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(glucosa, fructosa y sacarosa) como sustrato, durante una fermentación de levadura de vino
manzana con la cepa Saccharomyces cerevisiae CCTCC M201022. Este modelo se utilizó para
predecir la utilización del azúcar por esta levadura a partir de varias concentraciones iniciales de
azúcar. Tras la observación de los datos experimentales, se desarrolló un modelo basado en la
ecuación logística del crecimiento de la levadura, la producción asociada de etanol con un
tiempo de retardo y el consumo de azúcares para la formación y mantenimiento de biomasa.
Después de la instalación experimental del modelo, se estimaron los parámetros cinéticos en el
modelo. La verificación experimental del modelo se llevó a cabo mediante fermentación en
matraz-escala, y el modelo obtenido predijo eficazmente el rendimiento de fermentación,
utilizando diferentes azúcares como sustrato fijado en varias concentraciones iniciales de
azúcar. Sobre la base de los parámetros cinéticos estimados y las características de la utilización
del azúcar, la levadura examinada parecía ser glucófilas. Se investigaron los efectos de diferentes
azúcares con varias concentraciones iniciales sobre el rendimiento de fermentación de esta
levadura, y se discutieron algunas aplicaciones de parámetros cinéticos
INTRODUCCIÓN
El vino de manzana es una bebida fermentada elaborada a partir de zumo de manzana fresco o
concentrado. Ha tenido una larga tradición en Europa y ha ocupado un lugar importante en la
industria mundial del vino de fruta. Se ha convertido en la segunda mayor industria del vino de
frutas con una demanda creciente en China. Hoy en día el uso de cultivos seleccionados de
levadura pura para la fermentación de vino de manzana como entrantes, y los avances
tecnológicos en otras partes de la industria de bebidas fermentadas han influido en el proceso
de elaboración de vino de manzana, no obstante, la información disponible no es todavía
suficiente para permitir una plena comprensión y control del procesos. El jugo de manzana
contiene muchos azúcares, incluyendo fructosa, glucosa, sacarosa y otros carbohidratos, en
concentraciones variables. A diferencia del puré, el azúcar en la mayor cantidad de jugo de
manzana es fructosa, hasta el 70% del total azúcar fermentable de 100~150 g/L, más glucosa y
sacarosa. Al igual que la levadura de vino, la función principal de la levadura de vino de manzana
(Saccharomyces cerevisiae es la cepa industrial principal) es catalizar la conversión rápida,
eficiente y completa de azúcares al alcohol sin el desarrollo de la fermentación off-sabores. Sin
embargo, la fermentación alcohólica lenta e incompleta del jugo (p. ej., lenta o atascada) es un
problema crónico para la industria del vino fruta.
Esto puede conducir a una pérdida no programada de la capacidad del tanque debido a los
tiempos de procesamiento prolongados y el potencial de inestabilidad microbiana y off-taste del
producto final debido a los azúcares residuales. En estos casos, la fructosa es el factor principal,
causando una alta concentración residual de azúcar. A pesar de la importancia de la
fermentación de fructosa para la producción de vino de manzana, pocos estudios han abordado
este tema. Además, otros azúcares fermentables de caña, remolacha o jarabe de maíz
hidrolizado se utilizan comúnmente como complementos en la producción de vino de manzana.
Los cambios en el contenido de azúcar afectarán al proceso de fermentación. De ahí la necesidad
de una investigación práctica sobre el mecanismo de absorción y utilización del azúcar y el
comportamiento cinético de fermentación por levadura utilizado en este proceso es
significativa.
Se requiere más información para seleccionar y evaluar las levaduras para mejorar el
rendimiento de la fermentación. Como herramienta útil, el objetivo principal de un modelo
cinético desarrollado para la fermentación del vino es la predicción del comportamiento cinético
de la fermentación de levadura basado en las características iniciales del jugo. El desarrollo de
los correspondientes modelos matemáticos de cinética de fermentación también es importante
en la investigación del comportamiento de la levadura y la regulación metabólica.
Por lo tanto, el objetivo de este trabajo era proponer un modelo no estructurado para la cinética
de fermentación de levadura de vino manzana utilizando diferentes azúcares como sustrato, en
el que se supone que el microorganismo puede ser representado por una variable de estado, y
no es necesario considerar la incorporación de conocimientos bioquímicos complicados sobre
los diferentes mecanismos de regulación de la célula. Luego se predice el rendimiento de
fermentación en diferentes niveles iniciales de azúcar por la levadura de vino de manzana.
Basado en parámetros cinéticos obtenidos, se comparó la utilización de diferentes azúcares por
esta levadura, y se discutieron las características cinéticas de la levadura.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizó para los experimentos la cepa de levadura Una cepa de levadura, Saccharomyces
cerevisiae strain CCTCC M201022 (China Center for Type Culture Collection), seleccionada por
este laboratory.
