UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

ENZIMOLOGÍA

Nombres: Leiva Luis, Llano Mateo Fecha: 12 de diciembre de 2018

Docente: Dr. Rodrigo Ávalos

1. ¿Cómo es usado el EDTA para la extracción de enzimas?

Se debe añadir EDTA para producir la liberación de lipopolisacáridos de la envoltura de
la pared además este actúa como agente quelante uniéndose a cationes divalentes
esenciales en la pared lo que hace que la lisozima pueda acceder.

2. ¿Cuál es la desventaja de usar el método de congelación descongelación para

la extracción de enzimas?
La congelación y descongelación puede dar lugar a una pérdida de la actividad enzimática
además esta requiere de periodos prolongados de tiempo (hasta 36 horas) para el
congelamiento y descongelamiento.

3. ¿En que se basan los métodos de diferencias de solubilidad para la

purificación enzimática?

Dado que las enzimas se encuentran disueltas muestran cambios significativos de

solubilidad en función del pH, las enzimas precipitan en concentraciones altas de las sales.
Para realizar esto se basan en la precipitación fraccionada con concentraciones crecientes.
Las sales más usadas son el sulfato amónico y el sulfato magnésico.

4. Escriba dos tipos de métodos de ultrafiltración y mencione sus

características:

Ultrafiltro Microporoso: Membrana rígida y con orificios de 500-5000 A, las moléculas

pequeñas pasan y las grandes se retienen.

Ultrafiltro de Difusión: Concentran moléculas de menor PM y hacer una discriminación

molecular más efectiva. El transporte de solventes y solutos es por difusión molecular por
gradiente de concentración, para lo cual requiere activación térmica para generar energía
cinética.

Nombre: Maldonado Helen, Utreras Camila

1. ¿Qué tipo de enlace hidroliza la lisozima, enzima extraída de la clara del

huevo, en la extracción enzimática por el método químico de lisozima y
EDTA?
 La lisozima cataliza la reacción de hidrolisis de los enlaces beta-1,4 glicosídicos
de células bacterianas, específicamente en los mucopéptidos de las paredes.

2. ¿Cuáles pueden ser las localizaciones de una enzima con respecto a la célula,
cuál es la diferencia en su extracción?

Las enzimas pueden ser extracelulares o intracelulares, a las extracelulares se las

puede extraer por métodos más sencillos como centrifugación con las enzimas
intracelulares se requieren métodos más elaborados debido a que primero se
necesita romper la pared celular.

3. ¿Por qué la filtración en gel o cromatografía de exclusión celular es referida

como un tamiz molecular, cómo funciona el método de purificación?
En este método de purificación se emplea un gel con poros de tamaño definido,
dependiendo de la forma, masa y peso molecular de la enzima, el gel permite que
una mezcla de proteínas sea separada. El método se fundamenta en que las
moléculas de mayor tamaño no travesarán el gel, saldrán rápidamente y serán
aparecerán en el eluido, mientras que las proteínas de interés a travesarán el gel,
serán retardadas y por lo tanto serán separadas.

4. ¿Qué enzimas son más fáciles de aislar las extracelulares o intracelulares?

La purificación de enzimas extracelulares es mucho más fácil que el aislamiento
de enzimas intracelulares, no se requieren métodos de lisis y se reduce el coste de
producción. Para el aislamiento de enzimas se utiliza la centrifugación y la ultra
centrifugación, la separación de proteínas, mediante cromatografía de exclusión o
en geles de electroforesis.

Nombre: Fernández Paola

1. ¿En que se basa la técnica de diálisis para la extracción enzimática?

Para realizar esta técnica se necesita de un homogenizado de células o tejidos, el cual se

retiene en un saco construido con un material cuyos poros son ultramicroscópicos, por
ejemplo, el celofán. El siguiente paso es suspender el saco en agua destilada las moléculas
pequeñas que hay en el extracto, tales como las sales minerales, atravesarán los poros,
pero las proteínas quedarán retenidas. Tras la separación de las moléculas pequeñas, en
el interior del saco queda una mezcla de proteínas.

2. ¿De qué depende elegir un proceso de purificación?

