Introducción a la

Genética Molecular

Prof. Dra. Carina M. Rivolta

Gregor Mendel, 1865
 Francis Crick y James Watson
Rosalind Franklin 1953
1950-1953
“PROYECTO GENOMA HUMANO”

1999 2000
Def. genoma?

Genoma nuclear: 3000 mill de pb x 2

 desarrollo de la Biología Molecular

genes estructura
secuencia
expresión
regulación

alteración de secuencia - cambio genotipo

ALTERACION
fenotipo clínico
MOLECULAR
CROMOSOMA 8
 genoma haploide: 3000 millones de pb

•cromosoma 1: 250 millones de pb

•cromosoma X: 150 millones de pb
citogenética •cromosoma 21: 50 millones de pb
•1 banda: 10 – 20 millones de pb
•1 sub-banda: 2 – 5 millones de pb

•bacteriófago λ: 50.000 pb
•gen eucariota medio: 20.000 pb
biol. molecular
•exón: 50 – 1.000 pb
•mutación puntual: 1 pb
Solo evidenciamos la patología viable!!!
 ADN nuclear

• genoma: 6 x 109 pb
•23 pares de cromosomas
44 autosomas
2 sexuales
•30 a 35.000 genes
•herencia mendeliana
•segregación meiótica
 ADN mitocondrial

• genoma: 17.000 pb
•circular
•hasta 10 copias / mitoc.
centenares de mitoc. / cel.
•37 genes
•herencia materna
•segregación mitótica
 gen eucariota

CAAT ATG TAA/TAG/TGA

5´ 3´

E1 i1 E2

TATA GT AG AATAAA

-Definición
-Tamaño
-Importancia de los intrones.
 mRNA policistrónico procariota

Los mRNA policistrónicos con frecuencia codifican

proteínas que cumplen funciones relacionadas.
 Splicing
alternativo
 gen eucariota

CAAT ATG TAA/TAG/TGA

5´ 3´

E1 i1 E2

TATA GT AG AATAAA

-Definición
-Tamaño
-Importancia de los intrones.
 citoplasma núcleo
promotor exón
intrón
Gen
Transcripción

ARN premensajero

Empalme
ARN mensajero (Splicing)

Proteína Traducción
MUTACION
 Fidelidad y Estabilidad de la secuencia de ADN.

• El DNA es una molécula estable.

• La replicación, la reparación, la recombinación

homóloga del ADN se producen con una gran fidelidad.

• Estos procesos aseguran que los genomas de un tipo

de organismo sean casi idénticos de una generación a la
siguiente.

• Sin embargo, cabe destacar que hay procesos

genéticos que modifican la secuencia del DNA y así
conducen a una estructura genómica más dinámica.
 MUTACION
cambio en la secuencia de bases del ADN
información codificada
señales expresión
maduración transcriptos

EFECTOS

POSITIVO NEUTRO NEGATIVO

evolución polimorfismos enfermedad
Herramientas para determinar susceptibilidad
de enf. o protección para otras.
 Mutaciones espontáneas (10-6 – 10 -11)
Causas de •Errores durante la replicación
Mutaciones •Lesiones o daños fortuitos
•Elementos genéticos transponibles

Mutaciones Inducidas
•Agentes mutagénicos
químicos
físicos
 MUTACIONES
CLASIFICACION POR TAMAÑO

•macrolesiones: alteraciones cromosómicas

-estructurales
citogenética
-numéricas

•microlesiones: alteraciones génicas

de megabases a
biol. molecular 1 pb (mutación puntual)
 MACROLESIONES

CAUSAS accidentes meióticos o mitóticos

NUMÉRICAS monosomía
trisomía (ej. Trisomía par 21
(viable)).
ESTRUCTURALES translocación
inserción / deleción
amplificación
inversión
 MICROLESIONES
CAUSAS agentes químicos y físicos

• Análogos de base
•Agentes alquilantes
• Agentes intercalantes
• Rayos X
• Radiación gamma
• Radiación UV

errores en la replicación
 MICROLESIONES

EFECTOS regiones codificantes

regiones no codificantes
 MICROLESIONES

Desaminación

CGA →TGA
R → Stop
Ej. de microlesiones: Mutaciones puntuales
por sustitución en región codificante
 MICROLESIONES

•deleción: 1pb a genes completos

Cambio en el
marco de
•inserción: incluyen duplicaciones
lectura

•mutaciones dinámicas
 Mutaciones que cambian el marco de
lectura (Inserciones o deleciones)

Ej. Deleción de un nucleótido

AAA TCA CTT GGC

Phe Ser Glu Pro

AAA TCAC TTG GCG

Phe Val Asn Arg
 deleciones

ζ ψζ1
ψζ ψα2
ψα ψα1
ψα α2 α1 θ

α3.7
-α
α+ talasemia α4.2
-α

--MED

--SEA
α0 talasemia

α)20.5
-(α
 mut. puntuales- región no codificante

•región promotora
región 5´no traducible

•splicing sitio aceptor y dador

sitios crípticos exónico
intrónico
•señal de terminación
•señal de poliadenilación
 Química del Splicing

