Bioprospecção Dos Fungos Endofíticos Associados À Espécie Vegetal Eugenia Jambolana

UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“Júlio de Mesquita Filho”

Instituto de Química de Araraquara
Programa de Pós-graduação em Química
VANESSA MARA CHAPLA
Bioprospecção dos fungos endofíticos associados à espécie

vegetal Eugenia jambolana e utilização de modificador epigenético no
cultivo do fungo Lecythophora sp.
Araraquara
2014
VANESSA MARA CHAPLA
Bioprospecção dos fungos endofíticos associados à espécie

vegetal Eugenia jambolana e utilização de modificador epigenético no
cultivo do fungo Lecythophora sp.
Tese apresentada ao Instituto de Química,

Universidade Estadual Paulista, como parte
dos requisitos para obtenção do título de
Doutora em Química
Orientadora: Prof. Dra Angela Regina Araujo
Araraquara
2014
DADOS CURRICULARES
Dados Pessoais:
Nome: Vanessa Mara Chapla

e-mail: vanessachapla@gmail.com
Formação Acadêmica:
(1) Doutorado em Química – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita

Filho” (UNESP) – Instituto de Química – Araraquara – SP (2010 - 2014), com período
sanduíche na University of Arizona (2012-2013 - Orientador: Leslie A. A. Gunatilaka)
(2) Mestrado em Química – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

(UNESP) – Instituto de Química – Araraquara – SP (2008 - 2010).
(3) Graduação em Química Bacharelado - Universidade Estadual do Oeste do

Paraná (UNIOESTE) – Centro de Engenharias e Ciências Exatas – Toledo – PR (2003
- 2007).
Bolsas Concedidas
(1) Bolsista de Doutorado – CAPES (2010-2014)

Título do projeto: Avaliação química e biológica dos fungos endofiticos associados a
especie vegetal Eugenia jambolana.
Orientação: Angela Regina Araujo
(2) Bolsista de estagio de doutoramento – CAPES (2012-2013)

Título do projeto: Maximizando a diversidade metabólica de endófitos de plantas e de
liquens utilizando moduladores epigenéticos
Orientação: Leslie A. A. Gunatilaka
(3) Bolsista de Mestrado – CAPES (2008-2010)
Título do projeto: Avaliação química e biológica do fungo endofítico Phomopsis sp.
isolado da Senna spectabilis.
Orientação: Angela Regina Araujo
Artigos completos publicados em periódicos
1. CHAPLA, V. M., BIASETTO, C. R., ARAUJO, A. R.

Fungos endofiticos: uma fonte inexplorada e sustentável de novos e bioativos
produtos naturais. Revista Virtual de Química. v. 5, p. 421-437, 2013.
2. SILVA, Cristiana Da, SAVARIZ, Franciele Cristina, FOLLMANN, Heveline Dal

Magro, NUÑES, Luciana, CHAPLA, Vanessa, Mara; SILVA Classius Ferreira da,.
Análise físico-química de salames coloniais comercializados no município de Toledo,
Estado do Paraná. Acta Scientiarum. Technology (Online). v.33, p.331 - 336, 2011.
Trabalhos Apresentados em Congressos
1. CHAPLA, V. M., CAVALHEIRO, A. J., BOLZONI, V.S., FERREIRA, P. M. P.,

PESSOA, C., ARAUJO, A. R. Two new compounds isolated from saccharicola sp. An
endophytic fungus in Eugenia jambolana (MYRTACEAE). 4th Brazilian Conference of
Natural Products. Natal-RN, 2013.
2. ARAUJO, A. R., CHAPLA, V. M., LOPES, M.N., SILVA, D.H.S., CAVALHEIRO, A.

J., BOLZONI, V.S. Two new metabolites from Saccharicola sp. an endophytic fungus
in Eugenia jambolana (Myrtaceae) In: The American Society of Pharmacognosy
Annual Meeting, Saint Louis. 2013.
3. HILARIO, F., CHAPLA, V. M., ARAUJO, A. R., SANTOS, L. C. Estudo químico por
HPLC-PDA de fungos endofíticos isolados das partes aéreas de Paepalanthus
giganteus (Eriocaulaceae). 36ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química,
Águas de Lindóia - SP. 2013.
4. HONORIO, A. E., GUBIANI, J. R., CHAPLA, V. M., BOLZONI, V.S., ARAUJO, A.
R., CAVALHEIRO, A. J. Saccharicola sp. um endófito de Eugenia jambolana, um
prolífico produtor de metabólitos bioativos. 36ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira
de Química, Águas de Lindóia - SP. 2013.
5. ARAUJO, A. R., MONFARDINI, J. D., CHAPLA, V. M., LOPES, M.N., SILVA, D.H.S.,
CAVALHEIRO, A. J., BOLZANI, V.S. Dihydroisocoumarins produced by
Botryosphaeria parva an endophytic fungus from Eugenia jambolana In: The
International Congress on Natual Products Research, 2012.
6. CHAPLA, V. M., SOMENSI, A., CAVALHEIRO, A. J., BOLZANI, V. S., ARAUJO, A.

R. Substâncias acetilênicas produzidas por Saccharicola sp. um fungo endofítico
isolado de Eugenia jambolana, 35ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, Águas de Lindóia - SP, 2012.
7. CHAPLA, V. M., SILVA, D.H.S., BOLZONI, V.S., FERREIRA, LIMA, D., J., B.,
PESSOA, C., MORAES, M. O., ARAUJO, A. R. Bioprospection in endophytes
associated with Eugenia jambolana, Brazilian Conference of Natural Products, Ouro
Preto-MG, 2011.
8. CHAPLA, V. M., ZANARDI, M. L., LOPES, M.N., SILVA, D.H.S., YOUNG, M. C. M.,
BOLZANI, V. S., ARAUJO, A. R. Metabólitos secundários produzidos pelo endófito
Phomopsis sp. associado a Senna spectabilis In: 33a Reunião Anual da Sociedade
Brasileira de Químcia, Águas de Lindóia – SP, 2010.
9. CHAPLA, V. M., ZANARDI, M. L., LOPES, M.N., CÂMARA, M.P.S., ARAUJO, A.

R., BOLZANI, V. S. Citocalasinas produzidas pelo fungo endofítico Phomopsis sp.
isolado da Cassia spectabilis In: 32 Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, Fortaleza-Ce, 2009.
10. CHAPLA, V. M., ZANARDI, M. L., SILVA, D.H.S., BOLZANI, V. S., ARAUJO, A. R.
Diketopiperazines from Phomopsis sp. an endophytic fungus in Senna spectabilis In:
2nd Brasilian Conference on Natural Products and XXVIII Annual Meeting on
Micromolecular Evolution, Systematics and Ecology, São Pedro. 2009.
11. PELLEGRINI, M. M.; CHAPLA, V. M.; BIASETTO, C. R.; ZANARDI, L. M.; SILVA,
D. H. S.; BOLZANI, V. S.; ARAUJO, A. R. Prospecção Química do fungo endofítco
Nigrospora shaerica isolado de Alchornea glandulosa. 17-Encontro da SBQ-Regional
Interior Paulista Waldemar Saffioti, Araraquara, 2009.
12. CHAPLA, V. M.; OLGUIN, C. F. A.; BRAUN, G.; CORNELIUS T. F. M.

Estudo fitoquímico biomonitorado do extrato hexânico da parte aérea da macrófita
Eichornia crassipes. In: XX Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil e X International
Congress of Ethnopharmacology, São Paulo, 2008.
13. CHAPLA, V. M.; OLGUIN, C. F. A.; BRAUN, G. Avaliação da atividade citotóxica

e antimicrobiana do extrato da parte aérea da macrófita Eichhornia crassipes. In: XV
Encontro de Química da Região Sul, Ponta Grossa, 2007.
14. SILVA, C.; CHAPLA, V. M.; CAMPOS, S. D. Substituição e modificação do cimento

odontológico a base de fosfato de zinco. In: XV Encontro de Química da Região Sul,
Ponta Grossa, 2007.
15. CHAPLA, V. M.; OLGUIN, C. F. A. Investigação fitoquímica do extrato hexânico

da parte aérea da Eichhornia crassipes. In: XVI Encontro Anual de Iniciação Científica,
Maringá, 2007.
16. CHAPLA, V. M.; OLGUIN, C. F. A.; FOLLMANN, H. D. M.; NUNES, D.; SONE, A.
P.; HAMERSKI, L. Toxicidade frente à Artemia salina e germinação de Lactuca sativa
com os extratos fracionados da parte aérea da Eichhornia crassipes.In: XIII Encontro
de Química da Região Sul, Florianópolis, 2005.
Demais tipos de produção técnica
CHAPLA, V. M. Palestra Intitulada: Avaliação Química e biológica do fungo endofítico

Phomopsis sp. isolado de Senna spectabilis. In: IV Workshop NuBBE, 2009,
Araraquara.
Orientações e supervisões
Monografias de conclusão de curso de aperfeiçoamento/especialização

1. André Paulesini Iagalo. Estudo da variação metabólica do fungo endofítico
Saccharicola sp. associado a espécie vegetal Eugenia jambolana. 2012. Monografia
(Química) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
Iniciação científica
2. Julia Dietsche Monfardini. Estudo químico e biológico do fungo endofítico
Botryosphaeria parva isolado de Eugenia jambolana. 2012. Iniciação científica
(Química) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
Atividades extracurriculares
Participou da comissão organizadora do I Encontro Paranaense de Estudantes de

Química e de VIII Semana Acadêmica, realizado na Universidade Estadual do Oeste
do Paraná- UNIOESTE, Campus de Toledo, totalizando 20 horas.
Estágio docente em Química Orgânica Experimental II - UNESP (março de 2009 a

junho de 2009);
Bolsista didático – Professora da disciplica de Química Orgânica I (4 horas/semana,

2011), e disciplina de Química Orgânica Experimental I (4horas/semanis, 2011).
Iniciação Científica (IC) voluntária concedida pela PICV/UNIOESTE/PRPPG (2007).

Aos meus queridos pais
AGRADECIMENTOS
A UNESP e ao Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química- Araraquara, pela

possibilidade do desenvolvimento deste trabalho e por ter sido cenário importante de uma
etapa da minha vida.
A University of Arizona pela possibilidade da realização do estágio de doutoramento.
A prof. Dra. Angela R. Araujo pela orientação, dedicação, compreensão, carinho, amizade,
muito obrigada pela confiança, sabedoria e apoio.
Ao prof. Dr. Leslie A. A. Gunatilaka pela orientação, pelos ensinamentos, compreensão e
amizade.
A prof. Dr. Lúcia M. Xavier Lopes e ao prof. Dr. Ian Castro Gamboa que participaram do exame
de qualificação, e contribuíram para a finalização deste trabalho.
Aos professores membros da banca que gentilmente aceitaram o convite para
avaliação desta tese.
Aos professores do departamento de Química Orgânica, por seus ensinamentos e amizade.
A todos os funcionários do IQ da Unesp.
Ao querido Nivaldo Boralle pela realização dos espectros de RMN, por estar sempre disposto
a compartilhar os seus conhecimentos.
Ao técnico Marquinhos, por ser tão prestativo. Aos técnicos João e Juliana.
Ao Thomaz pelos espectros de massas, pelas discussões e dúvidas esclarecidas.
A prof. Dr. Maria Cláudia M. Young e ao prof. Dr. Paulo Michel P. Ferreira pela realização dos
ensaios biológicos.
A todos os meus amigos em especial a Cristiana (Mer) e Juliana (Piri) que não foram apenas
amigas mas sim grandes irmãs, não esquecendo e claro das demais bandidas: Adriana,
Juzona, Raquel, Dani, Lorena, Thais, Aline, Andrea, Mariana, amo vocês.
Aos grandes amigos Nerilson, Luciana, Néia, Cláudio Rodrigo, Alessandra, Caio, Andre e a
Merilu.
Aos meus queridos alunos de IC Julia e Andre.
Aos amigos da turma da micose Carolina, Andressa, Miller, Fernandinho, Renato, Patrícia,
Alana, Felipe pela convivência dentro e fora do laboratório.
A todos os amigos do Departamento de Química Orgânica em especial aos do NuBBE, pela
convivência e amizade e que de uma maneira ou de outra colaboraram para o
desenvolvimento deste trabalho (não vou citar nomes, para não correr o risco de esquecer
alguém), foi muito bom estar todo esse tempo com vocês.
Ao Dr. Kitshiri pelos ensinamento, amizade e carinho.
Aos funcionários e colegas do NPC (Natural Product Center) pela dedicação e disposição em
ajudar, em especial a May pelas conversas nos corredores e amizade.
Ao Kamal e Hementha pela amizade e carinho.
Aos amigos que “ganhei” nos EUA em especial a Conceição, Jair, Brilla e a galera do CsF.
A minha família, mesmo que de longe sempre me apoiou. Pai, Mãe, Sirlei, Tati, Angélica,
Chicão, Heraldo, Charles e a pequena Annabelle. Amo essa família buscapé!!
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.
Á CAPES pelas bolsas concedidas e a FAPESP pelo financiamento.

Eu preciso encontrar
Um lugar legal pra mim
Dançar e me escabelar
Tem que ter um som legal
Tem que ter gente legal
E ter cerveja barata
Um lugar onde as pessoas

Sejam mesmo afudê
Sejam loucas e super chapadas
Um lugar do caralho
Sozinho pelas ruas de São Paulo

Eu quero achar alguém pra mim
Um alguém tipo assim
Que goste de beber e falar
LSD queira tomar
E curta Syd Barrett e os Beatles
Um lugar e um alguém
Que tornarão-me mais feliz
Sejam loucas e super chapadas
Um lugar do caralho
Lugar do caralho
“Jupter maçã”
Resumo
RESUMO
Os produtos naturais têm desempenhado um papel importante pela humanidade, no

uso da medicina popular e na geração da descoberta de novos fármacos. Fungos
endofíticos são micro-organismos que vivem em associação mutualística com a
espécie hospedeira trazendo benefícios a ambos, e são uma promissora fonte de
produtos naturais. A espécie vegetal Eugenia jambolana tem sido intensamente
explorada química e biologicamente devido a seus usos populares e por apresentar
diversas atividades biológicas. No intuito de explorar a potencionalidade dessa
espécie vegetal, E. jambolana foi submetida ao isolamento dos fungos endofíticos
presentes nas folhas, caule e frutos, dos quais foram isolados treze fungos endofíticos.
Estes endófitos foram cultivados em escala reduzida em Czapek (400 mL) para
obtenção dos extratos brutos AcOEt. Os extratos brutos AcOEt foram submetidos a
análises químicas (cromatografia em camada delgada comparativa, cromatografia
líquida de alta eficiência e ressonância magnética nuclear de 1H) e biológicas (ensaios
antioxidante, antifúngico, anticolinesterásico e citotóxico). Todos os extratos brutos
apresentaram pelo menos uma atividade biológica positiva, o que adicionado as
análises químicas permitiram selecionar dois fungos endofíticos para crescimento em
escala ampliada, e isolamento dos metabólitos secundários. Destes, o fungo
endofítico isolado do caule de E. jambolana codificado como Ej-c3 foi identificado
como Saccharicola sp., foi possível isolar 7 substâncias das quais 4 são inéditas (4-
7), os compostos 4 e 5 foram inativo nos ensaios realizados. Do estudo químico do
fungo endofítico Botryosphaeria parva (Ej-f1), isolado das folhas, foram isolados 4
substâncias da classe das isocumarinas [meleina (3), 4-hidroximeleina (11), 5-
hidroximeleina (13), 7-hidroximeleina (12)], as substâncias 3 e 13 foram ativas no
ensaio antifúngico contra C. sphaerospermum.
No intuito de aumentar a produção metabólica e ativar as vias biossintéticas
silenciosas, a epigenética surge como uma ferramenta útil e simples para expressar
diferentes genes biossintéticos. Lecythophora sp., um fungo endofítico proveniente do
líquen Parmotrema tinctorum, foi submetido ao estudo químico utilizando no cultivo o
modificador epigenético 5-azacetidina (500 µM). No cultivo em escala reduzida (MDB
1 L) o modificador epigenético aumentou o rendimento do extrato bruto em 9,2 vezes,
e pela análise em CLAE foi possível observar a produção de dois compostos
diferentes. Este fungo foi cultivado em escala ampliada (10 L) na presença de 5-
azacetidina (500 µM). Após realizar o isolamento dos metabólitos secundários foi
possível identificar 5 compostos da classe dos oxaspirois (14-18), sendo dois
compostos inéditos (14-15). A estereoquimica absoluta das substâncias 16 (oxaspirol
E) e 17 (oxaspirol C) foi determinada utilizando-se o método de esteres de Moscher.
As substâncias inéditas foram produzidos somente no cultivo do fungo com o
modificador epigenético, demonstrando que esta técnica é eficaz na modificação da
produção metabólica. Os oxaspirois E, C e B foram inativos no ensaio citotóxico
realizado. As estruturas das substâncias isoladas foram elucidadas pelo uso de
técnicas espectrométricas como RMN 1 e 2D, espectrometria de massas, e espectros
de absorção na região do infravermelho.
Palavras-chave: Fungos endofíticos, Eugenia jambolana, epigenética, Saccharicola

sp., Botryosphaeria parva, Lecythophora sp.
Abstract
Abstract
The natural products have occuped an important role for humanity, in the use of folk
medicine and in the generation of drug discovery. Endophytic fungi are microorganism
that living in a mutualist association with host species, refleting benefits to both, and
they are a promising source for natural products. The vegetal species Eugenia
jambolana has been intensively explored chemically and biologically, because of its
popular uses and it has several biological activities. In order to explore the
potencionality of this plant species, E. jambolana was submitted to isolation of
endophytic fungi in the leaves stems and fruits, of which thirteen endophytic fungi were
isolated. The endophytes were cultived in small scale in Czapek (400 mL) to give the
EtOAc crude extract. The EtOAc crude extract were submited to chemistry (thin layer
chromatography, high performace liquid chromatography and 1H nuclear magnetic
ressonance) and biological (antioxidant, antifungal, anticholinesterase and cytotoxic
activities) analysis. All of crude extract showed at least one positive biological activity,
which added the chemical analyzes allowed us to select two endophytic fungi to
growing on a larger scale, and isolation of secondary metabolites. The endophytic
fungus isolated from stems of E. jambolana encoded Ej-c3 was identified as
Saccharicola sp. it was isolated 7 substances of which 4 are new (4-7). The substances
4 e 5 were inactive in the biological assays. Chemical study of Botryosphaeria parva
(Ej-f1) isolated from leaves, was isolated 4 isocoumains [melein (3), 4-hidroxymelein
(11), 5-hidroxymelein (13), 7-hidroxymelein (12)]. The substances 3 and 13 were active
in antifungal assay agains the fungus C. sphaerospermum.
In order to increase the metabolite production and activate the silent biossintetic
pathway, the epigenetic appear as a useful and simple tool to gene expression.
Lecythophora sp. an endolichenic fungus from Parmotrema tinctorum, was submited
to chemical study using the epigenetic modifier 5-azacytidine (500 µM). In small scale
culture (PDB 1L) the epigenetic modifier increase the yield of the crude extract in 9.2
times. The HPLC analyses was observed the production of two diferent compounds.
The grow up scale culture (10 L) in the presence of 5-azacytidine (500 µM) were
isolated 5 oxaspirois compounds (14-18), which two are new compounds (14 and 15).
The absolute stereochemistry of the substances 16 (oxaspirol E) and 17 (oxaspirol C)
were obtained using the Mosher’s ester method. The new substances were produced
just in the culture using epigenetic modifier, showing that this technique is efficient in
modifier the metabolic production in fungi. The oxaspirol E, C and B were inactive in
the cytotoxic assay. The structure of the substances were determinted by
spectrometric 1D and 2D techniques, mass spectrometry and IR.
Keywords: Endophytic fungi, Eugenia jambolana, epigenetic, Saccharicola sp.,

Botryosphaeria parva, Lecythophora sp.
Lista de figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Substâncias bioativas isoladas de fungos endofíticos ............................... 38

Figura 2: Eugenia jambolana .................................................................................... 41
Figura 3: Fitoquímicos presentes em Eugenia jambolana ........................................ 42
Figura 4: Antocianinas presentes em Eugenia jambolana ........................................ 44
Figura 5: Substâncias produzidas por fungos endofíticos do gênero Botryosphaeria
.................................................................................................................................. 47
Figura 6: Foto do líquen Parmotrema tinctorum ....................................................... 49
Figura 7: Substâncias isoladas do líquen Parmotrema tinctorum ............................. 50
Figura 8: Itens publicados por ano contendo “endolichenic”..................................... 51
Figura 9: Substâncias isoladas de fungos do gênero Lecythophora ........................ 52
Figura 10: Metilação do resíduo citosina do DNA..................................................... 54
Figura 11: Acetilação do resíduo lisina encontrado nas histonas e sua interação com
o DNA ........................................................................................................................ 55
Figura 12: Exemplos de moléculas utilizadas como modificadores epigenéticos ..... 56
Figura 13: Compostos isolados do cultivo de fungos com modificadores
epigenéticos. ............................................................................................................. 57
Figura 14: Etapas de isolamento, purificação e preservação dos fungos endofíticos
.................................................................................................................................. 66
Figura 15: Fluxograma da obtenção e triagem dos extratos brutos obtidos de E.
jambolana .................................................................................................................. 67
Figura 16: Obtenção do extrato bruto produzido por Saccharicola sp. ..................... 68
Figura 17: Fracionamento do extrato bruto e isolamento dos metabólitos
secundários produzidos pelo fungo Saccharicola sp................................................. 70
Figura 18: Fluxograma de cultivo e obtenção do extrato bruto produzido por B. parva
.................................................................................................................................. 71
Figura 19: Isolamento dos metabólitos secundários produzidos pelo fungo B. parva
.................................................................................................................................. 72
Figura 20: Fungos endofíticos isolados de Eugenia jambolana................................ 77
Figura 21: CCDC dos extratos brutos obtidos dos fungos ........................................ 79
Figura 22: Cromatogramas dos extratos bruto dos fungos endofíticos isolados das
folhas ......................................................................................................................... 80
Lista de figuras
Figura 23: Espectro de absorção na região do UV para: pico a (a) pico b (b) e pico c
(c) do cromatograma do fungo Ej-f1 (Figura 22) ....................................................... 81
Figura 24: Espectro de absorção na região do UV para: pico a (a) e pico b (b) do
cromatograma do fungo Ej-f2 (Figura 22).................................................................. 81
Figura 25: Espectro de absorção na região do UV para: o pico d (a) e pico e (b) do
cromatograma do fungo Ej-f3 (Figura 22).................................................................. 81
Figura 26: Cromatogramas dos extratos bruto dos fungos endofíticos isolados dos
caules ........................................................................................................................ 82
Figura 27: Espectros de absorção na região do UV para o pico f (a), pico g (b) do
extrato bruto do fungo Ej-c3 ...................................................................................... 83
Figura 28: Cromatogramas dos extratos produzidos pelos fungos isolados do fruto
de E. jambolana. ....................................................................................................... 84
Figura 29:Espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-f1 (CDCl3, 500 MHz)
.................................................................................................................................. 85
Figura 30: Espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-f2 (CDCl3, 500 MHz)
.................................................................................................................................. 86
.................................................................................................................................. 87
Figura 32: Espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-c1 (CDCl3, 500
MHz) .......................................................................................................................... 89
MHz) .......................................................................................................................... 90
MHz) .......................................................................................................................... 90
Figura 35: Espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-c4 (CDCl3, 500MHz)
.................................................................................................................................. 91
Figura 36: Espectro de RMN de 1H do extrato do fungo Ej-fm1 em DMSO-d6
(500MHz)................................................................................................................... 92
Figura 37: Espectro de RMN de 1H do extrato do fungo Ej-fv1 em DMSO-d6
(500MHz)................................................................................................................... 93
Figura 38: Espectro de RMN de 1H do extrato do fungo Ej-fv2 em DMSO-d6 (500
MHz) .......................................................................................................................... 93
MHz) .......................................................................................................................... 94
Lista de figuras

MHz) .......................................................................................................................... 97
Figura 41: Espectro de RMN de 1H do extrato do fungo Ej-fv5 em DMSO-d6
(500MHz)................................................................................................................... 97
Figura 42: Placa de CCDC obtida no ensaio antifúngico para os extratos obtidos dos
fungos endofíticos ................................................................................................... 102
Figura 43: Espectro de RMN de 1H da substância 4 (DMSO-d6, 500 MHz) ........... 106
Figura 44: Estrutura parcial A da substância 4 ....................................................... 107
Figura 45: Estrutura parcial B da substância 4 ....................................................... 107
Figura 46: Estrutura parcial C da substância 4 ....................................................... 108
Figura 47: Estrutura parcial D da substância 4 ....................................................... 108
Figura 48: Principais correlações observadas no espectro de HMBC para 4 ......... 109
Figura 49: Correlações observadas em NOE para a substância 4 ......................... 109
Figura 50: Configuração relativa proposta para a substância 4.............................. 110
Figura 51: Principais correlações observadas em HMBC para a substância 5 (500
MHz) ........................................................................................................................ 112
Figura 52: Correlações observadas em ROESY para a substância 5 .................... 112
Figura 53: Configuração relativa proposta para 5................................................... 113
Figura 54: Principais correlações observadas no experimento HMBC para a
substância 6 ............................................................................................................ 115
Figura 55: Principais correlações observadas no experimento de HMBC para 7 ... 117
Figura 56: Espectro de RMN de 1H da substância 8 (500 MHz) ............................. 120
Figura 57: Espectro de RMN de 1H da substância 9 (500 MHz) ............................. 122
Figura 58: Correlações observadas no experimento HMBC para 10. .................... 124
Figura 59: Espectro de RMN de 1H da substância 10 (500 MHz) ........................... 125
Figura 60: Proposta biossintética para a substância 8, 9 e 10 ............................... 127
Figura 61: Espectro de RMN de 1H do sólido em DMSO-d6 (500 MHz). ................ 128
Figura 62: Espectro de RMN de 1H do Ext. AcOEt-óleo em CDCl3 (500 MHz). ...... 129
Figura 63: Proposta biossintética para as isocumarinas......................................... 135
Figura 64: Resultados obtidos para as substâncias testadas no ensaios antifúngico
................................................................................................................................ 137
Figura 65: Esquema do cultivo e extração para obtenção dos extratos brutos dos
fungos endofíticos ................................................................................................... 143
Lista de figuras
Figura 66: Fluxograma da obtenção e triagem dos extratos brutos obtidos de

