VALIDAÇÃO DE MÉTODOS

MICROBIOLÓGICOS

AGOSTO/2013
Sarah Marçal
Graduação: Farmácia Habilitação em Indústria e Análises Clínicas
– UFOP
Pós Graduação: Assuntos Regulatórios – ICTQ
Experiência Profissional: Controle de Qualidade, Garantia da
Qualidade e Assuntos Regulatórios.
Objetivo da aula:

DESCREVER OS PRINCÍPIOS FUNDAMENTAIS DE

VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
MICROBIOLÓGICOS
Aplicações da validação microbiológica:

• Produtos biológicos;
• Instrumentos médicos;
• Matérias-primas;
• Produtos farmacêuticos;
• Produtos alimentícios.

Exemplo de métodos:

• Dosagem microbiológica de antibióticos;

• Potência de ensaio biológico (vitaminas);
• Endotoxina bacteriana.

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 Tópicos para Discussão
• Bases legais  RDC ?

• Validação X Verificação da Adequabilidade;

• Se constatada a necessidade de validação de

metodologia, porque validar?

• “Validação de meio” e “Validação de

microrganismo”
 Validação de Métodos Microbiológicos

Considerações gerais

Toda documentação de validação deve ser procedida de

protocolos previamente aprovados, com a definição dos
parâmetros e dos critérios de aceitação para cada método
e parâmetro.

Qualquer desvio do protocolo deve ser devidamente

documentado e o impacto do desvio investigado.

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 Validação de Métodos Microbiológicos

Considerações gerais

Todos os equipamentos utilizados como parte de um

método devem estar previamente calibrados e quando
apropriado realizar a qualificação de instalação, operação
e desempenho, bem como avaliar os itens referentes a
sistemas computadorizados.

Procedimentos escritos e aprovados devem descrever a

preparação, etiquetas, estocagem e uso dos reagentes de
laboratório como soluções, tampões e padrões de
referência.
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 Validação de Métodos Microbiológicos

Considerações gerais

Estudos de verificação e validação de métodos

bioanalíticos devem ser documentados e retidos de
acordo com a política de retenção de documentos
vigentes.

Todo controle de mudanças deve ser previamente aberto e

aprovado pelas áreas correlacionadas.

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 Validação de Métodos Microbiológicos

Considerações gerais

A verificação de um método microbiológico compendial

deve ser realizada sob as atuais condições de uso de
acordo com a aplicabilidade compendial para o produto e
incluir, mas não estar limitado à avaliação dos seguintes
parâmetros:

•Especificidade
•Recuperação e/ou quantificação de cada analito.

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 Validação de métodos Microbiológocos
Antecedentes:
• Qualificação de Equipamentos;
• Qualificação de Área;
• Calibração de vidrarias;
• Procedimento Operacional Padrão;
• Treinamentos dos analistas;
• Pesquisa em compêndios oficiais reconhecidos
pela ANVISA ;
• Protocolo de Validação;
 Validação de Métodos Microbiológicos
Protocolo:
• Folha de aprovação
• Histórico
• Objetivo
• Escopo
• Responsabilidades
• Estratégia de Validação
• Reagentes, materiais e equipamentos
• Critérios de aceitação
• Referências
 Validação de Métodos Microbiológicos
Relatório:
• Folha de aprovação
• Histórico
• Objetivo
• Estratégia de validação
• Dados e resultados
• Gráficos
• Conclusão
 Validação de Métodos Microbiológicos

Na validação de métodos analíticos

microbiológicos é importante que as propriedades
antimicrobianas sejam neutralizadas para
recuperação dos microrganismos viáveis.

A neutralização pode ser alcançada com uso de

alguns métodos como o uso de neutralizantes
específicos, diluição, filtração e lavagem.
 Métodos de Neutralização
• Inibição Química: A ação rápida dos neutralizantes
químicos favorecem a sua utilização na indústria, como
por exemplo, na fabricação de antibióticos que é usada
a penicilinase.

• Diluição: O fator diluição colabora para reduzir o poder

bactericida de algumas substâncias e propiciar o
crescimento bacteriano.

