2.4.2.

DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES

ACTIVIDAD N° 1

1. DENOMINACIÓN: Análisis bioquímicos

2. OBJETIVOS:

 Detectar anormalidades en personas asintomáticas o con síntomas inespecíficos.

 Realizar seguimiento a la enfermedad del paciente.

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS: Perfil hepático Perfil lipídico

 Tubos tapa roja
 Capuchón
 Agujas vacutainer
 Algodón
 Ligadura
 Alcohol de 70°
 Esparadrapo
Perfil renal
 Crioviales
 Micropipetas
 Tips descartables para micropipetas
 Cronometro
 Tubos de ensayo
 Gradilla
 Centrifuga
 Baño de maría
 Analizador de bioquímica semiautomático
 Reactivos

a. Tomar la muestra de sangre al paciente mediante punción venosa con un ángulo de 15°.
b. Centrifugar la muestra a 4500 por 5 minutos.
c. Extraer el suero en un criovial con la ayuda de la micropipeta.
d. Encender el analizador de bioquímica semiautomático.
e. Aspirar agua destilada y proceder a realizar las pruebas correspondientes.

Perfil Hepático:

TGO (AST) Agregar 50ul de Muestra + Homogenizar y Lectura inmediata

400ul de Reactivo A preincubar
Agregar 100ul de
Reactivo B
TGP (ALT) Agregar 50ul de Muestra + Homogenizar y Lectura inmediata
400ul de Reactivo A preincubar
Agregar 100ul de
Reactivo B
BILIRRUBINA TOTAL BM: Agregar 40ul de Incubar 5 min x Lectura inmediata
Muestra + 600ul de Reactivo 37°C
A
M: Agregar 40ul de Incubar 30 seg. x Incubar 5 min x 37°C
Muestra + 500ul de Reactivo 37°C
A Agregar 100ul de
Reactivo B
BILIRRUBINA DIRECTA BM: Agregar 40ul de Incubar 5 min x Lectura inmediata
Muestra + 600ul de Reactivo 37°C
A
M: Agregar 40ul de Incubar 60 seg x Incubar 5 min x 37°C
Muestra + 500ul de Reactivo 37°C
A Agregar 100ul de
Reactivo B
FOSFATASA ALCALINA Agregar 5ul de Muestra + Preincubar unos Lectura inmediata
500ul de Reactivo A minutos
Agregar 125ul de
Reactivo B
 ALBUMINA Agregar 10ul de Muestra + Incubar 10 min x 15- Leer a absorbancia 625 nm
2.5 ml de Reactivo A 28°C
PROTEINAS TOTALES Agregar 20ul de Muestra + Incubar 15 min x Leer a absorbancia 540 nm
2 ml de Reactivo A 37°C

Perfil Lipídico:

Agregar 500ul de
COLESTEROL Reactivo + 10ul de Incubar 5 min x 37°C Leer a absorbancia 505 nm
muestra
Agregar 500ul de
TRIGLICERIDOS Reactivo + 10ul de Incubar 5 min x 37°C Leer a absorbancia 505 nm
muestra
Agregar 100ul de
Homogenizar y dejar a T°
Agregar 200ul de sobrenadante + 1000ul de
amb. x 10 min
HDLc Muestra + 500ul de Reactivo Colesterol
Centrifugar 15 min a 3000
Reactivo A Incubar 5 min x 37°C
rpm
Leer a absorbancia 505 nm
Agregar 50ul de sobrenadante
Homogenizar y dejar en
Agregar 200ul de + 1000ul de Reactivo
reposo 15 min a 25°C
LDLc Muestra + 100ul de Colesterol
Centrifugar 15 min a 3000
Reactivo A Incubar 5 min x 37°C
rpm
Leer a absorbancia 505 nm

Perfil Renal:

Agregar 500ul de Reactivo Incubar 5 min x

GLUCOSA Leer a absorbancia 505 nm
+ 10ul de muestra 37°C
Agregar 480ul de Reactivo
Agregar 100ul de
CREATININA A + 120ul de Reactivo B Lectura inmediata
Muestra
(Reactivo de Trabajo)
Agregar 20ul de Muestra + Incubar 15 min x
PROTEINAS TOTALES Leer a absorbancia 540 nm
2 ml de Reactivo A 37°C

Urea:

Agregar 10ul de Muestra + Homogenizar e incubar 1 min.

UREA Lectura inmediata
1000ul de Reactivo A Agregar 255ul de Reactivo B

4. RESULTADOS:

Los valores normales de los análisis bioquímicos anteriormente mencionados, se encuentran en la siguiente
tabla.

Redactar los resultados indicando los valores normales que corresponden al análisis bioquímico.
COLESTEROL VN: < 200 mg/dL
TRIGLICERIDOS VN: < 150 mg/dL
HDLc VN: 40 - 60 mg/dL
LDLc = COL - LDL
LDLc
VN: < 130 mg/dL
VN: Hombres: hasta 38 U/l
TGO (AST)
Mujeres: hasta 32 U/l
VN: Hombres: hasta 41 U/l
TGP (ALT)
Mujeres: hasta 31 U/l
BILIRRUBINA TOTAL VN: hasta 1.0 mg/dL
BILIRRUBINA DIRECTA VN: hasta 0.2 mg/dL
FOSFATASA ALCALINA VN: 65 – 300 U/l
ALBUMINA VN: 3.5 – 4.8 g/dL
PROTEINAS TOTALES VN: 6.1 – 7.9 g/dL
GLUCOSA VN: 70 - 110 mg/dL
VN: Hombres: 0.7 – 1.3 mg/dL
CREATININA
Mujeres: 0.6 – 1.1 mg/dL
UREA VN: 10 - 50 mg/dL
 5. CONCLUSIONES:
 Si los resultados obtenidos no se encuentran dentro de los valores de referencia entonces el paciente
está presentando anormalidades en su estado de salud y requiere de atención médica.
 Los análisis bioquímicos miden los niveles de determinadas sustancias en la sangre que le indican
al médico si los distintos órganos están sanos y funcionan bien o no durante la enfermedad
diagnosticada al paciente.

ACTIVIDAD N° 2

1. DENOMINACIÓN: Hemograma completo

2. OBJETIVOS

 Evaluar el estado de salud general y detectar enfermedades como la anemia, las infecciones y la
leucemia.
 Medir los niveles de los componentes de la sangre.

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO

 Microscopio  Agujas vacutainer

 Centrífuga de hematocrito  Algodón
 Contometro  Ligadura
 Cámara de Neubauer  Alcohol de 70°
 Portaobjetos  Esparadrapo
 Micropipetas  Crioviales
 Tips para micropipetas  Aceite de inmersión
 Tubos capilares con heparina  Solución de Turk
 Lancetas  Oxalato de amonio 1%
 Plastilina  Reactivo de GOWER
 Tabla para lectura de hematocrito  Colorante de Wright
 Tubos EDTA

El hemograma completo incluye:

Hematocrito:
a. Ubicar el dedo anular de la mano izquierda. En el lado externo del dedo, donde la sensibilidad es
menor que en la punta.
b. Limpiar el sitio escogido, usar algodón humedecido con alcohol de 70°, después pasar algodón
seco.
c. Punzar el dedo con la lanceta estéril con firmeza y rapidez.
d. Limpiar la primera gota de sangre con un pedazo de algodón seco.
e. Comenzar a absorber la sangre con el tubo capilar, cuando llega a un determinado límite se debe
colocar la plastilina
f. Centrifugar el tupo capilar.
g. Colocar el tubo capilar centrifugado en la tabla de lectura en forma vertical.
h. Hacer coincidir la base del paquete globular con la línea roja que indica “0%”.
i. En la misma posición desplazar el tupo capilar horizontalmente hasta que el menisco superior del
plasma coincida con la línea que indica “100%”.
j. El hematocrito se obtiene directamente de la altura del paquete globular como porcentaje del
volumen total.

Hemoglobina: se obtiene multiplicando el hematocrito por un factor equivalente a 0.32, dicho factor está
relacionado al volumen de sangre que tiene una persona.