Lecythophora sp. ..................................................................................................... 145
Figura 67: Obtenção do extrato bruto produzido por Lecythophora sp. .................. 146
Figura 68: Fluxograma da partição líquido/líquido do extrato bruto AcOEt ............ 147
Figura 69: Fluxograma de fracionamento da fração CHCl3 .................................... 147
Figura 70: CCDC obtida dos extratos brutos .......................................................... 153
Figura 71: CCDC obtida dos extratos brutos .......................................................... 154
Figura 72: Cromatogramas obtidos do cultivo em 1L do fungo Lecythosphora sp. (A)
cultivo em MDB (B) cultivo em MDB contendo 500 µM de 5-azacitidina ( = 254 nm)
................................................................................................................................ 154
Figura 73: Correlações HMBC e 1H-1H COSY para 14 .......................................... 158
Figura 74: Correlações observadas por ROESY para a substância 14 .................. 159
Figura 75: Correlações HMBC e 1H-1H COSY para a substância 15 ..................... 161
Figura 76: Conformação cadeira para o composto 15 ............................................ 162
Figura 77: Correlações observadas em ROESY para o composto 16 .................... 164
Figura 78: Valores de  [( em ppm) = S - R] para 16 ..................................... 164
Figura 79: Correlações ROESY observadas para 17 ............................................. 167
Figura 80: Valores de  [( em ppm) = S - R] para 17 ...................................... 167
Figura 81: Proposta biossintética para o oxaspirol E e C ....................................... 170
Figura 82: Proposta biossintética para os derivados do oxaspirol .......................... 171
Figura 83: Espectro de Massas de alta resolução para a substância 1 (Ej-f3) ....... 187
Figura 84: Espectro de Massas de alta resolução para a substância 1 (Ej-fv2) ..... 188
Figura 85: Espectro de Massas de alta resolução para a substância 4 .................. 189
Figura 86: Espectro de RMN de 1H da substância 4 (DMSO-d6, 500MHz) ............ 190
Figura 87: Espectro de RMN de 13C da substância 4 (DMSO- d6, 125 MHz) ......... 191
Figura 88: Espectro de HMQC da substância 4 (DMSO-d6) ................................... 192
Figura 89: Espectro de HMBC da substância 4 (DMSO-d6) ................................... 193
Figura 90: Espectro de COSY 1H-1H da substância 4 (DMSO-d6).......................... 194
Figura 92: Espectro de RMN de 1H da substância 5 e 6 (DMSO-d6, 500 MHz)...... 196
Figura 93: Espectro de RMN de 13C da substância 5 e 6 (DMSO-d6, 125 MHz) .... 197
Figura 94: Espectro de HMQC da substância 5 e 6 (DMSO-d6) ............................. 198
Figura 95: Espectro de HMBC da substância 5 e 6 (DMSO-d6) ............................. 199
Lista de figuras
Figura 96: Espectro de COSY da substância 5 e 6 (DMSO-d6).............................. 200

Figura 97: Espectro de ROESY da substância 5 e 6 (DMSO-d6) ........................... 201
Figura 99: Espectro de RMN de 1H para a substância 7 ........................................ 203
Figura 100: Espectro de HMQC para a substância 7 ............................................. 204
Figura 101: Espectro de HMBC para a substância 7 .............................................. 205
Figura 102: Espectro de Massas de baixa resolução para a substância 8 ............. 206
Figura 103: Espectro de RMN de 1H da substância 8 (DMSO-d6) .......................... 207
Figura 104: Espectro de HMBC da substância 8 (DMSO-d6) ................................. 208
Figura 105: Espectro de COSY da substância 8 (DMSO-d6).................................. 209
Figura 106: Espectro de massas de baixa resolução para 9 .................................. 210
Figura 107: Espectro de RMN de 1H da substância 9 (DMSO-d6) .......................... 211
Figura 108: Espectro de HMQC da substância 9 (DMSO-d6, 500 MHz)................. 212
Figura 109: Espectro de HMBC da substância 9 (DMSO-d6, 500 MHz) ................. 213
Figura 110: Espectro de COSY da substância 9 (DMSO-d6, 500 MHz) ................. 214
Figura 111: Espectro de massas de baixa resolução para a substância 10 ........... 215
Figura 112: Espectro de RMN de 1H da substância 10 (DMSO-d6, 500 MHz) ....... 216
Figura 113: Espectro de HMQC da substância 10 (DMSO-d6) ............................... 217
Figura 114: Espectro de HMBC da substância 10 (DMSO-d6) ............................... 218
Figura 115: Espectro de COSY da substância 10 (DMSO-d6)................................ 219
Figura 116: Espectro de NOESY da substância 10 (DMSO-d6) ............................. 220
Figura 117: Espectro de Massas de alta resolução para a substância 11 .............. 221
Figura 118: Espectro de RMN de 1H da substância 11 (CDCl3, 500 MHz) ............. 222
Figura 119: Espectro de HMQC da substância 11 (CDCl3, 500 MHz) .................... 223
Figura 120: Espectro de HMBC da substância 11 (CDCl3, 500 MHz) .................... 224
Figura 121: Espectro de COSY da substância 11 (CDCl3, 500 MHz) ..................... 225
Figura 122: Espectro de RMN de 1H da substância 12 e 13 (CDCl3, 500 MHz) ..... 226
Figura 123: Espectro de Massas de alta resolução para a substância 12 e 13 ...... 227
Figura 124: Espectro de RMN de 1H da substância 12 e 13 (CDCl3, 500 MHz) ..... 228
Figura 125: Espectro de RMN de 1H da substância 14 (CDCl3) ............................. 229
Figura 126: Espectro de RMN de 13C da substância 14 (CDCl3) ............................ 230
Figura 127: Espectro de HMQC da substância 14 (CDCl3) .................................... 231
Figura 128: Espectro de HMBC da substância 14 (CDCl3)..................................... 232
Figura 129: Espectro de COSY da substância 14 (CDCl3) ..................................... 233
Lista de figuras
Figura 130: Espectro de ROESY da substância 14 (CDCl3)................................... 234

Figura 136: Espectro de RMN de 1H da substância 16 (400 MHz, CDCl3) ............. 240
Lista de tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Rendimento obtido dos extratos brutos dos endófitos fermentados em 400
mL ............................................................................................................................. 78
Tabela 2: Dados de RMN de 1H e 13C para a substância 3 (DMSO-d6) .................... 96
Tabela 3: Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três
linhagens tumorais testadas na dose única de 50 µg mL-1 Valores são média ± DPM.
.................................................................................................................................. 99
Tabela 4: Fator de Retenção das substâncias que apresentaram inibição da enzima
acetilcolinesterase (sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7) ......................................... 100
Tabela 5: Fator de Retenção das substâncias que apresentaram inibição no
crescimento dos fungos fitopatógenos (sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7) .......... 101
Tabela 6: Tempo de Retenção das substâncias que apresentaram potencial
antioxidante (sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7) ................................................... 103
Tabela 7: Valores de 1H e 13C para a substância 4 (DMSO-d6, 500 MHz) .............. 110
Tabela 8: Valores de 1H e 13C para a substância 5 (DMSO-d6, 500 e 125 MHz) .... 113
Tabela 9: Valores de 1H e 13C para a substância 6 (DMSO-d6, 500 MHz e 125 MHz)
................................................................................................................................ 115
Tabela 10: Valores de 1H e 13C para a substância 7 (DMSO-d6, 500 MHz) ............ 117
Tabela 11: Dados de RMN de 1H e 13C para a substância 8 (DMSO-d6) ................ 120
Tabela 12: Dados de RMN de 1H e 13C para a substância 9 (DMSO-d6) ................ 123
Tabela 13:Valores de 1H e 13C (500 e 125 MHz, DMDO-d6) para a substância 10. 125
Tabela 14: Dados obtidos de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) da substância
11 (CDCl3). .............................................................................................................. 131
Tabela 15: Dados obtidos de RMN de 1H (500 MHz) das substâncias 12 e 13
(CDCl3). ................................................................................................................... 133
Tabela 16: Resultado das substâncias para o ensaio antifúngico contra a linhagem
C. sphaerospermum ................................................................................................ 136
Tabela 17: Fração obtidas da CC reunidas de acordo com o perfil em CCDC ....... 148
Tabela 18: Resultados obtidos para os dois extratos brutos nos ensaios biológicos
testados ................................................................................................................... 155
Tabela 19: Dados de RMN obtidos para a substância 14 (CDCl3, 400 MHz) ......... 159
Tabela 20: Dados de RMN obtidos para a substância 15 (400 MHz) ..................... 161
Tabela 21: Dados de RMN obtidos para a substância 16 (CDCl3, 400 MHz) ......... 165
Tabela 22: Dados de RMN obtidos para a substância 17 (400 MHz) ..................... 168
Lista de abreviaturas e siglas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AChE Enzima Acetilcolinesterase

AcOEt Acetato de Etila
BDA Batata Dextrose Agar
CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
CC Cromatografia em Coluna
CDCl3 Clorofórmio Deuterado
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COSY Correlation spectroscopy
CpG Citosina-fosfina-guanidina
CPQBA Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas
e Agrícolas
DAD Detector de Arranjo de Diodos
DMSO Dimetilsulfóxido
DMSO-d6 Dimetilsulfóxido Deuterado
DNA Ácido desoxirribonucleico
DNMTs DNA metiltransferases
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
Ej-c Fungos endofíticos isolados do caule de Eugenia
jambolana
Ej-f Fungos endofíticos isolados da folha de Eugenia
jambolana
Ej-fm Fungos endofíticos isolados do fruto maduro de Eugenia
jambolana
Ej-fv Fungos endofíticos isolados do fruto verde de Eugenia
jambolana
EM Espectrometria de Massas
ESI-TOF electrospray ionization – Time of flight
HATs Histonas acetiltransferases
HDAC Histonas deacetilases
Hex Hexano
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence
Lista de abreviaturas e siglas
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HSQC Heteronuclear Single-Quantum Coherence
IV Espectroscopia na região do Infravermelho
MBD Meio de Batata Dextrose
NuBBE Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de
Produtos Naturais
NOESY Nuclear Overhauser effect spectroscopy
OSMAC One Strain Many Compounds
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RNA Ácido Ribonucleico
ROESY Rotating frame nuclear Overhauser effect spectroscopy
SAHA Ácido suberoilanilide hidroxamico
SBHA Ácido Suberohidroxamico
TMS Tretrametilsilano
UV Ultravioleta
Lista de simbolos
LISTA DE SÍMBOLOS
 Deslocamento químico
 Comprimento de onda
 Variação do deslocamento químico
μ Micro
[M]+ Íon molecular
J Constante de acoplamento
s Simpleto
sl Simpleto Largo
d Dupleto
dd Duplo dupleto
dt Duplo tripleto
m Multipleto
m/z Relação massa-carga
p para
t Tripleto
q Quarteto
quin Quinteto
sext Sexteto
Lista de substâncias
LISTA DE SUBSTÂNCIAS IDENTIFICADAS
Saccharicola sp.
O O HO
OH OH OH
HO HO O
OH OH OH
4 OH 5 H 6 H
OH
OH
O
OH
O
OH HO O
HO O
OH
7 8 9
HO
O
10
Botriosphaeria parva
OH O OH O
OH O OH O
O O HO
O O
OH OH
3 11 12 13
Lecythosphora sp.
O
OH O HO
O OH HO
HO O
HO OH HO
14 15 16
HO O
HO HO
O O
HO HO
O O
18
17
Sumário
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 31
1.1 Produtos naturais ......................................................................................... 31
1.2 Fungos ......................................................................................................... 33
1.3 Fungos endofíticos ....................................................................................... 34
1.3.1 Interação com o hospedeiro .................................................................. 35
1.3.2 Produtos naturais obtidos de fungos endofíticos ................................... 36
1.4 Espécie hospedeira - Eugenia jambolana .................................................... 40
1.5 Botryosphaeria parva ................................................................................... 45
1.6 Saccharicola sp. ........................................................................................... 47
1.7 Líquen .......................................................................................................... 47
1.8 Parmotrema tinctorum .................................................................................. 48
1.9 Fungos endofíticos de liquens ...................................................................... 50
1.10 Lecythosphora sp. ..................................................................................... 51
1.11 Epigenética e moduladores epigenômicos ................................................ 52
2 Objetivos ............................................................................................................ 60
2.1 Objetivos Gerais ........................................................................................... 60
2.2 Objetivos Específicos ................................................................................... 60
BIOPROSPECÇÃO DOS FUNGOS ENDOFITICOS ASSOCIADOS A EUGENIA
JAMBOLANA
3 Parte experimental ............................................................................................. 62

3.1 Materiais, equipamentos e técnicas utilizadas ............................................. 62
3.1.1 Solventes ............................................................................................... 62
3.1.2 Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) .................. 62
3.1.3 Cromatografia em Coluna (CC) ............................................................. 62
3.1.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) .................................. 62
3.1.5 Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C (RMN de 1H e 13C).......... 63
3.1.6 Espectrometria de massas (EM)............................................................ 63
3.1.7 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho (IV) .................. 63
3.1.8 Cultivo dos fungos endofíticos: .............................................................. 63
3.1.9 Outros equipamentos ............................................................................ 64
3.2 Seleção do material vegetal ......................................................................... 64
Sumário
3.3 Isolamento das cepas fúngicas .................................................................... 64

3.4 Cultivo dos fungos endofíticos em pequena escala para obtenção dos
extratos brutos ....................................................................................................... 66
3.5 Cultivo em escala ampliada do fungo Saccharicola sp. e obtenção do extrato
bruto....................................................................................................................... 67
3.6 Fracionamento do extrato bruto obtido do fungo Saccharicola sp. .............. 68
3.7 Isolamento dos metabólitos secundários produzidos pelo fungo Saccharicola
sp...... ................................................................................................................... ..69
3.8 Cultivo em escala ampliada do fungo Botryosphaeria parva e obtenção do
extrato bruto........................................................................................................... 70
3.9 Isolamento dos metabólitos secundários produzidos pelo fungo
Botryosphaeria parva ............................................................................................. 72
3.10 Avaliação biológica ................................................................................... 73
3.10.1 Ensaio citotóxico* (MTT) ........................................................................ 73
3.10.2 Ensaio anticolinesterásico**................................................................... 74
3.10.3 Ensaio antifúngico** ............................................................................... 74
3.10.4 Ensaio antioxidante ............................................................................... 75
4 Resultados e Discussão ..................................................................................... 76
4.1 Isolamento, purificação e cultivo dos endófitos ............................................ 76
4.2 Classificação das linhagens fúngicas ........................................................... 77
4.3 Triagem química dos extratos brutos dos endófitos ..................................... 78
4.3.1 Obtenção do extrato bruto ..................................................................... 78
4.4 Análise química ............................................................................................ 79
4.4.1 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) .................... 79
4.4.2 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de
diodos (CLAE): ................................................................................................... 79
4.4.3 Ressonância magnética nuclear de 1H: ................................................. 85
4.5 Triagem Biológica......................................................................................... 98
4.5.1 Ensaio citotóxico .................................................................................... 98
4.5.2 Ensaio anticolinesterásico ..................................................................... 99
4.5.3 Ensaio antifúngico ............................................................................... 101
4.5.4 Ensaio antioxidante ............................................................................. 102
4.6 Identificação estrutural das substâncias produzidas pelo endófito
Saccharicola sp. .................................................................................................. 105
4.6.1 Determinação estrutural da substância 4 ............................................ 105
Sumário

4.6.3 Determinação estrutura da substância 6 ............................................. 114
4.6.7 Determinação estrutural da substância 10 .......................................... 123
Botryosphaeria parva ........................................................................................... 128
4.7.2 Determinação estrutural da substância 12 e 13................................... 131
4.7.4 Biossíntese das isocumarinas ............................................................. 134
4.8 Resultados dos ensaio biológicos realizados com as substâncias
isoladas................................................................................................................ 136
5 Conclusão ........................................................................................................ 138
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO METABOLICA DO FUNGO LECYTHOPHORA SP.
UTILIZANDO MODIFICADOR EPIGENETICO
6 Parte experimental ........................................................................................... 140

6.1 Materiais, equipamentos e técnicas utilizadas ........................................... 140
6.1.1 Solventes ............................................................................................. 140
6.1.2 Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) ................ 140
6.1.3 Cromatografia em Coluna (CC) ........................................................... 140
6.1.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ................................ 140
6.1.5 Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C (RMN de 1H e 13C)........ 141
6.1.6 Espectrometria de massas .................................................................. 141
6.1.7 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho (IV) ................ 141
6.1.8 Cultivo dos fungos endofíticos ............................................................. 141
6.1.9 Outros Equipamentos .......................................................................... 141
6.2 Cepa fúngica .............................................................................................. 142
extratos brutos ..................................................................................................... 142
extratos brutos ..................................................................................................... 144
Sumário
6.5 Cultivo em escala ampliada do fungo Lecythophora sp e obtenção do extrato

bruto..................................................................................................................... 145
6.6 Fracionamento do extrato bruto obtido de Lecythophora sp. ..................... 146
6.7 Reação usando reagente de Mosher ......................................................... 149
6.8 Ensaios biológicos...................................................................................... 150
6.8.1 Ensaio de citotoxicidade (Alamar Blue Assay)..................................... 150
6.8.2 Ensaio de indução de choque térmico (HSIA) ..................................... 151
6.8.3 Ensaio de inibição da migração celular (CMIA) ................................... 151
7 Resultados e discussão ................................................................................... 153
7.1 Identificação estrutural das subtâncias isoladas de Lecythophora sp ........ 155
7.1.6 Resultado obtido dos ensaios biológicos realizados com as substâncias
puras.... ............................................................................................................ 171
8 Conclusão ........................................................................................................ 172
Referências ............................................................................................................. 174
Anexos.....................................................................................................................184
Introdução
31
Introdução
1 INTRODUÇÃO
1.1 Produtos naturais
Os produtos naturais são em geral, de origem pré-biótica ou originam-se de

micro-organismos, plantas ou animais e incluem classes de compostos tais como
terpenos, policetídeos, aminoácidos, peptídeos, proteínas, carboidratos, lipídios,
ácidos nucleicos, ácido ribonucleico (RNA), ácido desoxirribonucleico (DNA), e assim
por diante. Produtos naturais não são apenas acidentes ou produtos de conveniência
de natureza, mais do que provável, uma expressão natural do aumento da
complexidade dos organismos (SPAINHOUR, 2005).
Os produtos naturais são utilizados pela humanidade há milhares de anos, e
estão associados à medicina por igual período, pela utilização de medicamentos
populares e venenos naturais (BUTLER, 2004; STROBEL; DAISY, 2003). A
organização mundial da saúde estima que aproximadamente 80% da população
terrestre recorrem à medicina popular como fonte dos primeiros tratamentos
farmacológicos (SPAINHOUR, 2005).
Estudos químicos, farmacológicos e clínicos dos medicamentos populares,
derivados principalmente de plantas, foram à base de uma grande parte de
medicamentos, tais como, a Aspirina (ácido acetil salicílico) derivada da salicina,
encontrada em diversas plantas do gênero Salix, a quinina, um antimalárico
encontrado nas espécies de Cinchona, a morfina, proveniente do opium (Papaver
somniferum) nomeada em homenagem ao Deus Grego Morfeu, Deus do sono e dos
sonhos, e os medicamentos digitoxina e pilocarpina (BUTLER, 2004; STROBEL;
DAISY, 2003; STROBEL et al., 2004).
A descoberta dos antibióticos sulfonamidas e β-lactâmicos na década de 1930
levou a um profundo impacto na saúde humana, por tornar possível o tratamento
rápido de pacientes com infecções bacterianas, que previamente eram consideradas
fatais (BUTLER; COOPER, 2011).
A investigação de produtos naturais como fontes de novos agentes terapêuticos
alcançou um pico na indústria farmacêutica no período de 1970-1980, o qual resultou
num bem-estar farmacêutico influenciado por moléculas não sintéticas. Das 877 novas
32
Introdução
entidades químicas introduzidas no mercado entre 1981 a 2002, cerca da metade

(48%) eram produtos naturais, análogos naturais semi-sintéticos ou compostos
sintéticos baseados em produtos naturais. Apesar deste sucesso, a procura
farmacêutica nos produtos naturais tem evidenciado um lento declínio nos últimos
anos (KOEHN; CARTER, 2005).
Apesar da concorrência com outros métodos de descoberta de novos
medicamentos, os produtos naturais ainda desempenham um papel significativo na
descoberta de novas drogas e no desenvolvimento desta área. Isto foi demonstrado
por Newman e Cragg (2012) que analisaram os agentes terapêuticos aprovados no
mundo, nos últimos 30 anos (1981 a 2010). Das novas entidades químicas aprovadas,
29% foram obtidas de origem natural. Dos medicamentos anticancerígenos, 48,6%
são obtidos de produtos naturais ou derivados diretamente destes, e dos
medicamentos aprovados para tratamento de infecções contra bactérias, fungos,
parasitas e vírus, 33,7% são obtidos a partir de fontes naturais. Esta constatação
mostra como os produtos naturais são uma fonte expressiva para a obtenção de
medicamentos, e que estes foram e ainda são valorizados como fonte de protótipos
para a descoberta de novos fármacos (NEWMAN; CRAGG, 2012; NEWMAN;
CRAGG, 2007; GUO et al., 2008; CARTER, 2011).
Os produtos naturais são produzidos em um específico estágio de
desenvolvimento da planta, condições específicas do ambiente, estresse ou
disponibilidade de nutrientes, dificultando a extração de uma quantidade suficiente
dos produtos de interesse. Indiscriminado desmatamento de plantas medicinais para
extração dos mesmos, tem ameaçado de extinção algumas espécies, tornando-as
vulneráveis ou em perigo de extinção (CHANDRA, 2012).
Diferentes estratégias têm sido desenvolvidas para aumentar a produção dos
metabólitos secundários bioativos em linhagens vegetais. As estratégias incluem
triagem e seleção de espécies vegetais com alta produção de metabólitos de
interesse, cultura de órgãos, cultura de células imobilizadas, disponibilização de
precursores biossintéticos, e a produção em alta escala. Considerando todas as
limitações associadas com a produtividade e vulnerabilidade de espécies de plantas,
como fontes de novos metabólitos, os micro-organismos servem como a mais nova,
renovável e reprodutível fonte inesgotável de novas estruturas com potencial
farmacêutico. Os micro-organismos, especialmente os fungos, desde há muito tempo
33
Introdução
são considerados uma fonte importante de metabólitos bioativos com atividades

antibacteriana, antimicótica e antiviral (CHANDRA, 2012).
1.2 Fungos
Estima-se que o Reino Fungi apresente, aproximadamente, 1,5 milhões de

espécies com representantes habitando praticamente todos os ecossistemas
existentes no planeta (HAWKSWORTH, 2001). Os fungos constituem um grupo de
micro-organismos eucarióticos, uni ou multicelulares, em geral, com parede celular e
cujas estruturas reprodutivas apresentam uma variedade de formas. São organismos
que não possuem pigmentos fotossintetizantes, sendo heterotróficos com nutrição por
absorção. Os fungos podem ser filamentosos, constituídos por filamentos longos e
ramificados denominados hifas; leveduriformes, constituídos por células individuais
que se reproduzem por brotamento ou fissão binária; ou dimórficos, podendo ser
filamentoso ou leveduriforme dependendo das condições ambientais, principalmente
a temperatura (ARAUJO et al., 2010; ESPOSITO; AZEVEDO, 2010).
Os fungos em geral são benéficos, sendo importantes na cadeia alimentar por
decomporem matéria vegetal morta, reciclando elementos vitais, pelo uso de enzimas
extracelulares como a celulase. A maioria das plantas depende das simbioses com
fungos, conhecidas como micorrizas, que auxiliam as raízes das plantas a absorverem
minerais e água do solo. Os fungos são utilizados pelo homem como alimentos e
também para a produção de drogas. Das mais de 100 mil espécies conhecidas de
fungos, apenas cerca de 200 são patogênicas ao homem e aos animais (TORTORA;
FUNKE; CASE, 2012).
A descoberta acidental da penicilina, por Fleming em 1928, isolada do fungo
Penicillium notatum, levou a um acréscimo aos estudos investigativos dos fungos
como fontes de produtos naturais (TULP; BOHLIN, 2004; STROBEL et al., 2004). A
partir do estudo químico destes organismos, ocorreu um grande avanço nas áreas
dos antibióticos, imunossupressores e medicamentos antineoplásicos. Alguns
fármacos bem conhecidos e derivados de fungos são os antibióticos da classe das
penicilinas e cefalosporinas, os redutores de colesterol como a mevastatina e
lovastatina, imunossupressores como a ciclosporina e rapamicina, entre outros.
Pesquisas têm demonstrado o enorme potencial dos fungos em produzir diversas
34
Introdução
classes de substâncias que podem ser utilizadas na indústria farmacêutica (humana

e animal), alimentícia e agrícola (GREVE et al., 2010; GUO et al., 2008).
Dentro das classes de organismos investigados como fonte de produtos naturais,
existem os fungos que vivem em associação com espécies vegetais. Estes são
classificados como epifíticos, que são os fungos que vivem na superfície do material
vegetal, os fitopatógenos, que causam doenças, os da micorriza que vivem nas raízes
e os endofíticos que vivem dentro dos tecidos vegetais. Neste trabalho foram
selecionados, como objeto de estudo, os fungos endofíticos de planta e líquen, pois
esses micro-organismos vêm desempenhando um importante papel na descoberta de
novos e bioativos produtos naturais.
1.3 Fungos endofíticos
O termo endófitos, originalmente descrito por De Bary em 1866, refere-se a

qualquer micro-organismo que vive nos tecidos das plantas, distinguindo-se dos
epifíticos que vivem na superficie. São encontradas diferentes definições de endófitos
na literatura (ESPOSITO; AZEVEDO, 2010), mas a definida por Bacon e Write,
amplamente aceita e utilizada, é que endófitos são micro-organismos que colonizam
os tecidos internos das plantas sem causar efeitos negativos imediatos (KHARWAR
et al., 2011).
Os fungos endofíticos são um grupo diversificado de ascomicetos definidos por
sua ocorrência assintomática dentro dos tecidos vegetais. Ocorrem em todo o território
terrestre, nas comunidades naturais e antrópicas, colonizando plantas no Ártico,
Antártica, solos geotérmicos, desertos, oceanos, florestas tropicais, mangues e
florestas costeiras (JALGAONWALA et al., 2011; ARNOLD, 2007). Em quase todas
as plantas vasculares, algas marinhas, musgos e samambaias, estudadas até o
momento, foram encontradas bactérias e fungos endofíticos. Normalmente, centenas
de espécies de endófitos podem ser isolados de uma única espécie vegetal, sendo
que pelo menos um é específico ao hospedeiro (TAN; ZOU, 2001).
Das aproximadamente 300 mil espécies de plantas existentes, cada uma é
hospedeira de pelo menos um micro-organismo endofítico, e poucas foram as
espécies vegetais estudadas em relação a sua biologia endofítica.
Consequentemente, é grande a oportunidade de descoberta de novos e interessantes
35
Introdução
micro-organismos endofíticos de plantas de diferentes ecossistemas (KUSARI;