• Filtração em membrana: Muito utilizado nos testes de

esterilidade. Este método depende da retenção física do
microrganismo na membrana filtrante.
 Neutralizantes

CONSERVANTES AGENTE NEUTRALIZANTE

Álcool Diluição
Aldeídos Diluição, Tiossulfato, Glicina
Bi-Guanidas Lecitina
Cloreto de mercúrio e outros mercuriais Tioglicolato, Tiossulfato de Sódio
Clorhexamida Polissorbatos e Lecitina
Compostos amônio quaternários Lecitina, Polissorbato 80
Compostos Fenólicos Diluição e Polissorbato 80
EDTA Ions de Mg++ e Ca++
Glutaraldeído Glicina e Bissulfito de Sódio

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 Neutralizantes

CONSERVANTES AGENTE NEUTRALIZANTE

Halogênios Tiossulfato
Hipoclorito de Sódio Tiossulfato de Sódio
Ácidos Orgânicos e seus Ésteres Diluição e Polissorbato 80
Parabenos Polissorbato 80 e Lecitina
Sorbato Diluição
Antibióticos beta-lactâmicos Beta-lactamase
Cloranfenicol Cloranfenicol acetiltransferase
Sulfonamida Ácido p-aminobenzóico
Trimetoprima Timidina

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 Métodos de Neutralização

• A aderência do agente microbiano residual

podem causar inibição do crescimento
microbiano.

• O conservante pode ser diluído ou lavado,

fazendo a rinsagem da membrana com um
fluído inerte.

• Referência: Fluido A do capítulo <71> da USP.

 Métodos de Neutralização

• Durante a realização da validação do método

microbiológico, após realizar todas as tentativas
com os métodos de neutralização e não obter
sucesso, pode assumir que o produto não é
susceptível a contaminação microbiana pelas
espécies testadas.

• O ideal é conhecer a flora microbiana local e realizar

os testes com estes microrganismos.

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 Adequação/Verificação de Métodos
Microbiológicos

Método Parâmetros
Contagem e Pesquisa de Patógenos Recuperação Qualitativa e
Quantitativa dos Microrganismos
Identificação dos Microrganismos
Esterilidade Recuperação Qualitativa
LAL Confirmação da Sensibilidade da
Curva
Doseamento Microbiológico Especificidade, Precisão, Exatidão e
Linearidade

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 “Validação” de Métodos Microbiológicos

• Contagem Microbiológica: Contagem em

Placa, Filtração por Membrana e Tubos
Múltiplos (MNP).

• Pesquisa de Patogenos: Meios seletivos.

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 “Validação” de Métodos Microbiológicos

Teste de Recuperação:

• Padronização da suspenção microbiana;

• Controles positivos e negativos;
• Procedimento realizado em triplicata;
• Critério de aceitação: FB e USP.

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 “Validação” de Métodos Microbiológicos

Teste de Identificação:

• Teste sequencial a verificação da Contagem;

• Verificação da capacidade promotora de

crescimento dos meios seletivos.

22
 “Validação” de Métodos Microbiológicos

Conclusões:

• Resposta positiva de crescimento de microrganismo 

a metodologia pode ser utilizada sem alterações.

• Ausência de crescimento microbiano  Investigação

das falhas e/ou adequar a metodologia de análise.

23
 “Validação” de Métodos Microbiológicos

• Esterilidade: Método de filtração por membrana,

método de inoculação direta.

• A conformidade do método deve ser verificada

através dos testes de Basteriostase e Fungistase.

24
 “Validação” de Métodos Microbiológicos

USP 1227 – Teste de esterilidade <71>:

• Adicionar ao copo de filtração parte do diluente a ser

utilizado. Filtrar.

• Adicionar ao copo de filtração a amostra a ser analisada.

Filtrar.

• Lavar 3 vezes com 100mL com o diluente.

• Cortar a membrana ao meio e colocar a metade em

triglicolato fluido e a outra metade em TSB.

• Critério de aceitação: Isento de microrganismo.

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Teste de Bacteriostase e Fungistase – Membrana
Filtrante:

• O produto é filtrado através de uma membrana, seguido

por duas rinsagens de 100mL de fluido neutralizante.

• A terceira rinsagem deve conter 100mL do fluído

contendo menos de 100 UFC de microrganismo teste.