Glóbulos blancos
a. Tomar la muestra de sangre al paciente mediante punción venosa con un ángulo de 15°.
b. Colocar 380 ul del reactivo de Turk en un criovial y añadir 20 ul de la muestra de sangre.
c. Mezclar completamente y dejar reposar por 5 minutos.
d. Montar la laminilla de vidrio en la cámara para recuento,
e. presionándola cuidadosamente para colocarla en su sitio.
f. Con una micropipeta colocar 10 ul en la cámara de Neubauer
g. Observar en el microscopio con el objetivo de 10x y 40x
h. Contar los leucocitos en las áreas celestes.
i. Calcular el número de leucocitos en un mm3 de sangre
 Glóbulos rojos
a. Agregar 400 ul de reactivo de GOWER en un criovial, líquido isotónico que impide la formación
de grumos.
b. Agregar 20 ul de sangre.
c. Con una micropipeta colocar 10 ul en la cámara de Neubauer
d. Observar en el microscopio con el objetivo de 10x y 40x.
e. Contar los eritrocitos en las áreas rojas.
f. Calcular el número de leucocitos en un mm3 de sangre

Plaquetas
a. Agregar 380 ul de oxalato de amonio 1% en un criovial, dicho líquido permite la observación de
plaquetas.
b. Agregar 20 ul de sangre.
c. Dejar reposar por 20 minutos en cámara húmeda.
d. Con una micropipeta colocar 10 ul en la cámara de Neubauer
e. Observar en el microscopio con el objetivo de 10x y 40x.
f. Contar las plaquetas en los cuadrantes para glóbulos rojos.
g. Calcular el número de plaquetas en un mm3 de sangre

Serie blanca
a. Extensión sanguínea:
 Recoger una gota de sangre tocándola ligeramente con una cara del portaobjeto 1 cerca del extremo
de este.
 Sostener el portaobjeto 1 con una mano. Con la otra mano colocar el borde de un portaobjeto 2
frente a la gota de la sangre.
 Desplazar el portaobjeto 2 hacia atrás, hasta que toque la gota de sangre.
 Dejar que la gota de sangre se extienda por el borde del portaobjeto 2.
 Deslizar el portaobjeto 2 hacia el extremo opuesto del portaobjeto 1 que contiene la gota de sangre
con un movimiento suave (extender toda la gota de sangre antes de llegar al extremo del
portaobjeto).
b. Secado de la extensión sanguínea.
c. Fijación con metanol de la extensión sanguínea.
d. Coloración de Wright:
 Cubrir la extensión de sangre con unas gotas de colorante Wright.
 Dejar actuar en reposo durante 1 minuto.
 Agregar sobre el colorante, agua destilada y mezclar rápidamente, que se puede ser hecho soplando
suavemente (debe formarse una capa plateada).
 Dejar reposar la mezcla por 5 minutos.
 Lavar con agua destilada. Dejar caer el chorro de agua en forma suave, empezando por el borde de
la lámina inclinada.
e. Dejar secar a temperatura ambiente.
f. Observar en el microscopio con objetivos de 40x y 100x (objetivo de inmersión).
g. Conteo de la serie blanca diferenciando granulocitos (eosinófilos, basófilos y neutrófilos) y
agranulocitos (monocitos y linfocitos).

4. RESULTADOS
Calcular el número de células mediante la siguiente tabla:
CÉLULAS FÓRMULA
Leucocitos Leucocitos / mm3 = leucocitos contados x 50
Eritrocitos Eritrocitos / mm3 = eritrocitos contados x 10 000
Plaquetas Plaquetas/ mm3 = plaquetas contados x 1 000

Notificar el resultado como el número de células que hay en 1 mm3 de sangre sin diluir.
Los valores normales de las pruebas que incluye un hemograma completo, se encuentran en la siguiente tabla.
Hematocrito VN: Hombres: 40 – 50 %
Mujeres: 37 – 42 %
Hemoglobina VN: Hombres: 13 – 16
Mujeres: 12 – 14
Leucocitos V.N.: 5 000 – 10 000
Eritrocitos V.N.: 4 500 000 – 5 500 000
Plaquetas V.N.: 150 000 – 450 000
Eosinófilos VN: 1 – 4%
Basófilos VN: 0 – 1%
Neutrófilos V.N.: 55 – 65%
Monocitos V.N.: 3 – 8%
Linfocitos V.N.: 25 – 35%
 5. CONCLUSIONES
 Las enfermedades como la anemia, las infecciones y la leucemia pueden ser detectadas mediante un
hemograma completo, ya que este brinda información importante sobre los tipos y las cantidades de
células en su sangre, ayudando al médico a diagnosticar ciertas afecciones.
 La cantidad de los componentes de la sangre proporciona información a los médicos sobre posibles
problemas de salud; la proporción o porcentaje (Fórmula leucocitaria) de cada tipo de leucocitos es
importante para el diagnóstico. Los resultados que excedan los valores normales podrían requerir
seguimiento dependiendo de la situación del paciente.

ACTIVIDAD N° 3

1. DENOMINACIÓN: Reacciones de aglutinación (reacción antígeno – anticuerpo)

2. OBJETIVOS

 Realizar la reacción de Widal para el diagnóstico de infección por Salmonella entérica.

 Realizar la Prueba Rosa de Bengala para el diagnóstico por Brucella abortus.

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO

 Muestras de sangre humana, obtenidas por

venopunción en tubos sin anticoagulante.
 Agujas n° 20 o 21.
 Ligaduras, algodón y alcohol.
 Tubos de ensayo de 13 x 100 sin anticoagulante.
 Láminas portaobjetos.
 Centrífuga.
 Rotador serológico.
 Palillos monadientes o varillas plásticas.
 Antígenos febriles para Salmonella entérica.
 Antígenos febriles para Brucella abortus.

a. Extraer por punción venosa una muestra de sangre del paciente en un tubo sin anticoagulante.
b. Dejar coagular la muestra de sangre (observar la retracción de coágulo).
c. Centrifugar el tubo con la muestra de sangre coagulada a 2500 RPM por 5 minutos.
d. Extraer el suero sanguíneo.
e. Sobre 4 portaobjetos, colocar una gota de suero (aprox. 50 ul) en cada uno.
f. Agregar a cada uno de ellos 1 gota de los antígenos febriles (Tífico O, Tífico H, paratífico A y
Paratífico B), de Salmonella entérica (REACCIÓN DE WIDAL).
g. Sobre otro portaobjeto, colocar una gota de suero (aprox 50 ul).
h. Agregar 1 gota del reactivo de Rosa de bengala. (PRUEBA DE ROSA DE BENGALA).
i. Homogenizar usando una varilla distinta para cada una de ellos.
j. Agitar en rotador serológico por 2 minutos.
k. Observar la presencia o ausencia de aglutinación.

4. RESULTADOS

Para la Reacción de Widal:

Si se observa aglutinación en alguno de portaobjetos, deberá aplicarse la técnica de “Titulación rápida”

 En portaobjetos limpios, agregar con la ayuda de una micropipeta agregar los siguientes volúmenes
de suero:
 80 uL de suero….1/20  10 uL de suero….1/160
 40 uL de suero….1/40  5 uL de suero.…. 1/320
 20 uL de suero….1/80
 Agregar a cada uno de ellos una gota del antígeno febril.
 Mezclar el suero con el antígeno y agitar durante 2 minutos.
 Observar aglutinación en cada uno de las diluciones.
 Reportar el título correspondiente a la última aglutinación obtenida.

Para la prueba de Rosa de Bengala:

 Toda prueba de rosa de bengala positiva debe confirmarse por la “Prueba en tubo y del 2-
Mercaptoetanol”.
 5. CONCLUSIONES
 La reacción de Widal es un test basado en el principio de aglutinación antígeno-anticuerpo, donde
se determina la presencia de anticuerpos contra el antígeno O y H de la Salmonella typhi para el
serodiagnóstico de fiebre tifoidea, sin embargo debido a su falta de especificidad, debe ser
interpretado en el contexto clínico del paciente. El motivo está en que puede presentar reacciones
antigénicas cruzadas con otras bacterias, parásitos, virus y hongos, además comparte su estructura
antigénica con otras enterobacterias (antígeno O, H).
 La prueba Rosa de Bengala es un método serológico para el diagnóstico de infección por Brucella
abortus. También llamada de la tarjeta o Card Test, se basa en la inactivación de las
inmunoglobulinas IgM a un pH bajo. Detecta exclusivamente IgG. Presenta elevado grado de
correlación con la seroaglutinación y, por su simplicidad, es muy útil como prueba de despistaje
inicial. Sus falsos negativos se limitan a enfermos con procesos de pocos días de evolución y a
algunos casos de enfermedad de curso muy prolongado.

