba detectó que los poblados
asentados a lo largo de 20 km de recorrido arrojan basura al cauce. La descarga de agua
residual, especialmente la que viene de lubricadoras acompañada de desechos de
hidrocarburos, se ha convertido en otro factor de gran contaminación del Chibunga.
Según la normativa vigente, el límite permisible que ayude a mantener la vida natural es
de 200 puntos de demanda bioquímica de oxígeno (DBO) por coliformes fecales. Pero en
el Chibunga hay entre 2.000 y 10.000, lo que ubica a ese río como de mala calidad de
acuerdo con los estudios de agua efectuados por la Central Ecuatoriana de Servicios
Agrícolas (CESA) y el Instituto Nacional de Meteorología e Hidrología (Inamhi).
TECNICA DE MUESTREO
La muestra se tomará lo más lejos posible de la orilla, procurando no remover el fondo y
evitando los remansos o zonas de estancamiento.
Para tomar una muestra del agua de un lago o de un río se sujetará el frasco por el fondo
en posición invertida, sumergiéndolo completamente y dándole la vuelta en sentido
contrario a la corriente (río).
El volumen para tomar debe ser el adecuado para que en una sola muestra se puedan
efectuar simultáneamente la totalidad de los análisis microbiológicos y estará en función
de la técnica analítica a utilizar.
Para los análisis que utilicen la técnica del NMP se tomarán, como mínimo, 250 ml y para
los que empleen la de membranas filtrantes, como mínimo, 500 ml.
Antes de la toma de la muestra se marcará el frasco mediante rotulador resistente al agua,
con una referencia que permita su identificación.
MÉTODOS DE SIEMBRA
Sembrar: Es el acto de colocar el material bacteriológico en el medio de cultivo para
promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente multiplicación. El resultado de
una siembra se llama: Cultivo
Las siembras pueden ser:
1.- Primarias: cuando el material es inoculado en los medios por primera vez.
2.- Secundarias: cuando el material a inocular procede de una siembra primaria.
Métodos Generales:
1) Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo
simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada
con el material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados.

 Medio de cultivo: Liquido


 Instrumento: Asa
 Finalidad: poner la bacteria en suspensión.
2) Siembra por estrías en superficie: Se siembra el material en la superficie del agar
inclinado en un tubo de ensayo, allí se extiende por toda la superficie con el asa
bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo
estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más
profunda de la superficie inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca
del tubo.
 Medio de cultivo: agar base inclinado
 Instrumento: asa o aguja bacteriológica.

3) Siembra por estría por agotamiento: Con éste procedimiento se puede conseguir
una buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio
de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente
esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie
del medio formando estrías.
 Medio de cultivo: solido en placa de Petri
 Instrumento. Asa
 Finalidad. Obtener colonias aisladas

4) Por picadura o punción: Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y
se lo introduce en el tubo, con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo,
formando un canal de punción, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este método se
utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias.

 Medio de cultivo: Semisólido


 Instrumento: aguja bacteriológica
 Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias
5) Siembra en TSI: (Por picadura y estrías en superficie): el TSI (Triple Sugar Iron) es
un medio que contiene glucosa, sacarosa y lactosa, hierro y un indicador que es el rojo
fenol. En este medio sembraremos por picadura y estrías en superficie, como ya
conocemos, para estudiar los cambios que ocurrirán en superficie y profundidad. A lo
largo del canal se desarrollan los microorganismos, y según lo hagan en la parte superior
o inferior del tubo, estarán indicando su comportamiento frente a los azucares, los
cambios indican lo siguiente:

MICROORGANISMOS HALOFILOS
Al igual que otros microorganismos, los halófilos son considerados como una fuente
potencial de productos de interés aplicado en diversos sectores de las industrias:
Alimentaria, Farmacéutica, Cosmética, Química, etc. Por otra parte, como resultado de
los procesos de halo adaptación y de protección frente al estrés provocado por diversos
factores característicos de los ambientes hipersalinos (elevada concentración salina? alta
radiación solar, cambios extremos de temperatura, etc.), los halófilos han desarrollado
una serie de características únicas que suponen toda lU1a amplia gama de productos
nuevos con propiedades especiales.
Con todo, algunas de las aplicaciones que podemos destacar son:
1. Bacteriorrodopsina: Debido a sus propiedades fotocrómicas, se perfila como un
pigmento con gran futuro en aplicaciones muy diversas corno material para elaboración
de memOrL'1S ópticas, almacenamiento y procesado de información, holografía,
moduladores espaciales de luz, etc.
2. Solutos compatibles orgánicos: estabilizadores de biomoléculas y células,
antagonistas de sales, agentes protectores de estrés, ele.
3. Diopolírneros a. Exopolisacáridos: espesantes, emulgentes y gelificantes. b.
Liposomas: transporte de compuestos en medicina y cosmética. c. Ácido poli-g-D-
glutámico (PeA): humectante, espesante, etc. d. PolihidroxiaIcanoatos: prótesis, plásticos
biodegradables, etc.
4. Enzimas a. IIidrolasas: Enzilnas conlO b-galactosidasas, a-arnilasas, serina
proteasas, etc. pueden ser de utilidad en la obtención de ciertos productos en industrias
farmacéuticas, químicas, ele. b. Isomerasas: para el modelamiento, estabilización,
desnaturalización y renaturalización de proteínas.
5. Halocinas como el PlNHE: protector en el infarto de núocardio (entre otros usos).
6. Vesículas de gas: separación, presentación de antígenos y desarrollo de vacunas.
7. Pigmentos carotenoides: como el b-caroteno, que es un precursor de la vitamina A y
es un aditivo de gran importancia como complementos y colorantes de alimentos, en
productos cosméticos, como componentes de fármacos, etc.
8. Ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUF A): como complementos en
dietas para contrarrestar deficiencias en ácidos grasos esenciales. (Oren, 2002)