SPITELLER, 2011; ESPOSITO; AZEVEDO, 2010).
A espécie hospedeira pode ser infectada pelos endófitos horizontalmente por
lesões naturais, como estômatos ou crescimento das raízes, e artificiais, como injúrias
causadas por práticas agrícolas. A infecção também pode ocorrer verticalmente pelas
sementes do hospedeiro, neste caso, o endófito pode se instalar em uma planta por
toda sua vida. O modo com que o fungo infecta uma espécie vegetal pode alterar o
tipo de interação endófito-hospedeiro. Na transmissão vertical é predominante a
interação mutualística, enquanto que na transmissão horizontal (não-sistêmica) essa
interação tende a ser antagônica. Uma vez no hospedeiro o endófito permanece,
geralmente, em um estado latente por toda sua vida ou por um período prolongado,
até que as condições ambientais lhe sejam favoráveis. Neste caso, o endófito pode
assumir uma função patogênica (MELO; AZEVEDO, 1998; ALY; DEBBAB;
PROKSCH, 2011).
Comunidades endofíticas variam com a espécie hospedeira, tipo de órgão e
ontogenia. As folhas são os órgãos mais ricos em endófitos e os níveis aumentam
durante o desenvolvimento das folhas, provavelmente devido a mudanças nas
propriedades estruturais e químicas, que mudam durante o ciclo de vida das folhas
(SANCHEZ-AZEFEIFA et al., 2012).
1.3.1 Interação com o hospedeiro
Apesar de espécies dos gêneros Phomopsis, Phoma, Colletotrichum e

Phyllosticta terem sido descritas colonizando diversas plantas, é conhecido que
alguns endófitos são específicos ao hospedeiro e podem crescer em diferentes
condições ecológicas e geográficas. A relação de um endófito com o hospedeiro pode
variar de um hospedeiro para outro, e as interações entre eles ainda são pouco
compreendidas. Esta associação sugere que estes micro-organismos coevoluiram
com os seus hospedeiros, apresentando uma íntima relação mutualística, onde os
endófitos recebem nutrientes e proteção enquanto a planta tem vantagens
decorrentes dessa interação, como a maior resistência em ambientes com intenso
estresse causado por fatores bióticos (insetos, herbívoros, nematóides parasitas e
micro-organismos fitopatogênicos) ou abióticos (pH, temperatura, estresse hídrico,
36
Introdução
ventos fortes, salinidade, etc.) (CHANDRA, 2012; ARNOLD, 2007; ALY; DEBBAB;
PROKSCH, 2011; GUNATILAKA, 2006).
A presença dos endófitos pode alterar o metabolismo de muitas plantas. Alguns
endófitos produzem enzimas, como as celulases e ligninases que auxiliam na
degradação das folhas, hormônios de plantas, metabólitos secundários, ou até mesmo
melhorar a fotossíntese (SANCHEZ- AZEFEIFA et al., 2012).
1.3.2 Produtos naturais obtidos de fungos endofíticos
Os micro-organismos endófitos associados a plantas representam uma fonte

inexplorada de produtos naturais novos e bioativos, com mais de 20000 substâncias
descritas, sendo que destas 51% apresentam estruturas inéditas e 80% atividade
biológica. Isto pode ser explicado pela teoria ecológica, que estabelece que esta
produção metabólica depende do nicho ecológico no qual o micro-organismo está
inserido e das consequentes interações bióticas e abióticas. Estes relatos sugerem
que a seleção do endófito para estudo deve ser realizada com espécies vegetais de
diferentes biotas, principalmente as que enfrentam frequentes e intensas interações
no ambiente como plantas de regiões áridas, florestas tropicais, entre outras
(CHAPLA; BIASETTO; ARAUJO, 2013).
Apesar de poucos estudos químicos dos fungos endofíticos, foi isolado um
número considerável de substâncias com atividade biológica, como por exemplo, com
atividade antimicrobiana (I-VII) (ALY; DEBBAB; PROKSCH, 2011; WANG et al., 2012),
antiparasitária (VIII-XI) (ALY; DEBBAB; PROKSCH, 2011; ONDEYKA et al., 1997),
neuroprotetiva (XII) (ALY et al., 2010), antioxidante (XIII-XIV) (JALGAONWALA et al.,
2011), antidiabética (XV) (ZHANG et al., 1999), propriedades imunossupressoras
(XVI) (STROBEL; DAISY, 2003), antiviral (XVII-XVIII) (STROBEL; DAISY, 2003; GUO
et al., 2000), anticolinesterásica (XIX) (ALY; DEBBAB; PROKSCH, 2011),
antineoplásicos (XX- XXVII) (ZHANG; SONG; TAN, 2006; SHWETA et al., 2010) e
citotóxica (XXVIII) (ALY; DEBBAB; PROKSCH, 2011; ALY et al., 2010) (Figura 1).
Alguns estudos mostram que os fungos endofíticos são capazes de produzir um
grande número de importantes metabólitos secundários bioativos, conhecidos apenas
em plantas (ARNOLD, 2007; JALGAONWALA et al., 2011; ALY; DEBBAB;
PROKSCH, 2011, ALY et al., 2010; GREVE et al., 2010). Um exemplo bem conhecido
37
Introdução
é a produção do Taxol, um importante fármaco anticancerígeno, pelo fungo endofítico

Taxomyces andreanae, isolado da planta Taxus brevifolia, que também produz esta
substância. Outro importante anticancerígeno é a vincristina isolada da planta
Catharanthus roseus, e isolada do fungo endofítico Fusarium oxysporum, obtido da
mesma planta (ARNOLD, 2007). Podofilotoxina, também utilizada no tratamento de
câncer, é encontrada em espécies vegetais do gênero Podophylum e também relatada
nos endófitos Trametes hirsuta e Phialocephala fortinii (JALGAONWALA et al., 2011).
Existem outros exemplos de compostos de origem vegetal que são produzidos por
fungos que habitam os mesmos (JALGAONWALA et al. 2011; ALY; DEBBAB;
PROKSCH, 2011), sugerindo haver uma transposição de genes entre as plantas e os
fungos em uma verdadeira engenharia genética in vivo (ZHANG; SONG; TAN, 2006)
Estas evidências atraem a atenção dos químicos de produtos naturais e de
biólogos, conforme indicado pelo aumento constante de publicações dedicadas a este
tema nos últimos anos (113 artigos científicos sobre metabólitos secundários de
fungos endofíticos no período de 2008-2009, 69 de 2006-2007, 36 de 2004-2005, 14
de 2002-2003 e 18 de 2000-2001) (CHAPLA; BIASETTO; ARAUJO, 2013).
38
Introdução
Figura 1: Substâncias bioativas isoladas de fungos endofíticos
R O
OH HO O
O
OH OH
OH O
O O
O
O
R=OH; pestaloteol A (I)
R=H; pestaloteol B (II) pestaloteol C (III) pesteloteaol D (IV)
OH
O
O OH
O
O H OH
O O
HO O
HO O OH O OCOCH3
O
HO
H2N O OH O
HO
cercosporamida (V)
enfumagina (VI) tricodemina (VII)
O
O OH O O R
H OH
O O O O O
OH O
OH O
R=OH; ácido nodulispórico A (X)

palmarumicina CP17 (VIII) palmarumicina CP18 (IX) R=NH2; terc-butil nodulisporamida (XI)
OH O
O HO
OH H
NH N O OH
HN O
OH O
HO
O
crisogenamida A (XII) isopestacina (XIII) pestacina (XIV)
H O
O NH
HO H
O
OH H
O OH
HN O
O
L 783.281 (XV) subglutinol A (XVI)

39
Introdução
O
O O O
N H
O OH O OH N
H
O O OH OH N O
O O
OH OH N
O O OH
HO OH HO OH
ácido citônico A (XVII) ácido citônico B (XVIII) 16--hidroxi-5-N-acetilardimina (XIX)
R4
R1 O
O R5
O O
O OH
N O OH
R1 R2
OH O R3
O O R2
N HO
HO (XXI) R1=R2=H (XXIV) R1=R2=R3=R4=R5=H
(XXII) R1=H, R2=OH (XXV) R1=OH, R2=R3=R4=R5=H
10-hidroxicamptotecina (XX) (XXIII) R1=OH, R2=H (XXVI) R1=R2=R3=R4=H, R5=OH
antraquinonas XXI-XXIII (XXVII) R1=H, R2=R3=R4=R5=OH
antraquinonas XXIV-XXVII
OH
AcO O OH N
O
O N
N O
O N
H O H
O OH OH
O CH3O O
N HO Ph OAc
O CH3O N OAc
HN Ph H
O HO
Ph O OCH3
O
camptotecina (XXVIII) taxol (XXIX) vincristina (XXX)
OH
O
O
O
O
CH3O OCH3
OCH3
podofilotoxina (XXXI)
Fungos endofíticos são relativamente inexplorados e incompreendidos em

comparação com os fungos isolados do solo e os fitopatogênicos. Apesar disso, os
fungos endofíticos tem um papel ecológico, devido às diversas interações dos fungos
com o hospedeiro. Alguns autores (TAN; ZOU, 2001; SCHULZ et al., 2002; TEJESVI
et al., 2007) têm revisado a diversidade dos metabólicos secundários produzidos por
fungos endofíticos enfatizando esse potencial ecológico. Eles têm evidenciado a
produção de metabólitos secundários por diversas vias metabólicas, como policetídea,
40
Introdução
isopreno, derivados de amino ácidos etc., e uma grande diversidade de classes

estruturais, como xantonas, esteroides, isocumarinas, fenóis, terpenos, citocalasinas,
etc. (CHANDRA, 2012).
1.4 Espécie hospedeira - Eugenia jambolana
Eugenia jambolana (syn Syzygium cumini, Figura 2) pertence à família

Myrtaceae, é encontrada em todo o subcontinente Asiático, na África Oriental,
América do Sul, Madagascar, e também nas regiões mais quentes dos Estados
Unidos da América (Flórida e Havaí). É famosa devido aos seus frutos, que são
considerados uma iguaria. A árvore pode chegar até 15 metros de altura e possui
grande copa, as folhas são elípticas, longas, lisa de natureza fibrosa, as flores
aparecem uma vez ao ano, e estas são pequenas (7-12 mm) de coloração branca e
com finas pétalas membranosas. Os frutos são encontrados em grupos de 4-20 e não
amadurecem simultaneamente, estes são redondos ou elipsóides, e possuem uma
semente no centro. Os frutos são inicialmente de coloração verde, à medida que
amadurecem tornam-se vermelhos e quando maduros possuem coloração roxa
escura ou preta, o fruto possui uma combinação de sabor doce, levemente amargo e
adstringente (BALIGA et al., 2011; LI et al., 2009).
No Brasil é conhecida principalmente como jambolão, mas também é
popularmente chamada de jamelão, cereja, jalão, kambol, jambú, azeitona-do-
nordeste, ameixa roxa, murta, baga de freira, guapê, jambuí, azeitona-da-terra, entre
outros nomes. Tem sido usada na medicina tradicional brasileira e em outros países
tropicais principalmente devido as suas propriedades hipoglicêmica e antidiabética
(VIZZOTO; FETER, 2009; VASI; AUSTIN, 2009).
Eugenia jambolana é utilizada em outros tratamentos, a casca é carminativo,
digestiva, antidiabética, anti-helmíntica e antibacteriana. As folhas possuem
propriedade antibacteriana e são usadas para reforçar dentes e gengivas. As folhas
têm sido também extensivamente usadas para tratar diabetes, constipação,
leucorreia, febre, gastropatia e dermopatia (SRIVASTAVA; CHANDRA, 2013).
41
Introdução
Figura 2: Eugenia jambolana
Das folhas são conhecidos diferentes flavonoides, terpenoides como também

o β-sitosterol, ácido betulínico, ácido crategolico, n-heptacosane, n-nonacosane, n-
hentriacontane, noctacosanol, n-triacontanol, quercetina, miricetina, miricitrina e o
flavonoide glicosilado miricetina 3-O-(4″-acetil)-α-L-ramnopiranosídeo (LOGUERCIO
et al., 2005; SANTOS et al., 2012; BALIGA et al., 2011).
O óleo essencial das folhas é conhecido por conter as substâncias pinocarveol,
α-terpineol, mirtenol, eucarvone, muurolol, α-mirtenal, cineole, geranil acetona, α-
cadinol e pinocarvone (BALIGA et al., 2011).
No caule é reportado a presença de friedelina, friedelina-3-α-ol, ácido
betulínico, β-sistosterol, β-sistosterol-D-glicosideo, kaempferol, kaempferol-3-
glicosídeo, ácido gálico, ácido elagico, galotanina, elagitanina, quercetina e miricetina
(BALIGA et al., 2011; SRIVASTAVA; CHANDRA, 2013).
Os frutos são comestíveis e utilizados como adstringente, estomáquico,
diurético e antidiabético (TIMBOLA et al., 2002). Extratos do fruto apresentaram forte
atividade antioxidante devido à presença de vitamina C, ácido gálico, taninos e
antocianinas (BANERJEE; DASGUPTA, 2005). O principal ácido presente no fruto é
o ácido málico, com vestígios de ácido oxálico, ácido gálico e taninos que conferem
adstringência ao fruto. A cor roxa do fruto é devido à presença de cianidina
diglicosídeo. Glicose, frutose, manose e galactose são os principais açúcares. O fruto
é uma fonte rica de minerais e vitaminas (SRIVASTAVA; CHANDRA, 2013). Alguns
dos principais substâncias encontrados em E. jambolana estão ilustrados na Figura
3. Além do uso na medicina tradicional o fruto do jambolão também é utilizado na
42
Introdução
culinária em tortas, sucos, drinques e vinhos (SANTOS et al., 2012; BALIGA et al.,
2011).
Figura 3: Compostos presentes em Eugenia jambolana

43
Introdução
Estudo realizado por Dametto (2010) com os frutos de E. jambolana permitiu a

identificação de oito antocianinas: delfinidina-diglicosídeo, cianidina-diglicosídeo,
petunidina-diglicosídeo, malvidina-diglicosídeo, delfinidina-glicosídeo, cianidina-
glicosídeo, petunidina-glicosídeo e malvidina-glicosídeo nos extratos do fruto e, o
isolamento de outras três (Figura 4). Estudos preliminares com os extratos e frações
dos frutos e folhas de E. jambolana mostraram que esta espécie apresenta elevada
ação sequestradora de radicais livres e quimiopreventiva, atividade antimalárica,
antifúngica contra patógenos-humanos e anticolinesterásica.
44
Introdução
Figura 4: Antocianinas presentes em Eugenia jambolana
Os estudos realizados até o momento com o jambolão indicam que este

apresenta diversos benefícios à saúde e é descrito como importante produto
alimentício. Estudos têm demonstrado inúmeras atividades biológicas dos extratos de
jambolão, justificando seu uso na medicina tradicional. No entanto, o efeito mais
estudado são os efeitos antidiabéticos das sementes de jambolão, em diferentes
modelos experimentais e em pacientes. Os benefícios observados a saúde foi
atribuído à presença de várias substâncias como os polifenóis, terpenos, antocianinas
e flavonoides (BALIGA et al., 2011).
Devida ao grande uso de E. jambolana na medicina tradicional e seus estudos
fitoquímicos relatarem inúmeras atividades biológicas, esta espécie foi selecionada
como alvo dos estudos dos fungos endofíticos. Dois fungos dessa espécie vegetal
45
Introdução
foram selecionados para o estudo mais aprofundado, o fungo endofítico isolado das
folhas classificado como Botryosphaeria parva, e o fungo endofítico isolado dos caules
classificado como Saccharicola sp.
1.5 Botryosphaeria parva
Membros da família Botryosphaeriaceae foram descritos pela primeira vez na

década de 1820 como espécies de Shaeria, conhecidos como patógenos de plantas.
Apenas em meados de 1980, fungos dessa família foram descritos como endófitos.
Desde então, foram isoladas diversas espécies como fungos endofíticos. Com base
na alta distribuição taxonômica e na alta frequência de infecções dos fungos
endofíticos dessa família em diferentes hospedeiros, sugere-se que a maioria, ou
todos os fungos da família Botryosphaeriaceae, pode ter uma fase endófita
(SLIPPERS; WINGFIELD, 2007).
A família Botryosphaeriaceae representa um diverso e proeminente
componente de muitas comunidades endofíticas. No entanto, o reconhecimento de
sua importância econômica, a sua presença e o papel ecológico em comunidades
vegetais são pouca estudadas. Fatores que influenciam a patogenicidade não são
claros e, consequentemente, sua importância como fungos endofíticos não é bem
definida (SLIPPERS; WINGFIELD, 2007).
A maioria dos gêneros na família Botryosphaeriaceae, é descrita como
endófitos, como os gêneros Guignardia, Botryosphaeria (anamorfo Fusicoccum),
Dothidotthia (anamorfo Dothiorella), Neofusicoccum, Pseudofusicoccum,
Lasiodiplodia e Diplodia. Alguns destes endófitos são muito comuns, dominando
comunidades endofiticas em Eucaliptus e Pinus em diferentes ambientes (SLIPPERS;
WINGFIELD, 2007).
O gênero Botryosphaeria foi descrito apenas em 1863. Esses ascomicetos
foram observados como saprófitas sobre o tecido morto de plantas lenhosas,
posteriormente esse gênero na sua forma anamorfa foi descrito como patógeno,
principalmente em viveiros, plantios agrícolas e florestas.
O gênero Botryosphaeria é conhecido por abranger muitas famílias de plantas,
como as monocotiledoneas, dicotiledoneas e gimnospermas. Muitas espécies deste
gênero são conhecidas por apresentarem-se em um estado endofítico, mais tarde
46
Introdução
podendo se tornar um fungo saprófita ou patogênico. Sintomas típicos de doença

desses patógenos incluem cancros, necrose da madeira, podridão, entre outros.
(GURE; SLIPPERS; STENLID, 2005; NIEKERK et al., 2006). Botryosphaeria tem
ganhado destaque como um agente patogênico de diversas espécies de uvas, devido
ao fato dos fungos deste gênero serem encontrados em plantas que apresentavam
diversos sintomas de doenças.
O fungo Botryosphaeria parva foi isolado de Vitis vinifera (uva utilizada na
produção de vinho) e de outras difierentes especies de uvas como em fungo
fitopatogênico, causador de apodrecimento do tronco, morte dos brotos e necrose
(NIERKEK et al., 2004; PHILLIPS, 2002).
Em uma busca realizada na literatura (Scifinder e Web of Science) não foram
encontrados trabalhos referentes ao estudo químico do fungo Botryosphaeria parva;
mas em relação ao gênero, podemos destacar a produção de policetídeos (XXIX-
XXXVI) pelo fungo endofítico Botryosphaeria australis (XU et al., 2011), e uma
variedade de isocumarinas, fenólicos e lactona (XXXVII-XLIII) produzidos pelos
fungos endofíticos Botryosphaeria rhodina (RUKACHAISIRIKUL et al., 2009) e
Botryosphaeria mamane (PONGCHAROEN et al., 2007) (Figura 5).
47
Introdução
Figura 5: Substâncias produzidas por fungos endofíticos do gênero Botryosphaeria
1.6 Saccharicola sp.
Saccharicola é um gênero de fungo pertencente à família Massarinaceae. Esse

gênero surgiu para re-classificar duas espécies fitopatogênicas encontradas em cana-
de-açúcar, Leptosphaeria bicolor e Leptosphaeria taiwanensis, como Saccharicola
bicolor e Saccharicola taiwanensis, respectivamente (ERIKSSON; HAWKSWORTH,
2003). Não há relatos na literatura sobre o estudo químico dos fungos deste gênero.
1.7 Líquen
Liquens são organismos que vivem em associação simbiótica entre fungos

filamentosos (micobionte) e algas (fotobionte), geralmente algas verdes ou
cianobactérias. Os liquens são considerados organismos pioneiros no ecossistema, e
produzem metabólitos únicos que raramente ocorrem em outros organismos. Os
metabólitos secundários de liquens são produzidos pelo organismo dominante (fungo)
48
Introdução
e são depositados nas hifas externas. Os metabólitos de liquens ocorrem em ampla

gama de cores, como amarelo, laranja, vermelho e marrom. Os liquens possuem um
importante papel na ciclagem mineral por capturar os nutrientes que serão liberados
no ambiente por precipitação e também pela morte e decomposição do talo
(PODTEROB, 2008; BOUSTIE; TOMASI; GRUBE, 2011).
Os metabólitos de liquens possuem diferentes funções na natureza, pois filtram
a luz para proteger os liquens da radiação, podem impedir o ataque de herbívoros e
outros possuem propriedades antibióticas para a proteção contra a degradação
microbiana. Podem ainda estar envolvidos no equilíbrio simbiótico ou na degradação
das rochas para melhorar a fixação dos liquens ao substrato (MUGGIA; SCHMITT;
GRUBE, 2009).
As substâncias isoladas dos liquens apresentam um gama de atividades
biológicas incluindo antimicrobiana, anti-inflamatória, antioxidante, antiproliferativa e
citotóxica. Um aumento crescente nas propriedades farmacêuticas dos metabólitos de
liquens vem sendo observado. No entanto, relativamente poucos liquens foram
estudados quimica e biologicamente, devido principalmente as dificuldades na
obtenção de quantidades e pureza suficiente para a elucidação estrutural e testes
farmacológicos. Consequentemente, muito poucos medicamentos comercializados
são provenientes de líquen. Exemplos de medicamentos comercias de sucesso são
os antibióticos da classe das riminofenazina, como clofazimina (Lampren®), que foi
desenvolvida como um fármaco antimicobacteriano (BOUSTIE; TOMASI; GRUBE,
2011).
1.8 Parmotrema tinctorum
O gênero Parmotrema é um líquen pertencente à família Parmeliaceae. Este

gênero se caracteriza pelos talos com lobos de ápices largos e arredondados (maiores
que 0,5 cm, com frequência ultrapassando 2 ou 3 cm de largura), pela ausência de
pseudocifelas (poros com extravasamento de hifas medulares), ocorrência frequente
de cílios marginais, ampla zona marginal do córtex inferior nua, rizinas geralmente
simples, e ascósporos elipsóides de paredes espessas. Mais de trezentas espécies
são conhecidas em todo o mundo, sendo a maioria delas encontrada nas ilhas do
Pacífico e nas regiões tropicais e sub tropicais da América do sul, dos quais
49
Introdução
aproximadamente um terço é citado para o Brasil (BLANCO et al., 2005; MARCELLI;

BENATTI, 2010).
Muitos liquens são sensíveis a poluição do ar e são utilizados para avaliar o
ambiente, como é o caso de Parmotrema tinctorum (Figura 6). Este líquen é sensível
ao dióxido de enxofre (SO2) e tem sido usado como um bioindicador da qualidade do
ar tanto no Japão quanto no Brasil (OHMURA et al., 2009; KAFFER et al., 2012).
Figura 6: Foto do líquen Parmotrema tinctorum
Fonte: http://parmotrema.lifedesks.org/node/4
Estudos químicos de Parmotrema tinctorum revelaram que o extrato acetônico

contem grande quantidade de compostos fenólicos. Este extrato apresentou alta
atividade antioxidante (STANLY et al., 2011). Estudos químicos relatam do P.
tinctorum o ácido salazinico (EIFLER-LIMA et al., 2000), atranorina e o ácido
lecanorico. Atranorina apresentou baixa atividade contra Micobacterium tuberculosis
(HONDA et al., 2010). Foi isolado também a lecanorina, ácido girofórico, haematomato
de metila, carboxilato de metil-α-orcinol, liquexantona, orselinato de metila, orcinol,
bem como o ácido orselinico, e ácido usnico (Figura 7). Alguns desses compostos
apresentaram atividade antiproliferativa e citotóxica (ROJAS; LOTINA-HENNSEN;
MATA, 2000).
50
Introdução
Figura 7: Substâncias isoladas do líquen Parmotrema tinctorum
O OH OH
COOCH 3 COOH
O O O
OH
HO
O O O
OHC OH
HO OH HO OH
HO
O O CHO
ácido salizínico atranorina ácido lecanórico
OH O O
O O OH
O HO OH O OH
HO OH OH O
lecanorina O ácido girofórico
OCH 3
HO OH
O H
haematomato de metila
1.9 Fungos endofíticos de liquens
Cerca de 8% do território terrestre é dominado por liquens (LOGESH et al.,

2012). Trabalhos mostram que os liquens podem abrigar numerosos fungos, que são
chamados de endófitos de líquen ou “endolichenic fungi”. Estes vivem
assintomaticamente no talo do líquen assim como endófitos vivem no interior de
plantas (PARANAGAMA; WIJERATNE; GUNATILAKA, 2007; KANNANGARA;
RAJAPAKSHA; PARANAGAMA, 2009; U’REN et al., 2010). A comunidade dos fungos
endofíticos de liquens é tão diversa quanto a comunidade endófita de fungos
provenientes de plantas (PARANAGAMA; WIJERATNE; GUNATILAKA, 2007).
Os liquens constituem um nicho ecológico inexplorado para uma grande
variedade de micro-organismos incluindo os fungos (LOGESH et al., 2012), sendo
estes fungos muito pouco explorados quimicamente. O primeiro relato de metabólitos
secundários produzido por fungos endofíticos de liquens foi descrito por Paranagama
e colaboradores (2007). Os estudos com fungos endofíticos de liquens estão em
51
Introdução
evidencia, sendo observado um aumento no número de publicações nos últimos anos

(Figura 8), na maioria dos casos sendo descritas substâncias inéditas com potencial
biológico (WANG et al., 2013a; 2013b; CHEN et al., 2013; HE et al., 2012; LI et al.,
2012; ZHANG et al., 2009; 2012; WANG et al., 2012; LOGESH et al., 2012). Estas
observações demonstram a importância do estudo desta classe de micro-organismos
para obtenção de novas entidades químicas, que possam ser utilizadas na agricultura
e terapêutica.
Figura 8: Itens publicados por ano contendo “endolichenic”
Fonte: Web of Science (5/12/2013)
1.10 Lecythosphora sp.
O gênero de fungo Lecythophora é caracterizado por colônias úmidas com

abundante adelofialides (fiálides reduzidos), contudo essas células conidiogênicas
mostram colaretes visíveis, e as colônias geralmente são rosa-salmão ao marrom
escuro, embora fiálides discretas, como as de Acremonium podem estar presentes.
Embora esses fungos sejam sapróbios, algumas espécies são consideradas
patógenos humanos. Lecythophora hoffmannii tem sido associado a casos de
infecções subcutâneas, ceratite, sinusite, peritonite e osteomielite canino.
Lecythophora mutabilis tem sido descrito como sendo o agente causador da peritonite
humana, endocardite, endoftalmite, e ceratite, entre outros (PERDOMO et al., 2011).
Nos estudos químicos realizados com espécies desse gênero foi possível isolar
diversas substâncias químicas de diferentes classes. Do fungo Lecythophora sp.,
52
Introdução
isolado de planta Alyxia reinwardtii, foi isolada uma nova macrolactona glicosilada,
lecitomicina, que apresentou atividade antifúngica contra os fungos Aspergillus
fumigatus e Candida Kruzei (SUJIGANTO; DIESEL; RATEB, 2011). De Lecythophora
hoffmannii, associado à Populus tremuloides, foi isolado uma nova substância
denominada de sulfato de caetiacandina (lecitoforina, XLIV), o conhecido
caetiacandina (XLV) e lecitosideo (XLVI) (Figura 9) (AYER; KAWAHARA, 1995;
AYER et al., 1996).
Figura 9: Substâncias isoladas de fungos do gênero Lecythophora
OR OH
HO OH OH OH
O HO O
O O O
O OH OH
OH
OH OH OH
OH O
HO OH
XLVI
O O
XLIV R = SO3Na
XLV R = H
1.11 Epigenética e moduladores epigenômicos
Estudos sobre o sequenciamento do genoma de fungos têm revelado a

presença de inúmeros genes desconhecidos, que codificam as enzimas responsáveis
pela produção dos metabólitos secundários (CHEN et al., 2013). Os métodos de
fermentação típicos como agitação em “shaker”, culturas estáticas ou artificialmente
definidas são pobres em mimetizar o habitat natural dos fungos endofíticos. Como
consequência, muitos genes responsáveis pela produção de metabólitos secundários
não são expressos no ambiente artificial de laboratório; apenas um subconjunto de
vias biossintéticas são expressas, limitando assim as perspectivas para realizar uma
completa busca no potencial de descoberta de novos metabólitos bioativos em micro-
organismos. Esta constatação sugere que novas alternativas devem ser utilizadas de
53
Introdução
modo a mimetizar, de forma mais precisa, o habitat natural dos micro-organismos