Los métodos a elegir dependen de la fuente biológica y de la concentración de la enzima,
y se basan en las distintas propiedades fisicoquímicas de las proteínas.

3. ¿Qué es la cromatografía por afinidad?

Es un tipo de cromatografía que separa una sustancia de una mezcla basándose en la unión
específica y reversible de una proteína a un ligando unido a la matriz. El ligando puede
unirse de manera directa a la proteína de interés o a una etiqueta molecular que se
encuentre ligada a la proteína.

4. ¿En qué consiste la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida?

Los geles de poliacrilamida son geles porosos cuya porosidad es regulable dependiendo
de la concentración de acrilamida usada. Durante la electroforesis la fuerza que provoca
la migración de las proteínas es un campo eléctrico, y el gel actúa como filtro molecular,
ralentizando la migración de las proteínas en función de su relación carga/masa. A
diferencia de lo que ocurría en la cromatografía de filtración, en las electroforesis las
proteínas mayores son retardadas y se mueven más lentamente a través del gel, ay que las
va frenando el tamaño del poro y las proteínas más pequeñas avanzan más rápidamente.

Nombre: Recalde Mishell, Luzón Mirla

1. En la Ultrasonicación, indique de qué manera se produce la ruptura celular por

medio de ondas ultrasónicas para realizar la extracción enzimática.
Las ondas ultrasónicas generan cavitación que rompe las paredes celulares y facilita la
liberación de los componentes del citoplasma debido a que se generan ciclos de ondas de
alta y baja presión en el líquido sonicado, en donde durante el ciclo de baja presión, las
ondas ultrasónicas crean pequeñas burbujas de vacío en seno del líquido que colapsan
violentamente en el ciclo de alta presión. La implosión de las burbujas de cavitación causa
grandes fuerzas hidrodinámicas de cizalla, las cuales pueden romper el material fibroso y
celulósico en partículas más finas y romper las paredes de las células permitiendo la
extracción de enzimas.

2. Identifique los tres tipos de detergentes que se pueden usar en el método de

Solubilización para la extracción enzimática. Y explique ¿Qué es CMC?.
Lo detergentes se clasifican en tres tipos:

 Iónicos (aniónicos o catiónicos): Se componen de una cadena hidrofóbica y

un grupo terminal cargado, el cual puede ser un catión o un anión
 Zwitteriónicos: Contienen el mismo número de cargas positivas que de
negativas, lo que resulta una carga neta nula
 No iónicos: Tienen grupos terminales hidrofílicos no cargados
CMC se refiere a la concentración micelar crítica, la cual hace referencia a la minina
concentración de surfactante a partir de la cual se forman micelas espontáneamente en
una disolución. La concentración micelar crítica es un punto definido con precisión para
cada compuesto.

3. ¿Describa los parámetros de purificación enzimáticos que nos ayudan a

cuantificar y comparar los diversos métodos de purificación?

Existen 3 diferentes parámetros a considerar en al elegir un método de purificación

enzimática: el porcentaje de rendimiento, el factor de purificación y la actividad
enzimática.

Porcentaje de rendimiento: relaciona la actividad del extracto purificado (U)p y del

extracto inicial (U)i

(𝑈)𝑝
%𝑅𝑒𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥100
(𝑈)𝑖

Factor de purificación: relaciona la actividad específica del extracto purificado (𝑈/𝑚𝑔)𝑝

purificación y la actividad específica del extracto inicial (𝑈/𝑚𝑔)𝑖 .

(𝑈/𝑚𝑔)𝑝
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
(𝑈/𝑚𝑔)𝑖

Actividad específica: relaciona la actividad total (U) de la enzima con la cantidad de

proteína en mg.

(U)
Actividad específica =
mg de proteína

4. ¿Describa el método de purificación enzimática de precipitación por punto

isoeléctrico?
Se lleva a cabo ajustando el pH de la solución a uno cercano o igual al punto isoeléctrico
de la enzima de interés; el punto isoeléctrico de las proteínas, donde las cargas positivas
y negativas presentes en la superficie se neutralizan unas con otras y la repulsión
electrostática con otras moléculas no ocurre, da lugar a la atracción entre las moléculas
de proteína disueltas y formando así un precipitado. Importante tener en cuenta que
valores extremos de pH pueden favorecer la desnaturalización de la proteína.