ACTIVIDAD N° 4

1. DENOMINACIÓN: Prueba de reagina plasmática rápida (RPR)

2. OBJETIVOS

 Realizar un descarte serológico de Sífilis mediante RPR

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO

Kit de RPR18. Este kit trae lo siguiente:

 Tarjeta con círculos marcados.

 Capilares.
 Antígeno.
 Controles
 Aguja roma (sin bisel) N.° 20.
 Aplicadores de madera o plástico.
 Frasco gotero de plástico.

a. Colocar la aguja sin bisel en el frasco gotero de plástico.

b. Colocar parte del antígeno (dependiendo del número de muestras a procesar), en el frasco gotero
de plástico y verificar que la gota de antígeno salga de forma uniforme a través de la aguja.
c. Colocar sobre cada uno de los círculos de la tarjeta, 50 µL (0,05 ml) de los sueros a evaluar, o una
gota utilizando el aplicador del kit. No olvidar colocar los sueros control.
d. Con ayuda del aplicador extienda la muestra dentro del círculo sin salir del margen.
e. Agregar 17 µL (0,017 ml) de antígeno, con micropipeta o una gota con el gotero del kit, sobre las
muestras a evaluar.
f. Colocar la tarjeta con las muestras sobre el rotador por 8 minutos a 100 RPM.
g. Luego de los 8 minutos, tomar la tarjeta con ambas manos y balancearla para observar los grumos,
sobre todo en casos de mínima reactividad.
h. Hacer la lectura bajo una lámpara de luz, de preferencia.

4. RESULTADOS

Lectura Informe
Grumos grandes, medianos o pequeños, pero definidos Reactivo (R)
Sin grumos No reactivo (NR)

5. CONCLUSIONES
 La prueba de reagina plasmática rápida (RPR) es una prueba serológica no treponémica, utiliza un antígeno
que contiene partículas de carbón para ayudar a visualizar de modo macroscópico la reacción, cloruro de
colina para no inactivar los sueros y ácido etildiaminotetraacético (EDTA) para hacer más estable la
suspensión.
ACTIVIDAD N° 5

1. DENOMINACIÓN: Prueba ELISA para Chagas y VIH

2. OBJETIVOS

 Diagnosticar la enfermedad de Chagas.

 Diagnosticar la infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH).
 Asegurar la vigilancia seroepidemiológica de dichas enfermedades.
3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
 Kit de ELISA – CHAGAS.
 Kit de ELISA – VIH.
 Crioviales con sueros.
 Micropipetas.
 Tips descartables para micropipetas.
 Cronometro.
 Incubadora.
 Lector de ELISA.

Según kit de ELISA para Chagas marca VIRCELL

a. Añadir 100ul de diluyente de muestra a todos los pocillos que se van a emplear.
b. Añadir 5ul de las muestras, 5ul de control positivo, 5 ul de control de negativo y 5ul de suero cut
off (en duplicado).
c. Incubar a 37°C por 45 minutos.
d. Lavar 05 veces.
e. Agregar 100 ul de conjugado de todos los pocillos.
f. Incubar a 37°C por 30 minutos.
g. Lavar 05 veces.
h. Agregar 100 ul de TMB a cada pocillo. Mezclar suavemente.
i. Incubar a Temperatura ambiente por 20 minutos en oscuridad.
j. Parar la reacción agregando 50 ul de solución STOP.
k. Leer la absorbancia a 450 nm.

Según kit de ELISA para VIH marca WANTAI

a. Colocar los pocillos necesarios para la prueba: B, Control Negativo (tres), Control Positivo (tres:
CP 1, CP 2, y CP Ag).
b. Dispensar 20ul de anticuerpos anti –HIV biotinilated dentro de cada pozo a excepción del blanco.
c. Dispensar 100ul de controles negativo, controles positivos y especímenes dentro de sus respectivos
pozos.
d. Incubar la placa a 37°C X 60 minutos.
e. Lavar 5 veces con tampón fosfato diluido 1/20. En cada lavado dejar que los micropozos se remojen
por 30 segundos.
f. Dispensar 100ul de conjugado HRP dentro de cada pozo a excepción del blanco.
g. Incubar la placa a 37°C x 30 minutos.
h. Lavar 5 veces con tampón fosfato.
i. Dispensar 50ul de solución cromógeno A y 50ul de solución cromógeno B dentro de cada pozo,
incluyendo el blanco.
j. Incubar la placa a 37°C x 15 minutos evitando la luz.
k. Adicionar 50ul de solución stop.
l. Leer absorbancia de cada pocillo a 450 nm. (Leer la absorbancia dentro de los 15 minutos de parada
la reacción).

Según kit de ELISA para VIH marca DIA PRO

a. Disolver conjugado N°1 liofilizado con el diluyente de conjugado N°1 antes de dispensar las
muestras y controles.
b. Colocar los pocillos necesarios para la prueba: De, control negativo (tres), control positivo, Ac
VIH1(dos), Ac VIH2 (dos), calibrador(dos).
c. Dispensar 50ul de diluyente de muestra dentro de cada pozo excepto el blanco.
d. Dispensar 150ul de CN, CP, Mx dentro de sus respectivos pozos.
e. Incubar la placa a 37°C x 60 min.
f. Lavar 5 veces con tampón fosfato diluido 1/20 (5 ml de Wash + 95 ml de agua destilada). En cada
lavado dejar que los micropozos se remojen por 30 segundos.
g. Dispensar 150ul de conjugado N°1 dentro de cada pozo a excepción del blanco.
h. Incubar la placa a 37°C x 30 minutos.
i. Dispensar 100ul de conjugado N°2 a cada pozo excepto el blanco.
j. Incubar la placa a 37°C x 30 minutos.
k. Lavar 5 veces con tampón fosfato.
l. Dispensar 200ul de conjugado TMB dentro de cada pozo incluyendo el blanco.
m. Incubar la placa a Temperatura ambiente x 30 minutos evitando la luz.
n. Adicionar 100ul de Ácido Sulfúrico.
o. Leer la absorbancia de cada pocillo a 450 nm. (Leer la absorbancia dentro de los 15 minutos de
parada la reacción).
4. RESULTADOS
Para la validez de los resultados, los Interpretación de los resultados
controles deben cumplir ciertos requisitos.
ELISA- -La absorbancia del control positivo debe ser La absorbancia individual de cada
CHAGAS mayor de 0.9. muestra (D.O. Mx)
(VIRCELL) -La absorbancia del control negativo debe Media de D.O. del suero cut off (Cox)
ser menor de 0.55. Índice de Anticuerpos = (D.O. Mx/Cox)
-Control cut off: (<0.55 x D.O. CP; >1.5 x x10. Si es: <9 → negativo
D.O.CN) 9-11 → dudoso
>11 → positivo
ELISA-VIH -Blanco debe ser < 0.080 CNx: valor de la absorbancia media para
(WANTAI) -CN deben ser < 0.100 Eliminar cualquier 3 tres controles negativos.
CN > 0.100 VC = CNx + 0.120
-CP debe ser > 0.800 Eliminar cualquier CP Índice de Anticuerpos = D.O. /V.C.
< 0.800 Si es: <1 → negativo
0.9-1.1 → dudoso
≥1 → positivo
ELISA-VIH -Blanco debe ser < 0.100 CNx: valor de la absorbancia media para
(DIA PRO) -CN deben ser < 0.200 Eliminar cualquier 3 tres controles negativos.
CN > 0.200 VC = CNx + 0.125
-CP. AC VIH -1 y AC VIH -2 debe ser > Índice de Anticuerpos = D.O. /V.C.
0.700 Eliminar cualquier CP < 0.700 Si es: <1 → negativo
-CAL deben ser Mx/C.O. > 1 0.9-1.1 → dudoso
≥1 → positivo