• Retirar a membrana e incubar nos meios de cultura

recomendados.

• Comparar o crescimento de microrganismo com o teste

sem o produto (controle positivo).

26
 “Validação” de Métodos Microbiológicos

Conclusões:

• Resposta positiva de crescimento de microrganismo 

a metodologia pode ser utilizada sem alterações.

• Ausência de crescimento microbiano  Investigação

das falhas e/ou adequar a metodologia de análise.

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 “Validação” de Métodos Microbiológicos

Teste de Endotoxinas Bacterianas:

• Utilização do extrato aquoso dos amebócitos circulantes

do Limulus polyphemeus e Tachypleus Tridentatus 
reagente de LAL.

• Técnicas: Método de coagulação em gel e Fotométricos

(turbidimétrico e cromogênico).

• Materiais utilizados devem ser despirogenizados ou

materiais descatáveis com indicação livre de pirogênios.
28
 “Validação” de Métodos Microbiológicos

Teste de Endotoxinas Bacterianas:

• Coagulação em gel: A validação é realizada através de

testes de potenciação ou inibição.

• Métodos fotométricos: A curva de calibração do

equipamento deve ser validada.

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Validação de Metodologia Para Doseamento de
Microbiológico – Teor de Antibióticos

• Método de Diluição seriada

• Método Turbidimétricos:
- Similar ao método diluíção;
- Não se caracteriza por ser um avaliação tudo ou nada;
- Construção de uma curva que correlaciona a
concentração do antibiótico com a turbidez resultante.

• Método de Microplacas: extrapolação do ensaio

turbidimétrico.

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Validação de Metodologia Para Doseamento de
Microbiológico – Teor de Antibióticos

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Validação de Metodologia Para Doseamento de
Microbiológico – Teor de Antibióticos

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Validação de Metodologia Para Doseamento de
Microbiológico – Teor de Antibióticos

• Atividade em grupo!

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 Métodos Alternativos

• O laboratório microbiológico pode utilizar métodos

alternativos comparado aos oficiais para recuperação
microbiana e identificação.

• O capítulo da USP <1225> define características como

exatidão, precisão, especificidade, limite de detecção,
limite de quantificação, reprodutibilidade, robustez na
aplicação de métodos analíticos.

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 Métodos Alternativos

• Comumente empregados nas Análises Clínicas e

recentemente adotados pelas indústrias de alimentos.

• Apresentam custo de implementação elevado, porém a

longo prazo podem representar um excelente opção.

• Em 2004, o FDA aprovou um MA para liberação de lotes

de produtos de terapia celular da Genzyme, Carticel ®.

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 Métodos Alternativos

• São métodos com limites de detecção mais baixos e

podem revelar preocupações microbiológicos que os
métodos menos robustos não podem detectar.

• A partir de uma perspectiva de negócios, o custo de

validação pode ser muito alto ou o retorno sobre o
investimento muito longo.

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 Métodos Alternativos

Métodos Qualitativos:

• Impedância ou Condutividade: Avaliação de

alterações iónicas nos meios de comunicação a partir de
subprodutos produzidos durante o crescimento
bacteriano.
• Detecção de CO2: Detecção do dióxido de carbono
produzido pelo metabolismo microbiano através de
detector colorimétrico. Vantagem: capacidade de
recuperar os microorganismos para investigações de
falhas ou identificação após análise.

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 Métodos Alternativos

• Pressão de Headspace: Detecta o crescimento

microbiano como resultado de consumo ou produção de
gases na câmara. A alta resolução de varredura do laser
é responsável pela identificação de mudanças nas
câmara. Segundo seus idealizadores o equipamento é
mais sensível que os detectores de CO2, pois permitem
identificar outros gases produzidos pelos
microrganismos.

• Outras Técnicas: Citometria de Fluxo e ATP

Bioluminescência.
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 Métodos Alternativos

Métodos Quantitativos:

• Scanning Laser direto: lasers para fazer a varredura

de microrganismos que crescem em filtros de membrana
com imagens ópticas usando uma câmera digital.
Permite a detecção e enumeração de microcolônias
dentro de poucos dias. Vantagem: redução do tempo e
os microorganismos permanecem viáveis para a
identificação de colónias.