Nombre: Acosta Andrés, Corredor Daniel

1. ¿Qué métodos existen para una extracción enzimática? Cite dos ejemplos de
cada una.

R: -Métodos físicos no mecánicos: 1) Sock osmótico 2) Desintegración térmica.

-Métodos físicos mecánicos: 1) Homogenización a alta presión 2) Molino de perlas a

alta velicidad.
 -Métodos químicos: 1) Tratamiento con álcalis 2) Tratamiento con detergentes.

-Métodos biológicos: 1) Lizosima+EDTA 2) Autolisis

2. ¿Qué función cumple en EDTA en la extracción Lizosima+EDTA?

R: Es un compuesto que quela los iones calcio y magnesio favoreciendo la liberación de

lipopolisacáridos y desestabilizando

la membrana celular.

3. ¿Cuál es el fundamento de la cromatografía de afinidad?

R: se fundamenta en la capacidad de unión reversible y específica que caracteriza a las

enzimas con determinadas moléculas.

Las partículas de la columna tienen en este caso un grupo químico unido covalentemente
llamado ligando, (un grupo o molécula

que se una a una macromolécula).

4. Cite tres métodos de concentración.

R: Ultrafiltración, concentración por liofilización, concentración por sales

Nombre: Flores Brando, Andrade Doménica

1. ¿Cómo funcionan los solventes orgánicos para la extracción enzimática?

Consiste en la desestabilización de la pared celular empleando solventes orgánicos no
polares, los mismos que actúan disolviendo componentes hidrofóbicos en la pared celular.

2. ¿Cuál es el objetivo de la purificación enzimática?

El objetivo de la purificación es obtener la máxima cantidad posible de proteína pura
respecto de la cantidad inicial.

3. ¿Cuál es el fundamento que utiliza la cromatografía de interacción

hidrofóbica?
Las proteínas tienen regiones hidrófobas debido a la presencia de cadenas de aminoácidos
hidrófobos no polares como Phe, Trp, Ala, Met. La cromatografía de interacción
hidrofóbica separa proteínas de acuerdo a sus diferencias en la hidrofobicidad de
superficie utilizando una interacción reversible entre las proteínas y la superficie
hidrofóbica presente en la matriz. Esta interacción se ve influenciada por la presencia de
sales en el buffer de corrida.

4. ¿En qué consiste la cromatografía de inmunoafinidad?

Esta técnica utiliza anticuerpos inmovilizados en un soporte sólido sobre el cual las
muestras serán colocadas y el antígeno correspondiente al anticuerpo será colocado al
soporte sólido; el resto de moléculas que no se unieron son lavadas y la enzima es eluída.

Nombre: Quinde Gisell, Orozco Mishell

1. ¿Cuáles son las principales fuentes de enzimas?

Los tejidos animales, tejidos vegetales o por procesos de fermentación pertenecientes a

microorganismos seleccionados con la finalidad de obtener enzimas específicas.

2. ¿Qué función cumple el EDTA con la lisozima?

Debilita las uniones iónicas de la membrana externa y el daño resultante de la membrana

permite el ingreso de la lisozima a la capa de peptidoglucano, de esta forma se libera el
lipopolisacárido.

3. ¿Cuál es el fundamento de cromatografía de intercambio iónico?

La cromatografía de intercambio iónico se fundamenta en las propiedades ácido-base de

las enzimas. Una proteína, a pH menor de su punto isoeléctrico tiene carga positiva
uniéndose a una resina con carga negativa y a pH mayor de su punto isoeléctrico posee
carga negativa lo que le permite unirse a una resina con carga positiva.

4. ¿Qué factores deben ser tomados en cuento para la elección de un sistema de

purificación?

Los factores que influyen para la elección del sistema de fusión son: el ambiente que es
tolerado por la proteína de interés, la localización, el costo, la afinidad por la matriz,
soluciones amortiguadoras a usar y las posibilidades de remover la proteína de fusión.