(WILLIAMS et al., 2008; CHEN et al., 2013).
Existem alguns métodos para mimetizar o ambiente natural dos endófitos ou
alterar a produção metabólica tentando a maior expressão gênica das vias
biossintéticas. Uma delas é a dependência da produção metabólica com as condições
utilizadas no cultivo conhecido como OSMAC (do inglês one strain many compounds).
A abordagem desse método resulta na observação de que pequenas alterações nas
condições de cultivo podem mudar completamente o perfil metabólico de muitos
micro-organismos (PARANAGAMA; WIJERATNE; GUNATILAKA, 2007). Com esta
variação metabólica, novas entidades químicas podem ser produzidas e
possivelmente com potencial a ser utilizados na terapêutica.
Outro método de modificar a produção metabólica de endófitos e aumentar a
expressão de genes é a utilização dos manipuladores de genes, também conhecidos
como modificadores epigenéticos. Esses modificadores atuam na transcrição do DNA
alterando as rotas biossintéticas, ou ativando as rotas biossintéticas silenciosas
(WILLIAMS et al., 2008).
O método de cultivo epigenético em fungos foi relatado por Williams e
colaboradores (2008), demonstrando ser eficaz na produção de diferentes metabólitos
secundários, indicando que está técnica é promissora e racional para a expressão
natural das vias biossintéticas silenciosas.
Existem diferentes mecanismos epigenéticos, estes estão envolvidos nas
alterações do epigenoma, que controla a acessibilidade transcricional dos genes que
codificam as enzimas biossintéticas. Dos mecanismos epigenéticos, os mais
estudados e conhecidos são a metilação do DNA e as modificações das histonas
(CICHEWICZ, 2010; FISCH et al., 2009).
O DNA é modificado pós-translacional em fungos pelas enzimas DNA
metiltransferases (DNMTs), resultando na conversão da citosina em seu
correspondente 5-metilcitosina (Figura 10). A metilação do DNA ocorre quase
exclusivamente em dinucleotideos CpG (pares de Citosina-fosfato-Guanina) de
células diferenciadas e tem uma importante função na regulação da expressão gênica
e no silenciamento de elementos repetitivos do genoma (CICHEWICZ, 2010;
CHERBLANC et al., 2013).
54
Introdução
A metilação do DNA é um traço hereditário, mas esta marca epigenética pode

ter estabilidade limitada durante contínuos repiques. Manipulações genéticas,
resultando em alteração de metilação do DNA têm sido estudadas e estas tendem a
resultar em fenótipos modificados drasticamente, incluindo desenvolvimento sexual e
a aberração no comportamento cromossômico (replicação do DNA anormal ou
segregação cromossômica) (CICHEWICZ, 2010).
Figura 10: Metilação do resíduo Citosina do DNA
NH2 NH2
H3C
N DNA metiltransferase N
N O N O
H H
Citosina 5-metilcitosina
As histonas são proteínas associadas à cromatina e possuem duas importantes

funções. Encontram-se sob a forma da estrutura básica de condensação do DNA, o
nucleossomo, e participam no controle da regulação transcricional, que é essencial
para o bom funcionamento celular (CICHEWICZ, 2010). O nucleossomo é a unidade
básica da cromatina e é composto por dois complexos idênticos, cada um constituído
de 4 proteínas histonas, que formam um octâmero. As proteínas histonas presentes
em cada nucleossomo são: a H2A, H2B, H3 e H4. Duas voltas da molécula de DNA
incorporam-se a esta estrutura, que tem também a proteína histona H1 associada ao
DNA, contribuindo para sua condensação (MULLER; PRADO, 2008).
As modificações das histonas regulam as funções da cromatina alterando a
acessibilidade do DNA aos diferentes fatores que atuam em trans, como as enzimas
de transcrição, ou pelo recrutamento de proteínas específicas que reconhecem as
modificações ocorridas nas histonas. As principais modificações são as acetilações,
metilações e fosforilações, que ocorrem nos resíduos N-terminais dos amino ácidos
presentes nas histonas (CICHEWICZ, 2010; FISCH et al., 2009; MULLER, PRADO
2008).
A acetilação do grupo 3-amino da lisina é a mais estudada modificação pós-
traducional em histonas de fungos. O processo de acetilação e desacetilação da lisina
é realizado por dois grupos de enzimas: histonas acetiltransferases (HATs) e histonas
55
Introdução
deacetilases (HDAC), respectivamente. A acetilação do resíduo lisina diminui a sua

afinidade de ligação com o DNA (Figura 11), o que contribui para uma transição entre
o estado da cromatina “aberta” e “fechada”, que estão envolvidos na regulação da
expressão ou não dos genes, respectivamente (CICHEWICZ, 2010).
Figura 11: Acetilação do resíduo lisina encontrado nas histonas e sua interação com o DNA
Fonte: CICHEWICZ, 2010
Metilação de resíduos de lisina e arginina representam outro conjunto de

modificações pós-traducionais que são frequentemente encontrados. Considerando
que a acetilação da lisina normalmente leva à inibição da transcrição, os efeitos de
metilação são variadas e vão desde a ativação ou silenciamento de genes. A
metilação de resíduos de lisina e arginina é realizada por diferentes conjuntos de
enzimas que exibem especificidades distintas para as funções -amino ou -guanidina
(CICHEWICZ, 2010; CHERBLANC et al., 2013).
Uma série de pequenas moléculas surgiram como ferramentas e tem permitido
o desenvolvimento de técnicas epigenéticas químicas (Figura 12), essas moléculas
são capazes de seletivamente ou semi-seletivamente inibir a DNA metiltranferase
(DMNT) ou a histona deacetilase (HDAC) alterando o processo de transcrição do
DNA. Essas moléculas ainda são orientadas a examinar como os recursos
epigenéticas regulam os processos biológicos, o que inclui a regulação de
mecanismos biossintéticos envolvidos na geração de metabólitos secundários
(CICHEWICZ, 2010).
56
Introdução
Figura 12: Exemplos de moléculas utilizadas como modificadores epigenéticos
Os modificadores epigenéticos podem ser empregados para expressar vias

biossintéticas silenciosas e melhorar a produção de metabólitos secundários de
fungos (WILLIAMS et al., 2008). As vias biossintéticas silenciosas são uma fonte rica
de diversos compostos químicos (características estereoquímicas, incorporação de
heteroátomo, etc.) com excelente potencial para a geração de novos derivados
terapêuticos (FISH et al., 2009).
Essa técnica tem sido utilizada por diversos grupos de pesquisa e tem-se
comprovada a sua eficiência. Chen e colaboradores (2013) isolaram dois novos
compostos (XLVII e XLVIII) no cultivo de Fusarium oxysporum tratado com SAHA
(inibidor de DMNT). Chung e colaboradores (2013) observaram a mudança da
produção metabólica do fungo Beauveria felina cultivado com SAHA, isolando três
compostos diferentes não encontrados no controle, sendo dois inéditos (XLVIX e L).
Beau et al. (2012) obtiveram um aumento da produção de três compostos
antimicrobianos (LI, LII e LIII) na cultura de Staphylococcus aureus tratada com
butirato de sódio (inibidor de HDAC). Asai et al. (2012a) obteveram alteração do perfil
da produção metabólica do fungo entomopatogênico Gibellula formosana no cultivo
57
Introdução
com os dois modificadores epigenéticos SBHA e RG-108 (inibidor de HDAC e inibidor

de DMNT, respectivamente), comparando com o controle ou o cultivo com os
modificadores separadamente, sendo isolado 8 compostos novos (LIV-LXI). Asai et
al. (2012b) isolaram uma substância nova com esqueleto policetídeo (LXII) no cultivo
de Isaria tenuipes na presença dos dois modificadores epigenéticos SBHA e RG-108.
Figura 13: Compostos isolados do cultivo de fungos com modificadores epigenéticos.

58
Introdução
Essa técnica exibe várias vantagens em relação às técnicas existentes

disponíveis. A principal é que fornece uma ferramenta para o acesso rápido aos
produtos naturais de fungos presentes apenas em seus hospedeiros nativos. Essa
metodologia pode ser facilmente implantada na maioria dos laboratórios sem a
necessidade de equipamentos caros, e os custos e esforços para obter informações
sobre as vias metabólicas silenciosas são reduzidos, uma vez que não é necessário
fazer uma varredura pré-selecionando fungos utilizando diferentes condições de
cultivo (WILLIAMS et al., 2008).
Objetivos
60
Objetivos
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais:
 Isolar e estudar quimicamente os fungos endofíticos da espécie vegetal
Eugenia jambolana;
 Avalição da produção metabólica do fungo endofítico de líquen Lecythophora
sp., no cultivo com e sem modificador epigenético.
2.2 Objetivos Específicos:

 Isolar, purificar e preservar os fungos endofíticos associados à espécie vegetal
Eugenia jambolana;
 Cultivar os endófitos isolados de E. jambolana em meios de cultivo líquido para
obtenção dos extratos brutos;
 Realizar a triagem química dos extratos brutos obtidos por RMN de 1H, CLAE-
DAD e CCDC.
 Realizar a triagem biológica dos extratos brutos obtidos contra os fungos
fitopatogênicos C. cladosporioides e C. sphaerospermum, linhagens de células
tumorais, anticolinesterásico e antioxidante.
 Selecionar os extratos promissores e realizar o crescimento em escala
ampliada para obtenção do extrato bruto.
 Realizar fracionamento do extrato bruto obtido do cultivo em escala ampliada,
isolamento e elucidação estrutural das substâncias;
 Submeter as substâncias puras isoladas aos respectivos ensaios biológicos
para verificar as atividades biológicas.
 Emprego da técnica de epigenética na avaliação da produção metabólica do
fungo endofítico Lecythosphora sp
 Isolamento e determinação estrutural dos metabólitos secundários produzidos
por Lecythosphora sp.
 Submeter as substâncias puras isoladas do fungo Lecythophora sp. aos
ensaios biológicos.
Bioprospecção dos
fungos endofíticos
associados à espécie
vegetal Eugenia jambolana
62
Desenvolvimento
BIOPROSPECÇÃO DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS A ESPÉCIE

VEGETAL EUGENIA JAMBOLANA
3 PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Materiais, equipamentos e técnicas utilizadas
3.1.1 Solventes
Deuterados: CDCl3 e DMSO-d6 (CIL e Acros).
Não-deuterados: Merck, J.T. Baker, TEDIA e Quimis.
3.1.2 Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC)

Foram utilizadas placas pré-prontas de sílica gel da marca Whatman (AL SIL
G/UV 20 x 20 cm). As revelações foram obtidas por irradiação ultravioleta (UV 254 e
366 nm), nebulização com anisaldeído seguido de aquecimento ou exposição ao iodo
sublimado.
3.1.3 Cromatografia em Coluna (CC)

Nas separações cromatográficas em coluna aberta ou sob pressão foram
utilizadas colunas de vidro de diferentes diâmetros internos e comprimentos.
Fases estacionárias: sílica C-18 (40-75 µm, Sorbent Technologies), sílica gel
fase normal (0,060-0,200 mm; ACROS Organics) e sílica gel flash (40-63 μm;
Silicycle).
3.1.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

As análises cromatográficas foram obtidas em aparelho de cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) Varian Pro Star (Solvent Delivery Module 240 e Auto
Sampler 410) acoplado ao detector Varian Pro Star Photodiode Array Ultra-violet
(PDA-UV) 330. E em equipamento Schimadzu: bomba Schimadzu LC-6 AD; auto
injetor Schimadzu SIL 10 AF; detector Ultravioleta, em arranjo de diodos, Schimadzu
SPD M20A.
Foi usado coluna analítica Phenomenex tipo Gemini (C-18, 250 x 4,60 mm e 5
μm), coluna analítica Phenomenex tipo luna (C-18, 250 x 4,6 mm; 5 μm), coluna
63
Desenvolvimento
analítica Fenil (Shim-pack Phenyl, 250 mm, 5 μm), coluna preparativa Fenil (Shim-
pack Phenyl, 250 x 25 mm) e coluna preparativa C18 (Phenomenex, tipo Luna 5µm).
3.1.5 Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C (RMN de 1H e 13C)

Os experimentos unidimensionais e bidimensionais foram realizados em
espectrômetro Varian INOVA-500 operando em 500 MHz para o núcleo de 1H e em
125 MHz para o núcleo de 13C (campo magnético 11,4 T), e também em espectrômetro
Bruker INOVA-300 operando em 300 MHz para o núcleo de 1H e em 75 MHz para o
núcleo de 13C. Foi utilizado TMS como referência interna.
3.1.6 Espectrometria de massas (EM)

Os espectros de massa foram obtidos em espectrômetro de alta resolução,
micrOTOF QII – ESI-TOF Espectrômetro de massas (Bruker Daltonics, Billerica).
Condições do Experimento: Bomba de infusão, fluxo 300 µl.h-1, fase móvel para a
solubilização: MeOH:H2O 50% e modo de detecção positivo e negativo para as
amostras. O aparelho de alta resolução necessitou calibração interna antes de realizar
as análises, usou-se calibrante NA-TFA a 10 mg.mL-1. Foi utilizado o software
DataAnalysis (Bruker Daltonics) para o processamento dos dados.
E em espectrômetro LCQ FLEET (ESI-IT-MSn, Thermo Scientific®) equipado
com dispositivo de inserção direta da amostra via análise por injeção em fluxo contínuo
(FIA). A faixa de aquisição foi de m/z 50-2000. O software Xcalibur (Thermo
Scientific®) foi utilizado durante a aquisição dos dados e processamento dos dados
espectrométricos.
3.1.7 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho (IV)

A obtenção dos espectros na região do infravermelho foram obtidos utilizando-
se o espectrofotômetro NICOLET modelo SX-FT Impact 400, na região de 4000-400
cm-1, resolução de 4 cm-1, empregando a técnica de pastilha de KBr.
3.1.8 Cultivo dos fungos endofíticos:

Para cultivo dos micro-organismos foram utilizados os meios:
BDA (Acumedia): Batata Dextrose Ágar: 39 g L-1 de água;
64
Desenvolvimento
Czapek Broth: Sacarose (30 g), NaNO3 (3 g), K2HPO4 (1 g), MgSO4 (0,5 g), KCl (0,5
g) e FeSO4 (0,01 g) /1L de água.
Os meios líquidos de cultura foram submetidos à esterilização em autoclave
(Quimis) a 121oC por 20 minutos.
3.1.9 Outros equipamentos

 Evaporador rotatório – Buchi;
 Balança analítica – Mettler Toledo;
 Autoclave vertical – Quimis Aparelhos Científicos Ltda;
 Câmara de Fluxo laminar vertical – PACHANS;
 Microscópio - Olympus (CX40).
 Câmera de UV (254 e 360 nm)
3.2 Seleção do material vegetal
O material vegetal foi coletado da mesma espécime de Eugenia jambolana

obtida anteriormente para estudos fitoquímicos, já geo-referenciadas, localizada na
cidade de Araraquara, São Paulo-Brasil, em abril 2010 e dezembro 2010.
3.3 Isolamento das cepas fúngicas
Folhas e caules jovens e saudáveis de Eugenia jambolana foram selecionados

para o isolamento dos endófitos seguindo o procedimento: a superfície do material foi
lavada com água corrente e sabão neutro, e esterilizada por imersão em uma solução
de hipoclorito de sódio (NaClO) 1% (1 minuto), etanol aquoso 70% (1 minuto), seguida
de uma dupla lavagem em água estéril (5 minutos) e posterior secagem (MAIER et al.,
1997). A seguir, pedaços de folha e caule foram seccionadas assepticamente (3 a 4
de 0,5 cm) e inoculadas em placas de Petri contendo BDA (Batata Dextrose e Agar),
ao qual foi adicionado, após esterilização em autoclave, antibiótico sulfato de
gentamicina (100 μg mL-1) para evitar o crescimento de bactérias. O crescimento dos
fungos foi monitorado até cada cultura atingir 0,5-1 cm de comprimento, e submetidas
a sucessivas repicagens até obtenção das linhagens puras (Figura 14).
65
Desenvolvimento
A avaliação da pureza das linhagens foi realizada pela aparência uniforme das
placas. Foram obtidas sete linhagens puras, codificadas como Ej-c1, Ej-c2, Ej-c3, Ej-
c4, Ej-f1, Ej-f2, Ej-f3 (Ej = Eugenia jambolana; c = caule; f = folha), os quais foram
posteriormente preservadas em “slants”, contendo água estéril (método Castelani), e
depositadas na micoteca do Departamento de Química Orgânica, IQ-UNESP.
O isolamento dos fungos endofíticos, presentes nos frutos verdes e maduros,
foi realizado seguindo o mesmo protocolo utilizado no isolamento dos endófitos
presentes nas folhas e caule, apenas o tempo de esterilização foi alterado, devido a
mudança do material vegetal. No processo de esterilização, as imersões em solução
de NaClO 1%, etanol aquoso 70% e dupla lavagem em água estéril foram realizadas
em 3 min, 5 min e 5 min, respectivamente. A seguir, pedaços dos frutos foram
seccionados assepticamente (3 a 4 de 0,5 cm) e inoculadas em placas de Petri
contendo BDA, ao qual foi adicionado, após esterilização em autoclave, antibiótico
sulfato de gentamicina (100 μg mL-1). O crescimento dos fungos foi monitorado até
cada cultura atingir 0,5-1,0 cm de comprimento, e submetidas a sucessivas
repicagens até obtenção das linhagens puras.
A avaliação da pureza das linhagens foi realizada pela aparência uniforme das
placas e pela utilização de microscópio. Foram obtidas seis linhagens puras,
codificadas como Ej-fm1, Ej-fv1, Ej-fv2, Ej-fv3, Ej-fv4, Ej-fv5 (Ej = Eugenia jambolana,
fm = fruto maduro, fv = fruto verde) sendo posteriormente preservados em “slants”,
contendo água estéril e depositadas na micoteca do Departamento de Química
Orgânica, IQ-UNESP.
66
Desenvolvimento
Figura 14: Etapas de isolamento, purificação e preservação dos fungos endofíticos
3.4 Cultivo dos fungos endofíticos em pequena escala para obtenção

dos extratos brutos
Os fungos endofíticos isolados do caule, folha e frutos foram repicados para

placas de Petri contendo BDA e incubados por 7, 7 e 6 dias, respectivamente. A seguir
cada fungo foi inoculado em 2 frascos de Erlenmeyer (500 mL) contendo 200 mL de
meio de cultivo Czapek, preparado na concentração de 35 g L -1, os quais foram
mantidos sobre a bancada a 25oC por 28 dias, com agitações manuais a cada 24
horas. Após esse período o caldo foi separado do micélio por filtração, o filtrado foi
submetido a uma partição líquido/líquido com acetato de etila (AcOEt) (3 x 200 mL) e
concentrado, fornecendo o extrato bruto AcOEt de cada fungo (Figura 15).
Os extratos brutos foram submetidos a avaliação química por CCDC
(cromatografia em camada delgada comparativa) utilizando placas de sílica gel e fase
móvel [Hex:AcOEt (3:7 v/v)], CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência) acoplada
a detector de arranjo de diodo e Ressonância Magnética Nuclear de 1H (RMN de 1H).
67
Desenvolvimento
O perfil cromatográfico dos extratos foi obtido por CLAE em gradiente

exploratório, utilizando como fase estacionária uma coluna analítica Phenomenex (tipo
Gemini, C18) e eluição em gradiente de H2O:CH3OH (95:05 v/v a 0:100% em 40
minutos permanecendo nesta condição por mais 10 min.), com uma vazão de 1,0 mL
min -1.
Os extratos brutos AcOEt foram submetidos a avaliação biológica, testados nos
ensaios anticolinesterásico, antifúngico, antioxidante e antitumoral (para o
procedimento dos ensaios veja seção 3.10, pág. 72)
Figura 15: Fluxograma da obtenção e triagem dos extratos brutos obtidos de E. jambolana
3.5 Cultivo em escala ampliada do fungo Saccharicola sp. e obtenção

do extrato bruto
O fungo endofítico, isolado dos caules de Eugenia jambolana, Saccharicola sp.

foi repicado para placas de Petri contendo BDA e incubado por 7 dias. Em seguida o
fungo foi inoculado em 22 frascos de Erlenmeyer (500 mL) contendo 200 mL de meio
de cultivo Czapek, preparado na concentração de 35 g L -1, os quais foram mantidos
sobre a bancada a 25oC por 28 dias. Após esse período o caldo foi separado do
68
Desenvolvimento
micélio por filtração a vácuo, o filtrado foi submetido a uma partição líquido/líquido com
AcOEt (3 x 2,2 L) e concentrado, fornecendo o extrato bruto AcOEt (520,0 mg) (Figura
16).
O extrato bruto AcOEt foi submetido a análise de CCDC, CLAE e RMN de 1H.
O perfil cromatográfico do extrato foi obtido por CLAE em gradiente
Gemini, C18) e eluição em gradiente de H2O:CH3OH (95:05 v/v a 0:100% em 40
minutos permanecendo nesta condição por mais 10 min.), com uma vazão de 1,0 mL
min-1.
Figura 16: Obtenção do extrato bruto produzido por Saccharicola sp.
3.6 Fracionamento do extrato bruto obtido do fungo Saccharicola sp.
O extrato bruto AcOEt obtido do fungo Saccharicola sp. (500,0 mg) foi
submetido a um fracionamento utilizando coluna de vidro (21 x 4 cm), como fase
estacionária sílica de fase reversa C18 (40-75 µm, Sorbent Technologies) e eluente
69
Desenvolvimento
um gradiente de água:metanol (40-100%) e metanol:acetato de etila (50%), obtendo-

se 8 frações (500 mL).
As frações obtidas foram submetidas a análise de CCDC, CLAE e RMN de 1H
(obtidos em CDCl3 e DMSO-d6, 500MHz).
O perfil cromatográfico obtido para as frações foi realizado por CLAE em
gradiente exploratório, utilizando como fase estacionária coluna analítica
Phenomenex (tipo Gemini, C18) e eluição em gradiente de H2O:CH3OH (95:05 v/v a
0:100% em 40 minutos permanecendo nesta condição por mais 10 min.), com uma
vazão de 1,0 mL min -1.

Saccharicola sp.
A fração 1 (180,0 mg), após análise do perfil químico, foi submetida à

separação por CLAE preparativo utilizando uma coluna fenil (Shim-pack) e como
eluente um gradiente de água:metanol (60:40-0:100 v/v em 40 minutos) numa vazão
de 10 mL min-1 e =254 nm. Foram coletados onze frações que foram submetidos à
análises de RMN de 1H, resultando na identificação de quatro substâncias (Figura
17).
A fração 2 (119,5 mg) foi submetida a separação cromatográfica por CLAE

preparativo utilizando uma coluna fenil (Shim-pack) e como eluente um gradiente de
água:metanol (60:40-0:50 v/v em 20 min 50-100% de metanol em 2 minutos e
permaneceu nesta condição por mais 10 minutos) numa vazão de 9 mL min-1 e =254
nm. Foram coletados nove frações que foram submetidos à análises de RMN de 1H,
resultando na identificação de três substâncias (Figura 17).
A fração 3 (45,7 mg) foi submetida a separação cromatográfica por CLAE

preparativo utilizando uma coluna Phenomenex C18 (tipo Luna 5 µm) e como eluente
um gradiente de água:metanol (65:35-40:60 v/v em 30 minutos 60% a 100% de
metanol em 10 minutos e permaneceu nesta condição por mais 10 minutos) numa
vazão de 9 mL min-1 e =254 nm. Foram coletados três frações que foram submetidos
70
Desenvolvimento
à análises de RMN de 1H, resultando no isolamento e identificação de uma substância

(Figura 17).
Figura 17: Fracionamento do extrato bruto e isolamento dos metabólitos secundários

produzidos pelo fungo Saccharicola sp.
3.8 Cultivo em escala ampliada do fungo Botryosphaeria parva e

obtenção do extrato bruto
O fungo endofítico Botryosphaeria parva foi repicado para placas de Petri

contendo BDA e incubado por 5 dias. A seguir o fungo foi inoculado em 42 frascos de
Erlenmeyer (500 mL) contendo 200 mL de meio de cultivo Czapek, preparado na
concentração de 35 g L-1, os quais foram mantidos a 25oC por 28 dias em modo
estático, agitados manualmente a cada 24 horas. Após esse período o caldo foi
71
Desenvolvimento
separado do micélio por filtração, o filtrado foi submetido a uma partição líquido/líquido
com AcOEt (3 x 12,6 L) e concentrado, fornecendo o extrato bruto AcOEt. O extrato
bruto AcOEt foi submetido a análise de CCDC, CLAE e RMN de 1H (Figura 18).
Ao preparar-se a amostra para análise de RMN de 1H utilizando clorofórmio
deuterado (CDCl3), observou-se a dissolução parcial do extrato, com o deposito de
um sólido branco na parede do balão, e um sobrenadante amarelo. Devido a
dissolução de parte do extrato bruto, utilizou-se clorofórmio (CHCl3) para
recristalização do sólido contido no balão de evaporação. Obtendo-se um sólido
branco (105,0 mg), e um resíduo amarelo oleoso (135,6 mg) proveniente do
sobrenadante. Ambos os extratos foram submetidos à análise de RMN de 1H, e
somente o extrato oleoso (Ext. AcOEt-óleo) foi submetido à análise CLAE em modo
analítico.
Figura 18: Fluxograma de cultivo e obtenção do extrato bruto produzido por B. parva
O perfil cromatográfico do extrato foi obtido por CLAE em gradiente

72
Desenvolvimento
Luna, C18) e coluna fenil (Shim-pack Phenyl), eluição em gradiente de H2O:CH3OH

(95:05 v/v a 0:100% em 40 minutos permanecendo nesta condição por mais 10 min.),
com uma vazão de 1,0 mL min-1.