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 Métodos Alternativos

PCR: Os iniciadores ou primer / sonda amplificam regiões

específicas altamente conservadas dos genomas
bacterianos, mycoplasmal ou fúngica.

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Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

A validação deve incluir os seguintes parâmetros:

• Exatidão;
• Precisão;
• Especificidade;
• Limite de detecção;
• Limite de quantificação;
• Linearidade;
• Reprodutibilidade;
• Robustez.
41
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Exatidão

• Representa o grau de concordância entre os resultados

individuais encontrados pelo método alternativo e os
valores aceitos como referência.

• Geralmente expressa pela porcentagem de recuperação

de um microrganismo pelo método.

42
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>
Exatidão

Deve ser estabelecida por um limite especificado pelo método:

• Utilize culturas microbianas puras para cada microrganismo que

deve ser identificado;
• Prepare uma suspensão de microrganismos no limite superior do
teste e dilua seriadamente até o limite inferior do teste;
• Calcule a quantidade de células esperadas da cultura microbiana
para um mínimo de cinco diluições em série;
• Analise um mínimo de duas replicatas em cada uma das cinco
concentrações da faixa do método;
• Obtenha um critério de aceitação numa faixa de 70-130% de
recuperação para cada microrganismo baseado em uma
comparação de resultados de testes atuais com os resultados
esperados das diluições usando o limite superior do teste como
uma referência de 100%.
43
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Precisão

• Representa o grau de repetibilidade entre os resultados

de análises individuais, quando o procedimento é
aplicado diversas vezes numa mesma amostra
homogênea, em idênticas condições de ensaio.

• Geralmente expressa pelo desvio padrão ou desvio

padrão relativo (coeficiente de variação).

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Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>
Precisão

Procedimento:

• Utilize culturas microbianas puras para cada microrganismo

que deve ser identificado;
• Prepare uma suspensão de microrganismos no limite superior
do teste e dilua seriadamente até o limite inferior do teste;
• Analise um mínimo de duas replicatas para cada cinco
concentrações através da faixa do método;
• Repita a análise em uma segunda suspensão;
• Realize uma avaliação estatística dos dados (ex: coeficiente
de variação, ou seja, desvio padrão relativo) em uma faixa
entre 15 e 35% para uma contagem microbiana aceitável.

45
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Precisão intermediária (intra-laboratório):

• Um mínimo de 3 (três) concetrações (baixa, média e

alta), contemplando a faixa de variação do
procedimento, determinada em corridas diferentes, com
diferentes analistas em diferentes dia de testes;
• Analisando-se no mínimo 5 (cinco) determinações por
concentração;
• Pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR)
ou coeficiente de variação, não se admitindo valores
superiores a 15%.

46
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Especificidade
• Habilidade do método bioanalítico de medir e diferenciar o
analito de componentes que possam estar presentes na
amostra, tais como metabólitos, impurezas, compostos de
degradação ou componentes da matriz.

• Determinado durante a validação selecionando o método

junto a uma faixa de microrganismos representativos e tipos
de amostras para demonstrar que o método é adequado para
este propósito.

• Todos os microrganismos representativos devem ser isolados

de forma bem sucedida e contados de um tipo de amostra
específica. 47
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Limite de Detecção

• Menor concentração de um analito que o procedimento

bioanalítico consegue diferenciar confiavelmente do
ruído de fundo.

48
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Limite de Detecção

Pode ser determinado por uma análise da amostra com

concentrações conhecidas de microrganismos:

• Use uma amostra original antes de qualquer passo de

incubação;
• Um mínimo de cinco replicatas de controle positivo deve
ser avaliada para cada microrganismo a ser detectado;
• Estabeleça um nível mínimo em que um microrganismo,
quando presente na amostra, possa ser detectado
durante o tempo de ensaio.
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Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Limite de Quantificação

• Menor / Maior quantidade de um analito numa amostra

que pode ser determinada quantitativamente com
precisão e exatidão aceitáveis.

• Deve ser determinado pela análise de um mínimo de

cinco replicatas para cada uma das cinco concentrações
dentro da faixa do método. O LQ deve estabelecer o
nível mínimo que um microrganismo, quando presente
na amostra, pode ser quantificado durante o tempo do
ensaio.
50
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Limite de Quantificação

• O limite de quantificação deve ser maior que o do

método tradicional.

