MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

INGENIERÍA EN AGROALIMENTOS
UNViME 2016

Nutrición de los microorganismos.

Substratos y medios de cultivo para
la fermentación industrial.
DRA. MARÍA CECILIA VILLA
LA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Es el estudio de la microbiología orientada a la producción de elementos de
interés industrial mediante procesos en los que interviene, en algún paso, un
microorganismo.

Surge con el ánimo de generar compuestos químicos complejos de una forma

mas sencilla y barata que mediante síntesis orgánica.

Esto es posible debido a la enorme versatilidad metabólica e los

microorganismos que frecuentemente son capaces de producir los compuestos
deseados o sus precursores.

Las Fermentaciones de Productos Industriales comprenden un buen número

de procesos industriales que son utilizados para producir satisfactores para la
salud y la alimentación.

Para aprovechar las fermentaciones se deben desarrollar tecnologías que

permitan fabricar los productos en cantidades industriales, para satisfacer los
requerimientos.

Se debe buscar siempre bajo costo, para poder competir con los productos
actuales.
CONCEPTO DE FERMENTACIÓN
Proceso realizado en un fermentador o biorreactor, mediante el cual
determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados
por acción microbiana en metabolitos y biomasa.
La fermentación es un proceso de oxidación incompleto, siendo el producto final
un compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan los
diversos tipos de fermentaciones.
El microorganismo aumenta su concentración y el medio se va modificando.
Resultado….. Formación de de nuevos productos como consecuencia
del metabolismo.
 Proceso de fermentación:

MICROORGANISMOS
Bacterias, levaduras , hongos MICROORGANISMO

MEDIO DE CULTIVO CO2

CONDICIONES AMBIENTALES PRODUCTO

Intra o extra celular
HISTORIA DE LA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Es tan antigua como la manipulación de alimentos fermentados como el
vino y el pan.
Ha sido clave en la producción de penicilinas:
-naturales, como la Penicilina G, (esto es de forma totalmente microbiológica),
-semisintéticas, como la meticilina (que requiere la purificación de un
intermediario que luego ha de modificarse química o enzimáticamente)
Por último, el estudio del ADN recombinante y el enfoque de la Ingeniería
Genética, han permitido producir proteínas humanas mediante
microorganismos transformados on genes humanos. Por ejemplo: la Insulina
recombinante
IMPORTANCIA DE LA FERMENTACIÓN EN LA BIOTECNOLOGÍA

 Procesos de fermentación en alimentos:

 Naturales o espontáneas (fermentación del
cacao,ensilado, pozol).
 Inoculadas ( vino, yogurt, tempeh).
 Procesos de fermentación en medios de cultivo:
 Producción de biomasa (proteína unicelular,
levadura de pan, levadura de cerveza).
 Obtención de metabolitos primarios ( alcohol, ácidos
orgánicos) y secundarios ( enzimas, polisacáridos).
 TIPOS DE FERMENTACIÓN DE VARIOS MICROORGANISMOS

Fermentación Productos Organismos

Alcohólica Etanol + CO2 Levadura(Sccharomyces)
Ácido láctico Ác. láctico Bacterias del ácido láctico
Ácido mixto Ác. láctico,acético,etanol, CO2, H2 Bacterias entéricas(Escherichia, salmonella)
butanediol Butanediol, ác. láctico, acético, etanol, CO2, H2 Bacterias entéricas(Aerobacter, Serratia)
Ácido buritico Ác. burítico, acético, CO2, H2 Clostridios(Clostridium butyricum)
Acetona- butanol Acetona, butanol, etanol Clostridios(Clostridium acetobutylicum)
Ácido propiónico Ác. propiónico Levadura(Sccharomyces)

 Fermentación etílica:  Fermentación láctica:

Se transforman los azúcares de las uva en
etanol, debido a la acción de las levaduras.
EJEMPLOS DE PRODUCTOS OBTENIDOS POR FERMENTACIÓN
INDUSTRIAL

Producción de alimentos: Fermentación del vino

Fermentación del pan
Fermentación de la cerveza

Suplementos dietéticos: Cultivo de algas

Obtención de vitaminas o aminoácidos

Biopolímeros: Xantano, Alginato, Celulosa, Ácido hialurónico,

Polihidroxialcanatos

Biorremediación de entornos contaminados o Tratamientos de desechos

Principios activos medicinales: Insulina, Hormona de crecimiento

Reactivos diagnóstico e investigación: Taq polimerasas empledas en PCR

A LA PAR DE LOS AVANCES, EMPEZARON LAS CONSIDERACIONES…
Los medios de producción deben incluir consideraciones económicas
además de las microbiológicas.