Botryosphaeria parva
O Ext. AcOEt-óleo foi submetido a fracionamento cromatográfico para o

isolamento dos metabólitos produzidos pelo fungo Botryosphaeria parva, utilizando
CLAE em modo preparativo. Foi utilizada uma coluna Fenil (Shim-pack Phenyl, 250
mm, 25 mm) e eluente em gradiente água:metanol 60:40 – 0:100% em 40 minutos,
com vazão de 10 mL min-1 e  = 254 nm. Foram coletados oito frações que foram
submetidos a análise de RMN de 1H, resultando no isolamento e identificação de
quatro substâncias (Figura 19).
Figura 19: Isolamento dos metabólitos secundários produzidos pelo fungo B. parva
73
Desenvolvimento
3.10 Avaliação biológica
3.10.1 Ensaio citotóxico* (MTT)

Material
Células: As linhagens tumorais utilizadas, MDA-MB435 (mama - humano),
HCT-8 e HCT-116 (cólon - humano), SF-295 (glioblastoma - humano) e OVCAR
(carcinoma de ovário), foram cedidas pelo Instituto Nacional do Câncer (EUA), tendo
sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10 % de soro fetal bovino e
1% de antibiótico, mantidas em estufa a 37 C e atmosfera contendo 5% de CO2.
Amostras: As amostras foram diluídas em DMSO puro estéril para a
concentração estoque de 20 mg mL-1 (extratos), 10 mg mL-1 (frações) ou 5 mg mL-1
(substâncias puras).
Método
Análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no programa
de screening do National Câncer Institute dos Estados Unidos (NCI), que testa mais
de 10.000 amostras a cada ano (SKEHAN et al., 1990). É um método rápido, sensível
e barato. Foi descrita primeiramente por Mosman (1983), tendo a capacidade de
analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica
baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de
tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes
somente nas células metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT
permite definir facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação
(BERRIDGE et al., 1996).
As células foram plaqueadas na concentração de 0,1 x 10 6 cél mL-1 para as
linhagens MDA/MB-435 e SF-295 e 0,7 x 105 cél mL-1 para a linhagem HCT-8. As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO 2 a 37C. Ao término
deste, as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante, removido. Em seguida,
foram adicionados 150 L da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram
incubadas por 3h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com 150 L
de DMSO puro em espectrofotômetro de placa a 595 nm.
*Ensaio realizado pelo Dr. Paulo Michel Pinheiro Ferreira na UFP, PI.
74
Desenvolvimento
Análise Estatística
Os experimentos foram analisados segundo a média ± desvio padrão da média
(DPM) da porcentagem de inibição do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism.
3.10.2 Ensaio anticolinesterásico**

Os extratos de interesse foram submetidos à constatação da inibição da enzima
acetilcolinesterase (AChE), de acordo com a metodologia de Marston, Kissling e
Hostettmann (2002), utilizando cromatoplacas. Foram aplicados 100 μg dos extratos
de interesse em uma cromatoplaca de sílica gel. A placa foi eluida com acetato de
etila: hexano (7:3) e, em seguida, borrifada com a solução da enzima
acetilcolinesterase (Solução A), após foi incubada em câmera úmida fechada, a 37ºC
por 2 minutos, e em seguida borrifada com uma solução D. Foi utilizado o padrão
fisostigmina.
As substâncias que apresentaram atividade anticolinesterásica inibem a enzima
acetilcolinesterasica, onde é observado o aparecimento de manchas brancas, em
comparação com o fundo de coloração roxa da placa; estas manchas brancas são
proporcionais à inibição da enzima acetilcolinesterase.
 Solução A: Acetilcolinesterase dissolvida em 150 mL do tampão Tris-HCl (0,05
M; pH=7,9), a solução estoque foi armazenada a 4oC e no momento do uso foi
adicionado 0,1% de albumina de soro bovino.
 Solução B: 250 mg de acetato de 1-naftila em 100 mL de etanol;
 Solução C: 400 mg do sal “Fast Blue” B em 160 mL de água destilada;
 Solução D: mistura contendo 10 mL da solução B mais 40 mL da solução C.
3.10.3 Ensaio antifúngico**

A atividade antifúngica foi determinada pela técnica de bioautografia para
detecção da atividade fungitóxica, pela nebulização dos fungos fitopatogênicos
Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum (concentração de
5x107 esporos mL-1 em solução de glicose e sais) em placas do CCDC contendo 200
μg dos extratos de interesse, previamente eluídas com acetato de etila:hexano (7:3).
As placas foram incubadas a 25º C por 48 horas, verificando a presença de halos de
**Ensaios biológicos realizados pela Dra. Maria Claudia Marx Young do Instituto Botânico, SP.
75
Desenvolvimento
inibição do crescimento dos fungos, em comparação com o padrão positivo nistatina

(10 μg).
3.10.4 Ensaio antioxidante

Os extratos brutos foram avaliados quanto à reatividade com 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH) utilizando o método por cromatoplaca (SIMÕES-PIRES et al.,
2005).
Esta atividade é observada quando ocorre redução do DPPH com os
compostos antioxidantes presentes nos extratos. Os extratos foram aplicados em
placa de sílica (CCDC) e eluidas com CHCl3:CH3OH (9:1). As cromatoplacas foram
borrifadas com uma solução metanólica 0,2% de DPPH, depois deixadas sob a luz
artificial durante 2 horas. O potencial antioxidante foi evidenciado pela presença de
manchas brancas, decorrentes da redução do DPPH, contra a coloração roxa do
fundo.
76
Resultados e Discussão
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Isolamento, purificação e cultivo dos endófitos
A metodologia empregada no isolamento dos fungos endofíticos de E.

jambolana possibilitou o isolamento de 13 linhagens fúngicas (Figura 20), as quais
foram submetidas a triagem química e biológica.
Para o isolamento e purificação dos endófitos, foi utilizado o meio BDA, que é
um meio rico e possui nutrientes primários necessários para o crescimento de fungos.
No entanto, devemos considerar que algumas linhagens fúngicas precisam de
condições especiais e nutrientes específicos, o que pode ter interferido no
crescimento, impedindo o isolamento de outras cepas fúngicas. Desta forma, os
fungos isolados foram os que melhor se adaptaram às condições de crescimento
empregadas.
A eficácia da esterilização superficial do material vegetal foi constatada pelo
monitoramento da última água de lavagem que não apresentou crescimento de micro-
organismos, quando plaqueada, o que evidencia a eficiência no processo de
esterilização.
Durante o processo de isolamento dos endófitos, algumas linhagens fúngicas
foram perdidas devido a problemas com contaminação, ocorridos antes de suas
preservações, e devido a difícil purificação de algumas linhagens.
O isolamento dos fungos endofíticos dos frutos de E. jambolana demonstrou
uma distribuição aleatória da quantidade de endófitos na espécie vegetal. A
diversidade dos micro-organismos endofíticos antes da maturação dos frutos é maior
do que após a maturação, pois do fruto maduro foi isolado apenas um endófito
enquanto que dos frutos verdes foi possível isolar cinco linhagens fúngicas.
Esse fato tem sido descrito para micro-organismos endófitos isolados de
sementes de diferentes espécies vegetais, onde é encontrada uma maior quantidade
de endófitos nas sementes antes da maturação do que após a maturação das
mesmas. Justifica-se, pois os endófitos que possuem habilidade de entrar em um
estado latente permanecendo na semente durante a maturação e os demais tendem
77
a migrar para outros tecidos da planta, o que pode ser um motivo para a diminuição
da diversidade (ARAUJO et al., 2010).
Figura 20: Fungos endofíticos isolados de Eugenia jambolana
4.2 Classificação das linhagens fúngicas
Os fungos codificados como Ej-c3 e Ej-f1 foram identificados como Saccharicola

sp. e Botryosphaeria parva, respectivamente, por taxonomia molecular, pelo CPQBA
(Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas) em Paulínia-
78
SP. Os fungos codificados como Ej-c4 e Ej-fm1 foram identificados como

Colletotrichum gloeosporioides e Pseudofusicoccum stromaticum, respectivamente,
pela GENOTYPING BIOTECNOLOGIA - PROSPECTA em Botucatu-SP, estes fungos
foram depositados na micoteca do NuBBE com o número Ej-c4, Ej-f1, Ej-c5 e Ej-fm1,
respectivamente.
4.3 Triagem química dos extratos brutos dos endófitos
4.3.1 Obtenção do extrato bruto
Os extratos brutos foram obtidos de acordo com a metodologia descrita na

seção 3.4, pág. 65. Os rendimentos dos extratos obtidos foi satisfatória (Tabela 1),
sendo os melhores resultados obtidos para o fungo Ej-fm1, produzindo 87,8 mg e para
o fungo Ej-c3, 78,2 mg de extrato. A alta massa obtida pode estar associada a uma
alta produção metabólica. Considerando que cada fungo possui diferentes condições
ótimas de cultivo, e neste trabalho foi empregada a mesma metodologia para todos
os fungos.
A escolha do solvente AcOEt para a partição líquido/líquido dos meios de
cultivo foi baseada nos trabalhos anteriores realizados pelo grupo NuBBE e em dados
da literatura (SILVA, 2005).
Tabela 1: Rendimento obtido dos extratos brutos dos endófitos fermentados em 400 mL
Folha Massa obtida (mg) Caule Massa obtida (mg) Fruto Massa obtida (mg)
Ej-f1 29,7 Ej-c1 21,0 Ej-fm1 87,8
Ej-f2 25,5 Ej-c2 28,6 Ej-fv1 60,5
Ej-f3 20,8 Ej-c3 78,2 Ej-fv2 32,5
Ej-c4 27,9 Ej-fv3 67,4
Ej-fv4 36,7
Ej-fv5 40,1
79
4.4 Análise química
4.4.1 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)
A CCDC dos extratos brutos foi realizada em placas de sílica gel utilizando
como eluente uma mistura de Hex:AcOEt (3:7 v/v) e revelada com anisaldeído (Figura
21). É possível observar nos extratos brutos de cada fungo uma diversa produção de
substâncias, possivelmente de classes diferentes, por apresentar distintas colorações
após revelação com anisaldeído. As substâncias presentes na placa de sílica Figura
21c foram reveladas com lâmpada de UV em  = 366 nm.
Figura 21:CCDC dos extratos brutos obtidos dos fungos
Legenda
1- Ej-F1 Legenda:
2- Ej-F2 1 - Ej-fm1
3- Ej-F3 2 - Ej-fv1
4- Ej-c1 3 - Ej-fv2
5- Ej-c2 4 - Ej-fv3
6- Ej-c3 5 - Ej-fv4
7- Ej-c4 6 - Ej-fv5
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
(a) (b) (c)
4.4.2 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de

diodos (CLAE):
Os extratos brutos AcOEt foram submetidos a uma avaliação do perfil

cromatográfico por CLAE em gradiente exploratório, utilizando-se uma coluna
analítica de fase reversa C18.
Todos os cromatogramas obtidos foram comparados com o branco (meio de
cultivo sem inoculação de fungo) e não apresentaram picos com o mesmo tempo de
retenção, evidenciando que os picos observados nos cromatogramas são
provenientes da produção metabólica dos fungos.
80
Na Figura 22 estão ilustrados os cromatogramas em  = 254 nm dos extratos

brutos obtidos dos fungos isolados das folhas de E. jambolana.
Comparando-se os perfis cromatográficos, observa-se uma semelhança no
perfil dos fungos Ej-f1 e Ej-f2. Os cromatogramas apresentaram picos com o mesmo
tempo de retenção, e os espectros de UV (Figura 23 e Figura 24) indicaram que
poderiam se tratar das mesmas substâncias. O fungo Ej-f3 apresentou um perfil
diferenciado, em comparação com os demais, no cromatograma é possível identificar
diferentes picos com variados tempos de retenção, sugerindo uma vasta produção de
metabólitos secundários que apresentam absorção no ultravioleta.
Alguns picos dos cromatogramas foram selecionados e os espectros de
absorção no ultravioleta (UV) estão ilustrados na Figura 23-Figura 25.
Figura 22: Cromatogramas dos extratos bruto dos fungos endofíticos isolados das folhas
81
Figura 23: Espectro de absorção na região do UV para: pico a (a) pico b (b) e pico c (c) do
cromatograma do fungo Ej-f1 (Figura 22)
Figura 24: Espectro de absorção na região do UV para: pico a (a) e pico b (b) do
Figura 25: Espectro de absorção na região do UV para: o pico d (a) e pico e (b) do
Diferentes máximos de absorção são observados nos espectros de UV, isso

sugere a existência de diferentes classes de compostos químicos, demonstrando uma
vasta produção de metabólitos secundários pelos fungos.
82

brutos obtidos dos fungos isolados dos caules de E. jambolana.
Os fungos isolados do caule apresentaram um perfil diversificado. Em todos os
cromatogramas foi possível constatar diferentes picos com diferentes tempos de
retenção, sugerindo uma produção variada de metabólitos secundários que
apresentam absorção no ultravioleta.
Figura 26: Cromatogramas dos extratos bruto dos fungos endofíticos isolados dos caules
83
O fungo Ej-c3 apresentou substâncias de media a baixa polaridade e alguns

picos foram selecionados e os espectros de absorção no ultravioleta estão indicados
abaixo.
Figura 27: Espectros de absorção na região do UV para o pico f (a), pico g (b) do extrato
bruto do fungo Ej-c3

brutos obtidos dos fungos isolados dos frutos de E. jambolana.
Os cromatogramas apresentaram picos com tempo de retenção em uma ampla
faixa, o que evidencia a presença de substâncias que absorvem no UV de média a
baixa polaridade.
Comparando-se os perfis cromatográficos dos extratos brutos dos fungos Ej-
fv4 e Ej-fv5, observou-se picos com o mesmo tempo de retenção, de média
polaridade.
84
Figura 28: Cromatogramas dos extratos produzidos pelos fungos isolados do fruto de E.
jambolana.
85
4.4.3 Ressonância magnética nuclear de 1H:
Todos os extratos brutos AcOEt obtidos foram submetidos a análise de RMN

de 1H, com o objetivo de obter indícios sobre a natureza química dos hidrogênios
presentes nos metabólitos produzidos por cada fungo endofítico. Os espectros obtidos
estão ilustrados nas figuras abaixo (Figuras 29-41).
4.4.3.1 Extrato bruto obtido do fungo Ej-f1 e Ej-f2
Foram observados sinais no espectro de RMN de 1H dos extratos brutos dos

fungos Ej-f1 e Ej-f2 (Figura 29 e Figura 30) em uma ampla faixa espectral, como
sinais de hidrogênios aromáticos (H 6,0-7,5 ppm), olefínicos (H 4,5-6,0 ppm),
carbinólicos (H 3,5-4,5 ppm), metilênicos e metílicos (H 0,8-3,0 ppm). Como
observado para o perfil cromatográfico (Figura 22), os espectros de RMN de 1H do
extrato bruto dos fungos Ej-f1 (29,7 mg) e Ej-f2 (25,5 mg) mostraram-se muito
similares, evidenciando se tratar de fungos da mesma espécie ou do mesmo gênero.
Figura 29:Espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-f1 (CDCl3, 500 MHz)
86
4.4.3.2 Extrato bruto obtido do fungo Ej-f3
O espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-f3 (20,8 mg) (Figura

31), apresentou sinais em uma ampla faixa espectral (H 0,6 a 8,0 ppm). Observou-se
a produção majoritária de uma substância, que ao comparar os valores dos
deslocamentos químicos em H 3,02 (t, J = 6,5 Hz) e H 4,63 ppm (t, J = 6,5 Hz) com
a literatura (CHOMCHEM et al., 2005; CHAPLA, 2010) foi possível identificá-la como
o ácido nitropropiônico (1). O extrato bruto foi submetido a espectrometria de massa
de alta resolução em injeção direta (ESI (-)), sendo detectado o íon molecular em m/z
118,0148 [M-H+] correspondente a formula molecular C3H5O4N.
Este metabólito já foi isolado por membros do nosso grupo de pesquisa, dos
fungos endofíticos Phomopsis sp. associado a espécie vegetal Senna spectabilis e
87
Phomopsis stipata associado a espécie vegetal Michelia champaca (CHAPLA, 2010;

LEPTOKARYDIS, 2008), também já foi isolado de Phomopsis sp. associado as
espécies vegetais Urobotrya siamensis e a Mesua ferrea, tendo apresentado alta
atividade antimicobacteriana contra Mycobacterium tuberculosis (CHOMCHEON et
al., 2005; ELSASSER et al., 2005). Há relatos de sua ocorrência também em plantas
(CHOMCHEM et al., 2005). Schwarz et al. (2004) relataram que este metabólito possui
propriedades nematicidas, pois apresentou atividade contra o parasita nematóide
Meloidogyne incognita com valores de DL50 de 12,5-15,0 μg mL-1, e atividade contra
o saprófita Caenorhabditis elegans, sendo esta cinco vezes menor.
O ácido nitropropiônico (3-NP) é conhecido como um potente agente
neurotóxico, atua inibindo o metabolismo oxidativo mitocondrial, com isso o 3-NP tem
sido amplamente utilizado como um modelo experimental na doença de Huntington,
bem como em modelos para estudos do metabolismo e da morte celular in vivo e in
vitro (BROWNELL et al., 2004).
88
4.4.3.3 Extrato bruto obtido do fungo Ej-c1
No espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-c1 (Figura 32) foi

possível observar sinais característicos de hidrogênios aromáticos ( H 6,7-7,7 ppm),
hidrogênios carbinólicos (H 3,5- 4,5 ppm), hidrogênios metílicos e metilênicos (H 0,7-
2,7 ppm).
No espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-c1 (21,0 mg) foi
observado a presença de sinais característicos de triglicerídeos (2), em
aproximadamente H 1,20 ppm, característicos dos hidrogênios metilênicos de cadeia
alquílica longa, e os sinais em H 5,27 ppm, referente aos hidrogênios olefinicos.
H O
CH3
H O O n n
CH3
H O O
n n
CH3
H O n n
H
A produção dessas substâncias é bastante interessante Alguns triglicerídeos já

foram isolados por membros do nosso grupo de pesquisa e apresentam atividade
biológica contra a micobactéria Mycobacterium tuberculosis. Estudos realizados por
Guimarães (2006) revelam a alta atividade antitumoral de extratos de fungos
endofíticos ricos em ácidos graxos e triglicerídeos.
Atualmente tem se procurado fungos que possuem a capacidade de produzir
triglicerídeos. Esses fungos são denominados de oleaginosos, e têm sido utilizados
como matéria prima na produção de biodiesel. Pesquisas utilizando micro-organismos
para geração de energia têm sido desenvolvidas pela fácil manipulação, baixo custo
e a utilização de matéria prima não comestível, tornando a produção de biodiesel
sustentável (MENG et al., 2009).
89
Figura 32: Espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-c1 (CDCl3, 500 MHz)
4.4.3.4 Extratos brutos obtidos dos fungos Ej-c2 Ej-c-3 e Ej-c4
Os espectros de RMN de 1H dos extratos brutos dos fungos Ej-c2 (28,6 mg),
Ej-c3 (78,2 mg) e Ej-c4 (27,9 mg) (Figura 3433-35) apresentaram uma vasta produção
de metabólitos secundários, pois foi possível visualizar sinais em uma ampla faixa
espectral (H 0,5 a 11,0 ppm); diversos sinais de hidrogênios aromáticos, olefínicos,
carbinólicos, metilênicos e metílicos, evidenciando a produção de constituintes
químicos interessantes. No espectro do extrato bruto do fungo Ej-c4 foi possível
identificar sinais característicos de triglicerídeos como observado no espectro de RMN
de 1H do extrato bruto do fungo Ej-c1
90
91
Figura 35: Espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-c4 (CDCl3, 500MHz)
4.4.3.5 Extrato bruto obtido do fungo Ej-fm1, Fj-fv1 e Ej-fv2
Os espectros de RMN de 1H dos extratos brutos obtidos dos fungos dos frutos
Ej-fm1 (87,8 mg), Ej-fv1 (60,5 mg) e Ej-fv2 (32,5 mg) (Figura 36 - 38) apresentaram
sinais de hidrogênio na região dos aromáticos (H 6,0-8,6 ppm), sinais de hidrogênios
carbinólicos (H 3,0-4,5 ppm), metilênicos (H 1,2-3,0 ppm) e metílicos (H 0,5-1,2
ppm). Foi observado sinais por toda largura espectral sugerindo substâncias de alta
complexidade estrutural ou então várias substâncias de várias classes estruturais. O
espectro de RMN de 1H do extrato bruto obtido do fungo Ej-fv1 (Figura 37) apresentou
sinais de hidrogênios desblindados (10,5-13,0 ppm), sugerindo substâncias
aromáticas com hidroxilas fenólicas que fazem ligação de hidrogênio com carbonilas
vizinhas.
No espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-fv2 (Figura 38),
observou-se a produção majoritária de uma substância, que ao comparar os valores
dos deslocamentos químicos em 2,96 (t, J = 5,0Hz) e 4,78 ppm (t, J = 5,0Hz) com a
92
literatura (CHOMCHEM et al., 2005; CHAPLA, 2010) foi possível identificá-la como o
ácido nitropropiônico (1). O extrato bruto foi submetido a espectrometria de massa de
alta resolução em injeção direta, onde foi detectado o íon molecular em m/z 118,0180
[M-H+] correspondente a formula molecular C3H5O4N. Este metabólito foi identificado
no extrato bruto do fungo codificado como Ej-f3 isolado das folhas de E. jambolana.
Figura 36: Espectro de RMN de 1H do extrato do fungo Ej-fm1 em DMSO-d6 (500 MHz)
93
Figura 37: Espectro de RMN de 1H do extrato do fungo Ej-fv1 em DMSO-d6 (500MHz)
Figura 38: Espectro de RMN de 1H do extrato do fungo Ej-fv2 em DMSO-d6 (500 MHz)
94
4.4.3.6 Extrato bruto obtido do fungo Ej-fv3
O espectro de RMN de 1H do extrato bruto do fungo Ej-fv3 (67,4 mg) (Figura

39) apresentou sinais característicos de hidrogênios aromáticos ( H 6,5-8,5 ppm),
carbinólicos (H 2,8-4,8 ppm) metilênicos e metílicos (H 0,6-2,6 ppm). Observou-se a
produção majoritária de uma substância, e decidiu-se determinar a sua estrutura em
mistura, realizando-se os experimentos bidimensionais (HMBC, HMQC e COSY).
O espectro de RMN de 1H apresentou sinais de hidrogênios aromáticos em H

7,49 (t, J = 8,5 Hz,1H, H-6), em H 6,86 ppm (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-7) e H 6,81 ppm (d,
J = 8,5 Hz, 1H, H-5), evidenciando um anel aromático trissubstituído, um sinal em H
4,79 (m, 1H, H-3), característico de hidrogênio carbinólico, e um sinal intenso em H
1,41 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H-9), característico de uma metila, com esses dados foi
possível sugerir que esta substância possivelmente pertencente a classe das
isocumarinas.
95
O espectro de HMQC apresentou correlação direta dos hidrogênios aromáticos

H-5, H-6 e H-7 com os carbonos em C 114,8, 135,7, 117,8, respectivamente. O H-3
apresentou correlação direta com o carbono em C 76,4. O H-9 apresentou correlação
direta com o carbono em C 19,5 (Tabela 2).
No experimento de HMBC foi possível observar a correlação do H-6 com o C-
8/C4a e a correlação do H-5 com o C7/C8a, confirmando a posição dos carbonos C-
4a/C-8a com deslocamentos característicos de isocumarinas.
No experimento de COSY foi possível observar as interações 1H-1H do H-3 com
H-4 (H 3,10, dd, J = 16,5 e 3,5 Hz, 1H, H-4; e H 2,99, dd, J = 16,5 e 11,0 Hz, 1H, H-
4), permitindo estabelecer o grupo benzílico para a substância 3. Esta observação foi
confirmada, através das correlações observadas em HMBC de H-9 com C3/C4 e H-5
com C-4.
A configuração relativa do C-3 não foi proposta considerando que a substância
está em mistura.
Estas informações comparadas aos dados da literatura (OLIVEIRA, 2009)
sugerem a estrutura da meleina para a substância 3.
OH O
8
7 1 O
3 H
6 4a
5 4 CH3
A meleina pertence à classe das isocumarinas, já foi relatada de diferentes

fungos endofíticos como Prumnopitys andina (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al., 2005)
Plectophomella sp., Pezicula lívida, Cryptosporiopsis malicorticis (KROHN et al. 1997)
e Botryosphaeria rhodina (RUKACHAISIRIKUL et al. 2009). Possui diversas
atividades biológicas associadas como citotóxica (CHENG et al., 2012),
antibacteriana, fitotóxica, atividade contra protease do vírus da hepatite C
(SCHMEDA-HIRSCHMANN et al., 2005) e antifúngica (ZHAO et al., 2012).
96
Tabela 2: Dados de RMN de 1H e 13C para a substância 3 (DMSO-d6)

H (J em Hz) C
1 - -
3 4,79 (m) 76,4
4 3,10 (dd, 16,5 e 3,5) 32,8
2,99 (dd, 16,5 e 11,0)
4a - 140,7
5 6,81 (d, 8,0) 114,8
6 7,49 (t, 8,0) 135,7
7 6,86 (d, 8,0) 117,8
8 - 161,3
8a - 108,5
9 1,41 (d, 6,5) 19,5
4.4.3.7 Extrato bruto obtido do fungo Ej-fv4 e Ej-fv5
Os espectros de RMN de 1H dos extratos brutos dos fungos Ej-fv4 (36,7 mg)
(Figura 40) e Ej-fv5 (40,1 mg) (Figura 41), apresentaram sinais característicos de
hidrogênios aromáticos (H 6,0-8,5 ppm), carbinólicos (H 3,0-4,8 ppm), metilênicos e
metílicos (H 0,6-2,4 ppm). É importante salientar a riqueza de sinais na região de
aromáticos que se estendem pela região de 6,2 a 8,5 ppm. Os sinais na região de H
8,5 ppm, fortemente sugerem a presença de grupos retirados de densidade eletrônica
no anel aromático. Como observado para o perfil cromatográfico (Figura 28) os
espectros de RMN de 1H do extrato bruto dos fungos Ej-fv4 e Ej-fv5 mostraram-se
similares evidenciando se tratar de fungos da mesma espécie ou do mesmo gênero.
97
Figura 41: Espectro de RMN de 1H do extrato do fungo Ej-fv5 em DMSO-d6 (500MHz)

98
4.5 Triagem Biológica
O estudo fitoquímico bioguiado fornece uma ferramenta que pode ser usada
para testar a atividade alvo em uma amostra específica. Bioensaios em um
“screening” devem ser rápidos, simples, capazes de serem automatizados, de baixo
custo e produzir alta rentabilidade (SPAINHOUR, 2005).
4.5.1 Ensaio citotoxico
Câncer é uma doença que afeta milhares de pessoas em todo o mundo,

estimativas sugerem que esta doença matou cerca de 7,6 milhões de pessoas ao
redor do mundo, e este número pode chegar a 17,5 milhões até 2050. É um grupo de
doença que afeta diversos órgãos do corpo humano, e é caracterizado pelo
crescimento descontrolado de células anormais e invasão em tecidos saudáveis. As
células cancerígenas podem também se espalhar para outras partes do corpo e
produzir novos tumores. O tratamento de câncer ainda é limitado para diversos tipos
da doença, e a presença de diversos tumores resistentes a drogas existentes é um
problema para a eficiência do tratamento (KHARWAR et al., 2011).
A procura por produtos naturais com potencial anticâncer tem levado à
descoberta e desenvolvimento de diversos fármacos anticancerígenos (como, a
vimblastina, vincristina, taxol, camptotecina, etc.), a descoberta de novas drogas
anticancerígenas pode ser um dos principais objetivos dos produtos naturais e
química medicinal para auxiliar no tratamento da doença (CHANDRA, 2012).
A atividade citotóxica de todas as amostras está apresentada na Tabela 3 com
seus respectivos percentuais de inibição. Somente os extratos que apresentaram
valores de inibição ≥ 75% em pelo menos duas linhagens tumorais são considerados
ativos, valor esse considerado como cut-off para o screening de novas substâncias
com potencial antitumoral.
99
Tabela 3: Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três

linhagens tumorais testadas na dose única de 50 µg mL-1 Valores são média ± DPM.
Amostra HCT-8 SD MDAMB-435 SD SF-295 SD

