PRACTICA DE LABORATORIO N°3

DEMOSTRACIÓN DEL EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA

VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA

I. INTRODUCCION:

Los seres vivos pueden considerarse fábricas bioquímicas formadas por constelaciones
integradas de máquinas moleculares que operan con eficiencia. De todas las clases de
máquinas moleculares, las enzimas son sin duda las más importantes. Sin sus capacidades
catalíticas, la mayor parte de las miles de reacciones bioquímicas que sustentan los
procesos vitales ocurrirían a velocidades muy bajas. (Berg, Tymoczko y Stryer (2003)
Boquimica. 5° ed. España: Editorial Reverte, S.A)

La temperatura afecta todas las reacciones químicas. En general, cuanto mayor sea, tanto
mayor será la velocidad de reacción; es decir, es mayor el número de colisiones. La
velocidad de reacción incrementa debido a que hay más moléculas con la energía
suficiente para entrar en el estado de transición. Las velocidades de las reacciones
catalizadas por enzimas también aumentan con la temperatura. Sin embargo, las enzimas
son proteínas que se desnaturalizan a temperaturas elevadas. La temperatura óptima de
una enzima, que es la temperatura a la que actúa con su máxima eficiencia, se determina
en el laboratorio en condiciones específicas de pH, de fuerza iónica y de concentraciones
de solutos. En los seres vivos no hay una única temperatura óptima definible para las
enzimas. (Lenheniger David, Cox Michael (2009) Principios De Bioquímica. 5° ed.
Barcelona: Ediciones Omega, S.A.)

La concentración de iones hidrógeno, expresada como un valor de pH, afecta a las

enzimas de diversas formas. En primer lugar, la actividad catalítica está relacionada con
el estado iónico del sitio activo. Las variaciones de la concentración de iones hidrógeno
pueden afectar a la ionización de los grupos del sitio activo. En segundo lugar, los
cambios de los grupos ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima. Los
cambios drásticos del pH a menudo provocan desnaturalización. (Lenheniger David, Cox
Michael (2009) Principios De Bioquímica. 5° ed. Barcelona: Ediciones Omega, S.A.)

Las enzimas permiten las reacciones en las condiciones de temperatura, presión y pH

propios del medio intracelular, reduciendo la energía de activación necesaria para que se
produzca la reacción. Las enzimas no experimentan cambios estructurales al final del
proceso químico que catalizan.

El objetivo del realice de este experimento es demostrar el efecto o influencia del pH y

la temperatura sobre la velocidad de reacción de la enzima, para ello se usó la amilasa
salival, una enzima que escinde hidrolíticamente los enlaces glicosídicos α 1-4 del
almidón, el cual se usó como sustrato y se determinó las variaciones del mismo según
procedimientos de identificación y cuantificación de sustrato residual, para ello se usó
solución yodada.

II. MATERIALES Y METODO:

Para el desarrollo del experimento, se necesitó como material biológico a la amilasa

salival y el almidón como sustrato, previamente procesada y refrigerada. Entre los
materiales y equipo de laboratorio se usó catorce tubos de ensayo de 13 x 100 mm, pipetas
de 1ml, 2ml, 5ml y 10ml, pizeta con agua destilada, además de un Baño María a las
temperaturas aproximadamente de 2 °C, 37 °C y 65 °C. Para determinar la influencia del
pH y la temperatura, se utilizaron las siguientes soluciones: Almidón al 1%, cloruro de
sodio a 0.1M, amilasa al 1/2%, ácido clorhídrico a 0.05M, buffer fosfato 0.05M. pH 6.8
y solución yodada y agua destilada.

El experimento inició con la verificación previa de los materiales, confirmando que se

encontraron limpios y en buen estado, se procedió a realizar el experimento, los cuales
fueron dos, uno para el análisis del pH y el otro para la temperatura; cada uno tuvo dos
etapas, una de incubación y la otra de valoración enzimática.

La primera parte del experimento se enfocó en el análisis del efecto del pH y la primera
fase del mismo consistió en realizar un sistema de incubación enzimática, para ello se usó
tres tubos de ensayo, rotulándolos con el número de T1, T2 y T3 respectivamente, a los
cuales se agregó la misma cantidad: 0.5 ml de solución de almidón al 1%, buffer pH 2.5
solo a T1 una cantidad de 1.5 ml, buffer pH 6.9 solo a T2 una cantidad de 1.5 ml y buffer
pH 9.5 solo a T3 una cantidad de 1.5 ml. Luego se agregó la solución de cloruro de sodio
a 0.1N, en cantidad de 0.25 a los tres tubos. Se mezcló y se pre-incubó en Baño María a
37 °C por 15 minutos; posteriormente se agregó la solución de amilasa salival al 1/2%
solo a todos los tubos. Finalmente se mezcló suavemente e incubar a 37 °C por diez
minutos. Se realizó la pre-incubación para poder darle las condiciones óptimas al medio
para que la enzima logre adaptarse y realizar con eficiencia su función.
La segunda etapa consistió en determinar la valoración de la actividad enzimática por el
sustrato residual, la cual se realizó simultáneamente con el proceso de incubación por 15
minutos, se usaron cuatro tubos de ensayo, rotulados como T1, T2, T3 y TESTIGO,
agregando la misma cantidad 0.5 ml a loa tubos excepto al TESTIGO, a él se le agregó
2ml, de solución de ácido clorhídrico a 0.05N. Luego se agregó 0.25 ml de los tubos de
la primera parte T1, T2, T3 a los nuevos tubos T1, T2, T3, respectivamente; y al tubo
TESTIGO se le agregó la solución de almidón al 1%, una cantidad de 0.25ml. Finalmente
0.25 ml de solución yodada a todos los tubos de esta parte.