4. PROCEDIMIENTO
Preparación del medio de cultivo con Agar PCA

Una vez calentado el agar,


Realizar los cálculos mezclar el agar con el agua dejar enfriar, trabajar en un
aforar 144ml de agua destilada hasta obtener una
necesarios para pesar el área aséptica y vaciar hasta
destilada, pasar a un mezcla homogénea y llevar
agar que se necesita en esta las ¾ partes de cada una de
Erlenmeyer de 250ml a la autoclave.
práctica las doce cajas Petri con el
agar PCA y dejar solidificar.

Preparación del caldo peptona

Realizar los cálculos necesarios para pesar la peptona junto con 10g de
muestra de suelo

aforar 144ml de agua destilada, agregar los gramos de peptona y llevar a la


autoclave.

Se deja enfriar y colocar 9ml de la solución en cada uno de los tubos.

Los 90ml de agua de peptona que quedan se mezcla con la muestra de suelo
en un Erlenmeyer hasta homogenizar.
Diluciones de orden 10

• Con una primera


se vierte en un primer pipeta esterilizada
tubo llamado 10-2. se toma 1ml de la
Agitar hasta mezcla de agua de
peptona y muestra
homogenizar de tierra

con la misma pipeta • tomar una nueva


tomar 0.1ml del tubo pipeta y sustraer
1ml del tubo 10-2 y
10-2 y depositarlo en depositarlo en el
2 cajas Petri llamadas tubo 10-3 y agitar
10-2 hasta homogenizar

esparcir el inóculo con • Repetir el proceso


con los tubos y cajas
la varilla de Drigalsky hasta llegar a 10-7

Etiquetar las placas,


invertirlas y llevar a la
incubadora por 48
horas.

5. RESULTADOS
Aislamiento de Microoganismos
Sin Presión Selectiva (PCA) a 36 C
Concentración N° de N° de colonias
colonias por ml por agua
−1
10 699 69900

10−3 65 650000

10−5 1 1000000
PROMEDIO: 573300
Con Presión selectiva (PCA + NaCl) a 36 C
Concentración N° de N° de colonias
colonias por ml por agua
−1
10 132 13200

10−3 6 60000
10−5 1 1000000
PROMEDIO: 357733
La presión selectiva afecta significativamente al crecimiento de microorganismos, ya que
disminuye el número de colonias presentes, además de la condición de salinidad, el
aumento de temperatura también condicionó el crecimiento tanto en la placa sin presión
selectiva y la placa que si tenía la presión.
Inóculo de microorganismos tras la siembra procedentes del Río Chibunga-Parque
Ecológico de la ciudad de Riobamba con presión selectiva de NaCl y a 36 C.

Resultados del inoculo


Con Presión selectiva (PCA + NaCl al 7%) a 36 C
Tamaño de colonias Numero de colonias por cada celda
Grande 1,2,3,4,14,15,17,29,40
Medianas 11,57,58
Pequeñas 5,6,13,18,19,55,65,66
Total 20

Sin Presión selectiva PCA a 36 C


Tamaño de Colonias Numero de colonias por cada celda
Grande 3,14,15
Medianas 1,2,17,29,39,40,44,45,52,58
Pequeñas 11,19,46,56,57,66,65
Total 20

Al generar una base datos de ambas placas formulando un contraste entre ellas, las celdas
enmarcadas con las siguientes numeraciones: 1,2,3,11,14,15,17,19,29,40,57,58,65,66
proporcionan información en cuanto al crecimiento en ambos medios que refleja que los
crecimientos son de posibles bacterias extremo tolerantes de la muestra de agua aledaña
al parque ecológico cuyo tamaño más representativo es el grande según su
acondicionamiento más óptimo. Las colonias que crecieron bajo la presión selectiva y no
en medio sin la presión se asegura que son posibles extremofilos enmarcadas con las
siguientes numeraciones: 4, 5, 6, 13, 18,55 cuyo tamaño más representativo en el
pequeño. Las colonias que crecieron sin presión selectiva y no con la presión selectiva
corresponden a las siguientes numeraciones: 39, 44, 45, 52, 46,56, cuyo tamaño más
representativo es el mediano, asumiendo estos valores hay mayor cantidad de extremo
tolerantes seguido de las que crecieron en NaCl al 7% pero no al 10% y por ultimo las
extremofilas.
Inóculo de microorganismos tras la siembra procedente del Río Chibunga-
Ricpamba de la ciudad de Riobamba con presión selectiva de NaCl y a 36 C.
CON PRESION SELECTIVA (NaCl Se formaron 26 colonias al cabo de 3
7%) días, sin embargo, hubo cuatro colonias
que aparecieron tiempo después.
Según la numeración de cuadrillas:
1,2,3,4,9,10,11,12,13,22,14,14,16,17,18,1
9,23,24,43,44,
45,46.
Las colonias 5, 6,7 y 8 son aquellas que
requirieron mayor tiempo para crecer.
SIN PRESION SELECTIVA No se observó crecimiento.