Se produjeron cambios tecnológicos y DE LAS CUBAS CLÁSICAS DE

FERMENTACIÓN construídas de materiales diversos se pasó a
BIORREACTORES DE ACERO INOXIDABLE muy instrumentados.

EN EL DESARROLLO DE FERMENTACIONES INDUSTRIALES…

Conceptos de microbiología, química, bioquímica y tecnología,

constituyen las bases de la microbiología industrial actual.

En un proceso si el objetivo es un producto, este debería ser de alto

rendimiento y fácil extracción del medio de cultivo.
SELECCIÓN DE CEPAS PARA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Al seleccionarse un microorganismo, se deben tener en cuenta cierto

criterios como son:

La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos.

Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos a partir de
medios de cultivo de costo reducido.
Debe ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo, sin pérdida de
sus características particulares.
Debería llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.

Los microorganismos que se utilizan pueden ser obtenidos de

aislamientos a partir de su fuente natural o a partir de una
colección de cultivos.

EN GENERAL, EN LA INDUSTRIA CADA FIRMA POSEE SU

PROPIA COLECCIÓN DE ORGANISMOS, EN MUCHOS CASOS
MUCHOS DE LOS CUALES HAN SIDO MEJORADOS A TRAVÉS DE
TÉCNICAS CLÁSICAS DE MUTACIÓN E INGENIERÍA GENÉTICA.
CARACTERÍSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Contener los elementos para la síntesis celular y para la formación de

producto
Medio ambiente favorable para el crecimiento y/o formación del
producto.
Económicamente rentable.
Máxima producción.
Adaptación constante al proceso de fermentación.

CRITERIOS UTILIZADOS EN LA FORMULACIÓN DEL MEDIO

Recuperación del producto.

Eliminación de la represión catabólica.
Materiales de fácil disposición en cantidad suficiente.
Bajos costes de transporte.
Impedir que las impurezas dificulten la recuperación de producto.

EL MEDIO INFLUYE EN:

En el crecimiento celular.

En el procesado posterior.
En la fisiología y morfología de los microorganismos.
 INFLUENCIA DEL MEDIO EN EL CRECIMIENTO
CELULAR.
Los microorganismos necesitan:

Carbono
Nitrógeno
Minerales Biomasa
Factores de Microorganismos
Biosíntesis y
crecimiento mantenimiento celular
Agua
Oxígeno(aerobios)

Condiciones medioambientales:
pH, Temperatura...
 INFLUENCIA DEL MEDIO EN EL PROCESADO
POSTERIOR:

 Subproductos, proceso de recuperación más caro y

complejo. (Procesos de purificación de productos y
tratamiento de desechos).
 Necesidad de adicionar antiespumantes,
problemas en el procesado de productos asociados con
el crecimiento microiano
 INFLUENCIA DEL MEDIO EN LA FISIOLOGÍA Y
MORFOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS
Las condiciones relacionadas con el medio que han
demostrado tener influencia en la morfología

pH Cationes
Viscosidad divalentes

Polímeros Morfología Agentes

anióticos quelantes

Presencia de Agentes
sólidos tensoactivos

Por ej. PH: Las hifas del P. Chrysogenum se

vuelven más cortas y gruesas a medida que el
pH es más alcalino, forman gránulos.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS. COMPONENTES DE UN
MEDIO DE CULTIVO.

La preparación de los medios de cultivos es fundamental para asegurar la

productividad.

La nutrición microbiana consiste en aportar a las células los ingredientes

químicos que necesitan para la síntesis de monómeros, que son los componentes de las
macromoléculas, que a su vez construyen las estructuras celulares.
Monómeros Macromoléculas Estructuras
celulares

Monosacáridos Polisacáridos Pared celular

Glicocàlix

Aminoácidos Proteínas Membrana

Ribosomas
Flagelo
Pelos y fimbrias
Enzimas

Ácidos grasos Lípidos Membranas

Bases nitrogenadas Ácidos nucleicos Cromosoma

Ribosomas
Plásmidos
DISEÑO
EL DISEÑO DE UN MEDIO DE FERMENTACIÓN TIENE COMO
FINALIDAD SELECCIONAR LOS COMPONENTES DE LOS MEDIOS
PARA ASEGURARNOS EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS
Y LA FORMACIÓN DE LOS PRODUCTOS CORRESPONDIENTES AL
PROCESO A DESARROLLAR

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El medio de cultivo químicamente definido se prepara añadiendo
cantidades precisas de compuestos orgánicos e inorgánicos puros a un
volumen conocido de agua destilada.
Se conoce su composición exacta.