5. CONCLUSIONES
 La prueba de ELISA para Chagas nos permite diagnosticar la Enfermedad de Chagas, ya que es
una prueba inmunoenzimática indirecta que determina anticuerpos IgG + IgM frente a
Trypanosoma cruzi en suero o plasma humano. Durante la prueba de ELISA se deduce que la
globulina anti-humana reacciona con el complejo antígeno-anticuerpo, y la que no se une es
eliminada por los lavados; la unida reacciona con el sustrato (TMB), para dar una reacción
coloreada azul, que cambia a amarillo tras la adición de la solución de parada. Los kits ELISA de
Vircell tienen excelentes prestaciones y su estabilidad está garantizada.
 La prueba de ELISA para VIH nos permite diagnosticar la infección por el virus de
inmunodeficiencia humana, ya que es una prueba inmunoenzimática que determina el antígeno p24
específico del VIH en el cribado de unidades de sangre. Los resultados se evalúan en función de
un valor de corte capaz de discriminar los individuos negativos de los positivos. Desde el año 1983
en que se reportó el primer caso de sida en el Perú, hasta el 31 de Diciembre de 2018 se han
notificado un total de 120389 casos de infección por VIH.
 La vigilancia epidemiológica es el proceso, a través del cual se realiza la recolección de datos, su
análisis, interpretación y difusión de información sobre un problema de salud determinado, siendo
una herramienta esencial para la toma de decisiones en Salud Pública dirigidas a prevenir los
riesgos y daños a la salud. Por ello, en el Laboratorio Referencial del Amazonas se realiza vigilancia
epidemiológica a gestantes de los diferentes centros de salud del Amazonas.
ACTIVIDAD N° 6

1. DENOMINACIÓN: Urocultivo

2. OBJETIVOS

 Determinar la cantidad exacta de bacterias e identificar al microorganismo patógeno causante de la

infección.
 Determinar cuál es el antibiótico más efectivo en el tratamiento de la infección (antibiograma).

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
 Muestra de orina.  Discos antimicrobianos.
 Microscopio.  Batería de Gram.
 Centrifuga.  Placas de agar Mac Conkey, agar
 Tubos de ensayo. Sangre, CHROMagar
 Portaobjetos.  Tubos con agar Sabouraud, con
 Laminillas. solución salina.
 Asa calibrada.  Tubos con medios LIA, Indol,
 Hisopo estéril. Citrato, TSI, Urea.

Examen macroscópico
a. En un tubo de ensayo llenamos las ¾ partes de la orina, previamente homogenizada, llevamos a la
luz la muestra para determinar el color.
b. Colocamos la muestra en un fondo blanco para determinar el aspecto.
Examen directo – Tinción Gram
c. Verter 10 ml de orina en un tubo tapa rosca, centrifugar a 2 500 RPM durante 10 minutos.
d. Eliminar el sobrenadante. En el portaobjeto 1 hacer un frotis, en el portaobjeto 2 colocar una gota
del sedimento.
e. Teñir el frotis del portaobjeto 1 con tinción Gram y al portaobjeto 2 colocarle una laminilla.
f. Llevar a observación el portaobjeto1 con objetivo de 100x y el portaobjeto 2 con objetivo de 40x.
Siembra (Método del asa calibrada)
g. Tomar la orina sin centrifugar, con el asa de siembra calibrada, es decir, que cada asada suministre
0,01 o 0,001 ml de orina.
h. Sembrar la orina por dispersión-agotamiento con un asa calibrada, sobre una placa de agar Sangre,
otra sobre agar Mack Conkey. En caso de observarse hifas o levaduras en el examen directo se
siembra en un Tubo de agar Saboraud
i. Rotular e incubar a 37°C por 24 horas en aerobiosis.
j. Seleccionar colonias de las placas y realizar las pruebas de catalasa y oxidasa.
k. Seleccionar colonias de las placas y realizar tinción de Gram.
l. Seleccionar colonias de las placas y resembrar en los medios de diferenciación bioquímica.
m. En caso de observarse levaduras en el agar Saboraud resembrar en CHROMagar.

Antibiograma (Método de Kirby Bauer)

n. Seleccionar las colonias.
o. Prepara una suspensión del inóculo en solución salina. Luego, ajustar el inóculo a una turbidez
equivalente al estándar 0,5 de McFarland (equivalente a 1.5 x 108 UFC).
p. Después de 15 minutos, sumergir un hisopo estéril en la suspensión e inocular en una placa de
Mueller Hinton, estriando con un hisopo en tres direcciones para una distribución uniforme.
q. Después de 15 minutos, colocar los discos antimicrobianos con pinzas estériles, manteniendo una
distancia de 25 mm entre cada uno.
r. Después de 15 minutos, incubar la placa en posición invertida a 35°C.

4. RESULTADOS
Examen macroscópico
 Color: amarillo claro, amarillo oscuro, ámbar, café, rojizo, naranja, verde.
 Aspecto: transparente, ligeramente turbio, turbio

Examen directo
 Anotar si en caso se observó leucocitos, hematíes, piocitos (n°xcampo); bacterias, células
epiteliales, filamentos mucoides, cristales (cantidad) y otros (parásitos, levaduras,
espermatozoides, células renales, Trichomonas vaginalis).
Siembra (Método del asa calibrada)
 Para conocer el número de microorganismos en un 1 ml de orina, se cuentan las colonias y el
resultado se multiplica por 100 si se usó asa de 0.01 ml o por 1 000 si se usó asa de 0.001 ml.
 Negativo (contaminación). De 0-100 000 bacterias por ml de orina.
Dudoso, discutible y se pueden deber a envió De 10 000-100 000 bacterias por ml de orina.
tardío de la muestra al laboratorio, o a una
contaminación importante.
Indica infección urinaria. Recuento superior a 100 000 bacterias por ml
de orina.
Tinción Gram - Pruebas diferenciales
Tinción Bacteria Catalasa Oxidasa
Gram
Cocos Staphylococcus + -
Gram + Streptococcus - -
Enterococcus -

Cocos Neisseria + +
Gram -
Bacilos Enterobacterias + -
Gram - Pseudomonas + +
Staphylococcus

 Las enterobacterias que frecuentemente se encuentran en la orina infectada:

Enterobacteria TSI GAS/ LIA Indol Citrato Urea
H2S
Escherichia coli A/A o +/- K/K o + - -
K/a K/A
Klebsiella A/A +/- K/K +o- + +
Proteus K/A o + o -/+ R/A +o- V +
A/A o-
Citrobacter K/A o +/+ K/A - + V
A/A
 En el caso del CHROMagar, las interpretaciones se harán de acuerdo con el cuadro de la actividad
n°9.
Antibiograma
 Con una regla medir los diámetros de los halos de inhibición alrededor de cada disco.
 Los diámetros de inhibición son interpretados basándose en Tablas estandarizadas según la norma
de la CLSI. La sensibilidad de la cepa bacteriana será reportada como sensible (S), intermedio (I),
o resistente (R).

5. CONCLUSIONES
 La siembra de la orina sin centrifugar con un asa calibrada nos permitió una estimación
semicuantitativa del desarrollo microbiano e identificar al microorganismo patógeno causante de
la infección. El 85%-90% de las infecciones urinarias son producidas por enterobacterias; de los
gérmenes Gram positivos, los que se aíslan con mayor frecuencia son los enterococos y los
estafilococos.
 En el antibiograma se debe colocar los antibióticos apropiados para las distintas especies que
causan la infección urinaria, y no aquellos para que los que una determinada especie es
naturalmente resistente. Se debe informar los antibióticos utilizados e indicar el menos tóxico.

ACTIVIDAD N° 7

1. DENOMINACIÓN: Coprocultivo

2. OBJETIVOS

 Aislar e identificar al microorganismo patógeno causante de la infección.

 Determinar cuál es el antibiótico más efectivo en el tratamiento de la infección (antibiograma).