Intrón

5´ … AG GUA/GAGU……………A…………(seg. Py)AG G… 3´

Sitio de splicing 5´ Sitio de splicing 3´

Sitio de ramificación

Secuencias dentro del RNAm determinan donde

se produce el splicing.
 Errores de splicing

Salteo exónico Selección de pseudositio

de splicing

Ex. 1 2 3 Ex. 1 2
DNA

Pre-RNAm5´ 3´ 5´ 3´

RNAm 5´ 3´
“Seudositio de empalme”
“incorrecto”
5´ 3´
 mut. puntuales- región no codificante

•región promotora
región 5´no traducible

•splicing sitio aceptor y dador

sitios crípticos exónico
intrónico
•señal de terminación
•señal de poliadenilación
 Mutaciones puntuales en el gen de β-globina

-87 6 16 110 39 1 745

5’ ex.1 ex.2 ex.3 3’

codón sin sentido

deleción de 1 b = cambio de marco de lectura

aceptor de splicing

sitio críptico de splicing

región promotora
 CLASIFICACIÓN DE MUTACIÓN
POR SU FUNCIÓN

pérdida de función
son las más frecuentes
distintas mutaciones = fenotipo

ganancia de función
homogeneidad mutacional
por acumulación (efecto tóxico)
por interferencia con la proteína
normal
 MUTACIONES DINÁMICAS

• expansión de tripletes inestables

regiones no codificantes:
síndrome de X-frágil (gen FMR1) (CGG)n
normal: n < 50, mutado: n > 250

regiones codificantes:
Corea de Huntington
expansión (CAG)n → (glutamina)n
normal: n: 11 a 26 , mutado: n > 39
 Enfermedad de Huntington

-Dr. George Huntington en Long Island (1.872)

-origen en Nueva Inglaterra
-más de 1.000 casos

•comienzo: en adultos (40 ± 10 años)

•progresa por 15 a 20 años

•forma juvenil: comienza antes de los 20 años,

trastornos de aprendizaje y movimiento, rigidez

•las nuevas generaciones tienen cuadros más

graves o comienzo más precoz.
 Enfermedad de Hungtinton

Clínica

•trastorno neurodegenerativo - demencia

•muerte neuronal selectiva y progresiva

•movimientos involuntarios

•deterioro de funciones intelectuales y disturbios

cognitivos, episodios maníacos, tendencia suicida
 Diagnóstico

•Confirmatorio en pacientes.

•Puede elaborarse a corta edad, en la etapa

presintomática, mayores de 18 años, en
pacientes de riesgo .

•Problemas éticos.
gen: IT15 o huntingtina (67 exones y 66 intrones)
350 kDa, 3144 aa

exón 1
promotor intrón 1
(CAG)n

(glutamina)n

Normal = 11 a 26 repeticiones

Fenotipo Enfermo= > 39 repeticiones

herencia: autosómica dominante

Errores en la duplicación por “Slipagge” de la polimerasa
 32P
PCR

HD3 HD5

(CAG)n

ex. 1 - IT15

electroforesis
radioautografía

Muestras
+
secuencia
de fago M13
 GACT
(CAG) n = 66

(CAG) n =41 a 50

(CAG) n = 14 a 23
 Cambio de
Polimorfismos
sentido
ALTERAR
neutros
FUNCION
PROTEINA
Sin sentido
VARIANTES
GENOMICAS
(VG) ALTERAR
EXPRESION
Mutaciones DEL GEN
asociadas a
enfermedades

MUTAGENESIS IN VITRO SITIO DIRIGIDA

Técnica mediante la cual se puede

introducir una mutación definida in vitro,
en una secuencia de ADN clonado
 CLASIFICACION DE
ENFERMEDADES GENETICAS
 FACTORES GENETICOS

FACTORES PREDISPONENTES

ALTERACION MOLECULAR

FACTORES DESENCADENANTES

FACTORES AMBIENTALES
 PATOLOGÍA MOLECULAR

•PATOLOGÍAS HEREDITARIAS

♦AUTOSOMICAS Familiares
♦LIGADAS AL CROMOSOMA X “De Novo”