Medio definido para Escherichia coli

K2HPO4 7g
KH2PO4 2g
(NH4)2SO4 1g
MgSO4 0,1 g
CaCl2 0,02 g
Glucosa 4-10 g
Elementos traza 2-10 g
(Fe, Co, Mn, Zn,
Cu, Ni, Mo)
Agua destilada 1000 ml
pH7
Para elaborar el medio complejo se utilizan hidrolizados de
proteínas y otras sustancias muy nutritivas pero no definidas
químicamente que se pesan y se añaden a un volumen conocido
de agua.
No se conoce la composición exacta del medio complejo.

Medio complejo
para Escherichia coli
y Leuconostoc mesenteroides

Glucosa 15 g
Extracto de levadura 5 g
Peptona 5g
KH2PO4 2g
Agua destilada 1000 ml
pH7
 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

Estará determinado por el metabolismo celular

Fuente de C:
Autotróficos (algas, algunas bacterias) necesitan CO2
Heterotróficos necesitan compuestos orgánicos

Requerimientos de O2:
Aerobios
Anaerobios

Algunas bacterias en vez de O2 emplean NO3 o SO4 como aceptores finales de

electrones.

Fuente de E:
Las bacterias metanogénicas requieren H2, para reducir CO2 a CH4 y obtener
E (auxótrofos anaerobios).

Algunos anaerobios obtienen su E por reacciones de óxido-reducción de

compuestos orgánicos. Las fuentes de C, son muchas veces importante fuentes
de E.
 Fuentes de nitrógeno:
-Inorgánica u Orgánica
-Se emplea para síntesis de proteínas, ácidos nucleicos, polímeros de la pared
celular

 Macronutrientes:
- P y S en forma de PO4 y SO4
-PO4 para formar ADN, ARN y polímeros celulares
-SO4 para sínteis de aminoácidos azufrados, biotina, coenzima A, tiamina

-K y Mg, ligados al RNA. Mayor velocidad de crecimiento, aumento de RNA, mayor

requerimiento de K
- K actúa como coenzima y Mg es estabilizador de organelas (ribosomas) y es
cofactor.

 Micronutrientes:
- Esenciales: Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn.
- Poco esenciales: Na, Al, Si, Cl, Cr, Ni, Se, Mo
-Difíciles de cuantificar porque generalmente están presentes como impurezas de
otros componentes principales.
- Sus requerimientos aumentan cuando el cultivo se somete a “stress”.
Factores de crecimiento:
-Aminoácidos, tiamina, riboflavina, niacina; la mayoría son constituyentes de
coenzimas.

Requerimientos específicos según el proceso:

-Por ej. Ác. Fenilacético para la Penicilina

-Por ej. Sulfato que favorece la producción de glicerol en la fermentación

alcohólica

-Un proceso caracterizado por descenso de pH, obliga a agregar al medio un

agente buffer, como mezcla de fosfatos o carbonato de calcio, o mediante el
agregado de una solución alcalina.

-En un proceso de producción de ácido cítrico el hierro en exceso influye

negativamente. Por lo cual se diseña un medio con ausencia total de hierro y
se va agregando hierro de manera controlada.
OTROS CRITERIOS A TENER EN CUENTA EN LA FORMULACIÓN DE
LOS MEDIOS

CATIONES DIVALENTES: inducen el crecimiento en forma de gránulos, sus

efectos pueden contrarrestarse con AGENTES QUELANTES.
 La presencia de cationes influye en la floculación de las levaduras
(importante en su sedimentación y eliminación en la producción de bebidas
alcohólicas no destiladas).
 El manganeso afecta a la composición celular de la pared celular de A.
Niger.

AGENTES TENSOACTIVOS: Algunos aumentan la velocidad de secrección de

los enzimas microbianos extracelular.

 NITRÓGENO: niveles bajos inducen la formación de esporas.

 AMINOÁCIDOS: niveles elevados inhiben la formación de esporas.