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
 Muestra de heces.  Batería de Gram.
 Microscopio.  Solución yodurada de lugol.
 Aplicadores de madera  Solución salina.
 Portaobjetos.  Medios diferenciales para
 Laminillas. enterobacterias (Mac Conkey,
 Asa de Kolle. XLD, SS, TCBS).
 Hisopo estéril.  Tubos con medios LIA, Indol,
 Discos antimicrobianos. Citrato, TSI, Urea.
 Examen macroscópico
a. Homogenizar la muestra, llevamos a la luz la muestra para determinar el color.
b. Con ayuda del aplicador de madera determinar la consistencia y la presencia de moco.
c. Colocamos la muestra en un fondo blanco para determinar el aspecto.
Examen directo
a. Colocar una gota de solución salina, en la mitad del lazo izquierdo del portaobjetos y una gota de
solución yodurada de lugol, en la mitad del lado derecho del portaobjetos.
b. Tomar 1 – 2 mg de material fecal (de preferencia de la parte profunda de la muestra y si hay moco,
elegir esta porción) con el aplicador de madera.
c. Mezclar la porción tomada de la muestra con la gota de solución salina o de cloruro de sodio.
d. Tomar otra porción de la muestra y mezclarla con la gota de solución yodurada.
e. Colocar un cubreobjetos sobre cada gota.
f. Llevar a observación las preparaciones con el microscopio con objetivos de 10x y 40x.

Siembra (Método por siembra y agotamiento)

d. Enriquecer la muestra sembrándola en caldo selenito y caldo tioglicolato, incubar 6 hrs. a 37°C.
e. Sembrar una porción de heces por siembra y agotamiento con un asa de Koll, sobre una placa de
agar Mac Conkey, otra sobre agar XLD. Del caldo selenito sembrar con asa de koll en agar
Salmonella-Shigella, del caldo tioglicolato sembrar en agar TCBS.
f. Rotular e incubar a 37°C por 24 horas en aerobiosis.
g. Seleccionar colonias de las placas y realizar tinción de Gram.
h. Seleccionar colonias de las placas y resembrar en los medios de diferenciación bioquímica.

Antibiograma (Método de Kirby Bauer)

i. Realizar el procedimiento mencionado en la actividad n° 6

4. RESULTADOS
Examen macroscópico
 Color: amarillo, marrón-vinoso, marrón-anaranjada, verdosas,etc.
 Consistencia: pastosa, grumosa, semilíquida, líquida, acuosa.
 Aspecto: brillantes, voluminosas, presencia de sangre, pus.
Examen directo
 En el caso de observar parásitos, en la solución salina se puede observar los quistes y trofozoítos
de los protozoarios en forma natural. Las estructuras internas (núcleos, vacuolas, etc.) se observan
en las tinciones con solución yodurada de lugol.
 Anotar si en caso se observó leucocitos, hematíes (n°xcampo).
 Suele encontrarse como elementos normales, estructuras pertenecientes a la ingestión de alimentos,
como fibras vegetales, granos de almidón, esporas de hongos, granos de polen, fibras musculares
lisas o estriadas, cristales de ácidos grasos, cristales de oxalato de calcio, etc.

Siembra (Método por siembra y agotamiento)

 Se utilizó medios selectivos y diferenciales para enterobacterias.

Pruebas diferenciales
 Las enterobacterias que frecuentemente se encuentran en un coprocultivo:
Enterobacteria TSI GAS/ LIA Indol Citrato Urea
H2S
Yersinia A/A -/- A/A o + o - - +/-
K/A
Shigella K/A -/- K/A +o- - -
Salmonella K/A + o -/+ K/K - V/- -
 Antibiograma
 Con una regla medir los diámetros de los halos de inhibición alrededor de cada disco.
 Los diámetros de inhibición son interpretados basándose en Tablas estandarizadas según la norma
de la CLSI. La sensibilidad de la cepa bacteriana será reportada como sensible (S), intermedio (I),
o resistente (R).

5. CONCLUSIONES
 El coprocultivo nos permite aislar e identificar a los microorganismos patógenos causantes de las
enfermedades gastrointestinales. En la flora intestinal normal, habitan microorganismos que no
generan enfermedades y coadyuvan a digerir los alimentos. Sin embargo, existen organismos
entéricos capaces de producir enfermedades, entre los más comunes están Yersinia, Shigella y
Salmonella.
 Determinar el antibiótico más efectivo para la infección, provee al médico tratante la guía para el
tratamiento oportuno y eficaz. El uso indiscriminado de antibióticos sin prescripción médica
origina en el paciente resistencia a los agentes patógenos.

ACTIVIDAD N° 8

1. DENOMINACIÓN: Cultivo de secreciones

2. OBJETIVOS

 Identificar al microorganismo patógeno causante de la infección de acuerdo a la procedencia de la

secreción.
 Determinar cuál es el antibiótico más efectivo en el tratamiento de la infección (antibiograma).

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
 Muestra de orina.  Discos antimicrobianos.
 Microscopio.  Batería de Gram.
 Centrifuga.  Placas de agar Mac Conkey, agar
 Tubos de ensayo. Sangre, CHROMagar
 Portaobjetos.  Tubos con agar Sabouraud, con
 Laminillas. solución salina.
 Asa calibrada.  Tubos con medios LIA, Indol,
 Hisopo estéril. Citrato, TSI, Urea.

Test de aminas (Solo si la secreción es vaginal)

a. Colocar en un portaobjeto 1 gota de la muestra y añadir 2 gotas de KOH al 10%.
Examen directo – Tinción Gram
b. En el portaobjeto 1 hacer un frotis, en el portaobjeto 2 colocar una gota de la secreción.
c. Teñir el frotis del portaobjeto 1 con tinción Gram y al portaobjeto 2 colocarle una laminilla. En el
caso de secreción faríngea se realiza un frotis adicional para tinción Zielh-Neelsen.
d. Llevar a observación el portaobjeto1 con objetivo de 100x y el portaobjeto 2 con objetivo de 40x.
Siembra (Método por siembra y agotamiento
e. Sembrar una asada de secreción por siembra y agotamiento con un asa de Koll, sobre una placa de
agar Sangre, otra sobre agar Mack Conkey y otra sobre agar Chocolate o agar Thayer-Martin. En
caso de observarse hifas o levaduras en el examen directo se siembra en un Tubo de agar Saboraud.
f. Rotular e incubar a 37°C por 24 horas en aerobiosis. A excepción del agar Chocolate y Thayer-
Martin, estos se incuban en anaerobiosis es decir en la jarra de Brewer.
g. Seleccionar colonias de las placas y realizar las pruebas de catalasa y oxidasa.
h. Seleccionar colonias de las placas y realizar tinción de Gram.
i. Seleccionar colonias de las placas y resembrar en los medios de diferenciación bioquímica.
j. En caso de observarse levaduras en el agar Saboraud resembrar en CHROMagar.

Antibiograma (Método de Kirby Bauer)

k. Realizar el procedimiento mencionado en la actividad n° 6

4. RESULTADOS
Test de aminas
 Si emite un olor a pescado indica infección bacteriana.
 Si no emite olor indica infección por hongos.
Examen directo
 Anotar si en caso se observó leucocitos, hematíes, piocitos (n°xcampo); bacterias, células
epiteliales, filamentos mucoides, cristales (cantidad) y otros (levaduras e hifas, espermatozoides en
secreción uretral, Trichomonas vaginalis a excepción de la secreción faríngea, y Clue cells en caso
de secreción vaginal).
 Siembra (Método por siembra y agotamiento) – tinción Gram – pruebas diferenciales

Medio de Microorganismo Tinción Gram Catalasa Oxidasa

aislamiento
Cultivo de Agar Sangre Staphylococcus Cocos Gram + + -
secreción aureus
faríngea Streptococcus - -
pyogenes
Streptococcus - -
pneumoniae
Streptococcus - -
viridans
Haemophilus Cocobacilo G-
Corynebacterium Bacilo Gram +
Agar Mc Conkey Klebsiella Bacilo Gram - + -
pneumoniae
Agar Chocolate o Neisseria Diplococo G- + +
Thayer Martín Haemophilus Bacilo Gram -
Cultivo de Agar Sangre Enterococcus Cocos Gram + - -
secreción Staphylococcus + -
vaginal Haemophilus Cocobacilo
ducrey Gram -
Agar Mc Conkey Pseudomonas Bacilos Gram - + +
Enterobacterias + -
Agar Chocolate o Neisseria Diplococo Gram + +
Thayer Martín gonoorrhoeae -
Cultivo de Agar Sangre Staphylococcus Cocos Gram + + -
secreción Agar Mc Conkey Pseudomonas Bacilos Gram - + +
uretral Enterobacterias + -
Agar Chocolate o Neisseria Diplococo Gram + +
Thayer Martín gonoorrhoeae -
 Otros microorganismos en:
 Secreción vaginal: Clamydea trachomatis, Gardnerella vaginalis, Treponema pallidum,
Trichomonas vaginalis.
 Secreción uretral: Chlamydea trachomatis, Ureaplasma, Gardnerella, T. vaginalis.
 Las enterobacterias más comunes que se encuentran en las secreciones
Enterobacteria TSI GAS/ LIA Indol Citrato Urea
H2S
Escherichia coli A/A o +/- K/K o + - -
K/a K/A
Klebsiella A/A +/- K/K +o- + +
Proteus K/A o + o -/+ R/A +o- V +
A/A o-
 En el caso del CHROMagar, las interpretaciones se harán de acuerdo con el cuadro de la actividad
n° 9.
Antibiograma
 Con una regla medir los diámetros de los halos de inhibición alrededor de cada disco.
 Los diámetros de inhibición son interpretados basándose en Tablas estandarizadas según la norma
de la CLSI. La sensibilidad de la cepa bacteriana será reportada como sensible (S), intermedio (I),
o resistente (R).