La segunda parte del experimento se enfocó en el análisis del efecto de la temperatura y

la primera parte del mismo consistió en realizar nuevamente un sistema de incubación
enzimática, para ello se usó tres tubos de ensayo, rotulándolos de la misma manera que
en la primera parte, con el número de T1, T2 y T3 respectivamente, a los cuales se agregó
la misma cantidad: 0.5 ml de solución de cloruro de sodio a 0.1N, solución de amilasa
salival al 1/2% solo a todos los tubos en cantidades de 0.25 ml y buffer fosfato 0.05M.
pH 6.8, a los tres tubos una cantidad de 1.5 ml. Posteriormente se mezcló suavemente e
incubó cada tubo T1, T2 y T3 a una temperatura de 2 °C, 37 °C y 65°C respectivamente
por cinco minutos. Finalmente se agregó 0.5 ml de solución de almidón al 1%, a todos
los tubos.

La segunda fase donde se determinó la actividad enzimática se realizó de la misma

manera que para los efectos del pH.

III. RESULTADOS:

Los resultados obtenidos se registraron en las siguientes tablas:

Tabla Nº 1: Detección y medición de la actividad enzimática de la amilasa salival por el

sustrato residual por influencia del pH:
Nº DE TUBOS T1 T2 T3 TESTIGO
PH 2.5 6.9 9.5 -
COLOR INICIAL Incoloro Incoloro Incoloro -
COLOR FINAL Marrón Oscuro Amarillo Naranja Rojo Negro
ACTIVIDAD
No SI Regular No
ENZIMÁTICA
SUSTRATO Abundante Ausente Escasa Abundante
Tabla Nº 2: Detección y medición de la actividad enzimática de la amilasa salival por
el sustrato residual por influencia de la temperatura:

Nº de Tubos T1 T2 T3 TESTIGO
T °C 4 37 65 -
COLOR INICIAL Incoloro Incoloro Incoloro -
COLOR FINAL Naranja Amarillo Marrón Oscuro Negro
ACTIVIDAD
Regular Abundante No No
ENZIMÁTICA
SUSTRATO Escaza Ausente Abundante Abundante

IV. DISCUSION:

Respecto a la tabla 1, los efectos del ph en la actividad enzimática muestran que en el

tubo T2 el ph óptimo de la amilasa salival es de 6.9 aproximadamente, ya que se obtuvo
una ausencia de sustrato residual, mientras que en el tubo T3 hay un ph de 9.5 con una
actividad enzimática regular y una escasa presencia de sustrato residual, y en el resto de
tubos un poco o nula presencia de actividad enzimática; lo que confirma que la enzima
en un medio con pH optimo ejerce por efecto de los protones una disociación de
distintos grupos de sustrato y específicamente en la enzima, en su participación en la
unión enzima-sustrato, en el mecanismo catalítico y en el mantenimiento
conformacional de la enzima. Donde el medio con un mayor o menor ph respecto al
óptimo, disminuye la actividad enzimática. (Leninger Alber (2000) Principios de
bioquímica.2°ed. España: Omega).

Respecto a la tabla 2 la presencia de la temperatura genera un efecto en la velocidad de

la actividad enzimática en la amilasa salival, donde la óptima es de 37°C, ya que en el
tubo se observó una ausencia de sustrato residual, lo que confirma que para el realice
óptimo de su función tiene que tener una temperatura aproximada a la corporal.
(Mathews, Van Holde, Ahern (2002). 3°ed.Mexico: Pearson)

V. CONCLUSIONES:

La detección y la determinación de la actividad enzimática de la amilasa salival, se

concluye que el pH y la temperatura tienen un efecto sobre la velocidad de la reacción
enzimática del material biológico que se analizó.
La valoración de la actividad enzimática por el sustrato residual confirma la usencia y
presencia de sustrato residual, el cual depende de la presencia de la actividad
enzimática.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

(Berg, Tymoczko y Stryer (2003) Boquimica. 5° ed. España: Editorial Reverte, S.A)

(Lenheniger David, Cox Michael (2009) Principios De Bioquímica. 5° ed. Barcelona:

Ediciones Omega, S.A.)

Leninger Alber (2000) Principios de bioquímica.2°ed. España: Omega.

Mathews, Van Holde, Ahern (2002). 3°ed.Mexico: Pearson.