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Efeitos imunomoduladores de damnacanthal isolados

das raízes de Morinda elliptica


Morinda elliptica Ridley (Rubiaceae) tem sido tradicionalmente
usada como medicamento para tratar várias doenças em Malásia e
sudeste da Ásia. No presente estudo, investigamos os efeitos
imunomoduladores de damnacanthal isolado das raízes de
Morinda elliptica. O efeito imunomodulador deste composto foi
avaliada utilizando o ensaio de proliferação de linfócitos com
timócitos de rato e periféricos humanos células mononucleares de
sangue (PBMC). Além disso, o efeito do composto na progressão
do ciclo celular PBMC foi estudado usando citometria de fluxo. A
produção de interleucina-2 humana e inteleucina-12 humana.As
citocinas também foram avaliadas usando a técnica de ensaio de
imunoabsorção ligada a enzimas (ELISA). O linfócito o ensaio de
proliferação mostrou que o damnacanthal conseguiu ativar os
timocitos do rato e PBMC a baixa concentração (0,468 ug / mL).
Além disso, a produção de interleucina-2 humana e interleucina-
12 humana.As citocinas no sobrenadante da cultura dos linfócitos
ativados por Damnacanthal foram marcadamente up-regulado às
24h e sustentado até 72h com uma ligeira diminuição com o
tempo. Uma correlação positiva foi encontrado entre o nível
dessas duas citocinas e o teste de proliferação baseado em MTT.
Com base no acima resultados, damnacanthal pode atuar como
um agente imunomodulador que pode ser muito útil para manter
um sistema imunológico saudável.
Introdução
As espécies de Morinda são populares em todo o mundo sendo
que a morinda elliptica tem sua origem na malásia, no Brasil é
encontrada no Rio de Janeiro. É usada para tratar dor de cabeça,
diarreia, ulceras gastricas e atua como imunoestimulante
Damnacanthal
é uma antraquinona natural presente na morinda,é um inibidor potente da proteína quinase p56 que é uma
enzima que envolve o controle do ciclo celular e está envolvida na indução da mitose em
uma célula.Possui atividade antifúngica,antibacteriana e antitumoral

.Sem dúvida, damnacanthal possui várias formas farmacológicas


atividades. Embora testes abrangentes foram realizados para
estudar o citotóxico, antimicrobiano e efeitos antivirais deste
composto, sem especificidade estudo foi relatado abordando o
imunomodulador atividade de damnacanthal. Assim, o presente
estudo foi realizado para investigar o imunomodulador efeito de
damnacanthal em timócitos de rato e humanos proliferação de
células mononucleares de sangue periférico (PBMC)

materiais e métodos
Material vegetal
As raízes de Morinda elliptica foram coletadas e uma
espécime foi depositado no herbário
do Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências,
Universiti Putra Malásia.

Produtos químicos e compostos


Damnacanthal (C16H10O5) que tinha sido isolado de
as raízes de Morinda elliptica como descrito anteriormente
foi gentilmente fornecido por Nordin Lajis, do Laboratório de
Produtos Naturais, Instituto de Biociências, Universiti Putra
Malásia. 3- (4,5-Brometo de dimetiltiazol-2-il) -2,5-
difeniltetrazólio(MTT), concanavalina (Con) A, mitogã de
pokeweed(PWM) Solução de sais equilibrados de Hank (HBSS),
dimetilsulfóxido (DMSO), iodeto de propídio (PI), Triton
X-100 e RNase A foram todos comprados da Sigma
(St Louis, MO, EUA). O soro bovino fetal (FBS) era de
PAA, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)
de Flowlab (Flowlab, N.S.W, Austrália) e FicollPaque
Além de Amersham Biosciences, isoflurane,
citrato de sódio e EDTA foram adquiridos da Merck.
Concanavalina A (Con A) (50 μg / mL) e pokeweed
O mitógeno (50 μg / mL) foi utilizado como controlo positivo.
Estes imunomoduladores comerciais foram preparados
dissolvendo-os com meio DMEM (Flowlab,
N.S.W, Austrália). As soluções de estoque e subproduto foram
preparado como acima

