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u a
Aspectos moleculares . C del SIDA
l
r A
e s o
ro f
P
Dr. Alejandro Claude
Instituto de Bioquímica
UACH
Población actualmente infectada con HIV y/o síntomas
de SIDA:
d e
la u
. C
r A
es o
ro f
P
HIV Cases Expected to Rise Sharply in UK:
LONDON, February 2002 (Reuters) - The number of HIV-positive people
in Britain is likely to rise sharply over the next few years. More people were
diagnosed with HIV infection in the UK last year than ever before, Britain's
Public Health Laboratory Service (PHLS) said. The PHLS expects the total
number of cases to reach 34,000 by 2005, a 47% jump from 2000.
e
u d
C la
.
Tanto HIV-1 como HIV-2 son virus de origen zoonotico. Los
A
r
parientes virales más cercanos a HIV-1 y HIV-2 en simios
o
es
ocurren en el chimpancé común (Pan troglodytes) y en el
f
ro
“sootty magabey” (Cercocebus atys), respectivamente. La
P
evidencia filogenética indica que otros lentiviruses habrían
sido comunicados desde estas especies a seres humanos en al
menos ocho ocasiones anteriores.
Estructura del virus HIV
El virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1) será discutido en detalle como un
ejemplo de estructura viral. En algunos casos se comparará su estructura con la de otros
virus, por ser estos últimos mejor entendidos, o para ilustrar variaciones importantes.
caso de HIV. d e
•Formar una capa continua asociada a la membrana, como es el
la u
•Formar una capa discontinua, pero asociada a la membrana.
C
A
•Estar separada de la membrana.
.
o r
f es
La membrana lipídica de HIV o manto proviene de la membrana
P ro
plasmática de la célula infectada y es adquirida por el virus
durante el proceso de extrusión de la partícula viral a al atravesar
la membrana celular. Un manto es una característica común en
virus animales pero poco frecuente en virus vegetales.
En el caso de virus Herpes, el manto proviene de la membrana
nuclear. Para el virus Vaccinia, el manto proviene del Golgi.
El manto viral contiene los lípidos y proteínas características de la
membrana de la cual deriva originalmente. También posee
e
proteínas virales que frecuentemente forma púas o peplómeros.
d
a u
La principal proteína de HIV asociada con el manto es gp120/41.
l
C
Esta funciona com el antireceptor viral ó proteína de unión a
.
A
receptor. La subunidad gp41 es de transmembrana, mientras que
r
o
gp120 está presente en la superficie externa y esta unida de forma
es
f
no-covalente a gp41.
ro
P
El precursor de gp120/41 (gp160) es sintetizado en el retículo
endoplásmico de la célula infectada y transportado a través del
Golgi a la superficie celular donde son recogidas por la partícula
viral emergente.
Otros tipos de estructuras virales conocidas:
d e
la u
. C
r A
es o
ro f
P
TMV, un virus de RNA, ha sido particularmente bien
estudiado desde el punto de vista estructural. Si las
subunidades proteicas se distribuyen en forma de
circunferencia, se forma un disco. Si estos discos se
apilan, se forma un cilindro o tubo hueco, con espacio en
d e
el medio para el material genético. Un estudio más
la u
refinado revela que las proteínas de nucleocápside no
. C
están organizadas en forma cilíndrica, sino que
r A
helicoidal. Esto ocurre debido a la propensidad de los
o
f es
ácidos nucleicos para adoptar estructuras de hélice.
P ro
Al disponer las nucleocápsides en forma helicoidal, las
interacciones entre DNA (ó RNA) y proteína pueden
simplificarse y hacerse modulares – excepto para las
subunidades en las puntas.
Todos los virus filamentosos poseen nucleocápsides
helicoidales. El ancho típico es de 15-19 nm. El largo
varía con tamaño del genoma, pero el promedio es de
300-500 nm. La estructura de TMV puede ser descrita
en términos del número de subunidades por vuelta (16.3)
e
u d
y el avance por vuelta de la hélice o paso (2.28 nm). El
C la
avance axial por subunidad es por lo tanto 2.28/16.6 =
0.14 nm. A .
o r
es
Es posible que el filamento de nucleoproteína de HIV
f
ro
posea una estructura similar.
P
Las proteínas de nucleocápside son generalmente básicas
(+ a pH fisiológico) lo que neutraliza y facilita el
empaquetamiento de los ácidos (-) nucleicos.
