UNIVERSIDAD DE LAS

FUERZAS ARMADAS -
ESPE
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR II

INTEGRANTES: NRC: 4858

Coello Bryan FECHA: 14-06-19
Fernández Eduardo
Solís Alejandra
 OBJETIVOS

• Identificar la función de cada uno de los reactivos utilizados en la extracción.

• Elaborar dos tipos de buffers para utilizar en la extracción y posteriormente
comparar resultados.
 INTRODUCCIÓN
PROTEÍNA
PROTEOMA
• Células animales y vegetales
• 50% del peso seco de la
célula.
• Dos tipos: estructural y
funcional

Característica

• Contenido total de proteínas en una célula. • Ligero cambio de pH,

temperatura o disolventes
Célula vegetal

 Proteínas solubles
 Poco contenido de proteínas
 Gran cantidad de fenoles, terpenos, pigmentos, ácidos
orgánicos, carbohidratos -> extraer proteínas
EXTRACCIÓN DE
PROTEÍNAS

LISIS CELULAR
 Métodos Mecánicos

TÉCNICAS PRINCIPIO EJEMPLO

Homogeneizador Células son rotas Rompimiento
de cuchillos en un mezclador tejidos y células
animales
Homogeneizador Células pasa por un
alta presión pequeño orificio,
haciendo que se
rompan por
esfuerzo de corte
Ultrasonificación Células son Rompimiento de
quebradas en una células en pequeña
cavidad ultrasónica escala
Molinos de bolas Células son Células de plantas
trituradas con bolas
de acero o vidrio
 Métodos No Mecánicos
TÉCNICAS PRINCIPIO CARACTERISTICAS

Tratamiento Enzimas que - Método suave Células de las plantas- celulosa

enzimático hidrolizan la - Costo de la enzima y peptidasas ->rompen capa de
membrana celular de lo hace difícil celulosa
microorganismos
Se colocan en
Shock Osmótico volúmenes de agua 2
veces mayor que el
volumen de la célula,
se hinchan y revientan

Solubilización Solubilización de los Detergente

lípido de la pared Aniónico: SDS
celular Catiónico: Bromuro de
Catiltrimetil Amonio
No-iónico: Triton X-100
 Nitrógeno líquido

 Macerar la muestra con nitrógeno líquido en un

mortero de porcelana -> polvo fino
 Evitando que se formen cristales en el interior
de la célula que rompen la estructura celular e
inicie proceso de degradación

Soluciones Buffers- Tampones

Buffer fosfato salino
TRIS HCL (PBS)
• Mantiene pH estable.
• C4H12NO3Cl
• amortiguador que se Β-Mercaptoetanol
encargan de
mantener el pH en la • agente reductor de enlaces
solución disulfuro
 ELECTROFORESIS

Separar moléculas por Transporte de

su peso molecular o partículas en un campo
tamaño eléctrico

Partícula cargada Proteínas son

negativamente migra compuestos anfóteros,
hacia el ánodo (+), se comportan como
cargas positivas migran ácidos o bases
hacia el electrodo dependiendo del
negativo (cátodo) medio en el que estén.
 Electroforesis en gel de poliacrilamida PAGE
Poliacrilamida

Separación de proteínas,
a través de un gel ->corrida
ácidos nucleicos
Geles de agarosa
Proteínas se mezcla con SDS Rompe interacciones no
(dodecil sulfato de sodio) covalentes, se agrega con Reducir puentes de
mercaptoetanol disulfuro ->
desnaturalizar la proteína
-> cargándose
Colorante que permite observar de frente la corrida negativamente
-Resolución - Concentración Unidos -> fase de
Sistema discontinuos - Composición separación visible
-Empaquetamiento
- pH al trasluz
BUFFERS EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

• Es el agente tamponante que mantiene el

Tris - HCl pH en el gel de electroforesis.
• El amino es el grupo ácido-base que
ejerce el tamponamiento.
BUFFERS EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

• Es un conocido agente quelante de cationes

divalentes, en especial Ca2+ y Mg2+.
EDTA • Evita la acción de nucleasas capturando los
iones magnesio y así evita la degradación.
 BUFFERS EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

• Es una solución amortiguadora e isotónica, cuya

función es mantener el pH y la presión osmótica .
Buffer Fosfato • Existe un equilibrio entre dihidrógeno fosfato
(DHP) y su base: el monohidrógeno fosfato (MHP).
METODOLOGÍA PARA LA PREPARACIÓN
DE BUFFERS DE EXTRACCIÓN

Buffer Fosfato

1X 250 mL Concentración
NaCl 2g 0,137 M
KCl 50 mg 0,0027 M
𝑁𝑎2 𝐻𝑃𝑂4 360 mg 0,01 M
𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 60 mg 0,0018 M

Fuente: Laboratorio de genómica viral y

Humana
METODOLOGÍA PARA LA PREPARACIÓN DE
BUFFERS DE EXTRACCIÓN

Tris HCl (ph 7-8)

2,36 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑡𝑟𝑖𝑠 𝐻𝐶𝑙 𝑒𝑛 10 𝑚𝐿 → 1,5 𝑀

𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2

1,5 𝑀 𝑉1 = (0,05𝑀)(250 𝑚𝐿)

𝑉1 =8,33 mL De Tris-HCl 1,5M

EDTA
𝑥 3
=
250 20

𝑥 = 37.5 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝐸𝐷𝑇𝐴
 METODOLOGÍA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

1 2 3 4

1g de muestra 2,5 mL de buffer de Nitrógeno líquido 20 min a 15000 rpm

extracción y 3 µl
DTT
 CONCLUSIONES

• Se identificó y se preparó cada uno de los reactivos utilizados en la extracción de

proteínas.
• Se emplearon los dos buffers preparados en las mismas muestras en la extracción de
proteínas para compararlos.