Animais
Foram utilizados na experiencia total de dez camundongos
machos de 5-8 semanas de idade, Os animais foram comprados da
Animal House, Universiti Putra Malásia.
Este trabalho teve foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso
de Animais, Universiti Putra Malaysia (UPM)

Preparação de suspensões de células de timo de rato


Os ratos foram anestesiados com 2% de isoflurano (Merck)
e sacrificado pela luxação cervical. O timo que
está localizado acima do coração foi removido e rapidamente
lavado com solução de sais balanceados de Hank (HBSS) no
Placa de Petri. O timo foi triturado e pressionado
uma tela de malha de arame estéril com um êmbolo de seringa de
borracha.
A suspensão celular foi lavada com PBS suplementado
com 0,1% de BSA e 0,06% de citrato de sódio (PBS-BSA-SC)
e centrifugou 200 g por 10 minutos. Este passo foi repetido
até que a pelotização estivesse limpa (não continha nenhum
detritos ou contaminante). O sobrenadante foi descartado e 4 mL
O DMEM com 10% de soro inativado por calor foi adicionado a
re-suspender a pelota. A contagem de células foi então realizada
para determinar o número de células de linfócitos na suspensão.
Todas as etapas acima foram realizadas sob estéril
condições em um gabinete de segurança biológica para prevenir
qualquer contaminação.

Isolamento de células mononucleares de sangue periférico


(PBMC)
O sangue venoso foi coletado assepticamente de
Doadores em tubos de heparina sem conservantes. O sangue
foi diluído com solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH
7.4 e em camadas para Ficoll plus. Após centrifugação em
400 g durante 50 min, os linfócitos foram coletados da
Interfase e lavado três vezes com PBS. As células
foram ressuspensas em DMEM com 10% de soro bovino fetal
e antibióticos.

Ensaio de proliferação de linfócitos


A proliferação de linfócitos foi testada usando 3- [4,5-
brometo de dimetiltiol-2-il] -2,5-difeniltetrazólio
(MTT) (Mosmann, 1983). Em resumo, 100 μL de DMEM
foi adicionado a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo
plano exceto para a linha A. Foram adicionados 100μL de
daltonante diluído adicionado às linhas A e B. A solução foi
misturada por pipetagem e a partir da linha B, foram retirados 100
μL de cada bem e adicionado ao próximo poço na fila C. Uma
série de dupla as diluições da droga da linha B para a linha G
foram realizado. O excesso (100 μL) foi descartado. Fila H
ficou intocado. 100 μL de suspensão celular (periférica
células mononucleares de sangue ou linfócitos tímicos)
foi adicionado a todos os poços e incubado a 37 ° C, 5%
CO2 e 90% de umidade para 24, 48 e 72h. Uma solução-mãe
de MTT 5 mg / mL em PBS e 20 μL de
O MTT foi adicionado a cada poço. O meio de cultura foi
aspirado e 100 μL de DMSO foram adicionados a cada poço para
dissolver os cristais roxos. Finalmente, a placa foi lida
um ELISA de espectrometria EL 340μ de Quantum ELISA
Leitor (Bio-Tek Instruments, Winooski, EUA) usando teste
e comprimentos de onda de referência de 570nm. A porcentagem
de proliferação foi calculado usando o seguinte
equação:
% = - Proliferação × (controle de OD da amostra OD)
Controle OD
100
Análises de citometria de fluxo
Foi utilizado um citómetro de fluxo para determinar os efeitos de
damnacanthal na progressão do ciclo celular PBMC humano.
Este estudo foi realizado para avaliar os efeitos de
Damnacanthal e mitógeno de pokeweed (PWM) que induz a
proliferação de células T e linfócitos B no
alteração das fases do ciclo celular das PBMC em diferentes
tempos de incubações .A fase significativa na avaliação da
A proliferação de células está na fase G2 / mitosis.
PBMC foram escolhidos em
para avaliar a capacidade de damnacanthal estimular
a proliferação de linfócitos in vitro. Nisso
estudo, PWM e concanavalina A foi usado como um controle
positivo. O ativo concentrações escolhidas para damnacanthal e
PWM em
A fim de estimular a proliferação de PBMC foi de 30 e
50 μg / mL, respectivamente. Neste estudo, 1 mL de PBMC com
uma densidade de 1 × 106
células / mL, foi tratada com 1 mL de damnacanthal
e PWM de acordo com suas concentrações ativas
como acima mencionado. Os tratamentos foram realizados
em placas de 6 poços (Nunc, NY, EUA) com um total de trabalho
volume de 2mL para cada poço. As células tratadas foram então
incubadas por 24, 48 e 72 h e colhidas por centrifugação
a 1000 rpm (200 g) durante 10 min. Posteriormente, o
as células tratadas foram fixadas com 80% de etanol a 4 ° C
durante 2 h.Então, as células foram centrifugadas e lavadas duas
vezes comPBS a pH 7,5. As bolinhas celulares foram finalmente
dissolvidas e corado em tampão PBS consistindo em 0,1% de
Triton X-100,10 mM de EDTA, 50 μg / mL de RNase e 3 μg / mL
de propídio iodeto (PI). Esse processo foi feito no escuro porque
PI é sensível à luz. As células foram então incubadas para
30 minutos a 4 ° C e analisados utilizando o Coulter EPICS Altra
citómetro de fluxo (Beckman Coulter, Miami, EUA) no
Laboratório de Biologia, Faculdade de Medicina Veterinária,
Universiti Putra Malásia dentro de 24h.