Cápsides icosaedrales:
d e
la u
. C
r A
es o
ro f
P
Estudios por microscopía electrónica (ME) sugieren que
muchos virus son aproximadamente esféricos.
Un examen más detallado demuestra que en realidad son
d e
icosaedrales. Los virus icosaedrales son extremadamente
la u
comunes entre los virus animales y vegetales.
C
A .
Se supone que la cápside o r del virus de HIV tiene una
f e
estructura icosaedral.
s
En la actualidad no se conocen los
P ro
detalles precisos de esta cápsula, pero existe información
general que se presenta a continuación.
Las subunidades de la cápside están dispuestas alrededor
de los vértices y caras de un icosaedro. Un icosaedro es
una estructura con 20 triángulos equilaterales dispuestos
de manera regular y esférica. Se define por poseer ejes de
simetría doble, triple y quíntuple. e
u d
C la
A .
o r
f es
P ro
Existen varias razones por las cuales los virus adoptan
una simetría icosahedral:
e
•Los anti-receptores de influenza y polio virus se
d
ubican en surcos. la u
. C
•Los virus de insectos
r Ano están sujetos a una
respuesta inmunesyopor ende no poseen surcos.
El ligando o f e
para el receptor celular ocurre en
r
P de la superficie viral.
protuberancias
Replicación de HIV-1
e
El virus de la inmuno deficiencia humana (HIV-1)
d
la u
será discutido en detalle como un modelo de
replicación viral. . C
r A
En algunos casos e s o
se comparará su replicación con
otros virus,ro
f
P por ser estos mejor estudiados o para
ilustrar diferencias en este proceso.
Consideraciones generales:
d e
la u
. C
r A
es o
ro f
P
La replicación viral puede ser dividida en tres fases
arbitrarias:
Iniciación:
d e
• unión la u
• penetración . C
• desnudamiento r A
es o
ro f
El material genético viral entra en contacto con el
P
citoplasma celular, en algunos casos acompañado por
cofactores proteicos esenciales.
Replicación:
z síntesis de proteínas e
u d
la
C del genoma
El tamaño, composición y organización
.
A
viral presenta una enormerdiversidad. No existe un
s o
patrón único de replicación.
e Sin embargo todos
o f
producen proteínas
r con 3 tipos de funciones básicas:
P
1.-que aseguran la replicación del genoma.
2.-que empacan el genoma en partículas virales.
3.-que alteran el metabolismo celular para optimizar
la producción viral.
En algunos casos, como el de los parvovirus, las enzimas
celulares replican el genoma viral, asistido por proteínas
virales. Pero en la mayoría de los casos son proteínas
e
virales las encargadas de replicar el genoma.
u d
C la
A .
•Liberación: o r
f es
z P ro
ensamblaje
z maduración
z salida de la célula
Fase de Iniciación:
d e
la u
. C
r A
es o
ro f
P
El antireceptor es inicialmente sintetizado como un
precursor, gp160. Este es cortado por proteasas celulares
en gp120 y gp41. Este evento proteolítico es esencial para
la infectividad de HIV.
d e
Gp41 y gp120 permanecen asociadas a u como un
heterodímero. Es esta unión la. que
l
C mantiene a gp120
r A
asociada al virión ya que solo gp41 posee un dominio de
transmembrana. e s o
r o f
P HIV es el antígeno CD4, que une gp120
El receptor para
con una afinidad constante en el rango nanomolar. Esta
unión fue demostrada por estudios de co-precipitación
utilizando anticuerpos contra ambas proteínas.
La prueba definitiva que CD4 es el receptor de HIV
fue obtenida por Maddon y Weiss. Ellos demostraron
que células humanas negativas para CD4 (e.g. HeLa)
no pueden ser infectadas por HIV. La expresión
artificial de CD4 en estas células mediante e
d
transfección del gen clonado las vuelve permisivas
u
para HIV. C la
A .
r
Sin embargo, proteínas adicionales son necesarias, ya
o
es
que la expresión de CD4 en células de ratón no las
f
ro
vuelve permisivas para infección con HIV. Estos
P
componentes adicionales han sido identificados como
miembros de la familia de los receptores para las
beta-quemoquinas (chemokines), en particular
CXCR-4 y CCR-5.
d e
la u
. C
r A
CD4 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y
es o
posee 4 regiones análogas a las regiones variables de las moléculas
ro f
de anticuerpos. El sitio de unión para gp120 ha sido mapeado por
P
anticuerpos neutralizantes y mutagénesis sitio-específica. Esta sitio
existe en la primera región variable de CD4 entre loa aminoácidos
16-84. Aminoácidos adicionales del segundo dominio variable
también contribuyen a la unión. La estructura cristalina de la
molécula ha sido resuelta.