5. CONCLUSIONES
 Existen microorganismos patógenos causante de infecciones en el tracto genital y en vías
respiratorias. Los procesos infecciosos del tracto genital femenino son el motivo de consulta más
frecuente en las clínicas de Ginecología, además pueden presentar complicaciones al diseminarse
a otros órganos y también representan un riesgo para el feto en la mujer embarazada.
 El uso de correcto antibiótico es de gran importancia, ya que la resistencia microbiana es un
fenómeno en constante aumento. El antibiograma es una sugerencia acerca de la actividad de un
antimicrobiano sobre un determinado patógeno, presente en un determinado sitio anatómico.
ACTIVIDAD N° 9

1. DENOMINACIÓN: Diferenciación de especies Candida spp

2. OBJETIVOS

 Identificar al agente causal de la Candidiasis

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
 Asa de kolle.  Laminillas
 Microscopio.  Plasma humano
 Láminas portaobjetos  Cultivo de Candida
Prueba del tubo germinativo
a. Con la ayuda del asa de Kolle o aguja bacteriológica, sembrar en un tubo con 2 ml plasma humano
una porción de la colonia de Candida spp.
b. Llevar a incubación a 37°C por 2 horas.
c. Colocar una gota del cultivo en una lámina portaobjetos y cubrir con una laminilla.
d. Llevar a observación con objetivo de 40X.

Producción de Clamidosporas
e. Con la ayuda del asa de Kolle o aguja bacteriológica, sembrar en un tubo con 2 ml plasma humano
una porción de la colonia de Candida spp.
f. Llevar a incubación a 37°C por 2 horas.
g. Colocar una gota del cultivo en una lámina portaobjetos y cubrir con una laminilla.
h. Llevar a observación con objetivo de 40X.

Diferenciación en Medio cromogénico

i. Con la ayuda del asa de Kolle, realizar un trasplante de la colonia de la levadura a una placa con
agar cromogénico.
j. Llevar a incubación a 37° por 24 horas.
k. Observar el crecimiento y realizar la diferenciación de acuerdo al color de las colonias.

4. RESULTADOS
Especies Tubo germinativo Clamidosporas CHROMagar
C. albicans + + Colonias verdes claras
C. tropicalis - - Colonias azules
grisáceas
C. krusei - - Colonias rosa pálidas
C. parapsilosis - - Colonias cremas

CHROMaga-Candida es un medio hecho a base de sales cromógenas y enzimas, que permiten el desarrollo
de las especies más comunes de Candida. Así mismo, hace posible la identificación desde los primeros
aislamientos.
5. CONCLUSIONES
 La candidiasis es causada por diversas especies de levaduras oportunistas del género Candida. Por
ello se utilizan las pruebas anteriormente mencionadas para identificar la especie de Candida spp.
La candidiasis se considera una de las infecciones oportunistas más frecuentes en humanos, la
incidencia se ha elevado durante los últimos 30 años, además afecta a individuos de cualquier edad,
grupo étnico o sexo.
ACTIVIDAD N° 10

1. DENOMINACIÓN: Frotis para la identificación de Leishmania, y Bartonella.

2. OBJETIVOS

 Diagnosticar Leishmaniasis y Bartonelosis mediante frotis

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
 Metanol absoluto.
 Colorante Giemsa.

a. Fijar la extensión de sangre con metanol.

b. Cubrir la extensión de sangre con Giemsa diluido: 1 ml de sol. Giemsa en 9 ml de agua destilada.
c. Dejar actuar en reposo por 30 minutos para Leishmaniosis y 15 minutos para Bartonelosis.
d. Lavar con agua corriente. Dejar caer el chorro de agua en forma suave.
e. Dejar secar a temperatura ambiente.
f. Observar en el microscopio con objetivo de inmersión (l00x).

4. RESULTADOS
 En el caso de Leishmaniosis:
El examen directo se interpreta como positivo cuando se encuentran uno o más amastigotes. Se considera
como negativo cuando no se encuentran amastigotes después de haber recorrido un mínimo de 100 campos.
 En el caso de Bartonelosis:
Se lee de 50 a 100 campos por lámina con la muestra de frotis sanguíneo a 1000 aumentos (objetivo de 100x)
con aceite de inmersión, buscando la presencia de formas cocobacilares, bacilares o cocoides que se
encuentran dentro de los hematíes.

Leishmania Bartonella

5. CONCLUSIONES
 El frotis sanguíneo es la extensión de una gota de sangre de tal manera que se pueden observar al
microscopio, tanto los eritrocitos como los parásitos en un sólo plano. Con el frotis sanguíneo se
logró observar al agente etiológico de la leishmaniosis y bartonelosis. Dichas enfermedades, son
enfermedades endémicas de la región Amazonas.

ACTIVIDAD N° 11

1. DENOMINACIÓN: Examen de gota gruesa y frotis para la identificación de Plasmodium.

2. OBJETIVOS

 Descartar malaria o paludismo mediante la gota gruesa.

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
 Alcohol al 70%.  Láminas portaobjetos.
 Algodón.  Una lanceta estéril.

a. Ubicar el dedo anular de la mano izquierda. En el lado externo del dedo, donde la sensibilidad es
menor que en la punta.
b. Limpiar el sitio escogido: usar un pedazo de algodón humedecido en alcohol, después pasar un
pedazo de algodón seco para retirar los residuos de alcohol.
c. Punzar el dedo con la lanceta estéril con firmeza y rapidez.
d. Limpiar la primera gota de sangre con un pedazo de algodón seco.
e. Con la mano derecha tomar un portaobjetos sosteniéndolo por los bordes. Con la mano izquierda
oprimir el dedo para extraer la segunda gota de sangre, que debe colocarse en el tercio superior de
la lámina, a 1.5 cm del borde.
f. Extraer la tercera gota más pequeña y colocarla en el centro de la lámina
g. Extender la segunda gota de sangre hasta lograr un círculo de aproximadamente 1cm de diámetro
y haga que el espesor de la capa sea uniforme, para eso, usar la esquina de un portaobjeto limpio.
h. Utilizar el borde de una lámina auxiliar en un ángulo de 45° para extender la tercera gota, del centro
hacia el borde externo de la lámina, formando un extendido fino de 3 cm de largo.
i. Fijar el frotis con metanol y colorear como se ha descripto en la actividad n°

4. RESULTADOS
Recuento parasitario: Sistema de cruces

- No se encontró parásitos en 500 campos microscópicos observados.

Número de parásitos encontrados. Si se observó menos de 40 parásitos en
N°…
100 campos.
+/2 De 40 a 60 parásitos en 100 campos.
+ Un parásito por campo en 100 campos.
++ De 2 a 20 parásitos por campo en 100 campos.
+++ De 21 a 200 parásitos por campo en 100 campos.
++++ Más de 200 parásitos por campo en 100 campos.
En la gota gruesa:
 Los glóbulos rojos han desaparecido.
 Los gránulos de Schüffner se pueden observar alrededor del parásito.
 Los leucocitos se conservan sin modificaciones. Los parásitos pueden ser vistos semejantes a los
leucocitos, pero tienen apariencia más pequeña que en el frotis.
 El citoplasma de los anillos finos de los trofozoítos puede aparecer incompleto o roto en las
preparaciones de gota gruesa.
 Las granulaciones de Maurer de Plasmodium falciparum no pueden ser vistos en gota gruesa.