•PATOLOGÍAS NO HEREDITARIAS
♦SOMATICAS
 •PATOLOGÍAS HEREDITARIAS

Dominantes Recesivas
 PATOLOGÍA HEREDITARIA RECESIVA

Gen Materno

Gen Materno

Gen Materno

Gen Materno
Gen Paterno

Gen Paterno
Gen Paterno

Gen Paterno
genotipo
Homocigota Heterocigota Homocigota Doble Heterocigota

fenotipo
Normal Normal – Portador!!! Enfermo Enfermo

: Mutación
PATOLOGÍA HEREDITARIA DOMINANTE

Gen Materno
Gen Materno

Gen Paterno
Gen Paterno
genotipo
Homocigota Heterocigota

fenotipo
Normal Enfermo

: Mutación
 PATOLOGÍA HEREDITARIA

AUTOSÓMICA
dominante recesiva
enf. Huntington fibrosis quística
poliquistosis renal talasemia mayor
ataxia espinocerebelosa fenilcetonuria

LIGADA AL CROMOSOMA X

dominante recesiva
hipofosfatemia daltonismo
hemofilia A, B
X- frágil
 PATOLOGÍA HEREDITARIA

MONOGÉNICAS
♦monoalélicas ♦polialélicas
drepanocitosis hemoglobinopatías
defecto de α1- anti tripsina fibrosis quística
Distrofia Muscular de
Duchenne / Becker

COMPLEJAS

diabetes mellitus ateroesclerosis

hipertensión arterial esclerosis múltiple
 PATOLOGÍA HEREDITARIA

ADN mitocondrial
•poco frecuentes

•mutaciones puntuales
atrofia óptica de Leber
genes de ARNt: ej. lisina y leucina

•rearreglos complejos
miopatía mitocondrial
encefalomiopatía
episodios de acidosis láctica
 PATOLOGÍA MOLECULAR resumen

HEREDITARIA SOMÁTICA

dominante
genotipo / fenotipo recesiva

nuclear autosómica
genoma ligada al X
mitocondrial

monogénica
nº de genes compleja

monoalélica
nº de alelos
polialélica
DIAGNOSTICO
MOLECULAR

Cátedra de Genética y Biol. Molecular

Fac. Farmacia y Bioquímica – U.B.A.
 DIAGNOSTICO MOLECULAR

Objetivo:

Búsqueda de variaciones de secuencia en el ADN

-asociadas o no a patología.

codificantes
-en regiones
No codificantes
 DIAGNOSTICO MOLECULAR
Etapas:
- Identificar el gen

- Identificar mutaciones en los individuos con

la patología

- Determinar la frecuencia de mutaciones en la

población

- Armar un sistema de diagnóstico útil para la

patología de interés.
 Para qué sirve conocer el gen implicado en una
enfermedad?

Gen mutado identificado

Mejor comprensión de la enfermedad

Posibilidad de diagnóstico Posible tratamiento

En pacientes asintomáticos,
sintomáticos o prenatalmente,
búsqueda de mutación en
otros miembros de la familia y
consejo genético.
Terapia convencional más racional
Terapia génica y modelos animales
para desarrollo de tratamientos.

Implicancia en el pronóstico, calidad de vida

Situación 1

Gen asociado a patología ya caracterizado

Analizo el ADN de pacientes con la patología.

Situación 2

Gen asociado a patología NO caracterizado

Identifico gen asociado

Estrategia General para la identificación de genes asociados
con enfermedades.
Situación 2a Situación 2b
Se conoce la proteína NO se conoce la proteína

Proteína purificada Análisis de ligamiento

Clonar el gen Identificación región cromosómica

Gen candidato

Búsqueda de mutaciones

Probar que la mutación causa la enfermedad

 Clonación funcional

Defecto bioquímico conocido

Aislamiento de la proteína, Proteína purificada y secuenciada

Producción de anticuerpos Sondas de ADNc

Identificación de clones + a partir de genotecas.

Caminata cromosómica para caracterizar el gen.

Búsqueda de mutaciones en individuos afectados

 Clonación posicional

Defecto bioquímico desconocido

Sin datos cromosómicos

Búsqueda de ligamiento (linkage)

Encontrar ligamiento a marcadores polimórficos

Situar el gen lo más precisamente posible preferentemente

con menos del 1 % de recombinación.

Situar el gen en un punto concreto de un cromosoma.

GENÉTICA GENÉTICA
INVERSA patología CLÁSICA

mapeo función tratamiento

genómico alterada

secuencia
expresada proteína diagnóstico

gen
terapia
génica

diagnóstico
 Marcadores moleculares

Características
-Se conoce la precisa ubicación en el genoma
-Polimórficos

Tipos
-SNP: Cambio de base única
-RFLP: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de
Restricción.
-VNTR: Número Variable de Repeticiones en Tandem
Minisatélites y Microsatélites
 Armado de un sistema de diagnóstico

Cuál es la utilidad de un estudio de ADN?

Qué tipo de muestra necesito y en qué condiciones?

Qué técnica de diagnóstico voy a realizar?

Qué cantidad de ADN necesito?