GI% (media) GI% (media) GI% (media)
Ej-f1 20,49% 8,53% 15,49% 13,63% 7,47% 7,98%
Ej-f2 19,01% 7,30% 23,35% 1,79% 9,25% 18,85%
Ej-f3 76,10% 1,53% 59,01% 3,47% 69,70% 0,64%
Ej-c1 14,24% 8,90% 23,01% 3,94% -1,35% 27,15%
Ej-c2 12,68% 8,65% 22,08% 1,67% 5,93% 1,80%
Ej-c3 100,74% 0,18% 99,75% 0,12% 98,82% 0,00%
Ej-c4 11,38% 6,81% 23,43% 5,02% 5,38% 4,50%
Amostra HCT-8 SD OVCAR GI% SD SF-295 SD
GI% (media) (media) GI% (media)
Ej-fm1 99,14% 0,36% 88,60% 8,57% 75,03% 2,88%
Ej-fv1 10,75% 8,73% 9,98% 1,23% 3,82% 2,56%
Ej-fv2 22,79% 4,18% 13,62% 3,78% 20,09% 0,83%
Ej-fv3 1,83% 16,49% 2,14% 2,69% 7,97% 0,38%
Ej-fv4 6,21% 1,33% 8,87% 9,73% 8,78% 22,44%
Ej-fv5 11,67% 14,25% 4,97% 8,86% 7,74% 3,40%
Na avaliação da atividade antitumoral observa-se (Tabela 3) que os fungos

codificados como Ej-c3 e Ej-fm1 apresentaram forte inibição do crescimento das
linhagens testadas, evidenciando a produção de substâncias citotóxicas.
4.5.2 Ensaio anticolinesterásico
Os fármacos atualmente utilizados no tratamento do mal de Alzheimer ou

doença de Alzheimer, que é uma doença neurodegenerativa progressiva do sistema
nervoso central, são principalmente inibidores da enzima acetilcolinesterase (AChE),
por apresentarem melhores resultados no controle da doença (VIEGAS JUNIOR et
al., 2004). Alguns exemplos desses fármacos são a tacrina, fisistigmina e a
galantamina, que é de origem natural (CARDOSO, 2003). A galantamina tem sido
usada como protótipo para o desenvolvimento de drogas inibidoras de AChE. A
possibilidade de explorar distintos modos de ação tem estimulado estudos
fitoquímicos visando a obtenção de novos modelos, com isso, várias espécies tem
sido investigadas como fontes de inibidores de AChE (VIEGAS JUNIOR et al., 2005).
100
A avaliação da atividade anticolinesterásica em potencial dos extratos brutos foi

realizada segundo a metodologia de Marston, Kissling e Hostettmann (2002) por
cromatoplaca. Após a eluição dos extratos e o borrifamento das soluções, a coloração
roxa aparece em aproximadamente 2 minutos. O aparecimento de manchas brancas
(indicação de inibição da reação enzimática) em alguns extratos, sobre o fundo de
coloração roxa, indica a inibição da enzima acetilcolinesterase.
Este ensaio é qualitativo e é definido através do halo branco em fundo roxo,
para atividade inibitória positiva. De acordo com o observado na Tabela 4
praticamente todos os extratos apresentaram atividade positiva neste ensaio, apenas
o extrato do fungo Ej-f3 não apresentarou resultado positivo. Este resultado evidencia
a potencialidade dos fungos endofíticos na produção de metabólitos com potencial
anticolinesterásico.
Tabela 4: Fator de Retenção das substâncias que apresentaram inibição da enzima

acetilcolinesterase (sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7)
Extratos brutos RF
Ej-f1 0,6
Ej-f2 0,8
Ej-f3 -
Ej-c1 0,8 / 0,4 / 0,4 / 0,1
Ej-c2 0,8 / 0,4 / 0,1
Ej-c3 0,6
Ej-c4 0,8 / 0,4 / 0,1
Ej-fm1 0,0
Ej-fv1 0,0
Ej-fv2 0,0
Ej-fv3 0,0
Ej-fv4 0,0
Ej-fv5 0,3 / 0,0
Fisostigmina 0,3
101
4.5.3 Ensaio antifúngico
A atividade antifúngica foi determinada por bioautografia pela nebulização dos

fungos C. cladosporioides e C. sphaerospermum. Após a revelação da cromatoplaca
(contendo os extratos) com a solução fúngica, foi observada a inibição do crescimento
dos fungos em vários extratos, indicando a atividade antifúngica potencial. O padrão
utilizado para comparação foi a nistatina (5 μg). Os resultados obtidos deste bioensaio
estão presentes na Tabela 5 e Figura 42.
Tabela 5: Fator de Retenção das substâncias que apresentaram inibição no crescimento

dos fungos fitopatógenos (sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7)
Amostras C. cladosporioides C. sphaerospermum
Ej-f1 * 0,0/0,6
Ej-f2 * 0,6
Ej-f3 * rastro
Ej-c2 * 0,2
Ej-c3 * 0,6
Ej-c4 * -
Ej-fm1 0,4/ 0,2/ 0,0 0,4 / 0,2 / 0,1
Ej-fv1 0,4 / 0,2/ 0,1 0,4 / 0,2 / 0,3
Ej-fv2 0,1 0,1/ 0,05
Ej-fv3 0,258 / 0,094 0,3
Ej-fv4 0,3/ 0,2/ 0,05 0,2 / 0,05
Ej-fv5 0,3 / 0,2 / 0,05 0,2 / 0,05
*não testados
Os resultados da avaliação deste bioensaio evidenciaram que os extratos

brutos são potencialmente antifúngicos, somente o Ej-c4 não apresentou atividade
positiva. Os extratos presentaram inibição do crescimento dos testados.
102
Figura 42: Placas de CCDC obtida no ensaio antifúngico para os extratos obtidos dos
fungos endofíticos (sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7)
Legenda:
1 - Ej-fm1
2 - Ej-fv1
3 - Ej-fv2
4 - Ej-fv3
5 - Ej-fv4
6 - Ej-fv5
P – nistatina (5µg)
Esses dados podem estar diretamente relacionados à ecologia química do

fungo, onde os micro-organismos endofíticos produzem substâncias bioativas para
autodefesa contra micro-organismos fitopatógenos. Deste modo, os fungos
associados a espécies vegetais são promissoras fontes na busca por novos
metabólitos secundários com atividade antifúngica.
4.5.4 Ensaio antioxidante
A propriedade antioxidante está relacionada com as atividades anti-

inflamatórias e quimiopreventivas, e estas são necessárias para proteger o organismo
contra as doenças provocadas pelo estresse oxidativo. O estresse oxidativo é o maior
causador de isquemia cerebral, pois o cérebro consome grande quantidade de
oxigênio. A geração de radicais livres de maneira desordenada no corpo humano
provoca danos oxidativos em macromoléculas biológicas como lipídeos, proteínas e
DNA, alterando suas propriedades, estruturas, funções das membranas celulares e
do material genético. Os danos causados por radicais livres estão ligados a doenças
neurodegenerativas e ao câncer. A oxidação das lipoproteínas de baixa densidade
(LDL) é a principal causa de doenças do coração e arteriosclerose (SHIN; PARK; KIM
2006).
103
As propriedades antioxidantes das substâncias estão relacionadas a vários

mecanismos de ação, incluindo a captura de radicais livres e a inibição da geração de
espécies reativas durante o metabolismo celular (ZHANG et al., 2008).
Ensaios rápidos e baratos utilizando β-caroteno e DPPH foram desenvolvidos
no intuito de detectar a presença de substâncias potencialmente antioxidantes em
extratos brutos.
A avaliação qualitativa dos extratos por cromatoplaca em sílica gel, revelada
com solução metanólica do radical DPPH (0,2%), demonstrou para os extratos a
existência de substâncias com atividade antioxidante, evidenciadas pela presença de
manchas amarelas sobre fundo púrpuro, resultantes da redução do radical DPPH. Os
resultados obtidos estão demonstrados na Tabela 6. Apenas o extrato do fungo Ej-
fv1 não apresentou substâncias com potencial antioxidante.
Tabela 6: Tempo de Retenção das substâncias que apresentaram potencial antioxidante

(sílica gel – eluente Hex:AcOEt 3:7)
Extratos brutos RF
Ej-f1 0,9/0,8/0,6/0,0
Ej-f2 0,9/0,8/0,6/0,0
Ej-f3 0,8/0,6/0,0
Ej-c1 0,9
Ej-c2 0,9
Ej-c3 0,9/0,8
Ej-c4 0,9/0,8
Ej-fm1 0,9/0,8/0,6/0,0
Ej-fv1 -
Ej-fv2 0,9/0,9/0,8/0,3/0,0
Ej-fv3 0,9/0,8/0,0
Ej-fv4 0,9
Ej-fv5 0,9
A triagem química e biológica realizada para os fungos endofíticos isolados de

E. jambonala apresentaram resultados bastante satisfatórios. Após avaliação da
potencialidade biológica e o perfil químico de cada extrato produzido pelos fungos, foi
104
possível selecionar dois fungos para cultivo em escala ampliada e isolamento dos
metabólitos produzidos por estes. Com os resultados obtidos os fungos identificados
como Saccharicola sp. (Ej-c3) e Botryosphaeria parva (Ej-f1) foram selecionados para
o estudo químico. Em uma revisão na literatura (SciFinder e Web of Science) sobre
essas espécies notou-se que não há relatos do estudo químico das mesmas.
105

Saccharicola sp.
O fungo Saccharicola sp. foi submetido a crescimento em escala ampliada para

isolamento e caracterização dos metabólitos secundários produzidos por este. Após
a obtenção do extrato bruto este foi fracionado utilizando técnicas cromatográficas
adequadas, e em seguida submetido a separação cromatográfica utilizando CLAE
preparativo. Após análise prévia de RMN de 1H das frações coletadas foi possível
identificar e determinar a estrutura de sete substâncias.
4.6.1 Determinação estrutural da substância 4
H3C CH3
16 15
14
13
12
O
1
OH
6 2
5 3
4
HO 10
7
9
8 OH
HO CH3
11
A substância 4 foi isolada como um sólido branco, com fórmula molecular

C16H22O5 determinada por espectrometria de massa de alta resolução (ESI (+)
[317,1317 [M+Na]+, 333,1088 [M+K]+) e RMN de 13C. O espectro na região do
Infravermelho (IV) apresentou bandas de absorção em 3300 cm-1 sugerindo a
presença de hidroxila (-OH), em 2259 e 2130 cm-1 sugerindo a presença de tripla
ligação conjugada, e em 1644 cm-1 sugerindo a presença de dupla ligação. O espectro
de UV apresentou valores de máximos de absorção de ligação dupla e tripla
conjugada.
O espectro de RMN de 1H (Figura 43) da substância 4 apresentou três simpletos
referentes às metilas H 1,59 (H-15), H 1,70 (H-16) e H 1,30 (H-11) sendo duas sobre
106
carbono sp2 e uma sobre carbono carbinólico, cinco hidrogênios carbinólicos H 3,11
(s, 1H, H-6), H 4,44 (sl, 1H, H-5), H 3,90 (d, J = 7,5Hz, 1H, H-2), H 3,30 (m, 2H, H-
10), e dois hidrogênios metínicos de carbono sp2 em H 5,10 (dt, J = 1,6 e 8,0Hz, H-
13) e H 5,57 (sl, H-4).
O espectro de RMN de 13C (Figura 86, pág. 189) com auxílio de experimento de
HMQC (Figura 87, pág. 190) evidenciou seis carbonos carbinólicos sendo atribuídos
a três carbonos metínicos (C 58,7; 64,3 e 67,2), um metilênico (C 69,6) e dois
quaternários (C 61,2; 67,6), sendo que os observados em C 61,2 e 58,7 foram
atribuídos aos carbonos carbinólicos de um epóxido.
Figura 43: Espectro de RMN de 1H da substância 4 (DMSO-d6, 500 MHz)
Com auxílio do experimento de HMQC foi possível atribuir todos os átomos de

hidrogênios aos respectivos carbonos (Tabela 7, pág. 110).
Na análise dos mapas de correlação no experimento de HMBC (Figura 48,
Anexo Figura 88, pág. 193), foram observadas as correlações dos hidrogênios H-16
e H-15↔C-13/C-14, de H-13↔C-15/C-16 e de H-12↔C-1/C-13/C-14 evidenciando
uma unidade prenila como mostrado na estrutura parcial A (Figura 44).
107
Adicionalmente, foram observados um tripleto em H 4,84, um simpleto em H

5,16, dois dupletos em H 5,28 e H 5,36, sem correlação no experimento de HMQC
sendo atribuídos aos hidrogênios ligados ao oxigênio nas hidroxilas OH 10, OH9, OH5
e OH2, respectivamente.
Figura 44: Estrutura parcial A da substância 4
H3C CH3
Os valores de deslocamentos químicos em C 82,5 e C 92,3 associados à

ausência de hidrogênio, como visualizado no experimento de HMQC, associados aos
dados de IV, evidenciaram a presença de uma ligação tripla. Correlações observadas
em HMBC de H-11↔C-8/C-10, associado aos valores de deslocamento químico de
carbono e hidrogênio e as respectivas multiplicidades permitiram propor a estrutura
parcial B (Figura 45).
Figura 45: Estrutura parcial B da substância 4
OH
HO CH3
Analise do experimento de COSY (Figura 89, pág. 194) evidenciou um sistema

de spins entre H-5 e H-4 e entre o hidrogênio H-2 com a hidroxila 2-OH, o que
associado com as correlações observadas em HMBC de H-2↔C-1/C-6/C-4, H-4↔C-
2, juntamente com os valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1H e 13C nos
permitiram propor a estrutura parcial C (Figura 46).
108
Figura 46: Estrutura parcial C da substância 4
HO H
O
1 2 3 4 5
6
H OH H
H
A junção de C-6 e C-5 foi realizada com base nas correlações observadas em
HMBC de H-6↔C-4, e da interação observada em COSY de H-5↔H-6 dando origem
a estrutura parcial D (Figura 47).
Figura 47: Estrutura parcial D da substância 4
O
OH
H
H
HO
H
H
A cadeia lateral insaturada constituída por 5 carbonos pode ser conectada ao

C-3 do anel cicloexeno, devido a presença das correlações observadas no espectros
de HMBC (Figura 47) para os hidrogênios H-4 (H 5,57) e H-2 (H 3,90) com o carbono
em C-7 (C 82,5). A unidade prenila foi conectada a posição C-1 do anel cicloexeno,
devido a presença da correlação em HMBC dos H-12 com o C-1 e C-2, sendo possível
determinar a estrutura completa da substância 4.
109
Figura 48: Principais correlações observadas no espectro de HMBC para 4
H3C CH3
O H
H OH
HO
H OH
HO CH3
A configuração relativa da substância 4 foi determinada com base nos

experimentos de NOESY 1D (Figura 49 e 50), onde observou-se que a irradiação dos
sinais em H 2,18 (H-12a) e H 2,80 (H-12b) intensificaram por NOE os sinais em H
3,90 (H-2) e H 3,11 (H-6). A irradiação do sinal em H 5,10 (H-13) intensificou por NOE
os sinais em 3,90; 3,11 e 1,58 (H-16). A irradiação do sinal em H 3,11 intensificou por
NOE o sinal em 4,44 (H-5).
Figura 49: Correlações observadas em NOE para a substância 4
HO
O
H
HO H
H R
110
Figura 50: Configuração relativa proposta para a substância 4
H3C CH3
O
OH
HO
OH
HO CH3
Levantamento bibliográfico realizado (27/01/14) na Web of Science e Scinfinder

indicou tratar-se de uma substância inédita, pois não foram encontrados relatos dessa
substância na literatura.
Tabela 7: Valores de 1H e 13C para a substância 4 (DMSO-d6, 500 MHz)

Posição H (J em Hz) C
1 - 61,2
2 3,90 (d, 7,5) 67,2
3 - 121,3
4 5,57 (t, 2,5) 134,1
5 4,44 (sl) 64,3
6 3,11 (t, 2,5) 58,7
7 - 82,5
8 - 92,3
9 - 67,6
10 3,30 (m) 69,6
11 1,30 (s) 26,3
12 2,18 (dd, 7,5 e 15,0) 29,4
2,80 (dd, 7,5 e 15,0)
13 5,10 (dt, 1,5 e 8,0) 118,2
14 - 134,2
15 1,70 (s) 25,7
16 1,59 (s) 18,7
111
H3C CH3
16 15
13
O
OH
1
5 3
HO 10
7
8 OH
H CH3
11
A substância 5 foi isolada como um sólido branco, com fórmula molecular

C16H22O4 foi determinada por espectrometria de massas de alta resolução (ESI (+)
[279,1541 [M + H]+, 301,1360 [M+Na]+, 317, 1122 [M+K]+) e RMN de 13C. Os espectros
de RMN de 5 (Tabela 8, Anexos Figura 92-97, pág. 196-201) mostraram-se similares
aos de 4, sendo que a principal diferença observada foi que a CH3-11 apresentou-se
com um dupleto com constante de acoplamento de 5,6 Hz. Adicionalmente, foi
observado um sexteto em H 2,58 (C 29,2) e a ausência do carbono carbinólico C-9
que passou de C 67,6 em 4 para C 29,2 em 5, confirmando a redução da hidroxila
em C-9.
A redução de C-9 foi confirmada pelas interações observadas no experimento
de COSY (Figura 96, pág. 200), com a visualização da correlação entre H-11↔ H-
9↔H-10 e em HMBC de H-11↔C-8/C-9/C-10.
Pela criteriosa análise dos experimentos de HMQC foi possível atribuir todos
os átomos de higrogênio aos respectivos carbonos (Tabela 8).
As correlações observadas no experimento de HMBC de 5 (Figura 51), nos
permitiram atribuir para 5 a estrutura planar seguinte.
112
Figura 51: Principais correlações observadas em HMBC para a substância 5 (500 MHz)
H3C CH3
O H
H OH
HO
H OH
H CH3
A configuração relativa foi determinada usando os dados obtidos dos espectros

de ROESY e RMN de 1H. O sinal em H 5,12 (H-13) apresentou correlação com o H-
2 e H-6, o H-5 apresentou correlação com o H-2, H-4 e H-6, indicando que o H-2, H-
5, H-6 e H-13 possuem a mesma orientação espacial na molécula (Figura 52 e 53).
Levantamento bibliográfico realizado Web of Science e Scinfinder (27/01/12)
indicou tratar-se de uma substância inédita.
Figura 52: Correlações observadas em ROESY para a substância 5
HO
O
H
HO H
H R
113
Figura 53: Configuração relativa proposta para 5
H3C CH3
O
OH
HO
OH
H CH3
Tabela 8: Valores de 1H e 13C para a substância 5 (DMSO-d6, 500 e 125 MHz)

1 - 61,3
2 3,88 (d, 6,0) 67,4
3 - 121,6
4 5,52 (t, 2.0) 133,4
5 4,43 (sl) 64,3
6 3,10 (m) 58,7
7 - 81,5
8 - 92,2
9 2,58 (sexteto, 6,5) 29,2
10 3,25 (m) 65,4
3,44 (m)
11 1,08 (d, 6,5) 17,4
12 2,18 (m) 29,4
2,67 (dd, 7,0 e 13,0)
13 5,12 (dt, 7,0 e 1,5) 118,2
14 - 134,0
15 1,57 (s) 25,6
16 1,68 (s) 17,8
114
4.6.3 Determinação estrutura da substância 6
H3C CH3
16 15
13
12
HO
OH
1
5 3
O 10
7
8 OH
H CH3
11
A substância 6 foi isolada como um sólido de coloração amarelada e a fórmula

molecular C16H22O4 foi determinada por espectrometria de massas de alta resolução
(ESI (+) [279,1541 [M + H]+, 301,1360 [M+Na]+, 317, 1122 [M+K]+) e RMN de 13C. O
espectro de RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais (Tabela 9, Anexos Figura 92-97,
pág. 196-201) apresentaram sinais parecidos com os espectros da substância 5,
sugerindo se tratar de uma substância da mesma classe.
As principais diferenças observadas entre as substâncias 5 e 6 foram:
- presença de uma carbonila em c 197,3 e ausência do carbono carbinólico em
c 64,3, sugerindo a oxidação de C-5;
- a ausência de um carbono carbinólico c 58,7 (atribuído a epóxido) associado
ao aparecimento de um metileno em c 44,2 sugerindo a abertura do epóxido entre C-
1 e C-6;
- a variação de deslocamento químico de C-1 em 5 de C 61,3 ppm para C 74,5
em 6 corrobora com a sugestão da abertura do epóxido entre C-1 e C-6.
- a presença de um dupleto em H 2,14 (J = 16,5 Hz) e outro sinal em H 2,50
encoberto pelo DMSO (visualizado em HMQC) corroborando a sugestão que C-5 foi
oxidado a cetona;
- a variação de deslocamento químico de C-8 em 5 de C 92,2 ppm para C
103,8 em 6 corroborando com a sugestão de que C-5 tenha sido oxidado para
carbonila;
- a variação de deslocamento químico de C-3 em 5 de C 121,6 ppm para C
142,5 em 6 sugerer a presença de uma dupla comjugada com uma cabonila.
115
Estas observações, associadas aos experimentos de HMBC (Figura 54) e

COSY, nos permitiram atribuir para a substância 6 a estrutura planar.
Levantamento bibliográfico realizado na Web of Science e Scinfinder (27/01/14)
indicou tratar-se de uma substância inédita.
Figura 54: Principais correlações observadas no experimento HMBC para a substância 6

H3C CH3
HO H
OH
H OH
H CH3
Tabela 9: Valores de 1H e 13C para a substância 6 (DMSO-d6, 500 MHz e 125 MHz)
1 - 74,5
2 3,71 (s) 72,0
3 - 142,5
4 5,92 (s) 130,7
5 - 197,3
6 2,20 (m) 44,2
2,50 (m)
7 - 81,4
8 - 103,8
9 2,58 (sest, 6,5) 29,7
10 3,36 (m) 64,9
3,48 (m)
11 1,14 (d, 6,5) 16,9
12 2,18 (m) 35,9
2,75 (dd, 6,5 e 13,5)
13 5,24 (m) 118,8
14 - 133,1
15 1,68 (s) 25,9
16 1,55 (s) 17,8
116
H3C CH3
16 15
13
12
O
OH
1
5 3
O 10
7
8 OH
HO CH3
11
A substância 7 foi isolada como um sólido de coloração amarelada, e a fórmula

molecular C16H20O5 foi determinada por espectrometria de massas de alta resolução
(ESI (+) [315,1162 [M+Na]+) e RMN de 13C. A substância 7 mostrou-se impura, no
entanto, devido a pequena massa obtida optamos pela determinção estrutural sem
uma melhor purificação.
Análise detalhada dos experimentos de RMN uni e bidimensionais de 7 (Tabela
10, Anexos Figura 99-101 pág. 203-205) evidenciaram muita semelhança com a
substância 4, sendo que as únicas diferenças observadas foram a ausência do
carbono carbinólico em C 64,3 ppm observado em 4 e o deslocamento químico de C-
8 em campo mais baixo, C 104,0 ppm, sugerindo que C-5 tenha sido oxidado a
carbonila, assim como em 6.
Apesar desta substância encontrar-se impura e em pequena quantidade, foi
possível atribuir a estrutura planar, principalmente, com base no espectro de massas
de alta resolução e da junção dos dados observados nos mapas de contorno dos
experimentos de HMQC e HMBC As principais correlações observadas no
experimento de HMBC (Figura 55).
Levantamento bibliográfico realizado na Web of Science e Scinfinder (20/12/13)
indica tratar-se de uma substância inédita.
117
Figura 55: Principais correlações observadas no experimento de HMBC para 7

H3C CH3
O H
OH
H OH
HO CH3
Tabela 10: Valores de 1H e 13C para a substância 7 (DMSO-d6, 500 MHz)

1 - 65,0
2 4,44 (d, 10,0) 68,0
3 - *
4 6,00 (d, 7,5) *
5 - *
6 3,60 (m) 58,1
7 - 81,9
8 - 104,0
9 - *
10 3,64 (m) 70,1
3,45 (m)
11 1,41 (s) 24,5
12 2,35 (dd, 15,0 e 8,0) *
2,84 (dd, 15,0 e 7,0)
13 5,13 (t, 7,0) 116,2
14 - 138,2
15 1,69 (s) 25,8
16 1,61 (s) 17,8
* carbonos não identificados
Os compostos 4-7 são inéditos e pertencem a classe dos cicloexanois

oxigenados, contendo epóxidos, esses compostos têm sido isolados de bactérias,
fungos, moluscos e plantas superiores. Estes têm estimulado diversos trabalhos de
118
síntese devido às atividades, antifúngica, antibacteriana, antitumoral e fitotóxica,

relatadas (JIANG et al., 2009; BARROS; MAYCOK; VENTURA, 2000). Jiang et al.
(2011) isolaram nove novos compostos cicloexanois oxigenados juntamente com mais
sete conhecidos da mesma classe. O composto Speciosin B (LXIII) apresentou
significativa atividade citotóxica contra diversas células tumorais com valores de IC50
entre 0,23-3,30 µM.
OH O
OH
LXIII
11
OH 9
10
12
4
5 3
8
6 2
1
7
HO O
A substância 8 foi isolada como uma sólido de coloração branca. O espectro

de massas, analisado por ESI-MS em modo negativo, apresentou o íon molecular em
m/z 201,67 [M-H]-, sendo possível atribuir à fórmula molecular C12H10O3, esta está
coerente com os dados obtidos de RMN de 13C. O espectro na região do Ultravioleta
apresentou bandas de absorção máxima de cromóforos conjugados.
O espectro de RMN de 1H, 13C e HMQC (Tabela 11, Figura 55 e Anexos Figura
103-105 pág. 207-209) da substância 8 apresentaram sinais referentes a hidrogênios
vinílicos (H 5,37, d, 1,5, 2H; C 125,2), uma metila (H 1,95, t, 1,5, 3H; C 22,5), três
hidrogênios aromáticos (H 6,96, 7,76, e 7,83; C 115,2; 131,0, 134,2), seis carbonos
119
quaternários, sendo uma tripla ligação (C 84,9 e 94,0), uma carbonila de ácido
carboxílico (C 166,5) e três carbonos aromáticos.
Os sinais característicos de hidrogênios aromáticos em H 6,96 (d, J = 8,5
Hz,1H, H-5), H 7,76 (dd, J = 8,5 e 2,5 Hz, 1H, H-6) e H 7,83 (d, J = 2,5 Hz, 1H, H-2)
indicaram a presença de um anel aromático trissubstituído. As constantes de
acoplamento e as correlações observadas no experimento COSY dos H-5↔H-6↔H-
2 sugerem substituição nas posições 1, 3 e 4 do anel aromático. A presença do
deslocamento químico C 161,1 sugere um substituinte –OH para a posição C-4 do
anel aromático. As correlações observadas em HMBC do H-5↔C-1/C-3 (C
121,5/110,0), do H-6↔C-7/C-2 (C 166,5/134,2) e do H-2↔C-7 (C 166,5), associado
aos valores de deslocamento químico tanto em hidrogênio como carbono treze,
permitiram posicionar o grupo carboxílico em C-1.
Os valores de deslocamento químico de C 84,9 e 94,0 indicam a presença de
uma tripla ligação nas posições C-8 e C-9. Essa posição foi confirmada pelas
correlações entre H-11↔C-9 (C 94,0), e de H-2↔C-8 (C 84,9).
O sinal em H 5,37 (d, J = 1,5 Hz, 2H, H-11) foi atribuído a uma ligação dupla
terminal, devido ao valor de deslocamento químico e da constante de acoplamento.
Com a correlação dos hidrogênios H-11↔H-12 observada no experimento COSY, e
as correlações observadas em HMBC do H-12↔C-10/C-11/C-9 (C 125,2/122,0/94,0)
foi possível atribuir a posição da metila ao C-12 (H 1,95, t, J = 1,5 Hz, 3H, H-12).
Deslocamento em H 1,95 é característico de grupo metila ligado a um carbono
quaternário hibridizado em sp2 de ligação dupla.
A cadeia lateral de 5 carbonos foi posicionada na posição 3 do anel aromático
devido a correlação observada em HMBC do H-2 com o C-8 (C 84,9).
Comparando-se os dados espectroscópicos com a literatura (ABRAHAM,
ARFMANN, 1990) foi possível identificar a substância 8 como sendo o ácido 4-hidroxi-
3-(3’-metil-3’-buten-1’-il) benzóico, que é conhecido também como ácido eutipine.
Essa substância foi relatada do fungo Eutypa lata (DEFRANQ; ZESIGER; TABACCHI,
1993) e do fungo Culvularia fallax (ABRAHAM; ARFMANN, 1990), e apresenta baixa
citotoxicidade contra linhagens fúngicas do gênero Fusarium (CHRISTEN et al., 2005).
120