Gametocito Trofozoito
 5. CONCLUSIONES
 La confirmación diagnóstica se hace por el hallazgo del parásito en la sangre. El examen de gota
gruesa y frotis debe realizarse en el momento que se presenta la fiebre, ya que en esta etapa los
parásitos son más números y antes que se administren medicamentos antipalúdicos. En el Perú
existen tres especies de Plasmodium: P. vivax, P. malariae y P. falciparum; de los cuales P.
falciparum es el que cobra más víctimas.

ACTIVIDAD N° 12

1. DENOMINACIÓN: Identificación de Aedes aegypti.

2. OBJETIVOS

 Conocer las características morfológicas de larvas de Aedes aegypti.

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
 Viales con larvas de Aedes aegypti.
 Placas Petri.
 Alcohol de 70°.
 Pipetas de transferencia.
 Estereoscopio.

a. Con ayuda de una pipeta de transferencia, absorber a la pupa del vial que la contenga.
b. Colocar la pupa en una placa Petri y agregar alcohol de 70° para evitar la desecación.
c. Observar al estereoscopio.
4. RESULTADOS
 Las larvas surgen una vez que eclosionan los huevos, tiene un ciclo de 4 estadios larvales (I, II, III
y IV), creciendo desde 1 a 7 mm de largo.
 Poseen: cabeza, tórax, abdomen, los aparatos respiratorio y secretor.
 Tienen cabeza pequeña y redondeada con antenas cortas y poco visibles, el tórax es reducido y más
abultado que el abdomen y presentan a cada lado un par de espinas oscuras en forma de uña de gato
que son de mucha importancia para su identificación.
 En el octavo segmento de su abdomen, en la región del peine poseen de 8-12 espinas como puñales,
característica propia de Aedes aegypti.
 5. CONCLUSIONES
 La larva de Aedes aegypti es una fase eminentemente acuática y por lo general habitan en aguas
limpias o relativamente limpias, se caracteriza por poseer 2 pares de espinas o espolones en el tórax
y de 8 – 12 espinas como puñales en el octavo segmento de su abdomen. El ciclo evolutivo de
Aedes aegypti se caracteriza por su capacidad de desarrollo en pequeñas colecciones de agua que
se forman en relación con la actividad del hombre y de su entorno. Según la temperatura del
ambiente, en alrededor de 10 días completa su desarrollo.

ACTIVIDAD N° 13

1. DENOMINACIÓN: Examen directo del bacilo de la Tuberculosis (Bacilocospía)

2. OBJETIVOS

 Emplear la baciloscopía para el diagnóstico de la tuberculosis y el control mensual del tratamiento

por TBC.

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO

 Materiales para la obtención de

muestra.  Mechero de alcohol.
 Láminas portaobjetos, que no  Papel absorbente.
estén rayadas.  Fenol al 5%.
 Palitos de madera (bajalenguas).  Bandeja

a. Colocar sobre la mesa de trabajo papel absorbente humedecido con fenol al 5%.
b. Colocar las láminas y los envases conteniendo las muestras de esputo previamente rotuladas sobre
la bandeja y la mesa de trabajo respectivamente.
c. Destapar el envase de la muestra, manteniendo la boca del envase cerca del mechero encendido.
d. Con la mitad del bajalengua seleccionar y extraer la porción muco-purulenta de color amarillo
verdoso del esputo, enrollándola en el aplicador.
e. Colocar la porción elegida sobre el portaobjetos y extenderla, haciendo movimientos en vaivén,
hasta lograr que el extendido sea uniforme dibujando un círculo u óvalo de 2 cm de largo por 1 a 2
cm de ancho, sin llegar a los bordes de la lámina, para evitar contaminarse al manipularla.
f. Verificar que el extendido tenga grosor homogéneo y adecuado.
g. Dejar secar a temperatura ambiente.

COLORACIÓN DEL EXTENDIDO: TÉCNICA DE ZIEHL NEELSEN

 Extendidos fijados.  Microscopio.

 Soporte de varilla  Aceite de inmersión.
 Reactivos para coloración: fucsina  Mechero de alcohol.
básica fenicada, azul de metileno,
alcohol acido.

a. Colocar sobre el soporte de varilla, la serie de láminas fijadas con el extendido hacia arriba.
b. Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con el colorante fucsina básica fenicada.
c. Calentar suavemente con la llama del mechero de alcohol por debajo de cada lámina portaobjetos,
hasta la emisión de vapores, repetir el proceso tres veces. El tiempo de coloración con fucsina es
de 5 minutos.
d. Lavar dejando caer agua corriente a baja presión.
e. Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la solución de alcohol ácido, durante 2
minutos.
f. Eliminar el alcohol ácido, lavar nuevamente las láminas con agua corriente a baja presión.
g. Cubrir la superficie del extendido con el colorante azul de metileno, durante 30 segundos a 1
minuto.
h. Eliminar el azul de metileno y lavar cada lámina con agua a baja presión.
i. Dejar secar al medio ambiente.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LA MUESTRA COLOREADA

a. Se usa un microscopio con objetivo de l00x de aumento. Antes de usarlo, se debe colocar una gota
de aceite de inmersión sobre el extendido.
 4. RESULTADOS

Lectura
 Observar un mínimo de 100 campos útiles. Hacer un examen
completo empleando el objetivo de 100x, avanzando de
izquierda a derecha y con iluminación máxima.
 Apuntar el número de bacilos observados y el número de
campos microscópicos útiles a observarse, que variará según
la cantidad de bacilos que contenga la muestra.

Informe de resultados de baciloscopía

 Se informa con la siguiente escala semicuantitativa:

- No se encuentran BAAR en 100 campos microscópicos observados.

+ Menos de 1 BAAR por campo, en 1000 campos microscópicos observados.
++ 1 a 10 BAAR por campo, en 50 campos microscópicos observados.
+++ Más de 10 BAAAR por campo, en 20 campos microscópicos observados.

 En caso de encontrar de 1 a 9 BAAR en 100 campos microscópicos observados, se procederá a:

 Leer 100 campos más, contabilizando solo campos microscópicos útiles, en busca de
positividad.
 Si persiste el resultado (1 a 9 BAAR) realizar otro extendido de una porción más representativa
de la misma muestra, en búsqueda de positividad y reportar el número de BAAR observado.
 Derivar la muestra problema a cultivo para su confirmación bacteriológica.
 Indicar en el formato de resultados, en "observaciones", que se está derivando la muestra a
cultivo y sugerir el envío de nuevas muestras del paciente.

5. CONCLUSIONES
 El diagnóstico bacteriológico de tuberculosis depende del examen directo del esputo en búsqueda
de bacilos alcohol-ácido resistentes (BAAR), la baciloscopía es la herramienta primaria para el
diagnóstico de la tuberculosis pulmonar activa y es útil para evaluar la respuesta al tratamiento y
las tasas de curación.

ACTIVIDAD N° 14

6. DENOMINACIÓN: Preparación del medio Ogawa

7. OBJETIVOS

 Aprender la preparación del medio Ogawa y utilizarlo en el cultivo de Mycobacterium tuberculosis.

8. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO

Requerimientos para la preparación de  Beaker (500 ml).

la solución de sales.  Embudo.
 Balanza analítica.  Beaker (100 ml)
 Autoclave.  6 ml. Glicerol.
 Espátula.  6 ml. Verde de malaquita al 2%.
 Erlenmeyer (500 ml) Requerimientos para la distribución de
 Probeta (100 ml) medio.
 3gr. Fosfato monopotásico  Tubos de 20 x 125 mm con tapa de
 1 gr. Glutamato de sodio. rosca.
 100 ml Agua destilada.  Dispensador de medio.
Requerimientos para la preparación de  Gradilla.
huevo homogenizado. Requerimientos para la coagulación y
 Huevos frescos. conservación del medio
 Algodón.  Coagulador.
 Baguetas o palillos.  Bolsas de plástico para guardar los
 Gasa. medios.
 Probeta (250 ml).  Refrigeradora.