Medio Para investigar el efecto de un solo azúcar en la fermentación de la levadura, se preparó
un medio sintético para simular un concentrado de zumo de manzana, de acuerdo con la
composición de un jugo de manzana’ideal utilizado para el vino de manzana 5,11. Contenía
20~230 g/L de azúcar único (glucosa, fructosa o sacarosa, respectivamente), 1.7 g/L de extracto
de levadura, 1.7 g/L (NH4)2SO4 , 0.9 g/L quinato, 3.0 g/L de ácido málico, 1.0 g/L de ácido láctico,
y vitamina DB1 y 2 mg de vitamina 1,10 mg/L. El pH se ajustó a 3.5. la acidez valorable a 8.1
como el ácido málico fue de 3.95 g/l.
Modelo de desarrollo Kinetic modelo. Entre los numerosos modelos desarrollados, la mayoría
de los modelos se basan en el conocimiento bioquímico models13, que consiste en un conjunto
de ecuaciones matemáticas que describen los fenómenos que ocurren durante la fermentación
del vino. La principal ventaja de este tipo de modelo es que tienen en cuenta fenómenos
biológicos. Los parámetros del modelo con algún significado biológico pueden ser obtenidos,
pero sus estructuras pueden ser fuertemente no lineales, complejas y difíciles de verificar y
validar, y pueden plantear problemas en términos de identificación de parámetros. En el
desarrollo de técnicas de modelado no-lineal, ha habido un aumento en el uso de modelos de
crecimiento sigmoidal en el campo de la microbiología predictiva para pronosticar el proceso de
fermentación. Los detalles del modelado no-lineal han sido descritos por Speers et al.20 En
general, el modelo cinético de fermentación se puede subdividir en un modelo de crecimiento,
un modelo de sustrato y un modelo de producto. Hay tres ecuaciones diferentes derivadas para
describir el comportamiento cinético de la concentración de células de levadura, los azúcares
(glucosa, fructosa o sacarosa, respectivamente), y el etanol en este estudio.
Entre los muchos modelos que describen la cinética de crecimiento de microorganismos (p. ej.
modelo de crecimiento de monos), se eligieron las estructuras del modelo. Los modelos semi-
empíricos clásicos de tipo Monod no se ajustan bien a los procesos de fermentación en muchos
casos, aunque hay muchos tipos modificados. Recientemente el modelo logístico, como modelo
sigmoidal, ha sido el más popular debido a su "bondad de ajuste" 20 y ha sido ampliamente
utilizado para describir el crecimiento de microorganismos 9,13. Por lo general, el modelo
logístico se utilizó para mostrar la auto-regresión hecha por el aumento de la concentración
celular común en el lote-fermentación. En este trabajo, desarrollamos una ecuación basada en
el modelo logístico con el crecimiento-producción asociada de etanol
el tiempo de fermentación, que se utiliza para ajustar los datos experimentales de concentración
de biomasa. Hay dos parámetros, µm y Xm , en esta ecuación, y se estiman de los datos
experimentales del software matemático, Sistema SAS.
Combinado con la Ec. (1), Ec. (3) y los parámetros estimados, esta ecuación puede integrarse y
la ecuación de consumo de azúcar puede obtenerse como Ec. (6). Se estimaron los parámetros
conexos.
Estimación de parámetros. Los valores iniciales de X0 y S0 fueron fijados por las condiciones
experimentales. Los otros parámetros, como µm , xm , t, m y algunos coeficientes de
rendimiento fueron estimados por el método de regresión no lineal de Newton del sistema SAS
8.01 utilizando datos experimentales por lotes. En el programa SAS, se utilizaron 5 técnicas de
búsqueda iterativa, incluyendo el método de regresión no lineal de Newton, NewtonGauss,
Marguardt, Gradient y la técnica Dud, para minimizar la suma residual de cuadrados. Todas las
técnicas dieron resultados similares, sin embargo el Newton no lineal método de regresión
tendió a dar ligeros mejores ajustes como lo demuestra el examen de la suma residual de
cuadrados y F-value.
Fig. 1. Los perfiles de fermentación de la levadura de vino de manzana utilizando (A) glucosa con
una concentración inicial determinada de 85.0 g/L, (B) fructosa de 91.1 g/L, y (C) sacarosa de
96.6 g/L como sustrato, respectivamente.