MACRONUTRIENTES
MICRONUTRIENTES

FACTORES DE CRECIMIENTO
DISPONIBILIDAD DE LOS COMPONENTES

- Componentes susceptibles de ser usados por la célula.

- Concentración de iones metálicos modificada por quelación por componentes del
medio o productos de la fermentación, para controlar la concentración y
precipitación de los iones se emplean agentes quelantes, como el EDTA.

SE DEBE TENER EN CUENTA LA NATURALEZA DE LOS COMPUESTOS

ORGÁNICOS QUE PUEDEN ACTUAR COMO LIGANDOS Y SOBRE TODO
DEL ION METÁLICO CONSIDERADO, YA QUE ES NECESARIO
CONTROLAR SU CONCENTRACIÓN LIBRE.

Cte de Equilibrio para la formación del complejo ión metálico-ligando

MATERIAS PRIMAS

Se debe considerar costos, disponibilidad, estabilidad en su composición

química y problemas de impurezas.
Las materias primas fundamentales son las fuentes de C y N.

Los compuestos petroquímicos ( hidrocarburos, alcoholes y

ácidos). Se empleaban cuando el petróleo era barato, no mucha
extensión.

En la actualidad: materias primas renovables que contienen

azúcar y almidón y menos grasas y aceites.

Futuro: los productos de la hidrólisis de la lignocelulosa las

materias primas más importantes en los procesos de la
fermentación.( La lignocelulora representa el 50% de la
producción anual mundial de biomasa).
LAS FUENTES DE CARBONO PUEDEN SER:
 Hidratos de C como gllucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina.
 Alcoholes como el glicerol y manitol
 Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros

HIDRATOS DE CARBONO EMPLEADOS COMO FTE DE C EN LOS PROCESOS DE

FERMENTACIÓN
ALMIDÓN: es el más importante actualmente .
En forma de granos o raices, enteros o molidos, de plantas como el maíz, arroz, trigo , patatas y mandioca;
como almidón purificado, modificado o como dextrinas

CELULOSA:
Presente en la madera combinado con la hemicelulosa y la lignina en forma de lignocelulosa
La lignina hace a la celulosa resistente al ataque microbiano . No son rentables los métodos químicos y
enzimáticos que convierten la lignocelulosa en azúcares fermentables. (Para obtener champiñones y
substrato para producir enzimas celulolíticas)
SACAROSA:
En forma cristalina o en forma bruta como zumos o melazas (es el subproducto de la manufactura de
azúcares más barato, varía su composición , causando problemas en la reproductibilidad de la
fermentación)
LACTOSA:
En el suero de la leche (4% al 5%)
Baja concentración, caro su transporte. Solo se utiliza en lugares próximos a la factoría de quesos proveedora.

GLUCOSA:
Se obtiene a partir de la conversión enzimática directa del almidón.
Glucosa refinada, en forma de jarabe o cristalina para productos de mayor valor.

ACEITES VEGETALES ( de soja, palma y semillas de algodón como complemento delos carbohidratos),
METANOL, ETANOL......
FUENTE DE NITRÓGENO
DE NATURALEZA INORGÁNICA:
Amoniaco, nitratos, urea, y el nitrógeno presente en los cereales y raíces y
sus subproductos.
Aminoácidos purificados, empleados como precursores.

DE NATURALEZA ORGÁNICA:
Hidrolizados de Proteínas (Peptonas): Obtenidas por hidrólisis ácida o
enzimática de distintas fuentes proteicas, como carne, pescado, caseína,
gelatina, harina de soja, algodón y girasol. Además de su función como fuente
nitrogenada, las peptonas aportan vitaminas, sales inorgánicas como fosfatos y
micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu.

Extracto de carne: Se obtiene por extracción acuosa y concentración

posterior.

Extracto de Levadura: Se obtiene por autólisis o plasmólisis de levadura,

es una mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y
carbohidratos.

Extracto de malta: Es el extracto soluble en agua de la malta de la cebada

Cornsteep: Agua de maceración del maíz, es muy importante en la

producción de varios antibióticos y enzimas.
SUSTRATOS COMPLEJOS
Son una fuente barata de carbono, nitrógeno y otros nutrientes.
Presentes en plantas enteras y subproductos vegetales, animales y
microbianos.