• O novo método deve demonstrar que é ao menos tão

sensível quanto o método tradicional para os limites
inferiores semelhantes.

51
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Linearidade

• Corresponde à capacidade do método de fornecer

resultados diretamente proporcionais à concentração da
substância em exame (analito).

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Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Linearidade

Deve ser avaliada dentro da faixa do método durante a

validação:

• Prepare a suspensão de um microrganismo na faixa

superior e dilua seriadamente até a menor faixa;
• Analise um mínimo de duas replicatas para cada uma
das cinco concentrações dentro da faixa do método;
• Uma medida apropriada seria calcular o quadrado do
coeficiente de correlação (r2) de uma análise de
regressão linear dos dados gerados.
• O método alternativo não deve ter um r2 inferior a 0,95. 53
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Reprodutibilidade

• Precisão entre dois laboratórios. Também representa a

precisão do método sob as mesmas condições
operacionais, num curto período de tempo,
demonstrando que operações diferentes e variáveis no
meio ambiente (ex. diferentes analistas, equipamentos,
lotes de reagentes e laboratórios) não influenciam na
confiabilidade do teste sob condições normais do
laboratório.

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Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

Reprodutibilidade

• Métodos quantitativos alternativos (não compendiais)

devem ser testados para demonstrar a reprodutibilidade,
precisão e exatidão quando usados em dois ou mais
laboratórios, realizados com diferentes equipamentos e
por dois ou mais analistas. O experimento de
reprodutibilidade pode incluir amostras preparadas de
uma amostra homogênea ou composta por pelo menos
dois analistas diferentes em mais que um dia, e os
métodos executados em dois ou mais laboratórios.
55
Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>
Robustez

• Demonstração de que pequenas e controladas

mudanças nos parâmetros do método não afetam sua
confiabilidade.
• Mudanças acima de 20% em itens como concentração
de reagentes críticos, parâmetros na operação de
instrumentos e temperaturas de incubação devem ser
avaliadas.
• É essencial que uma estimativa da robustez do método
seja desenvolvida.

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Validação de Métodos Alternativos – USP <1223>

O relatório de validação dos métodos deve incluir, mas não

estar limitado ao seguinte:

• Um resumo completo dos resultados;

• Inclusão da referência para suportar os dados
incompletos;
• Discussão dos desvios, ações corretivas e mudanças
resultantes;

57
 Validação de Métodos Microbiológicos

Alterações que podem impactar na revalidação de um

método:

• Mudanças no método bioanalítico (procedimento

modificado ou novo procedimento na preparação de
amostras, mudanças nas condições de detecção, mudança
nas configurações dos instrumentos e/ou condições de
operação).
• Mudança na amostra a ser testada (mudança no
processo para ativos ou mudanças na composição do
produto).
• Mudanças nos requerimentos compendiais ou
regulatórios (EMEA, FDA). 58
 Referências Bibliográficas

• ANVISA – RE 899 de 29 de maio de 2003;

• ANVISA – RDC 17 de 16 de abril de 2010;
• USP 36 Chapter <1117>
• USP 36 Chapter <1123>
• USP 36 Chapter <1125>
• USP 36 Chapter <1126>
• Farmacopeia Brasileira 5 Edição;

59
"...Para viver de verdade, pensando e repensando a existência, para que ela
valha a pena, é preciso ser amado; e amar; e amar-se.
Ter esperança; qualquer esperança.

Questionar o que nos é imposto, sem rebeldias insensatas mas sem

demasiada sensatez.
Saborear o bom, mas aqui e ali enfrentar o ruim.
Suportar sem se submeter, aceitar sem se humilhar, entregar-se sem
renunciar a si mesmo e à possível dignidade.
Sonhar, porque se desistimos disso apaga-se a última claridade e nada mais
valerá a pena.
Escapar, na liberdade do pensamento, desse espírito de manada que
trabalha obstinadamente para nos enquadrar, seja lá no que for.
E que o mínimo que a gente faça, seja, a cada momento, o melhor que afinal
se conseguiu fazer."
- Lya Luft
MUITO OBRIGADA!!!!