Inoculo de microorganismos tras la siembra procedentes del Río Chibunga-Parque


Ecológico de la ciudad de Riobamba con presión selectiva de NaCl y a
Temperatura Ambiente

Medio Colonias N° de cuadrante Total


PCA + NaCl Blancas 13 3 colonias
𝟏𝟎−𝟏 Amarillas 41
Beige 43
PCA + NaCl Blancas 2,3,4,5,10,11,12,13,15,16,17,18,19 13 colonias
(replica) Amarillas 23,24,25,26,27,29,33,35 8 colonias
Beige 39,40,41,42,43,44,48 7 colonias

6. CONCLUSIONES
 Se determinó los microorganismos presentes en una muestra de agua del rio
Chibunga a la altura del parque ecológico de la ciudad de Riobamba, por lo cual
se necesitó esterilizar recipientes para su recolección y la preparación de medios
adecuados para propinar un crecimiento adecuado.
 Se aisló los microorganismos de la muestra de agua obtenida mediante diluciones
seriadas de orden 10 utilizando agar PCA, que es indicado para inocular
microorganismos heterótrofos, posterior a esto se dejó incubar por un tiempo
determinado para poder realizar el conteo de colonias en las placas de las
diferentes diluciones.
 Se aplicó presiones selectivas de NaCl y temperatura de 36 C para poder analizar
los microorganismos capaces de poder sobrevivir a estas condiciones e inferir sus
posibles aplicaciones como organismos bioremediadores en futuras aplicaciones.
Ya que al vivir en un ambiente contaminado como lo es el rio Chibunga, son
capaces de desarrollar mecanismos favorables. Al aplicar las presiones selectivas
se pudo observar un crecimiento considerable de colonias, por lo que nos indica
un gran número de microorganismos que pueden sobrellevar estas condiciones.
 Se intensificó la concentración de la presión selectiva de NaCl de 7% al 10% para
poder observar si habían microorganismos capaces de crecer en este medio
altamente salino, con los resultados obtenidos pudimos deducir que un pequeño
porcentaje de las colonias fueron capaces de adaptare a este medio y no al PCA
normal, por lo que podríamos decir que se puede tratar de microorganismos
extremofilos, en contraste de las colonias que crecieron en ambos medios que nos
pueden indicar que son organismos extremotolerantes.
 Se comparó los resultados obtenidos con muestras del agua del Rio a temperatura
ambiente dando un mayor número de colonias cuando se sometía a los cultivos a
temperatura ambiente, esto se puede deber a que se acerca más a la temperatura
normal del rio. Y también se comparó con la muestra obtenida a la misma
temperatura trabajada pero en otro tramo del rio, donde sin la presencia de la
presión selectiva del NaCl no se pudo constatar crecimiento a 36 grados, y con la
presión selectiva aumento el número de colonias en 6 unidades. Indicando que en
este tramo del rio hay menos presencia de microrganismos en general, esto puede
ser por ser una zona menos contaminada del rio.

7. BIBLIOGRAFIA
 García, B. Alcalofilos y Acidófilos Disponible en:
https://www.studocu.com/es/document/universitat-de-les-illes-
balears/microbiologia/apuntes/micro-acidofilos-y-alcalofilos/3149621/view Recuperado
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 Jiménez, A. Métodos de siembra Disponible en:
http://microbiologiauasd.blogspot.com/p/metodos-de-siembra.html Recuperado el 08 de
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 SERAMIX. Replicación en placas Disponible en:
https://seramix.blogs.uv.es/2012/12/16/tecnicas-basicas/ Recuperado el 08 de junio del
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Barreto (2009). Procedimiento de toma de agua. Recuperado de:
https://biorem.univie.ac.at/fileadmin/user_upload/p_biorem/education/research/protocol
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 Delgado (2015). PREPARACION MEDIOS DE CULTIVO (ROSA BENGALA Y
PCA). Disponible en: https://es.slideshare.net/caritolinda37017/preparacin-medios-de-
cultivo-rosa-bengala-y-pca Recuperado el 08 de junio del 2019
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http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU342_SPA.pdf Recuperado el 08 de junio del 2019

 Oren, A. (13 de junio de 2002). Halophilic microorganisms and. Obtenido de


file:///C:/Users/camyl/Downloads/3363-Texto%20del%20art%C3%ADculo-11749-1-
10-20140227.pdf