FORMULACIÓN
Se refiere a los aspectos cuantitativos de los medios.
Se debe tener una aproximación a la composición de la biomasa del
microorganismo. Una composición elemental en peso seco es:

-Carbono: 46 – 48%
-Nitrógeno: 7-12
-Fósforo: 1–3
-Azufre: 0.5 – 1
-Mg: 0.5 – 1
 COMPONENTE ELEMENTO/FUNCION MASA. gr
Glucosa C, energía 22.7
NH4Cl N 4.37
KH2PO4 P+K 1.13
MgSO4.7H2O S + Mg 0.232
CaCl2.2H2O Ca 0.011
FeSO4.7H2O Fe 0.007
MnS.4H2O Mn 0.002
ZnSO4.7H2O Zn 0.002
CuSO4.5H2O Cu 0.0004
CoCl2.6H2O Co 0.0004
EDTA Quelante 0.394
Agua destilada 1 ml
Composición de medio mínimo para Klebsiella aerogens
 SUSTRATOS COMPLEJOS UTILIZADOS EN LOS MEDIOS DE
FERMENTACIÓN MICROBIANA.
FUENTE INGREDIENTES PROT. CARBOH. GRASA FIBRA CENIZA
Cereales enteros Cebada 11,5 68,0 1,8 7,0 2,5
Cebada malteada 13,0 70,0 2,0 3,5 2,5
Maiz 9,9 69,2 4,4 2,3 1,3
Avena 12,0 54,0 4,5 12,0 4,0
Arroz 13,0 65,0 2,0 10,0 4,5
Trigo 8,2 69,0 1,9 2,6 1,8
Subpr.derv. plantas Melazas 3,0 54,0 0,4 9,0
Pulpa de remolacha 8,9 59,1 0,6 18,3 3,1
Pulpa de agrios (seca) 6,0 62,7 3,4 13,0 6,9
Harina de germen de maiz 22,6 53,2 1,9 9,5 3,3
Salvado de arroz 13,0 45,0 13,0 14,0 16,0
Harina integral de soja 42,0 29,9 4,0 6,0 6,5
Subp. deriv.animales Sangre 80,0 2,5 1,0 1,0 3,0
Harina de pescado 72,0 7,5 1,0
Harina de hueso 50,0 0,0 8,0 3,3 31,0
Subp deriv microorganismos Hidrolizado de levaduras 52,5 0,0 1,5 10,0
 CONTROL DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN: VARIABLES
1.-PH
2.-ESPUMA
3.-OXÍGENO
4.-TEMPERATURA
5.-REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DE PRODUCTO.

1.-PH:
 Control necesario para el desarrollo celular y formación de
producto.
 Control de forma indirecta o de forma directa:
 Directamente (Añadiendo agentes tamponantes):
Fosfato inorgánico pH entre 6.0 y 7.5.
Ácidos orgánicos pH bajos.
Carbonato cálcico frente a la producción de ácidos.
Hidroxisales, amoniaco, ácidos sulfúrico y clorhídrico.

Indirectamente ( mediante un balance equitativo entre las fuentes de

carbohidrato y nitrógeno).
Los carbohidratos bajan el pH (formación de ácidos orgánicos).

La asimilación del nitrato produce alcalinidad.

DESVENTAJAS: Efectos represivos sobre la formación del producto.

 2.- ESPUMA:
 ORIGEN:
Desnaturalización de las proteínas
en la interfase gas- líquido.
 PROBLEMAS:
Asciende hasta ocupar totalmente la
cabeza del fermentador por lo cual hay que
evacuar parte del contenido del aparato por
la salida del aire.
 SOLUCIÓN:
Antiespumantes ( agentes tensoactivos
que reducen la tensión superficial de las
espumas hasta dispersarlas ).
Rompedores mecánicos.
ANTIESPUMANTES:
 Eficacia (Depende de las condiciones
de fermentación):
 Composición del medio, cepas microbianas, etapa
de crecimiento, configuración de las vías de
aireación y del fermentador.
 Selección y cantidad del
antiespumante:
 Procedimientos de ensayo y error.
 Uso de soportes(aceites orgánicos y minerales)
 Cantidad de antiespumante mínima ( afecta a la
velocidad de transferencia de oxígeno hasta u 50%)
 No deben ser tóxicos ni peligrosos, esterilizables
por el calor y baratos.
 3.- OXÍGENO
Requerimientos en procesos aerobios.
Influencia sobre los procesos metabólicos.
Velocidad de absorción específica de oxígeno concentración de
oxígeno disuelto
Antioxidantes como protección del producto.