La región responsable en gp120 para unir CD4 también
ha sido identificada. Un segmento en la región C-
e
terminal entre los aminoácidos 397-439 es crítica.
d
la u
Deleciones de más de 12 aa o sustituciones eliminan la
unión a CD4. . C
r A
Una comprensión más
e s o detallada de esta interacción
ro f
depende de la resolución de la estructura cristalina de
P
gp120. Este estudio tiene particular importancia por su
potencial uso terapéutico.
Después de la unión, la penetración ocurre rápidamente en un
proceso dependiente de energía. Esto puede ocurrir por dos
mecanismos principales:
d e
la u
. C
r A
es o
ro f
P
El DNA proviral tiene 9.5 kb de largo y 3 marcos
principales de lectura abierta, gag , pol y env , comunes
en todos los retrovirus. También hay varios marcos de
lectura menores. Cuatro son no esenciales, ya que son
e
u d
dispensables para infectar células en cultivo:
C la
•vif - infectividad ? A .
o r
es
•vpr - transcripción ?
f
ro
•vpu – chaperona para env ?
P
•nef – efecto indirecto sobre transcripción ?
Las proteínas gag, pro y pol son producidas a partir
de un mensajero sin procesamiento por splicing. El
gen de pol (pro+pol) se sobrepone al de gag por 241
nucleótidos. El marco de lectura de pol es –1 relativo
al de gag. e
u d
En aproximadamente 10% de los casos se expresa
la
C
una proteína de fusión gag-pol debido a un
.
r A
corrimiento –1 del ribosoma. Este fenómeno siempre
es o
ocurre dentro de una secuencia de 6 U´s, U UUU
ro f
UUA e implica que una de estas bases es leída 2
veces.
P
Este proceso es conocido como corrimiento de
marco de lectura ribosomal y también ocurre en
otros genomas virales.
La proteína pol posee una actividad aspartato proteasa.
Esta cataliza la conversión proteolítica de para liberar la
integrasa, transcriptasa reversa y la proteasa libre.
e
gp160 (env) es producido a partir de unumensajero con
d
un evento de splicing. C l a
.
A involucradas el el
Tat y rev son proteínas resenciales,
s
control de la expresión
e ode los genes virales. Los genes
de tat y rev r o f
poseen 2 exones ambos y se sobreponen
P
parcialmente en distintos marcos de lectura. Ambos
provienen de mensajeros con dos eventos de splicing.
La región LTR funciona como un promotor sumamente
compacto. Luego de la integración, el DNA proviral se
comporta como un gen celular:
d e
la u
. C
r A
es o
ro f
P
La transcripción de esta unidad proviral es un fenómeno
complicado. Esta involucra la coordinación de múltiples
secuencias virales en el LTR actuando en cis y de
proteínas celulares y virales actuando en trans.
Algunas secuencias en el LTR actúan como sitios de
unión para factores generales de transcripción como
TFIID (TATA BP), mientras que otras unen factores
tejido-específicos como NFkB. d e
la u
. C
NFkB es un activador particularmente importante en
células T. r A
es o
ro f
La presencia de tantos sitios de unión para FT en el LTR
P
explica porqué es activado en tantos tipos distintos de
células. Estos factores celulares de transcripción
incluyen EBP-1, NFkB, SP1, CTF/NF1 y LBP-1.
El LTR solo genera un nivel de transcripción basal. Una
expresión elevada de los genes de HIV requiere la
presencia de la proteína tat. e
u d
Tat aumenta la producción de RNA
la
Cen 100X. La proteína
tat a su vez requiere de r
una
.
Asecuencia conocida como
TAR, que está presente
e s oen el extremo 5´de los mRNAs
de HIV. r o f
P
Se cree que TAR forma una estructura de asa-
vuelta (stem-loop). Se ha demostrado que una
molécula de tat se une directamente al RNA
TAR con una Kd de 1nM.
Estudios de mutagénesis indican que la unión e
es dependiente de una secuencia desapareada u d
la
de U´s dentro del elemento TAR. La secuencia
C
A .
TAR solamente es funcional en forma de
o r
RNA (no DNA) y únicamente en una posición
es
f
inmediatamente 3´ del sitio de inicio de la
ro
P
transcripción.
Esta actividad de enhancer (aumentador)
RNA-dependiente de tat es única en la
maquinaria eucariótica de expresión de genes.