Análise estatística
Todas as experiências foram realizadas em triplicado e a
Os resultados foram expressos como média ± SE. O teste t de
Student foi
usado para analisar a significância estatística das diferenças
entre o controle e os valores tratados.

Resultados
Atividade mitogênica de damnacanthal no timócito de
camundongos.
tividade mitogênica de damnacanthal em timócitos de rato
foi determinado usando o ensaio MTT. Os timócitos do rato estavam isolados
e incubadas com concentrações crescentes (0,468 ug / mL-30 μg /
mL) de damnacanthal ou Con A (2,5 μg / mL, como controle positivo) em
meio de cultura para 24, 48 e 72h. Os resultados foram expressos como significativos
percentual de absorção de MTT em tratamento com damnacanthal e
controle bem ± erro padrão de três experiências independentes com
três poços cada.

Damnacanthal foi usado para estimular a proliferação de


timócitos de rato significativamente em um tempo e dose maneira
(Figura 1) O crescimento máximo foi encontrado após a
incubação 24h com 30 μg / mL de damnacanthal, conseguindo um
aumento de duas vezes comparado para o controle positivo (Con
A) e este efeito foi significativamente reduzido após 48 e 72 horas
de incubação.Con A é um mitógeno de plantas e é conhecido pela sua habilidade
em estimular subgrupos de células T de camundongo, usado como um controle
positivo na sua concentração ideal (2,5 μg / mL) descobriu-se que
promove marcadamente o crescimento de linfócitos em uma
maneira dependente do tempo com crescimento máximo após
Tratamento 24h. Os resultados também sugeriram que este
composto não era tóxico para os timócitos do rato, mesmo em um
alta concentração de 30 μg / mL.

Atividade mitogênica de damnacanthal em humanos


células mononucleares de sangue periférico
Figura 2. A atividade mitogênica de damnacanthal em PBMC foi testada por
usando o ensaio MTT. As PBMC foram isoladas e incubadas com o aumento
concentrações (0.468 μg / mL-30μg / mL) de damnacanthal ou PWM
(50 μg / mL, como controle positivo) em meio de cultura durante 24, 48 e 72 h.
Os resultados foram expressos como porcentagem média de absorção MTT
em damnacanthal-tratado e controle bem ± erro padrão de três
experimentos independentes com três poços cada.
Damnacanthal estimulou a proliferação de
linfócitos humanos ao longo do período de tratamento
mas não inibiu a proliferação de linfócitos humanos em
qualquer das concentrações testadas. Damnacanthal foi
capaz de induzir a maior proliferação de PBMC às 24h
tratamento com um valor de 46,55% a 30 μg / mL. Neste
período de incubação, mostrou uma proliferação
significativamente melhor de PBMC quando comparado ao
controle positivo PWM. PWM estimulou a proliferação de PBMC
em um dependente do tempo. Isso induziu uma melhor
proliferação de PBMC após 48h com um valor de 36,87%.
Também foi claro que os efeitos proliferativos de PBMC tratados
com PWM eram muito maiores que damnacanthal após 48 e 72h
tratamentos. Obviamente, Damnacanthal pareceu estimular
PBMC em um tempo de incubação precoce (24h) enquanto
PWM parecia estimular PBMC após uma incubação mais longa
período.