4.-TEMPERATURA
 Temperatura óptima para la producción celular o de metabolitos.
 Uso de termostatos
5.-REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL PRODUCTO

 PERCUSORES

 INDUCTORES
 incorporarse al medio el inductor específico
 mediante adiciones continuas o discontinuas

 INHIBIDORES
 minimizar la formación de otros intermedios metabólicos.
 Prevenir el metabolismo posterior al producto deseado

 Ejemplos:
 Fuente de N utilizable rápidamente inhibe la producción de algunos
antibióticos.
 El ácido fenilacético es el ppal percusor en la producción de
bencilpenicilina por fermentación.
 MANTENIMIENTO DE LOS MEDIOS

El medio de almacenamiento y subcultivo de cepas industriales clave

debe ser diseñado para que las cepas:
•Conserven las características necesarias que permitan la capacidad
de producción particular.
•Minimicen la variación genética.

 ¿ POR QUÉ UTILIZAR MEDIOS DE MANTENIMIENTO?

METABOLITOS
CEPAS TÓXICOS
EFECTOS
DESESTABILIZANTES
 ESTERILIZACIÓN DE CULTIVOS

 OBJETIVOS:
 Evitar el desarrollo de microorganismos patógenos.
 Evitar el desarrollo de microorganismos alterantes.
 Incrementar la reproducibilidad del proceso (rendimiento, pureza y
tiempo de producción).

 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN:
 Calor húmedo (autoclave o chorro de vapor).
 Calor seco
 Radiación ( Rayos X ,UV)
 Esterilización química con líquidos o gases.
 Filtración (filtros de superficie o de profundidad).
 Nuevos métodos ( altas presiones, campos eléctricos)
 ¿DONDE SE CONTROLA LA ESTERILIDAD?

Mantener la pureza del inóculo.