Tabla I. Parámetros cinéticos estimados a partir de los datos experimentales sobre diferentes
azúcares.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Con valores estimados de Yp/x y ∆t (indicados en la Tabla I), (4) se usó para ajustar la producción
de etanol a las distintas azúcares. Se verificó una gran importancia para el ajuste del modelo
(todos los Pr < 0.0001), y r2 son 0,990 para la glucosa, 0,989 para la fructosa y 0,985 para la
sacarosa como sustrato, respectivamente. En la Fig. 3 se muestran los datos experimentales y
los previstos por el modelo cinético para la producción de etanol. Había poca diferencia entre
los datos experimentales y los resultados de las predicciones, y las predicciones de los datos
obtenidos del modelo eran razonables y en algunos casos muy preciso. Por lo tanto, la
consideración de la formación de productos asociados al crecimiento de la levadura y la
introducción del tiempo de retardo de la producción de etanol para el crecimiento celular, ∆t,
fueron razonable en el desarrollo del modelo. Según el coeficiente de rendimiento de Yp/x,
parecía que la fructosa y la sacarosa eran más beneficiosas para la producción de etanol con la
misma cantidad de levadura, con los valores más altos de Yp/x, aunque no eran tan adecuadas
para el crecimiento de la levadura como la glucosa. Además, los tiempos de retardo en la
producción de etanol, ∆t, fueron similares cuando se utilizó fructosa y glucosa como sustrato
respectivamente, pero la fructosa se consumió más lentamente para la producción de etanol
que la glucosa debido al lento crecimiento de la levadura en la fructosa. La sacarosa fue
hidrolizada extracelularmente por la acción de la S. cerevisiae invertasa, produciendo
inicialmente glucosa equimolar y fructosa1,14, que fue utilizada luego por la levadura. Por lo
tanto, el mayor retardo en la producción de etanol observado en la sacarosa era comprensible
en este caso. El etanol en el medio es el resultado de la formación de etanol a partir del
metabolismo del azúcar y su excreción en el medio. El parámetro de retraso, ∆t, refleja este
proceso e indica una producción rápida o lenta de etanol en relación con el crecimiento de la
levadura.
Fig. 3. Datos experimentales y predicciones de modelos cinéticos para la producción de etanol,
utilizando glucosa, fructosa o sacarosa como sustrato, respectivamente.
La evolución prevista de los diferentes azúcares por la Ecuación (6) durante los procesos de
fermentación se muestra en la Fig. 4, junto con los datos experimentales. Esta figura indica que
la predicción del modelo concuerda bien con los datos experimentales en todos los casos. El
modelo fue verificado con alta significación (todos los Pr < 0.001), y r2 del ajuste del modelo
fueron 0.996 para la glucosa, 0.994 para la fructosa, y 0.976 para la sacarosa como sustrato,
respectivamente. Claramente, el consumo de glucosa fue más rápido que el de los otros dos
azúcares. Este fenómeno puede explicarse por los parámetros cinéticos Yx /s y m. La glucosa fue
más beneficiosa para la producción de biomasa con mayor Yx /s. Simultáneamente, la levadura
metabolizó más fácilmente la glucosa, lo que se reflejó en el mayor coeficiente de
mantenimiento (m) de la glucosa. Debido a la hidrólisis de la sacarosa para producir glucosa y
fructosa equimolares, la sacarosa puede considerarse una mezcla de glucosa y fructosa, y la
utilización de la sacarosa era intermedia entre las de glucosa y fructosa. Mientras que la fructosa
se utilizó lentamente, la utilización de sacarosa fue más similar a la de la fructosa, con valores
más bajos de Yx /s y m. Combinado con los parámetros obtenidos de µm y Xm , se sugirió además
por los parámetros Yx /s y m que la levadura era glucofílica. Aunque algunas cepas de levadura
tienen una clara preferencia por la fructosa18, la mayoría de las levaduras glucófilas de vino de
frutas utilizan la fructosa más lentamente que la glucosa. Ahora se acepta en general que el
proceso de absorción de azúcar representa el principal mecanismo de control de la tasa de flujo
glicolítico bajo condiciones anaeróbicas, y la tasa de absorción de azúcar por levadura es
consecuencia de la cinética inherente al proceso de transporte y la inhibición del sustrato
(incluida la inhibición competitiva de la fructosa y la glucosa en el jugo)3 . Berthels et al.2
indicaron que la causa de la discrepancia glucosa/fructosa parece estar localizada en las etapas
de transporte y/o fosforilación de la vía de fermentación, y sugirió que la determinación de la
discrepancia glucosa/fructosa de las cepas candidatas de levadura de vino debería ser un
procedimiento estándar en la evaluación y selección de la cepa.
Predicción de modelos para consumos de sustratos con varios niveles iniciales de azúcar
Conclusiones
Un modelo cinético no-lineal es propuesto para diferentes fermentaciones de azúcar por una
levadura de vino de manzana industrial Saccharomyces cerevisiae, basado en la ecuación
logística del crecimiento de levadura, el crecimiento-producción asociada de etanol con un
tiempo de retardo, y consumo de azúcar para la formación y mantenimiento de biomasa.
Algunos parámetros cinéticos con significado fisiológico en el modelo fueron estimados por el
software matemático. La verificación experimental del modelo se llevó a cabo mediante
fermentación en matraz-escala. Los resultados obtenidos indicaron que el modelo podía
predecir el rendimiento de fermentación utilizando diferentes azúcares como sustrato con
varias concentraciones iniciales de azúcar. Además, algunos parámetros cinéticos obtenidos,
como µm , xm , yx /s, m, podrían utilizarse como indicadores de selección o evaluación.
ABREVIATURAS
t tiempo (h)
(g de etanol/g de biomasa)
(g de etanol/g de azúcar)
(g de biomasa/g de azúcar)