Qué técnica de purificación de

ácidos nucleicos voy a desarrollar?
 Purificación de ADN
cél. nucleada (ADN)
diploide: 6 pg (6 x 10-12 g)

135.000 cél. diploides 1 µg de ADN

genoma diploide: 6 x 109 pb

Consejo genético a nivel de células embrionarias.
 TECNICAS
MOLECULARES
 Estrategia

gen mutación diagnóstico

caracterizado conocida directo

Caracterizado indirecto
no caracterizado desconocida
 Diagnóstico directo

tamaño de la mutación

•grandes mutaciones
(Southern Blot)
•pequeñas mutaciones
(PCR + técnicas
complementarias)
 •Diagnóstico indirecto

•análisis de RFLP

•identificación de STR o VNTR

SOUTHERN BLOT
 SOUTHERN BLOT

hibridación corte
específica específico

SONDA ENDONUCLEASA
PRIMERS DE RESTRICCIÓN
 sonda
•ADN o ARN
•por lo menos 15 nucleótidos
•homóloga a ADN o ARN
•se hibrida en forma estable y específica
por reasociación de bases complementarias

•ADN genómico
tipos de
•ARN ADN complementario
sondas
•oligonucleótidos sintéticos
endonucleasa de restricción
 endonucleasa de restricción
alelo A: 11,0 y 3,5 Kb
alelo B: 14,5 Kb

Taq I

Taq I
Taq I

5’ 3’
exón exón

AA
Genotipos BB
AB
 Papel

Gel de agarosa Membrana de nylon

Electroforesis en Transferencia
Purificación del ADN
gel de agarosa
Corte con ER

Radioautografía Hibridación Marcación de la sonda

Deleciones en los
genes de α-globina Autorradiografía

α2 α1

-α
PCR
PCR
5’ 3’
3’ 5’

Desnaturalización
5’ 3’
3’ 5’

Annealing
5’ 3’ 3’ 5’

5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
Taq pol
Polimerización
dNTPs
5’ 3’ 5’ 3’

5’ 3’
3’ 5’
 5’ 3’ 5’ 3’
5’ 3’ 5’
3’

Desnaturalización
5’ 3’
3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

Annealing y Polimerización
5’ 3’ 5’ 3’

3’ 5’
5’ 3’
fragmentos limitados
3’ 5’ por primers
5’ 3’

5’ 3’
3’ 5’
desnaturalización
94 °C polimerización 94 °C
72 °C 72 °C

45 - 60 °C 45 - 60 °C
annealing

Primer ciclo Segundo ciclo

Unidad de transcripción
PCR Multiplex

491 pb

e 10

e 11

425 pb
 Detección de mutaciones puntuales
Dot-Blot e hibridación con
sondas de oligonucleótidos aleloespecíficas

ADN PCR desnaturalización

alcalina

siembra en
hibridación membrana de
con ASO nylon
Sonda Normal AAGTTGTACCTTCTAGGCGT

Sonda Mutada AAGTTGTACGTTCTAGGCGT

Resultado de hibridación
1 2 3 4 5 6
Sonda Normal

Sonda Mutada
 Screening de mutaciones puntuales

SSCP, Heterodúplex
ADN PCR electroforesis en geles de
poliacrilamida
(8-10 %)

detección de
secuenciación bandas anómalas
(tinción con plata)
Single Strand Conformation Polymorphism
+
(+)

Dirección de la corrida
(-)

electroforética
M
(+)
M
(-)
M
M

-
Estudio poblacional por SSCP del exón 10
del receptor beta de hormonas tiroideas

N1 N2 N3 M1 M2 N4 N5 N6 N7
N8

N1 a N8: normales, M1 y M2: mutados

DA PL AE SF OC GF CS PD LJ LC GA CR AD SA TM N3 N22 N30 N2 N14

Gel de poliacrilamida al 10 % sin glicerol.

SECUENCIACION
 Método de Sanger

ADN cadena simple 3’ CGTATACAGTCAGGTC 5’

Cebador marcado 5’ GCAT 3’
ADN polimerasa I (Fragmento Klenow)

dATP dATP dATP dATP

dCTP + ddATP dCTP + ddTTP dCTP + ddCTP dCTP + ddGTP
dGTP dGTP dGTP dGTP
dTTP dTTP dTTP dTTP

GCATA GCATAT GCATATGTC GCATATG

GCATAT GT CA GCATATGT GCATATGTCAGTC GCATATGTCAG
GCATAT GT CAGT CCA GCATATGTCAGT GCATATGTCAGTCC GCATATGTCAGTCCAG

A T C G
T
G 3´
A
C
T
G
T
A
5´
Cubas de Electroforesis Vertical
Secuenciación de la región genómica del exón 30
de Tg en la familia con bocio hereditario

Cadena
N1 At H Ac N2
Codificante TCAG TCAG T C AG TCAG TCAG

T A
T A
T A
C G
T A
C G
g/t c/a
t a
a t
a t
 Mutación en el exón 10 Familia 1
3’
p.P453T
T
G
T
T F.B. Ve.B. Vi.B. Padre Madre
T TCAG TCAG TCAG TCAG TCAG
C
1357: C/A
C
C
C
C
T
T
C
T
C
5’

Alelo Normal Alelo Mutado

CCT ACT
Pro (453) Thr (453)
 Nueva deleción en el exón 10 : c.1297-1304delGCCTGCCA
Alelo Normal
1145 Exon 10

Familia 4
.................................................ATCGCCCGGGG
R P G

CTTGCCTGTGTTGAGAGAATAGAAAAGTACCAAGATAGTTTCCTGCTGGCCTTTGAACAC
N M Hna 1 Padre Madre C.B. Hna 2 L A C V E R I E K Y Q D S F L L A F E H

TATATCAATTACCGAAAACACCACGTGACACACTTTTGGCCAAAACTCCTGATGAAGGTG
3’ 3’ TCAG TCAG TCAG TCAG TCAG Y I N Y R K H H V T H F W P K L L M K V
1297 1304
G C ACAGATCTGCGGATGATAGGAGCCTGCCATGCCAGCCGCTTCCTGCACATGAAGGTGGAA
T D L R M I G A C H A S R F L H M K V E
A C
TGCCCCACAGAACTCTTCCCCCCTTTGTTCCTGGAAGTGTTCGAGGATTAGACTGACTGA
C T C P T E L F P P L F L E V F E D *
1413
C T ATTCATTCTCATAATTCC..........................................
G C
T G
A C
C C Alelo Mutado
1145 Exon 10
C G .................................................ATCGCCCGGGG
G A R P G

T C CTTGCCTGTGTTGAGAGAATAGAAAAGTACCAAGATAGTTTCCTGCTGGCCTTTGAACAC
L A C V E R I E K Y Q D S F L L A F E H
C C TATATCAATTACCGAAAACACCACGTGACACACTTTTGGCCAAAACTCCTGATGAAGGTG
C G Y I N Y R K H H V T
1297-1304delGCCTGCCA
H F W P K L L M K V

G T ACAGATCTGCGGATGATAGGA
T D L R M I G
TGCCAGCCGCTTCCTGCACATGAAGGTGGAA
C Q P L P A H E G G M
A A TGCCCCACAGAACTCTTCCCCCCTTTGTTCCTGGAAGTGTTCGAGGATTAGACTGACTGA
G G P H R T L P P F V P G S V R G L N *
1413
G G ATTCATTCTCATAATTCC..........................................

A A
T T
A A Análisis de microsatélites
G G
5’ 5’ Madre Padre C.B. Hna1 Hna2 Control Madre Padre C.B. Hna1 Hna2 Control

203 pb 538 pb
201 pb
199 pb 502 pb
197 pb
TGrI29 TGrI30
Sec. Automática en gel

Sec. Automática capilar

Sistema de detección
Cromatograma
ESTUDIOS INDIRECTOS
 Secuenciación del exón 30 y de sus
intrones flanqueantes

TGrI29 TGrI30
cagagtctaagattttgccatcccataatttttaggacttcctggggccttctgaactattcctgtctgacccaactc
ccagctctactgacttcaatcctgctctggtttcacacagcataaaaatgtctctgtctctatctctgacactttctc
tctctgtctctctctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtttctttcttgtgtttttctcatattcactagagttaaaggtgc
aggaagttgactccctgcttctttttcag GTTTGACAACAGAACTTTTCTCCCCTGTGGACCTCAACCAGGTCATTG
Exon 30 L T T E L F S P V D L N Q V I V
TCAATGGAAATCAATCACTATCCAGCCAGAAGCACTGGCTTTTCAAGCACCTGTTTTCAGCCCAGCAGGCAAACCTAT
N G N Q S L S S Q K H W L F K H L F S A Q Q A N L W
GGTGCCTTTCTC gtaagtatccttagaactcattcttcttcttccagacactgtagtcaggcatcacaggccaagtc
tggcaactcctgagacacagataaggccaaattttgtgtcataactcatggatcactgtggatgatataaaagaaaga
tagcacataacccatatcttcaagaaggttacagtgtagttaatctctactctgcttccataacctatcttcatccac
ctgtctctccatctatccgtccattcacccatccatccatccatccatctacccatccatcccattcatccatccatc
tacccatttatccatcccatccatccttccatcccatccacccatccatccatccatccatccatccatcccattcat
ccgtccatctttgcatcccatccatccatccattcgatccatccatccatccatccatccatccatccatccatccat
ccacccatccaaccatccatccatccatgtatccatgtatccatcccatccaaccatccatccatccatccatccatc
catccatccatccatccatctatccatccatccatttggcagttattaagtatgcattatgttcaaagctttgtgttt
gattttggagaagaaagagaacacccaaaatgaatcaaatcaaccatgttccttgcccttggggagctcatatatacc
aggggcacaggctgacttgggcacaggtgcagggagaccattcacaaagttcacagtttttacagtcctgtgacctct
 Genotipificación de los marcadores microsatélites

PCR radiactiva



Exón 29 Exón 30 Exón 31 ADN genómico de individuos
no relacionados

TGrI29 TGrI30
AtSN HSN AcSN C1 C2 C3 C4
N1 N2 N3 N4 N5
30.8: 542 pb
30.7: 538 pb
30.6: 534 pb
30.5: 530 pb
29.4: 203 pb 30.4: 522 pb
29.3: 201 pb
29.2: 199 pb
29.1: 197 pb 30.3: 510 pb
30.2: 506 pb
30.1: 502 pb

140 cromosomas analizados 304 cromosomas analizados

Genética Molecular del Receptor
de Hormonas Tiroideas.
 Resistencia a Hormonas Tiroideas (RTH)

Incidencia: 1/50000 nacidos vivos

Diagnóstico:
∗ Elevados niveles de T3 y de T4 séricas
∗ Niveles de TSH normales o levemente elevados

Síntomas y signos:
Indicativos de hipotiroidismo e hipertiroidismo
 Frecuencia de Hallazgos clínicos
Síntomas
Hallazgos Clínicos Frecuencia(%)
Bocio 65-95
Bajo IQ 46
Baja Estatura 18-26
Edad ósea retrasada 29-47
Pérdida de audición 21
Taquicardia 50-80
Déficit de Atención 40-46
Hiperactividad/Dificultades en el 19-42
Aprendizaje

Elevada FT4 sérica y 100

TSH normal/alta
 Causa molecular de RTH

Mutaciones en el gen que codifica para

el receptor beta de hormonas tiroideas.
Modelo molecular para la represión basal por co-
represores en la ausencia de T3

Complejo co-represor

HDACs sin 3 Deacetilación de histonas

Co -represores

RXR TR
TAFs

X
TF IIB
Zn Zn TBP
RNApol Gen Blanco
TRE TATA
Transcripción

Co-represores: NCoR, SMRT

 Activación transcripcional por coactivadores en la
presencia de T3

Complejo SRC/p 160 Complejo DRIP/TRAP

Acetilación
de histonas P/CAF TRAP 220/
DRIP205
CBP/P300

Co -activador
I I
r

NH2
eso

HO O CH2 OH T3
pr

COOH
RXR TR I
-re

TAFs
Co

Zn Zn TF IIB
TBP
RNApol Gen Blanco
TRE TATA
Transcripción
 Genes que codifican a los Receptores de
Hormonas Tiroideas (TRs)
Gen Cromosoma Isoformas Localización del TR

TR α1 Generalizada
TR α Ch.17
TR α2 Generalizada

TR β1 Generalizada
TR β Ch.3
TR β2 Pituitaria/SNC
 Representación esquemática del gen TRβ
β y su proteína TRβ
β1

Cromosoma 3

3p22-24

171 72 64 261 101 148 206 147 259 269 pb

5’ 3’
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Gen: 372 Kb

5’ 3’ ARNm: 1.698 b

NH2 COOH Proteína: 461 aa

DBD LBD
 Localización de mutaciones en el gen TRβ
β

1 461 aa

Cluster 3 Cluster 2 Cluster 1 COOH

NH2

AF-2

DBD Hinge LBD

12 hélices
Interacción con co-represores
y co-activadores
Unión a T3
Heterodimerización
con RXR
 Mutaciones identificadas en el gen TRβ
β
D216A P247L V284I C298A V319K R338L R383H K424A K443N F455L c.1297-
1304del
E217R L266K V284R C298R R320C R338W P384R T426R V444R L456R GCCTG
CCA
W219K A268D D285A E299A R320H Q340H V389A T426I C446R E457A
c.1305-
E220R F269A K288A I302A R320L K342I V389K D427A C446X E457D
1306ins
K223A G251E K288I I302M Y321C G344A E390R L428R T448R E457K T

T224R K274E K289A I302R D322H G344E E393R R429A E449R E457R c.1358-
1359ins
E227R I276L I302V D322N G345D Q396R R429Q E449X E457T C
A228G T277R L305I E324R G345R L400R R429W L450H V458A

A228M V264D K306A L328F G345S L401R M430R F451A V458E

H229G A279V K306E T329N G345V Y406K I431T F451I V458G

H229M

V230R
I280S

I280K
C309A

C309K
L330F

L330S
L346V

G347E
Y409K

R410A
A433R

C434X
F451X

P453A
V458M

F459C
Características
A231R I280M C309W G332E V348E H413R C434R P453E E460K
Tipo de mutación: Germinal
T232G T281V M310I E333D V348R V414K H435L P453H

T232M T281R M310L E333Q V349M H416R H435Q P453S Presencia alélica: Heterocigota
A234T T281Q M310T M334K D351A W418K S437R P453T
Tipo de Herencia: Autosómica
A234X T281L M313T M334R D355A P419R R438C P453X

Q235R T281I S314C M334T M358A K420A R438H L454A dominante

R243Q R282S S314F V336M S361R L421R L440R L454R

R243W V283I S314Y T337A N364R L422R M442T L454S

V283M R316H T337H D366R M423R M442V L454T

V284A A317T T337I D367R K424R K443E L454V

Exón Exón Exón Exón

7 8 9 10

25% 75%
 Evidencias genéticas y clínicas para la actividad
dominante negativa ejercida por los TRβ β mutados
Herencia autosómica
TRβ
β heterocigota
dominante

TRα
α TR β
RTH

Mutación puntual

TRβ
β heterocigota
Herencia autosómica

Fenotipo Normal
X Tests de función tiroidea
recesiva

Deleción normales

TRβ
β homocigota
X
RTH
X
Doble deleción
Dicha actividad disminuye introduciendo mutaciones en el dominio DBD
 Objetivos

Identificar nuevas mutaciones en el gen TRβ

β en
pacientes con cuadro clínico compatible con RTH.

Metodología

Purificación de ADN genómico a partir de sangre periférica.

PCR de los exones 7, 8, 9 y 10

Secuenciación

SSCP para validar nuevas mutaciones

 Nueva deleción en el exón 10 : c.1297-1304delGCCTGCCA
Alelo Normal
Paciente CB 1145 Exon
.................................................ATCGCCCGGGG
R P G
10

CTTGCCTGTGTTGAGAGAATAGAAAAGTACCAAGATAGTTTCCTGCTGGCCTTTGAACAC
N M Hna 1 Padre Madre C.B. Hna 2 L A C V E R I E K Y Q D S F L L A F E H

TATATCAATTACCGAAAACACCACGTGACACACTTTTGGCCAAAACTCCTGATGAAGGTG
3’ 3’ TCAG TCAG TCAG TCAG TCAG Y I N Y R K H H V T H F W P K L L M K V
1297 1304
G C ACAGATCTGCGGATGATAGGAGCCTGCCATGCCAGCCGCTTCCTGCACATGAAGGTGGAA
T D L R M I G A C H A S R F L H M K V E
A C
TGCCCCACAGAACTCTTCCCCCCTTTGTTCCTGGAAGTGTTCGAGGATTAGACTGACTGA
C T C P T E L F P P L F L E V F E D *
1413
C T ATTCATTCTCATAATTCC..........................................
G C
T G
A C
C C Alelo Mutado
1145 Exon 10
C G .................................................ATCGCCCGGGG
G A R P G

T C CTTGCCTGTGTTGAGAGAATAGAAAAGTACCAAGATAGTTTCCTGCTGGCCTTTGAACAC
L A C V E R I E K Y Q D S F L L A F E H
C C TATATCAATTACCGAAAACACCACGTGACACACTTTTGGCCAAAACTCCTGATGAAGGTG
C G Y I N Y R K H H V T
1297-1304delGCCTGCCA
H F W P K L L M K V

G T ACAGATCTGCGGATGATAGGA
T D L R M I G
TGCCAGCCGCTTCCTGCACATGAAGGTGGAA
C Q P L P A H E G G M
A A TGCCCCACAGAACTCTTCCCCCCTTTGTTCCTGGAAGTGTTCGAGGATTAGACTGACTGA
G G P H R T L P P F V P G S V R G L N *
1413
G G ATTCATTCTCATAATTCC..........................................

A A
T T
A A Análisis de microsatélites
G G
5’ 5’ Madre Padre C.B. Hna1 Hna2 Control Madre Padre C.B. Hna1 Hna2 Control

203 pb 538 pb
201 pb
199 pb 502 pb
197 pb
TGrI29 TGrI30
 Paciente CB

Wild Type
Hinge
1 461 aa
NH2- -COOH
AF-2
Cluster 3 Cluster 2 Cluster 1

DBD LBD

1297-1304delGCCTGCCA
Hinge
1 460 aa
NH2- -COOH
AF-2
Cluster 3 Cluster 2 Cluster 1

DBD LBD
 Mutaciones identificadas en el gen TRβ
β

Exón Pacientes Mutaciones Nuevas Instituciones

9 PC c.991A>G p.N331D H. Gutiérrez

(AAT>GAT) ARGENTINA

9 MF c.1022T>C p.L341P H. Gutiérrez

(CTG>CCG) ARGENTINA

9 AS c.1036C>T p.L346F H. Gutiérrez

(CTT>TTT) ARGENTINA

10 MA c.1293A>G p.I431M H. Garrahan

(ATA>ATG) ARGENTINA

10 CB c.1297- p.A433fs H. Militar

Exón Pacientes Mutaciones conocidas Instituciones
1304delGCCT X461 Central
GCCA ARGENTINA
9 MA c.1012C>T p.R338W H. Garrahan
10 ED c.1358C>T p.P453L H. Gutiérrez (CGG>TGG) ARGENTINA
(CCT>CTT) ARGENTINA
10 GC c.1357C>A p.P453T H. Durán
10 MF c.1339C>A p.P447T H. R. Mejía (CCT>ACT) ARGENTINA
(CCC>ACC) ARGENTINA
10 VB c.1357C>A p.P453T H. Eva Perón
9 EM c.1003G>C p.A335P IDIMI (CCT>ACT) ARGENTINA
10 (GCA>CCA) CHILE
10 NL c.1357C>A p.P453T H. M.Central
(CCT>ACT) ARGENTINA
10 AE c.1376T>G p.F459C H. Clínicas
(TTC>TGC) Uruguay
8 GF c.803C>G p.A268G H. Clínicas
(GCC>GGC) ARGENTINA
 Validación de la mutación p.P453T por digestión con XcmI

Amplificación por PCR

MK Ndig GC BGL s/enz

Exón 10

312pb
XcmI 312pb
262pb
ccannnnn nnnntgg
XcmI 50pb
cccnnnnn nnnntgg

262pb 50pb Agarosa 3%

Análisis predictivo de la estructura secundaria del receptor

β-WT
THRβ QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSDAIFDLGMSL

ESP HHEE-----HHHHHHHH----------E-H---HHHHH--------EEEE--EHHH----

β-N331D QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLDGEMAVTRGQLKNGGLGVVSDAIFDLGMSL
THRβ

ESP HHEE-----HHHHHHHH------------H---HHHHH--------EEEE--EHHH----

Exón 9
β-R338W QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTWGQLKNGGLGVVSDAIFDLGMSL
THRβ

ESP HHEE-----HHHHHHHH----------E-H---HHHHH--------EEEE--EHHH----

β-L341P QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQPKNGGLGVVSDAIFDLGMSL
THRβ

ESP HHEE-----HHHHHHHH----------E-H---HEH----------EEEE--EHHH----

β-L346F QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGPGVVSDAIFDLGMSL
THRβ

ESP HHEE-----HHHHHHHH----------E-H---HHHHH---------EEEE-EHHH----

E: lámina β H: α hélice -: aa conectores

 p.L341P
Análisis evolutivo del receptor
p.N331D p.R338W p.L346F

Homo sapiens 296 LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351

Macaca mulatta 296 LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
Macaca fascicularis 296 LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
Mus musculus 296 LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPDSETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
Rattus norvegicus 296 LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPDSETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
Equus caballus 296 LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
Canis familiaris 302 LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 357
Conger myriaster 232 LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 287
Danio rerio 230 LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESDTLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 285
Gallus gallus 204 LPCEDQIILLKVCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 259
Xenopus laevis 208 LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 263

p.P453T
p.I431M p.P447T p.P453L

Homo sapiens 407 INYRKHHVTHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED 461

Macaca mulatta 407 INYRKHHVTHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED 461
Macaca fascicularis 407 INYRKHHVTHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED 461
Mus musculus 407 INYRKHHVTHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVGCPTELFPPLFLEVFED 461
Rattus norvegicus 407 INYRKHHVTHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED 461
Equus caballus 407 INYRKHHVTHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED 461
Canis familiaris 413 INYRKHHVTHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED 467
Conger myriaster 343 INYRKHKVSYFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED 397
Danio rerio 341 INYRKHKVAHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED 395
Gallus gallus 315 INYRKHHVAHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED 369
Xenopus laevis 319 INYRKHNIAHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED 373
Determinación de Estructuras 3D

P453

L456

E457

SWISS-MODEL
 L453

L456

E457
 T453

L456

E457
 Conclusiones

El análisis poblacional indica que la mutaciones

identificadas no se tratan de polimorfismos
frecuentes.

El análisis de la estructura secundaria de las

proteínas mutadas, los estudios evolutivos proteicos,
modelado molecular permiten inferir que las
mutaciones identificadas son de tipo inactivante.

En el 90 % de casos de RTH no existen síntomas ni

signos patognomónicos por lo cual la identificación de
nuevas mutaciones en el gen TRβ β aumentará la
precisión en el diagnóstico y tratamiento de RTH.
 Perspectivas

Expresión in vitro de los alelos TRβ

β
conteniendo las mutaciones identificadas.

Binding a co-activadores Binding a co-represores

Determinación de la afinidad de las hormonas
tiroideas por los receptores mutados.