H (J em Hz) C
1 - 121,5
2 7,83 (d, 2,5) 134,2
3 - 110,0
4 - 161,1
5 6,96 (d, 8,5), 115,2
6 7,76 (dd, 8,5 e 2,5) 131,0
7 - 166,5
8 - 84,9
9 - 94,0
10 - 125,2
11 5,37 (d, 1,5) 125,2
12 1,95 (t, 1,5) 22,5
121
11
OH
4 8 10
5
3 9 12
1
7
HO O
A substância 9 foi isolada como um sólido de coloração branca, com fórmula

molecular C12H14O3, foi atribuída de acordo com a presença do íon molecular em m/z
205,36 [M-H]- no espetro de massas, e devido aos valores obtidos no espectro de
RMN de 13C.
Os espectros de RMN de 1H, 13C e HMQC (Tabela 12, Figura 56 e Anexos
Figura 107-110, pág. 211-214) da substância 9 apresentaram sinais referentes a
hidrogênios aromáticos (H 6,83 e 7,62), benzílicos (H 3,23, d, J = 7,5 Hz, 2H, C 27,6),
um hidrogênio olefínico (H 5,27, tt, J = 8,0 e 1,0 Hz, C 121,8), duas metilas (H 1,67 e
1,70, C 17,6 e 25,4), cinco carbonos quaternários, sendo quatro olefínicos e uma
carbonila de ácido carboxílico (C 168,0).
A presença dos hidrogênios aromáticos em H 6,83 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-5) e
em H 7,62 (m, 2H, H-2 e H-6) indicam um anel aromático trissubstituido, esses dois
sinais apresentaram correlação no experimento de COSY, H-5↔H-6. De acordo com
os dados obtidos nos espectros citados, o anel aromático apresentou padrão de
substituição em C-1, C-3 e C-4, de acordo com as correlações observadas no
experimento de HMBC do H-5↔C-1/C-3 (C 121,8/127,1 respectivamente), do H-6/H-
2↔C-4 (C 159,2) e do H-6/H-2↔C-7 (C 168,0), foi possível posicionar a função
carboxílica em C-1. O deslocamento químico para o carbono C-4 (C 159,2) sugeriu
uma hidroxila como substituinte do anel.
Foram observados no espectro de RMN de 1H sinais em H 1,70 (s, 3H, H-11)
e H 1,67 (s, 3H, H-12) que foram atribuídos a duas metilas ligadas a um carbono
quaternário hibridizado em sp2. Adicionalmente, os sinais em H 5,27 e em H 3,23
foram atribuídos ao hidrogênio olefínico H-9 e aos hidrogênios benzílicos H-8,
122
respectivamente, devido aos deslocamentos químicos observados. A unidade prenila

foi determinada pelas correlações observados no experimento COSY do H-8↔H-
9↔H-11↔H-12, juntamente com as correlações observadas no HMBC do H-8 com o
C-9 e C-10 (C 121,8; 132,0), valores estes atribuídos a uma dupla ligação, e dos H-
11 e H-12 com o C-9 e C-10 sendo possível atribuir a ligação das metilas ao C-10 da
ligação dupla.
A unidade prenila foi conectada a posição 3 do anel aromático devido a
correlação observada de H-8 com o C-4/C-3 (C 159,2; 127,1) e de H-2 com o C-8 (C
27,6).
Comparando-se os dados espectroscópicos com a literatura (ABRAHAM;

ARFMANN, 1990) foi possível identificar a substância 9 como o ácido 4-hidroxi-3-
prenil benzóico. Essa substância foi descrita do fungo Curvularia fallax (ABRAHAM,
ARFMANN, 1990), e não há relatos de atividade biológica associada a está
substância.
123

H (J em Hz) C
1 - 121,5
2 7,62 (m) 129,0
3 - 127,1
4 - 159,2
5 6,83 (d, 9,0) 114,2
6 7,62 (m) 131,0
7 - 168,0
8 3,23 (d, 7,5) 27,6
9 5,27 (tt, 8,0 e 1,0) 121,8
10 - 132,0
11 1,70 (s) 25,4
12 1,67 (s) 17,6
OH
5 4
6 4a
O 3
2 10
7
8a
8 O
9
A substância 10 foi isolada como um sólido branco. Sua fórmula molecular de

C12H12O3 foi atribuída de acordo com a presença do íon molecular em m/z 205,18
[M+H]+, obtido por espectrometria de massas, e dos dados obtidos no espectro de
RMN de 13C (Tabela 13).
O espectro de RMN de 1H apresentou sinais de hidrogênios aromáticos com
deslocamento em H 7,67 (d, J = 2,5 Hz, 1H, H-5, C 127,4), H 7,70 (dd, J = 8,0 e
2,0Hz, 1H, H-7, C 127,4) e H 6,79 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-8, C 115,8) indicando a
presença de um anel aromático trissubstituido, com sistema de acoplamento meta,
orto/meta e orto, respectivamente. Esse sistema permitiu atribuir uma substituição nas
posições 6, 4a e 8a do anel aromático. O espectro de RMN de 13C apresentou uma
carbonila de ácido carboxílico em C 166,8 (C-11), de acordo com a correlação
124
observada em HMBC do H-5 e H-7 com o C-11 permitiu posicionar a função

carboxílica em C-6 (Figura 58 e Anexos Figura 112-116 pág. 216-220).
O espectro de RMN de 1H apresentou ainda dois dupletos em H 5,81 (d, J =
10,0 Hz, 1H, H-3) e 6,49 (d, J = 10,0 Hz, 1H, H-4), característicos de uma dupla ligação
com geometria cis, devido aos deslocamentos químicos e as constantes de
acoplamento observados. A correlações observada em HMBC do H-5 com o C-4 foi
possível posicionar a dupla ligação na posição 4a do anel aromático.
No espectro de RMN de 1H foi observado um simpleto em H 1,40 (s, 6H, H-9
e H-10), com integração para seis hidrogênios indicando a presença de duas metilas
com o mesmo deslocamento químico. Estas apresentaram correlações no
experimento HMBC com os C-2 (C 77,1) e C-4 (C 120,9), o que está coerente com a
estrutura proposta. As principais correlações observadas no experimento de HMBC
da substância 10 estão ilustradas na Figura 58.
Comparando os dados obtidos com os dados da literatura (BALDOQUI et al.,
1999) foi possível identificar a substância 10 como ácido 2,2-dimetil-2Hcromeno-6-
carboxílico da classe dos cromenos.
Figura 58: Correlações observadas no experimento HMBC para 10.

OH H H
H
O
CH3
H O
CH3
H
125
Tabela 13:Valores de 1H e 13C (500 e 125 MHz, DMDO-d6) para a substância 10.
H (J em Hz) C
2 - 77,1
3 5,81(10) 131,8
4 6,49 (10) 120,9
4a - 123,0
5 7,67 (2,0) 127,4
6 - 122,0
7 7,70 (8,0 e 2,0) 127,4
8 6,79 (8,0) 115,8
8a - 156,0
9 1,40 (s) 27,8
10 1,40 (s) 27,8
126
Essa substância apresenta atividade antimicrobiana e algicida contra

Microbotryum violaceum, Escherichia coli, Bacillus megaterium e Chlorella fusca, fraca
atividade contra a levedura Saccharomyces cereviceae e fraca atividade contra
Tripanosoma cruzi (QUIN et al., 2011; BALDOQUI et al., 1999; BATISTA Jr. et al.,
2008). Tem sido descrita da planta Piper aduncum e Piper gaudichaudianum, do fungo
Culvularia fallax, e do fungo endofítico Pestalotiopsis sp. (BATISTA Jr. et al., 2008;
ABRAHAM; ARFMANN, 1990; KLAIKLAY et al., 2012).
Os cromenos ocorrem em muitas plantas de diversas famílias, esses
compostos apresentam diversas atividades biológicas como fungicida, fitotóxica,
larvicida, inseticida, inibidores de crescimento, microbicida e citotóxica (MEEPAGALA
et al., 2010; BALDOQUI et al., 1999).
Este cromeno possui a biossíntese descrita em plantas e o isolamento em
fungos endofíticos pode estabelecer uma possível coevolução do endófito com a
espécie hospedeira. Tem sido evidenciado que alguns fungos endofíticos produzem
metabólicos secundários descritos primeiramente de plantas, sendo o caso mais
conhecido o do taxol, alguns autores sugerem que devido à coevolução dos endófitos
e seus hospedeiros ocorre uma transposição de genes da planta para o micro-
organismo, sendo assim o micro-organismo capaz de produzir os mesmos metabolitos
que a espécie hospedeira (CHANDRA, 2012).
4.6.7.1 Proposta biossintética para as substâncias isolados do fungo

Sacchaicola sp.
Os compostos 8-10 são biossintetizados a partir do ácido p-hidroxibenzóico,

obtido a partir da via do chiquimato. O composto 9 é precursor biossintético do
cromeno 10 e da substância 8 (LOPES et al., 2007).
127
Figura 60: Proposta biossintética para a substância 8, 9 e 10

CO 2H
H2P CO 2H CO 2H
O
PO O -HOP O
PO +
H NAD
HO OH HO OH
HO O H
OH OH
H+
OH
CO 2H CO 2H HO CO 2H
NADPH -H2O
HO OH O OH O OH
OH OH OH
ácido chiquímico
CO 2H CO 2H
O CO 2H
OH OH
ácido corísmico ácido p-hidroxibenzóico
DMAPP
preniltransferases
CO 2H CO 2H
O OH
10 9
CO 2H
OH
8
128

Botryosphaeria parva
O espectro de RMN de 1H do sólido branco obtido durante a solubilização em

CHCl3 (Figura 61) apresentou sinais de hidrogênios carbinólicos característicos de
açúcares. Como o meio de cultivo continha sacarose, esse sólido foi descartado,
supondo que poderiam ser do meio de cultivo e não da produção metabólica do fungo
endofítico.
Figura 61: Espectro de RMN de 1H do sólido em DMSO-d6 (500 MHz).
No espectro de RMN de 1H do Ext. AcOEt-óleo (Figura 62), observou-se uma

mistura de substâncias, onde foram observados sinais bem definidos, principalmente
na região de hidrogênios alifáticos, carbinólicos e aromáticos, evidenciando a
presença de vários metabólitos secundários.
129
Figura 62: Espectro de RMN de 1H do Ext. AcOEt-óleo em CDCl3 (500 MHz).
Ext. AcOEt-óleo foi submetido à CLAE preparativo, e foram coletados 5 frações.

Após uma análise prévia, verificou-se que as frações 1 e 4 eram substâncias puras, e
na fração 3 foi observado a presença de uma mistura de duas substâncias, todas
estas pertencentes a classe das isocumarinas.
As substâncias foram determinadas estruturalmente pelas análises de RMN
2D, sendo possível identificar as substâncias 3, 11, 12 e 13.
4.7.1 Determinação estrutural da Substância 11
HO O
7 8a 1 O
3
4a 9
5 CH3
OH
A substância 11 foi isolada como um sólido amorfo de coloração branca, sua

formula molecular C10H10O4 foi determinada por espectrometria de massas de alta
130
resolução (ESI (+) [217,0436 [M+Na]+). O espectro de RMN de 1H mostrou dois duplos
dupletos integrando para um hidrogênio aromático cada em H 6,86 (dd, J = 8,0 e 0,5
Hz, 1H, H-5) e H 6,97 (dd, J = 8,0 Hz; e 0,5 Hz, 1H, H-7), e um tripleto em H 7,41 (t,
J = 8,0 Hz; 1H, H-6), evidenciando um anel aromático trissubstituído. Observou-se
também um dupleto em H 1,53 (d, J = 6,5 Hz; 3H, H-9) característico da metila C-9
de isocumarinas; um simpleto em H 10,9 (1H) indicando a presença de uma ligação
intramolecular entre um grupo hidroxila (8-OH) e a carbonila em C-1. O espectro de
RMN de 13C evidenciou a presença de seis carbonos aromáticos, uma carbonila (C
162,0), e dois carbonos oxigenados (C 78,0 e 67,0) (Anexos Figura 117-121 pág. 221-
225).
No experimento de COSY foi possível observar as correlações entre o
hidrogênio metínico carbinólico em H 4,63 (dq, J = 6,5 Hz e 2,0 Hz, 1H, H-3) com os
hidrogênio metílico em H 1,53 e oxibenzilíco em H 4,51 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-4),
permitindo estabelecer a sub-unidade -metil-hidroxi para a substância 11. Esta
observação foi confirmada pelas correlações observadas no experimento de HMBC
de H-9 com C-3 e C-4.
No experimento de HMBC foi possível observar a correlação do H-5 com o C-
1 (C 162,0) que foi atribuído a uma carbonila de éster.
A configuração relativa de 11 foi definida com base na constante de
acoplamento de H-4 com H-3 de 2,0 Hz, indicando que estes hidrogênios se
encontram em uma relação cis. Essas informações aliadas a dados da literatura
(OLIVEIRA, 2009), permitiram sugerir que a substância 11 trata-se da isocumarina
denominada de rel. (3S, 4R)-4-hidroximeleina.
131
Tabela 14: Dados obtidos de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) da substância 11
(CDCl3).
Posição 1
H  (J = Hz) C
13
1 - 162,0
3 4,63 (dq, 6,5; 2,0) 78,0
4 4,51 (d, 2Hz) 67,0
4a - 140,0
5 6,86 (dd, 7,5; 0,5) 117,8
6 7,41 (t, 8,0) 136,4
7 6,97 (dd, 8,0; 1,0) 118,4
8 - 162,0
8a - 107,0
9 1,53 (d, 6,5) 15,7
4.7.2 Determinação estrutural das Substâncias 12 e 13
HO O O
HO
7 8a 1 HO 7 8a
O 1 O
3 3
4a 9 4a 9
5 CH3 5 CH3
HO 12 13
A determinação estrutural das substâncias 12 e 13 foi realizada em mistura,

uma vez que se encontravam com massa reduzida, inviabilizando a purificação das
mesmas. As substâncias possuem a mesma formula molecular C10H10O4, esta formula
está de acordo com o observado em espectrometria de massas de alta resolução (ESI
(+) [195,0626 [M+H]+, 217,0438 [M+Na]+).
O espectro de RMN de 1H (Tabela 15, Anexos Figura 121-122 pág. 226-227)
apresentou quatro hidrogênios aromáticos (H 6,92; 6,73; 6,54 e 7,01), estes
apresentaram diferentes integrações, sugerindo a presença de duas substâncias.
Esses sinais evidenciaram um padrão de substituição no anel aromático diferente da
substância 11.
132
A substância 12 foi identificada pelo espectro de RMN de 1H, que apresentou

02 dupletos em H 6,92 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-6) e H 6,73 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-7)
característico de um sistema de substituição orto/orto em um anel aromático, o que
sugeriu um anel aromático tetrassubstituído.
O C-4 passou de um carbono metínico oxibenzílico em 11 para um carbono
metilênico benzílico em 12, e seus hidrogênios apresentaram deslocamento em H
3,06 (dd, J = 17,0 e 3,0 Hz, 1H, H-4a) e H 2,61 (dd, J = 17,0 e 11,2 Hz, 1H, H-4b). O
espectro apresentou ainda sinais em H 4,64 (m, H-3), característico de um hidrogênio
metínico, e em H 1,48 (d, J = 6,0 Hz, 3H, H-9) atribuído ao grupo metila ligado ao C-
3.
A substância 13 foi identificada pelo espectro de RMN de 1H, que apresentou
02 dupletos em H 6,54 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-5) e H 7,01 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-6)
sugerindo um anel aromático tetrassubstituído, com padrão de substituição diferente
da substância 12, devido a diferença no deslocamento químico dos hidrogênios. O C-
4 passou de um carbono metínico oxibenzílico em 11 para um carbono metilênico
benzílico em 13, e os hidrogênios apresentaram deslocamento em H 2,81 (d, J = 6,5
Hz, 2H, H-4). Observou-se também sinais em H 4,64 (m, H-3), característico de um
hidrogênio metínico, e em H 1,45 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H-9) que foi atribuído ao grupo
metila ligado ao C-3.
Esses dados aliados aos da literatura (OLIVEIRA, 2009) permitiram identificar
a substância 12 como 5-hidroximeleina e a substância 13 como 7-hidroximeleina.
133
Tabela 15: Dados obtidos de RMN de 1H (500 MHz) das substâncias 12 e 13 (CDCl3).
12 13
Posição 1
H  (J em Hz) H  (J em Hz)
1
1 - -
3 4,64 (m) 4,64 (m)
4 3,06 (dd, 17,0 e 3,0) 2,81 (d, 6,5)
2,61 (dd, 17,0 e 11,2)
5 - 6,54 (dd, 8,0)
6 6,92 (t ap, 8,0) 7,01 (t ap, 8,0)
7 6,73 (dd, 8,0; 1,0) -
8 - -
9 1,48 (d, 6,0) 1,45 (d, 6,5)
4.7.3 Determinação estrutural da Substância 3
HO O
7 8a 1
O
3
4a 9
5 CH3
A substância 3 foi isolada como um sólido amorfo de coloração branca. O

espectro de RMN de 1H mostrou dupletos para dois hidrogênios aromáticos em H
6,62 (d, J = 8,0 Hz; 1H, H-5) e H 6,82 (d, J = 8,0 Hz; 1H, H-7), e um tripleto em H
7,33 (t, J = 8,0 Hz; 1H, H-6), evidenciando um anel aromático trissubstituído. Foi
observado também um sinal em H 1,46 (d, J = 6,5 Hz; 3H, H-9) característico de
hidrogênios metílicos, atribuído ao H-9; um simpleto em H 10,9 (1H) indicando a
presença de uma ligação intramolecular entre um grupo hidroxila (8-OH) e o grupo
carbonila (C-1), e um sinal em H 4,66 (q, J = 6,5 Hz, 1H, H-3) característico de um
hidrogênio oximetínico.
Esses dados evidenciaram uma grande similaridade estrutural entre a
substância 11 e 3, sendo que uma das diferenças observadas foi a redução de C-4 da
134
substância 11, que passou de um carbono metínico oxibenzílico para um metilênico

benzílico.
Estas informações associadas aos dados da literatura (OLIVEIRA, 2009)
sugerem a estrutura da meleina para a substância 3. Essa substância foi identificada
no extrato bruto produzido pelo fungo endofitico Ej-fv3 isolado do fruto de E.
jambolana.
Como especificado anteriormente, as substâncias 3, 11-13 pertencem à classe

das isocumarinas, que são encontradas em uma grande variedade de organismos,
como bactérias, liquens e fungos, sendo relatadas de diferentes espécies e gêneros
de fungos endofíticos (OLIVEIRA, 2009; CHAPLA; BIASETO; ARAUJO, 2013). As
isocumarinas são metabólitos secundários estruturalmente semelhantes às
cumarinas, possuindo como diferença um anel lactônico invertido. Essa classe de
substâncias pode apresentar diversas atividades biológicas, como por exemplo,
inibição de proteases, antimicrobiana, antialérgica, antimaláricos, reguladores de
crescimento, entre outros (OLIVEIRA, 2009; KROHN et al., 1997). A variedade de
atividades biológicas encontrada para as isocumarinas sugere que este fungo pode
exercer algum papel ecológico no hospedeiro, como protegê-lo de ataques de insetos,
micro-organismos fitopatogênicos ou predadores herbívoros.
4.7.4 Biossíntese das isocumarinas
O mecanismo que leva a formação de poliacetatos aromáticos dá origem quase

exclusivamente a metabólitos secundários, e encontra-se especialmente em fungos e
em menor escala, em bactérias e plantas superiores. Mesmo em fungos, a
possibilidade de formação de poliacetatos não se encontra uniformemente distribuída,
sendo características principalmente de fungos imperfeitos e Ascomicetos. Os
poliacetatos aromáticos são metabólitos de fungos amplamente conhecidos e seu
processo de síntese é análogo ao dos ácidos graxos.
A proposta biossintética para a formação das isocumarinas meleina (3), 4-
hidroximeleina (11), 7-hidroximeleina (12) e 5-hidroximeleina (13) se baseia na
condensação de uma molécula de acetil-SCoA com duas de malonil-SCoA, seguida
135
dedescarboxilação. Na Figura 63 encontra-se uma possível rota biossintética para os

compostos.
Figura 63: Proposta biossintética para as isocumarinas isoladas

Acetil-CoA O O
HO
Condensação Malonil-CoA
+
Redução SEnz
2 x Malonil-CoA
O O O O
SEnz Ciclização O
O HO Enolização
Reação de
O O Aromatização
Claisen OH
OH O
OH O
O Redução
O
HO
6-hidroximeleina
meleina
ão
aç
xil
Hi
dr o
dr
Hi
o
ção
xil
açã
oxila
OH O
Hidr
O
OH O
OH O
HO
O
OH O
4-hidroximeleina
7-hidroximeleina
OH
5-hidroximeleina
136
4.8 Resultados dos ensaio biológicos realizados com as substâncias

isoladas
No intuito de utilizar metabólitos secundários na terapêutica, os compostos

isolados e identificados produzidos pelos fungos endofíticos Saccharicola sp. e
Botryosphaeria parva foram submetidos aos ensaios biológicos previamente utilizados
na análise biológica dos extratos brutos crescidos em pequena escala.
Somente os compostos 4-5, 8-9 e as isocumarinas 3, 11-13 foram testados nos
ensaios. Os demais compostos foram isolados em quantidade insuficiente.
O resultado observado para as substâncias no ensaio antifúngico contra o
fungo Cladosporium sphaerospermum está ilustrado na Tabela 16 e Figura 66, as
substâncias inéditas da classe dos cicloexanois 4 e 5 não apresentaram atividade
positiva. As substâncias 8 e 9 apresentaram atividade moderada e a substância 9
apresentou atividade com limite de detecção de 5 µg. As isocumarinas 3 e 13
apresentaram atividade moderada e fraca respectivamente.
Tabela 16: Resultado das substâncias para o ensaio antifúngico contra a linhagem C.
sphaerospermum
substâncias 100 µg 50 µg 25 µg 10 µg 5 µg 1 µg
4 - - - - - -
5 - - - - - -
8 ** ** ** - - -
9 ** ** ** * * -
3 ** ** * - - -
13 * * - - - -
11+12 - - - - - -
*atividade fraca/**atividade media/***atividade forte
137
Figura 64: Resultados obtidos para as substâncias testadas para o ensaio antifúngico
138
Conclusão
5 CONCLUSÃO:
Da espécie vegetal Eugenia jambolana foram isolados 13 linhagens fúngicas,

que se mostraram excelentes produtores de metabólitos secundários, considerando
que foram observados vários sinais nos cromatogramas, e nos espectros de RMN de
1H. A avaliação das atividades biológicas mostrou extratos bioativos frente aos
ensaios testados. Esses dados sugerem que os endófitos de E. jambolana sejam
espécies interessantes para futuros estudos sobre o metabolismo secundário,
isolamento de protótipos farmacêuticos, e seu relevante papel ecológico no
hospedeiro.
O trabalho de isolamento, purificação e triagem química realizadas dos
endófitos de E. jambolana, nos permitiu selecionar dois fungos para o estudo em
escala ampliada, o fungo Saccharicola sp. e o Botryosphaeria parva.
O estudo químico do fungo Saccharicola sp. nos permitiu o isolamento de 7
substâncias de diferentes classes. O isolamento das substâncias inéditas 4-7
pertencente a classe dos cicloexanois oxigenados, fortalece a necessidade de
estudos com fungos endofíticos, pois essa classe de micro-organismos é uma fonte
promissora de novos metabólitos secundários. As atividades biológicas descritas para
as substâncias 8-10 revelam a importância da associação endófito-planta, sugerindo
que Saccharicola sp. esteja protegendo E. jambolana contra possíveis fitopatógenos
e revelam-no como um excelente produtor de metabólitos bioativos. Com base em
uma pesquisa bibliográfica verificou-se que estas substâncias acetilênicas são
raramente descritas de endófitos, sendo encontrado apenas 2 trabalhos. Este é o
primeiro relato do estudo químico de um fungo do gênero Saccharicola.
O estudo químico do fungo B. parva permitiu a identificação de 4 substâncias,
sendo todas pertencentes a classe das isocumarinas. As isocumarinas 3 e 13
apresentaram atividade contra o fungo fitopatogênico C. sphaerosphermum
demonstrando a importância ecológica dessas substâncias na espécie hospedeira,
uma vez que são descritas inúmeras atividades para essa classe de substâncias. Este
é o primeiro relato do estudo químico do fungo B. parva.
Avaliação da produção
metabólica do fungo
Lecythophora sp. utilizando
modificador epigenético
140
Desenvolvimento
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO METABÓLICA DO FUNGO LECYTHOPHORA SP.