Inicialmente, solo una pequeña
cantidad de mRNAs de tat y rev se
acumulan debido a la baja actividad
del promotor en ausencia de tat.
Eventualmente la acumulación
creciente de tat permite una mayor d e
transcripción en un ciclo de retro- la u
alimentación positivo. . C
La proteína rev regula este r A
reforzamiento positivo.
es o
f
Luego de varias horas los niveles de
ro
P
transcripción permanecen elevados y
la producción de mRNA cambia de mensajeros pequeños con doble
splicing, a mensajeros con splicing simple que codifican para env.
Finalmente se producen mensajeros sin splicing que codifican para
gag y pol.
Rev es responsable por este cambio en el patrón de transcripción.
e o
•Rev inhibe el splicing desmRNAs que contienen esta secuencia y
o f
favorece su exportación del núcleo.
r recientemente que rev se asocia con
•Se ha demostrado
P
nucleoporinas presentes el el complejo del poro nuclear.
e
La producción de interferón en respuesta a la infección
d
a u
viral. Este a su vez activa más de 30 otros genes celulares.
l
. C
A
Activación de la 2´5´poliadenilato sintetasa que produce
r
es o
2´-5´poli-A a partir de ATP. Esta molécula activa la
ro f
RNAsa L que degrada RNAs celulares y virales.
P
Activación de la proteína quinasa PKR, que fosforila la
subunidad α del factor de iniciación de la síntesis de
proteínas eIF2.
Este evento secuestra al factor de
intercambio de GTP para eIF2. Esto
detiene la maquinaria celular de síntesis
de proteínas y bloquea la replicación
viral.
Muchos virus, incluyendo HIV han d e
desarrollado estrategias para evitar el
la u
bloqueo por PKR. C
A .
HIV al igual que EBV, HHV-4 yo r
es
adenovirus, producen dsRNAs que se unen a PKR y la secuestran,
f
ro
pero no la activan. La secuencia TAR cumple admirablemente esta
P
función ya que está ubicada al comienzo de todos los mRNAs
virales e inhibe la función de PKR asociado a los ribosomas. De este
modo los mensajeros de HIV pueden ser traducidos de manera
preferencial en células donde la síntesis de proteínas endógenas ha
sido bloqueada
Ensamblaje, maduración y liberación
d e
la u
No está claro cuantas de las reacciones patológicas del
C
.
SIDA son causadas directamente por el virus HIV, y
A
o r
cuantas son causadas por el desbalance inducido en el
sistema inmune. f es
P ro
Algunas de las anormalidades inmunológicas asociadas
con la infección por HIV incluyen :
e s o
producción puede variar en 70x entre distintos individuos.
• La vida mediaf de un virión en el plasma es de 28-110
minutosP
o
enrvez de los 2 días que se creía anteriormente.
•Hasta 109-1010 partículas de HIV son producidas
diariamente.
•En promedio, 2x109 nuevas células CD4+ son producidas
diariamente.
Por lo tanto existe una situación extremadamente dinámica en
pacientes infectados con HIV, que involucra la infección,
destrucción y reemplazo de miles de millones de linfocitos
CD4+ cada día.
d e
Estos resultados favorecen la teoría de la destrucción directa
la u
de linfocitos como mecanismo causal del
C SIDA.
A .
Sin embargo esta destrucción
o rparece ser mediada por apoptosis
y destrucción inmune
f e s
más que por fusión.
P r o
Quien desarrolla SIDA?
Nuevas técnicas terapéuticas seguramente utilizaran un doble
ataque contra la enfermedad, un ataque contra el virus propiamente
tal y una terapia inmuno-moduladora para evitar la degradación
gradual del sistema inmune. e
Chemokinas: u d
C la
A .
o r
f es
P ro
El trafico de las células inmunes esta controlado por:
1.Moléculas de adhesión.
2.Citokinas quemo-atractoras (chemokinas) y sus
receptores.
d e
la u
. C
r A
es o
Receptores: ro f
P
•3 clases: C (1), C-C (beta), C-X-C (alfa)
•Cisteínas características: (C-C) puente o C-X-C repetición
•Proteína G de 68-120 aminoácidos con glicoproteínas asociadas
•7 dominios de transmembrana
•Por lo menos 50 miembros
Estudios sobre la naturaleza e identidad del receptor para HIV ha
revelado:
d e
la u
. C
r A
es o
ro f
P
Sobrevivientes a largo plazo: