Quantification of pectin-releasing

activity of protopectinase-SE from

Geotrichum klebahnii

Metodo para cuantificaci�n de una enzima libera pectina. La actividad enzimatica se

determin� midiendo la cantidad de pectina soluble soluble liberada desde la
protopectina del limon.

Quantification of protopectinase SE, an endopolygalacturonase with

pectin-releasing activity from Geotrichum klebahnii

La actividad enzim�tica fue determinada usando diferentes lotes de protopectina de

limon como sustrato. La PPasa permite liberar pectina soluble desde la
protopectina. La PPasa-SE tambi�n muestra actividad poligalacturonasa (PGase).

Las PPases tipo A con actividad de polygalacturonasa, liasas pectato o liasas

pectina) despolimerizan las smooth regions mientras que las tipo B degradan las
hairy regions en la protopectina, liberando en ambos casos pectina soluble.

Por lo tanto, la actividad puede ser evaluada con un sustrato soluble (PGA),
midiendo la tasa de liberaci�n de los grupos reductores.

En la metodolog�a, un stock de enzimas se lleva a una solucion buffer de acetato de

sodio a ph 5, usado para medir la actividad PGasa. Tambi�n se us� un crudo para
evaluar la PGasa.

No otras enzimas extracelulares excepto la PPasa ha sido reportada para esta cepa.

Usaron un medio basado en glucosa.

El tiempo de incubaci�n de las enzimas, sensibles a los cambios de temperatura.

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La actividad PGasa de la PPasa fue evaluada midiendo la tasa de liberaci�n de

grupos reductores del PGA con el m�todo de S-N con GALA como est�ndar.

Se usan 450 ul PGA + 50 ul de la soluci�n de enzimas (obtenidas despues de la

centrifugaci�n) a 37 �C. Luego se detiene la rxn con la adicion del reactivo de S y
los tubos se transfieren a un ba�o de agua hirviendo. Los tubos se enfian en ba�o
de agua fria y se agrega el reactivo de N. La solucion resultante se diluye en agua
y se mide a 660 nm. Las muestras con altos contenido de grupos reductores se
diluyen convenientemente antes de la aidicon de S.

Una unidad de actividad PGasa se define como la actividad que libera un poder
reductor equivalente a 1 umol de GALA por minuto.

Con la adicion del reactivo de Nelson se forma un precipitado del PGA residual que
se separa por centrifugaci�n.

***Preguntas
Le adicionamos PGA a la soluci�n despu�s de centrigufar, donde suponemos que est�n
las enzimas. Con el metodo de S-N podemos medir azucares reductores. Pero los que
queremos medir son los azucares liberados por la degradaci�n de PGA, si en la
solucion a�n hay glucosa tambi�n entran en la medici�n, generando un error e
incertidumbre. Al menos en los medios con glucosa. Pero c�mo va a sintetizar
enzimas PPasas la levadura si en el medio tiene glucosa y no tiene que degradar
pectina.

No hay diferencias significativas en las diluciones del crudo evaluado. Adem�s,

cuando baja actividad enzim�tica tiene que ser determinada (como 1:1000) largos
periodos de incubacion pueden ser usados con diferencias no tan significativas en
los resultados obtenidos. Este ultimo procedimiento puede ser aplicado para la para
la cuantificaci�n de muestras con grandes cantidades residuales de azucares
reductores. Por lo que hay que establecer una relaci�n apropiada entre la muestra y
tiempo de incubaci�n para minimizar los valores de abs en los blancos.

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Influence of trace elements on enzyme production: protopectinase

expression by a Geotrichum klebahnii strain

Logro de incrmento de la productividad de protopectinasa-SE, estudios llevados a

cabo en un medio de urea-definido para investigar el efecto de la [] de elementos
traza de Fe, Zn, Mn, Co, Cu y Mo en la producci�n enzim�tica. Zn y Fe son elementos
esenciales requeridos.

La actividad enzzimatica fue medida con un sustrato soluble (PGA) en 100 M de un

buffer. La actividad volumetrica fue calculada como la media de 3 determinaciones
llevadas a cabo a los 3, 4 y 5 min del tiempo de rxn. Una unidad de actividad PPasa
fue definida como la actividad de poder reductor equivalente a 1 umol de GALA a
37�C.

Se ha planteado que la secreci�n de algunas proteasas est�n reportadas por otros

investigadores que est� debido a los iones metalicos. Suieren que los metales
pueden prevenir que algunos componentes necesarios para la inducci�n se escapen de
las c�lulas.

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UNA CONTRIBUCION A LA CARACTERIZACION DE PROTOPECTINASA-SE, UNA ENDO-

POLYGALACTURONASA DE Geotrichum klebahnii CON ACTIVIDAD SOLUBILIZADORA DE PECTINA

One unit of PGase activity was defined as the amount of enzyme that releases a
reducing power equivalent to 1 �mol of GALA per minute.