Preparación de Solución de Sales:

a. Disolver en 100 ml de agua destilada, el KH₂PO₄ y el glutamato de sodio y colocar en una autoclave
a 121 ° C por 15 minutos.
 Preparación de Huevo Homogenizado:

b. Lavar los huevos con detergente y enjuagar con agua de

caño, dejar secar en una canastilla de alambre.
c. Limpiar los huevos con algodón embebido en alcohol al
70% y dejar secar. Romper los huevos uno por uno y verter
en un vaso pequeño, para comprobar si están en buenas
condiciones, de lo contrario descartar y cambiar de vaso.
d. Vaciar los huevos en un beaker y homogenizar con una
bagueta o palillos estériles, filtrar utilizando cuatro de gasa
estéril.
e. Adicionar 6 ml de Glicerol y 6 ml de verde malaquita al 2% a la solución de sales enfriada a
temperatura de ambiente y mezclar bien.
f. Agregar el huevo homogenizado lentamente por la pared del Erlenmeyer evitando la formación de
burbujas.
g. Mezclar suavemente y dejar reposar por 30 minutos.
h. Cubrir para que no le dé luz.

Distribución del Medio:

i. Distribuir el medio en tubos de 20 x 125 mm, en una

proporción de 6 ml por tubo, evitando la formación de
burbujas.

Coagulación del Medio:

j. Colocar los tubos inclinados en el coagulador y dejar a 90°C

por una hora (el coagulador debe de haberse encendido
previamente hasta lograr una temperatura de 90°C).

Conservación del Medio:

k. Después de la coagulación, sacar los tubos y dejar enfriar. Luego guardar en bolsas de plástico y
cerrarlas herméticamente, anotando la fecha de preparación. Los medios pueden guardarse en el
refrigerador hasta por un mes.

9. RESULTADOS
Se preparó 125 tubos con medio Ogawa, para su posterior utilización en el cultivo de Mycobacterium
tuberculosis. Se recomienda no usar el medio después de transcurridos 2 meses desde su preparación.

10. CONCLUSIONES

 El medio Ogawa es un medio de cultivo selectivo para microbiología utilizado principalmente para
aislamiento y cultivo de microorganismos del género Mycobacterium, lo cual está estandarizado
de acuerdo al protocolo establecido por el Instituto Nacional de Salud. En esta actividad se logró
aprender la preparación del medio Ogawa para su posterior uso en el cultivo de Mycobacterium
tuberculosis, ya que dicho microorganismo es exigente, este medio a base de huevo y con un PH
ácido le da los nutrientes necesarios para su crecimiento.

ACTIVIDAD N° 15

1. DENOMINACIÓN: Cultivo de Mycobacterium tuberculosis

2. OBJETIVOS

 Confirmar el diagnóstico de tuberculosis pulmonar.

3. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO

 Muestras de esputo, orina,  NaOH al 4%.

contenido gástrico, tejido  Tubos con medio Ogawa.
endógeno y exógeno (muestras  Centrífuga.
contaminadas), LCR, Líquido  Cabina de bioseguridad.
pleural, sinovial, ascítico,  Gradilla.
pericárdico (muestras asépticas).  Bandeja de madera inclinada.
Muestras contaminadas.
a. Colocar las muestras numeradas y en una gradilla colocar tubos estériles numerados con la misma
secuencia de las muestras.
b. Colocar 1 ml. de muestra (esputo. sedimento de muestra centrifugada, etc.) en cada tubo estéril de
acuerdo con la numeración correspondiente. Agregar 4 ml. de solución estéril de hidróxido de sodio
(NaOH) al 4%.
c. Dejar a 37 °C por 20 minutos en estufa.
d. Retirar los tubos de la estufa, homogenizar (mezclar) el contenido de cada tubo.

Para las muestras asépticas, solo se realizan los siguientes pasos.

e. Inocular 0,1 ml. (por tubo) en dos tubos de medio Ogawa, y bañar toda la superficie del medio.
f. Colocar los tubos en una bandeja de madera de fondo inclinado, e incubar en estufa a 37 °C.

4. RESULTADOS

Lectura:
 El desarrollo de M. tuberculosis generalmente aparece luego de
2 a 3 semanas.
 Las observaciones de los cultivos se hacen después de 48 horas
de incubación de la muestra, para descartar contaminación:
 Alcalinizado: color blanco amarillo.
 Acidificado: color azul oscuro, por mala descontaminación
(neutralización) de la muestra.
 El desarrollo de colonias antes de las 48 horas es indicativo de
contaminación, algunas veces el medio se licúa por acción de
gérmenes proteolíticos.
 Las revisiones posteriores se realizarán durante la incubación a los 7, 30 y 60 días.
 Si no se observan colonias en el tiempo mencionado, se deja los cultivos hasta las 8 semanas antes
de proceder a informar el resultado como negativo.
 Las colonias típicas son de color crema, rugosas, con aspecto de coliflor y de borde irregular. Se
desarrollan en la superficie del medio y el sitio en que se implantan no cambia de color.
 De las colonias que no tienen una morfología típica, se debe hacer un extendido y colorearlo por
Ziehl Neelsen para examinarlo. Si son bacilos ácido - alcohol resistente (BAAR), se debe enviar el
cultivo al laboratorio de referencia para su identificación.
 Informe de resultados del cultivo:
 Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa.

- No se observa colonias.
N°… Número total de colonias, si hay menos de 20.
+ De 20 a 100 colonias.
++ Colonias separadas más de 100.
+++ Colonias confluentes (se observa desarrollo en toda la superficie del medio).
Cultivo contaminado.
c Se debe realizar frotis y coloración Ziehl-Neelsen de las colonias que no tienen morfología
típica. De observarse B.A.A.R.*, se enviara el cultivo para su tipificación al I.N.S.

5. CONCLUSIONES

 La técnica de cultivo es más sensible que la baciloscopía, ya que en casos con baciloscopía negativa
contribuye a confirmar el diagnóstico, asegurar la negativización de los cultivos es imprescindible
para el seguimiento del cultivo es fundamental para el aislamiento de la bacteria, que permitirá, si
fuese necesario, estudios de resistencia de fármacos. Por ello, en muestras no asépticas es necesaria
la descontaminación para eliminar la flora asociada a M. tuberculosis, cuyos gérmenes se
multiplican más rápido que el bacilo. De igual manera, sirve para homogenizar la muestra
especialmente el esputo a fin de liberar al bacilo del mucus, material celular y tejidos.

2.5. RECOMENDACIONES

Para el trabajo en el laboratorio, se recomienda:

 Debe utilizar los EPP (equipos de protección personal) estos incluyen guardapolvo, guantes, mascarilla.
 En el laboratorio no se permitiré al personal comer, beber y fumar.
 La mesa de trabajo se descontaminara al terminar la jornada laboral y en caso de derramamiento de
sustancias peligrosas.
Ante la exposición laboral a la sangre u otras sustancias o materiales potencialmente contaminados, se recomienda:
1. Cuidado inmediato de la zona expuesta
 Lavar las heridas con agua y jabón.
 Lavar las membranas mucosas con agua.
2. Determinar el riesgo asociado a la exposición, en función del:
 Tipo de líquido corporal implicado (sangre, líquidos corporales visiblemente sanguinolentos, otros líquidos
corporales o tejidos potencialmente infecciosos, concentrados de virus).
 Tipo de exposición (lesión percutánea, exposición de membrana mucosa o piel no intacta, mordeduras
causantes de exposición a sangre).
3. Investigar la fuente de la exposición
 Evaluar el riesgo de infección con base en la información disponible.
 Investigar la presencia de HBsAg y anticuerpos anti-VHC y anti-VIH.
 Evaluar el riesgo de exposición a las infecciones por VHB, VHC y VIH en fuentes desconocidas.
 No analizar la presencia de virus en agujas y jeringuillas desechadas.

Para el almacenamiento de sustancias químicas, se recomienda:

 Almacenarlos según sus características de peligrosidad.
 Todo producto químico almacenado o en uso debe contar con tapas de cierre hermético y con rótulos que
permitan identificar fácilmente su riesgo.
 No se deben almacenar por tiempo indefinido los productos químicos ya que pueden sufrir cambios por
influencias externas como luz, aire y calor, generando peligros que no se esperaban de estos materiales en
su estado original.

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Fecha de Presentación Practicante Responsable