Análise de citometria de fluxo de distribuições do ciclo celular


nas PBMC com base nos efeitos da proliferação de
damnacanthal e PWM às 24, 48 e 72htempo de incubação

Análise dos perfis do ciclo celular revelou que as células tratadas


com damnacanthal sofreram maior proliferação às 24h com uma
porcentagem de 57,42% em comparação com células não tratadas
com um valor de 4,63% ema fase G2 / M. No entanto, a
porcentagem de células tratadas com damnacanthal entrar em G2 /
M diminuiu gradualmente após as 48h e 72h com valores de
40,26% e 43,46%, respectivamente.
A redução na percentagem de proliferação celular deveu-se às
percentagens mais elevadas de células que entram na fase Sub G1,
como mostrado por as taxas apoptóticas de 15,89% e 4,5% após
48h e 72h tratamentos, respectivamente

Conforme demonstrado na Tabela 1, a proliferação de PBMC


tratado com mitogênio pokeweed durante a incubação 24h foi
significativamente maior quando comparado às células não
tratadas com valores de 9,26% e 4,63%, respectivamente. No
entanto, o percentagem de células tratadas com mitogene de
pokeweed entrando em G2 / M aumentou gradualmente às 24, 48
e 72h com valores de 9,26%, 30,48% e 41,91%, respectivamente.
Em tempos iniciais de incubação, a baixa porcentagem de células
que entrou na fase G2 / M correspondendo a um aumento de
células que entraram na fase sub G1, indicando assim que
PWM pode causar maior apoptose na incubação anterior
vezes, particularmente às 24h e às 48h, com valores de 18,84%
e 13,25%, respectivamente. No entanto, a PWM suscitou melhor
A proliferação de PBMC é 2,6 vezes maior quando comparada
ao controle após o tratamento de 72h.

Discussão e conclusão
O presente imunomodulador estudos revelaram que damnacanthal
significativamente aumentou a proliferação de timocitos de rato
e PBMC sem levar a inibição em nenhum das
concentrações testadas. Este resultado estava de acordo com
Os resultados publicados por Wang et al. (2002) que demonstrou
que o timo em animais tratados com o suco do extrato obtido de
Morinda citrifolia foi ampliado.

os estudos de Hirazumi et al. (1994, 1996, 1999)


e Wang et al. (2002) apoioaram a capacidade de damnacanthal
para melhorar o sistema imunológico através da
modulação da proliferação e regeneração do timo.
Seus dados mostraram que o efeito proliferativo de Damnacanthal
no PBMC foi menor que o da PWM após as 48h
e 72h tratamentos. Isso pode ser devido à capacidade de
PWM para estimular a proliferação de células T e B
(Stanilove et al., 2005). Só que os efeitos de damnacanthal foram
sustentados até 72h após
tratamento.

Os resultados deste estudo sugeriram que Damnacanthal


tem um enorme potencial para estimular a imunidade
das células com pouca ou nenhuma toxicidade para células
saudáveis. Contudo,são necessários mais estudos para elucidar o
mecanismo exato das reações causadas por damnacanthal. No
Ao mesmo tempo, é vital utilizar múltiplos ensaios para permitir
uma avaliação abrangente do imunomodulador
eficácia deste composto. Além disso, farmacocinética
estudos também são fundamentais para avaliar melhor a eficácia
Efeitos de dose e toxicidade de Damnacanthal. Uma vez o
mecanismos de suas ações e um bioensaio abrangente
são estabelecidos, damnacanthal poderia ser usado como uma
vantagem molécula para uma nova geração de drogas para
impulsionar a sistema imunológico.