Esterilizar el medio de cultivo y los aditivos.
Esterilizar el material en contacto con el medio
(recipiente, fermentador, válvulas y conductos)
Esterilizar los gases entrantes y salientes.
Manterner las condiciones asépticas durante la
manipulación.
Construcción apropiada del biorreactor para su
esterilización y para la prevención durante la
fermentación.
 Para una buena rentabilidad, en virtualmente todos los
procesos, será necesario que en todas las etapas estén libres de
contaminantes.
También depende, no obstante, del campo en que nos estemos
moviendo. En el campo medio ambiental, hablar de esterilización
no tiene mucho sentido, mientras que en el campo alimentario
será esencial. Generalmente, la necesidad de un proceso de
esterilidad está en relación con el valor añadido del producto.
La probabilidad de que exista contaminación a lo largo del
proceso depende de las características del mismo. La probabilidad
de que exista contaminación en un cultivo mesófilo es mayor que
en un cultivo termófilo. También será más probable que exista
contaminación en un medio con pH aproximado a 7, más que a pH
ácido. La probabilidad de que haya contaminación será mayor en
los que consuman mucho oxígeno, que en los que consuman
menos.
Llegado a este punto hemos de plantear la optimización del
proceso a nivel de producción, sino a nivel de seguridad. Si se
puede ajustar el pH hacia abajo, mejor, que será más seguro.
 Durante la fermentación hemos de observar diferentes puntos para
garantizar la esterilidad:
- Esterilidad del medio de cultivo: el medio nutritivo que se prepara
inicialmente contendrá un elevado número de células vegetativas y otras
derivadas ingredientes del medio. Todos estos microorganismos han de ser
eliminados por el proceso adecuado antes de la inoculación. Existen
diferentes métodos, pero normalmente se usa el calor, y raramente otros.
- Pureza del inóculo: el inóculo representa entre el 2 y el 5% del
volumen total del biorreactor, si el cultivo no es puro habrá
contaminaciones.
- Esterilización del aire que fluye: La mayor parte de fermentaciones se
dan en condiciones de agitación vigorosa. El aire que entra ha de ser estéril.
El aire puede contener entre 10-105 partículas/m3 de los cuales entre 5 y
2000 serán microorganismos, principalmente esporas de hongos, bacterias
Gram negativas y fagos en suspensión. La esterilización del aire que entra
es esencial.
- Construcción apropiada del biorreactor, para que la esterilización entre
fermentación y fermentación pueda servir para prevenir la contaminación.
 Cuál será el método usado para la esterilización?
Mediante el uso de un agente biocida que inactive los
microorganismos. Los agentes biocidas tienen diferentes dianas.
Los usados en biotecnología se clasifican en:
- Agentes químicos: existe un elevado número de
desinfectantes químicos líquidos y gaseosos. Pueden ser
sustancias oxidantes como O3, óxido de etileno,... En la práctica se
usan poco, porque son difíciles de eliminar y por lo tanto se corre
el riesgo de inhibir el crecimiento de los microorganismos después,
en la fermentación.
- Agentes físicos: son los más habituales.
- - Radiaciones ionizantes: Rayos X, UV, o γ. Aunque
ocasionalmente se usan en industria alimentaria, no se usan de
manera habitual en fermentaciones industriales por el riesgo que
suponen para el manipulador.
- Calor: es el método más empleado, sobre todo para el medio
y para las instalaciones. Usualmente se usa vapor de agua para
esterilizar mejor.
- Métodos mecánicos: Filtración, Centrifugación,... La filtración
es la única que se usa en la práctica. Es útil para la esterilización
de medios con partes sensibles a calor y para esterilizar el aire.
Talycomoyahemos dicho, elcalor es elmétodo más empleado. Los agentes biocidas suelen tener
cinéticas de primer orden. Se ha de tener siempre en cuentaelfactor CT, siendo c laconcentración o
intensidad del agente biocida y t eltiempo de tratamiento. Es necesariorecordar esto, puesto que se puede
conseguir elmismo efecto esterilizando 2 horas a 90º Co 4 horas a 45º C.
En la microbiología industrial, cuando se habla de esterilización, no se considera la esterilidad absoluta,
como en el laboratorio, sino que se trata de esterilidad comercia. En muchos productos podemos
encontrar microorganismos, pero dado que no tienen efectosanitario,noresulta rentable eliminarlos.
El calor destruye vitaminas ydesnaturaliza proteínas, de aquíla
importancia del concepto CT. A partir deeste conceptosurgióla idea de
UHT. Se alcanza la misma eficiencia de inactivación de
microorganismos, pero elefecto que tiene sobre las proteínas yvitaminas es mucho menor.
Autoclave 120º C 10 – 15’
UHT 140º C Segundos
Comoya hemos dicho, el propio biorreactor se esteriliza mediante vaporde agua, pero los medios no se
pueden esterilizar así,porque elvapor de agua condensaría, de manera que aumentaríaelvolumen.
Además, resultaría muycaro calentar talvolumen de agua, y el tiempo aumentaría, porque se tendría que
esperar a que se enfriase. Existen diferentes métodos para esterilizar el medio, aparte de la filtración. Uno
de ellos es el que se conoce comoesterilización en continuo. Consiste en ir cargando el biorreactor poco a
poco con el medio, que se esteriliza por UHT. El medio va pasando porplanchas de acero a 140º C. El
tiempo que pase por laplancha será similar alde UHT. Elproblema es que elmedio que salga de aquí
estará demasiado caliente, por loque tendré que enfriarlo, yaque loquiero a unos 30º C.La solución es
un sistema que hace que pase cerca del medio fresco, aún no esterilizado, de manera que antes de la
esterilización a 140º, el medio ya está caliente. Si funciona bien se recupera el 80 – 90 % de la energía.
Otro problema al que nos enfrentamos es el aire, que es necesario esterilizar, que se suele hacer mediante
filtración. Podemos distinguir entre los filtros de adsorción, filtros en profundidad. En este caso, todo el
volumen del filtro tiene capacidad de filtrado. Está diseñado en forma de ovilloo bobina, de manera que
tarde o temprano, cualquier partícula en suspensión choque y quede retenida. Los filtros por retención
tienen eltamaño de poro más pequeño, puesto que las partículas quedarán retenidas.
 ESTERILIZACIÓN DISCONTINUA
T 121ºC
Tiempos de esterilización mayores(2-3h)
Calentamiento por inyección de vapor
o intercambiadores de calor
Alto consumo de energía.
Alteración y destrucción de nutrientes.
ESTERILIZACIÓN CONTINUA
20-30 segundos a 90-120 ºC
30-120 segundos a 140ºC
20-30 segundos refrigeración
Calentamiento por inyección de vapor
o intercambiadores de calor
Formación de sales insolubles
Tamaño de la partícula restringida a 1-2 mm