UTILIZANDO MODIFICADOR EPIGENÉTICO
Este trabalho foi desenvolvido na University of Arizona, Tucson-EUA sob

supervisão do Prof. Dr. Leslie A. A. Gunatilaka, no estágio de doutoramento realizado
durante o período de um ano (setembro de 2012 a agosto de 2013).
6 PARTE EXPERIMENTAL
6.1 Materiais, equipamentos e técnicas utilizadas
6.1.1 Solventes
Deuterados: CDCl3 e DMSO-d6 (CIL).
Não-deuterados: Sigma, Macron, Fisher e Aldrich.
6.1.2 Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC)

Foram utilizadas placas pré-prontas de sílica gel da marca Whatman (AL SIL
G/UV 20 x 20 cm), placas de Alunina (Agela Technologies, 20 x 20 cm) e placas de
fase reversa C18 (EDM Chemicals Inc, Silica gel 60 RP-18, 20 x 20 cm). As revelações
foram obtidas por irradiação ultravioleta (UV 254 e 366 nm) e nebulização com
anisaldeído seguido de aquecimento.
6.1.3 Cromatografia em Coluna (CC)

Nas separações cromatográficas em coluna aberta ou sob pressão foram
utilizadas colunas de vidro de diferentes diâmetros internos e comprimentos.
Fases estacionárias: sílica gel flash (40 μm; Baker) e SEPHADEX LH-20
(Amersham Biosciences).
6.1.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

As análises cromatográficas foram obtidas em aparelho de cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) Waters Delta Prep. 4000 acoplado ao detector Waters
996 Photodiode Array; e em equipamento HITACHI D-6000: bomba HITACHI L-6200;
auto injetor AS-4000; detector Ultravioleta em arranjo de diodos, L-4500.
141
Desenvolvimento
Foi utilizado coluna analítica Phenomenex tipo Luna (250 x 4,60 mm e 5 μm) e
coluna semi preparativa C18 (Phenomenex, tipo Luna, 250 x 10 mm x 5 µm).
6.1.5 Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C (RMN de 1H e 13C)

Os experimentos unidimensionais e bidimensionais foram realizados em
espectrômetro Bruker Avance III 400 operando em 400 MHz para o núcleo de 1H e em
100 MHz para o núcleo de 13C, utilizando solvente residual como referência interna.
6.1.6 Espectrometria de massas

Espectros de baixa resolução foram obtidos em equipamento Shimadzu LCMS-
8000 QPα.
6.1.7 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho (IV)

A obtenção dos espectros na região do infravermelho foram obtidos utilizando-
se o espectrofotômetro Shimadzu FTIR-8300, na região de 4000-400 cm-1,
empregando a técnica de pastilha de KBr.
6.1.8 Cultivo dos fungos endofíticos

Foram utilizados meios de cultivo
MBD: DifcoTM 24 g L-1
BDA: DifcoTM 39 g L-1
Modificador epigenético 5-azacitidina
6.1.9 Outros Equipamentos

 Evaporador rotatório – Buchi.
 Balança analítica – SHIMADZU e METLER TOLEDO.
 Balança semi-analítica – OHAUS.
 Centrífuga – DAMON/IEC Division e VWR Scientific products.
 Coletor automático – GILSON.
 Vortex – VWR Scientific Products.
 Linha de vácuo – VWR Scientific Products.
 Autoclave – MARKET FORGE Industries INC.
 Câmara de Fluxo laminar - SterilGARD® Advance.
142
Desenvolvimento
 Incubadora vertical - VWR Scientific Products (modelo 1925).

 Incubadora rotatória (“Shaker”) – New Brunswick Scientific (série I26).
 Espectrofotômetro – SHIMADZU UV-1601.
6.2 Cepa fúngica
O fungo codificado como FL1375 foi isolado do líquen Parmotrema tinctorum,

conforme procedimento descrito a seguir, e foi identificado como Lecythosphora sp.
Um talo aparentemente saudável de Parmotrema tinctorum foi coletado em
março de 2008 na estação biológica Archbold na Florida, EUA (27°11'19''N,
81°20'15"W, ca. 35 m.a.s.l.) como parte dos estudos realizados sobre a diversidade
dos fungos endofíticos de liquens (OLMO-RUIZ, 2012). O talo foi lavado com água da
torneira e a superfície foi esterilizada com imersão em 95% de etanol por 30 segundos,
0,5% NaOCl por 2 minutos e 70% de etanol por 2 minutos, após foram cortados em
96 pedaços (cada um de 2 mm2). Os segmentos foram secos em condições estéreis
e incubados em tubos de centrífuga (1,5 mL) contendo 2% de extrato de malte em
ágar. Os tubos foram selados com parafilme e incubados a temperatura ambiente
(21,5 oC) por três anos. Os fungos foram purificados em cultura de 2% de MEA, e
preservados em água estéril e depositados no Herbário Micológico Robert L.
Gilbertson da Universidade do Arizona (EUA).

dos extratos brutos
O fungo endofítico Lecythophora sp. foi repicado para placas de Petri contendo
BDA e incubado por 5 dias. Em seguida preparou-se uma solução de esporos, que foi
preparada adicionando esporos do fungo em água destilada estéril, agitando-se em
vortex e filtrando-se em separador celular. Em seguida foi medida a absorbância em
espectrofotômetro (Abs 0,8). A solução de esporos foi adicionada (1,2 mL) em tubos
que continham meio de cultivo MBD (12 mL) e diferentes concentrações do
modificador epigenético 5-azacitidina (125; 250 e 500 µM) Os meios contendo os
143
Desenvolvimento
esporos fúngicos e o modificar epigenético foram transferidos para uma placa de 24

poços (Figura 65), os fungos foram inoculados em “shaker” durante 7 dias, a 28oC e
160 rpm.
Após esse período o volume presente nos poços foi transferido para tubos de
centrifuga, mediu-se o pH e a solução foi neutralizada (NaOH 0,1% e HCl 0,1%). Em
seguida foram submetidos a extração com acetato de etila (3 x 8,0 mL), o AcOEt foi
lavado com água destilada (2 x 10,0 mL), adicionou-se sulfato de sódio para eliminar
os resquícios de água presente na fração AcOEt, o solvente foi evaporado obtendo-
se os respectivos extratos brutos. Os extratos brutos foram submetidos à análise em
CCDC.
Figura 65: Esquema do cultivo e extração para obtenção dos extratos brutos dos fungos
endofíticos
144
Desenvolvimento

dos extratos brutos
O fungo Lecythophora sp. foi repicado para placas de Petri contendo BDA e
incubado por 5 dias. Em seguida preparou-se uma solução de esporos (Abs:0.6-0.8),
esta solução foi adicionada (10,0 mL) em 2 frascos de Erlenmeyer (2 L), um fraco
contendo 1 L de meio de cultivo MBD e o outro frasco contendo 1 L de meio MBD com
500 µM do modificador epigenético 5-azacitidina, os frascos foram incubados em
“shaker” a 160 rpm e 28oC por 7 dias. Após esse período o caldo foi separado do
micélio por filtração, mediu-se o pH do filtrado e neutralizou-se, em seguida foi
submetido a uma partição líquido/líquido com acetato de etila (AcOEt) (3 x 600 mL), a
fase orgânica foi lavada com água destilada (3 x 600 mL) e em seguida concentrada,
fornecendo o extrato bruto AcOEt (Figura 66: Fluxograma da obtenção e triagem dos
extratos brutos obtidos de Lecythophora sp.).
Os extratos brutos foram submetidos a avaliação química, por CCDC utilizando
placas pré-prontas de sílica gel e fase móvel [5% MeOH em CH2Cl2] e CLAE.
O perfil cromatográfico dos extratos brutos obtido por CLAE foi realizado em
gradiente exploratório, utilizando como fase estacionária uma coluna analítica
Phenomenex (tipo Luna, C18) e eluição em gradiente de H2O:CH3CN 0,1% TFA
(70:30 v/v durante 10 minutos, diminuindo a polaridade até 0:100% em 40 minutos
permanecendo nesta condição por mais 10 min.), com uma vazão de 0,8 mL min -1.
Os extratos brutos AcOEt foram submetidos a avaliação biológica, testados nos
ensaios, citotóxico, indução de choque térmico (HSIA) e da inibição da migração
celular (CMIA) (para o procedimento dos ensaios veja seção 6.8, pág. 150)
145
Desenvolvimento
Figura 66: Fluxograma da obtenção e triagem dos extratos brutos obtidos de Lecythophora
sp.
6.5 Cultivo em escala ampliada do fungo Lecythophora sp. e obtenção

do extrato bruto
O fungo endofítico Lecythophora sp. foi repicado para placas de Petri contendo
BDA e incubado por 5 dias, em seguida preparou-se a solução de esporos e o fungo
foi inoculado em 10 frascos de Erlenmeyer (2 L) contendo 1 L de meio de cultivo MDB,
preparado na concentração de 24 g L-1, e cada frasco contendo 500 µM de 5-
azacitidina, os frascos foram incubados em “shaker” a 28oC e 160 rpm por 7 dias.
Após esse período o caldo foi separado do micélio por filtração a vácuo, mediu-se o
pH do filtrado e neutralizou-se, em seguida o filtrado foi submetido a uma partição
líquido/líquido com AcOEt (3 x 6,0 L), a fase orgânica foi lavada com água destilada e
concentrada, fornecendo o extrato bruto AcOEt (1,56 g) (Figura 67). O extrato bruto
AcOEt foi submetido a análise de CCDC e CLAE.
O perfil cromatográfico foi obtido em CLAE em gradiente exploratório, utilizando
como fase estacionária uma coluna analítica Phenomenex (tipo Luna, C18) e eluição
em gradiente de H2O:CH3CN 0,1% TFA (70:30 v/v durante 10 minutos, diminuindo a
polaridade até 0:100% em 40 minutos permanecendo nesta condição por mais 10
min.), com uma vazão de 0,8 mL min-1.
146
Desenvolvimento
Figura 67: Obtenção do extrato bruto produzido por Lecythophora sp.
6.6 Fracionamento do extrato bruto obtido de Lecythophora sp.
O extrato bruto AcOEt obtido de Lecythophora sp. (1,46 g) foi dissolvido em

uma solução metanólica 80% (95,0 mL) e submetido a partição líquido/líquido com
hexano (4 x 100,0 mL). A fração metanólica foi diluída para 50% e particionada
novamente com clorofórmio (4 x 300,0 mL), obtendo-se a fração CHCl3 (1,17 g).
(Figura 68).
147
Desenvolvimento
Figura 68: Fluxograma da partição líquido/líquido do extrato bruto AcOEt
Uma porção da fração CHCl3 (832,2 mg) foi fracionada utilizando coluna de
vidro (21 x 3 cm), como fase estacionária sílica flash (40 µm, 27 g) e eluente um
sistema de hexano:acetato de etila até acetato de etila:metanol (Figura 69), obtendo-
se 80 frações, que foram reunidas de acordo com o perfil cromatográfico em 15 sub-
frações (Tabela 17).
Figura 69: Fluxograma de fracionamento da fração CHCl3

148
Desenvolvimento
Tabela 17: Fração obtidas da CC reunidas de acordo com o perfil em CCDC

Fração combinadas Massa (mg) Codigo
1-3 2,4 Sub- fração 1
12-14 7,3 Sub- fração 4
15-26 146,2 Sub- fração 5
27-28 6,2 Sub- fração 6
29-32 8,2 Sub- fração 7
33-38 150,5 Sub- fração 8
39-41 42,8 Sub- fração 9
42-45 36,0 Sub- fração 10
46-58 72,8 Sub- fração 11
59-67 29,9 Sub- fração 12
68-74 40,4 Sub- fração 13
75-79 34,4 Sub- fração 14
80 144,8 Sub- fração 15
A sub-fração 5 (146,0 mg) foi submetida a CLAE preparativo utilizando uma

coluna C18 e eluente H2O:CH3CN 0,1% TFA (55:45 v/v isocrático em 30 minutos)
numa vazão de 3 mL min-1 e  = 250 nm. Foram coletados três frações que foram
submetidos à análises de RMN de 1H, resultando na identificação da substância 17 (tR
= 25 min.; 10,1 mg) e da substância 18 (tR = 28 min.; 35,4 mg).
A sub-fração 9 foi submetida a análise de RMN de 1H resultando na
identificação da substância 16 (42,8 mg).
A sub-fração 10 foi submetida a CLAE preparativo utilizando uma coluna C18
e eluente H2O:CH3CN 0,1% TFA (70:30 v/v isocrático em 30 minutos) numa vazão de
2,5 mL min-1 e =250 nm. Foram coletados 4 picos que foram submetidos à análises
de RMN de 1H, resultando na identificação da substância 15 (tR = 27 min., 3,0 mg).
A sub-fração 11 foi submetida a CLAE preparativo utilizando uma coluna C18
e eluente H2O:CH3CN 0,1% TFA (65:35 v/v isocrático em 30 minutos) numa vazão de
149
Desenvolvimento
2,5 mL min-1 e =250 nm. Foram coletados 3 picos que foram submetidos à análises
de RMN de 1H, resultando na identificação da substância 14 (tR = 26 min., 1,2 mg).
6.7 Reação usando reagente de Mosher
Os compostos 16 e 17 foram submetidos a reação com reagentes de Mosher

para determinação da configuração absoluta.
O composto 16 (5,0 mg) foi transferido para um tubo de RMN limpo e
completamente seco, adicionou-se ao tubo piridina deuterada (0,5 mL) e o reagente
(R)-MTPA-Cl (10 μL), em seguida borrifou N2 no tubo de RMN. A reação foi monitorada
por RMN de 1H, deixou-se a 25 oC durante 12 horas. O produto resultante foi purificado
em placa cromatográfica preparativa (sílica gel) usando AcOEt como eluente,
resultando no composto 16a (éster (S)-MTPA).
Da mesma maneira descrita acima, o composto 16 (5,0 mg) foi submetido a
reação com (S)-MTPA-Cl em um segundo tubo de RMN a 25 oC durante 12 horas
usando piridina deuterada (0,5 mL) como solvente. O produto resultante foi purificado
usando placa cromatográfica preparativa (sílica gel) e AcOEt como eluente,
fornecendo o composto 16b (éster (R)-MTPA).
Os compostos 16a e 16b foram submetidos a análise de RMN uni e
bidimensionais. Dados de RMN de 1H obtidos para os compostos 16a: (400 MHz,
CDCl3).  6,056 (1H, dd, J = 14,8 Hz, H-13), 5,913 (2H, m, H-7, H-14), 5,767 (2H, m,
H-8, H-9), 5,639 (1H, dt, J = 15,2, 7,2Hz, H-15), 5,387 (1H, dd, J = 15,2 Hz, H-12),
4,801 (1H, t, J = 2,8 Hz, H-11a), 4,649 (1H, s, H-4), 4,588 (1H, t, J = 2,8 Hz, H-11b),
3,886 (1H, d, J= 5,2 Hz, H-6), 3,364 (1H, d, J = 10,4 Hz, H-10), 2,002 (2H, q, J = 7,2
Hz, H-16), 1,345 (2H, q, J = 7,2 Hz, H-17), 0,862 (3H, t, J = 7,2 Hz, H-18). Dados de
RMN de 1H obtidos para os compostos 16b: (400 MHz, CDCl3). 6,072 (1H, dd, J =
15,2 Hz, H-13), 5,937 (1H, m, H-7), 5,899 (1H, m, H-14), 5,687 (1H, m, H-15), 5,681
(2H, m, H-8, H-9), 5,392 (1H, dd, J = 15,2 Hz, H-12), 5,110 (1H, s, H-4), 4,829 (1H, t,
J = 2,4 Hz, H-11a), 4,626 (1H, t, J = 2,8 Hz, H-11b), 4,037 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-6),
3,443 (1H, dd, J = 14,0, 2.4 Hz, H-10), 1,998 (2H, t, J = 7,2 Hz, H-16), 1,347 (2H, q, J
= 7,2 Hz, H-17), 0,864 (3H, t, J = 7,6 Hz, H-18).
150
Desenvolvimento
O composto 17 (2,5 mg) foi transferido para uma tudo de RMN limpo e
completamente seco, adicionou-se ao tubo piridina deuterada (0,5 mL) e o reagente
(R)-MTPA-Cl (5 μL), em seguida borrifou-se N2 no tubo de RMN. Deixou-se reagir por
30 minutos a 25 oC, resultando no composto 17a (éster (S)-MTPA).
Da mesma maneira o composto 17 (2,5 mg) foi submetido a reação com (S)-
MTPA-Cl em um segundo tubo de RMN a 25 oC durante 30 minutos usando piridina
deuterada (0,5 mL) como solvente, resultando no composto 17b (éster (R)-MTPA).
Os compostos 17a e 17b foram submetidos a análise de RMN uni e
bidimensionais. Dados de RMN de 1H obtidos para os compostos 17a: (400 MHz, d5-
piridina).  6,460 (1H, m, H-7), 6,275 (1H, dd, J = 14,8 Hz, H-13), 6,078 (1H, m, H-14),
6,046 (1H, m, H-9), 6,029 (1H, m, H-8), 5,898 (1H, dd, J = 15,2, Hz, H-12), 5,594 (1H,
m, H-15), 5,521 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4), 5,033 (1H, d, J = 4,4 Hz, H-6), 4,959 (1H, t, J
= 2,4 H-11a), 4,880 (1H, t, J = 2,4 Hz, H-11b), 4,085(1H, d, J = 8,4 Hz, H-10), 1,915
(2H, q, J = 7,2 Hz, H-16), 1,251 (2H, q, J = 7,2 Hz, H-17), 0,772 (3H, t, J = 7,2 Hz, H-
18). Dados de RMN de 1H obtidos para os compostos 17b: (400 MHz, d5-piridina).
6,549 (1H, m, H-7), 6,299 (1H, dd, J = 15,2 Hz, H-13), 6,063 (1H, dd, 14,8 Hz, H-14),
5,951 (1H, m, H-9), 5,942 (1H, m, H-12), 5,923 (1H, m, H-8), 5,839 (1H, t, J = 2,4 Hz,
H-4), 5,576 (1H, m, H-15), 5,107(1H, d, J = 4,4 Hz, H-6), 4,966 (1H, t, J = 2,0 H-11a),
4,918 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-11b), 4,156 (1H, d, J = 6,8 Hz, H-10), 1,910 (2H, q, J = 7,2
Hz, H-16), 1,247 (2H, q, J = 7,2 Hz, H-17), 0,779 (3H, t, J = 7,2 Hz, H-18).
6.8 Ensaios biológicos
6.8.1 Ensaio de citotoxicidade (Alamar Blue Assay)

Material
Células: As linhagens tumorais utilizadas, PC3M (próstata - humano), NCI-
H460 (pulmão - humano), SF-268 (sistema nervoso central - humano), MCF-7 (mama
- humano) e MDA-MB-231 (pâncreas - humano), foram cultivadas em meio RPMI,
suplementados com 10 % de soro fetal bovino e 1% de antibiótico, mantidas em estufa
a 37 C e atmosfera contendo 5% de CO2.
O crescimento e a sobrevivência da célula foi medida em microplacas de 96
poços utilizando a redução do corante resazurina (Alamar Blue) como ponto final da
reação, seguido da análise por fluorescência. Diluições em série dos extratos,
151
Desenvolvimento
substâncias puras e do controle (DMSO) foram adicionados aos poços em triplicata.

Após 72 horas de incubação, 20 μL/poço de solução de Alamar Blue foi adicionado
nos poços tendo-se no final do ensaio um volume de 200 μL/cavidade, obtendo-se
assim uma concentração final de 10% de Alamar Blue. Em seguida, foi feita uma
agitação por 10 segundos, e as placas foram devolvidas para a incubadora e mantidas
durante 4 horas a 37°C. A aquisição dos dados foi feita utilizando um fluorímetro de
microplacas (Excitação/Emissão: 560/590 nm) (WIJARATNE et al., 2012).
O número de poços tratados com os extratos e substâncias puras foram
comparados com o número de poços tratados com DMSO (controle negativo).
Dexorrubicina foi utilizado como controle positivo.
6.8.2 Ensaio de indução de choque térmico (HSIA)

Fibroblastos de rato estavelmente transcritos, com uma codificação construída
de uma proteína verde fluorescente sob o controle transcricional de um elemento
mínimo de choque térmico, foi utilizado para medir a atividade de indução de choque
térmico dos extratos e substâncias puras. As células foram adicionadas em placas de
96 poços de fundo plano a uma densidade de 20.000 células/poço e, permaneceram
em repouso por uma noite para aderir nos poços (uma coluna de poços da placa foi
deixada vazia para servir como controle/branco). No dia seguinte, duas diluições dos
extratos e das substâncias puras, foram preparados e adicionados nos poços em
triplicata. DMSO foi utilizado como controle negativo. As células foram incubadas, o
meio foi removido, e os poços foram lavados uma vez com PBS, seguido da adição
de 150 μL de PBS a cada poço. A fluorescência foi determinada em um equipamento
Analyst AD (LJL Biosystems) com leitor de placas equipado com um conjunto de filtros
que excitarou a 485 nm e emitiu a 525 nm (TURBYVILLE et al., 2006).
6.8.3 Ensaio de inibição da migração celular (CMIA)

Para CMIA (também conhecido como ensaio de cicatrização), células tumorais
relacionadas ao câncer de mama metastático (MDA-MB-231) foram cultivadas em
meio de DMEM/Ham's F-12 contendo 10% de soro fetal bovino e gentamicina (50 μg
mL-1). Estas células foram cultivadas sob uma atmosfera de 5% de CO2 a 37°C, e
foram colhidas acima de 80% de confluência. Após esse período, elas foram
plaqueadas em placas de 24 poços estéreis a uma densidade de 150.000 células por
poço, e recuperadas durante 24 horas até que uma monocamada das células
152
Desenvolvimento
confluentes tenha sido formada em cada poço (>90% de confluência). As células

cancerosas foram em seguida, infligidas a cada monocamada de células formada
utilizando um palito estéril, os meios foram removidos, as monocamadas de células
foram lavadas uma vez com PBS, e novos meios foram adicionados a cada poço.
Amostras teste dos extratos e substâncias isoladas foram preparados em DMSO em
diferentes concentrações e adicionados às placas, cada um em duplicata, juntamente
com os dois controles: inibidor de fosfotidilinositol (PtdIns) 3-quinase LY294002 a 7,5
μM (controle positivo) e DMSO (controle negativo). As placas foram incubadas durante
40 horas. Após esse período os resultados foram documentados fotograficamente
utilizando um microscópio invertido em 10x de ampliação da foto (WANG et al., 2011).
153
7 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O cultivo do fungo Lecythophora sp. em placa de 24 poços apresentou

mudanças na produção metabólica. O cultivo sem modificador epigenético e na
presença de 125 μM e 250 μM do modificador 5-azacitidina, não apresentou
mudanças significativas na produção metabólica, sendo esta avaliada por CCDC
(Figura 70), no entanto o cultivo na presença de 500 μM de 5-azacitidina apresentou
algumas alterações, notou-se o desaparecimento de um composto mais apolar e mais
polar, e também variação na coloração das manchas após a revelação com
anisaldeído.
Figura 70: CCDC obtida dos extratos brutos
Legenda
1= Controle
2= 125μM de Azacitidina
1 2 3 4
Esses resultados evidenciam que o modificador epigenético 5-azacitidina

empregado no cultivo exerceu uma alteração na produção metabólica do fungo, o que
nos motivou a cultivar o fungo em escala reduzida (1L) para uma avalição mais
detalhada.
O crescimento do fungo em escala reduzida (1L) apresentou diferenças
significativas na produção metabólica utilizando modificar epigenético 5-azacitidina,
assim como no crescimento do fungo em placa. A principal diferença observada foi o
aumento do rendimento do extrato bruto. O cultivo sem modificar epigenético forneceu
20,6 mg enquanto que o cultivo com o modificador foi de 189,0 mg, um aumento de
9,2 vezes. No perfil por CCDC observamos uma diferença entre os dois extratos brutos
(Figura 71).
154
Figura 71: CCDC obtida dos extratos brutos
O perfil por CLAE do extrato bruto AcOEt obtido do cultivo na presença de 500
µM de 5-azacitidina, mostrou o aparecimento de dois novos picos (14 + 15), e o
aumento da produção de 16 e 17 (Figura 72). Isso indica a presença de novos
compostos produzidos apenas na adição do modificar epigenético durante o cultivo,
confirmando que este influencia a produção metabólica.
Figura 72: Cromatogramas obtidos do cultivo em 1L do fungo Lecythosphora sp. (A) cultivo
em MDB (B) cultivo em MDB contendo 500 µM de 5-azacitidina (= 254 nm)
155
Os dois extratos foram ativos no ensaio citotóxico contra todas as linhagens

celulares testadas. O extrato AcOEt sem o modificador epigenético apresentou baixa
atividade no ensaio “HSIA” (Tabela 18).
Tabela 18: Resultados obtidos para os dois extratos brutos nos ensaios biológicos testados
Ensaio citotóxico
PC3M NCI- SF-268 MCF-7 MDA- HSIA CMIA CONC.

H460 MB-231
Extrato bruto 1 96,2 92,6 94,0 92,1 75,8 (+) (-) 10 µg/mL
Extrato bruto 2 96,9 98,4 95,4 95,8 77,6 (-) (-) 10 µg/mL
-
Dexorrubicina 86,6 98,6 87,9 82,6 85,1 - 1µM
Monocilina - - - - - (+) - 0,5 µM
LY294002 - - - - - - (+) 7,5 µM
7.1 Identificação estrutural das subtâncias isoladas de Lecythophora

sp
Objetivando a obtenção de substâncias bioativas do cultivo de Lecythophora

sp. na presença de modulador epigenético, o fungo foi cultivado em escala ampliada,
na presenca de 5-azacitidina, o extrato bruto obtido foi submetido a técnicas de
separação, sendo possivel isolar três novos compostos 14-16 e os oxaspirois C (17)
e B (18).
156
19
O
11
O 3
4
HO OH
6
7 5
8 10
9
12 14 16 18
O composto 14 foi obtido como uma goma incolor e sua fórmula molecular foi
estabelecida como C17H26O4, por RMN. O espectro de absorção no UV mostrou
absorção máxima em  = 250 nm sugerindo a presença de dieno conjugado, e o
espectro no IV apresentou bandas de absorção em 3404 e 1600 cm -1 indicando a
presença de grupos –OH e C=C respectivamente.
Análise dos espectros de RMN de 1H, 13C e HSQC indicaram a presença de
seis grupos metínicos sp2 contribuindo com três ligações duplas [H 5,54 (H-8 C
129,3), H-9, C 132,2), 5,45 (H-12 C 131,5), 6,13 (H-13 C 131,9), 5,99 (H-14 C 129,6),
5,64 (H-15 C 134,8)], cinco grupos metínicos sp3 sendo três oxigenados [H 4,02 (H-
4 C 82,7), 3,57 (H-6 C 79,8) e 4,38 (H-7 C 72,2)], dois grupos metílicos [H 0,88 (t, H-
18 C 13,7), 1,35 (s, H-11 C 18,3), uma metoxila em 3,27 (H-19 C 48,9)] e dois
metilenos alifáticos em 2,01 (m, H-16, C 34,7) e 1,39 (m, H-16, C 22,4). O valor de
carbono quaternário em δC 109,0 sugeriu a presença de um acetal. Estas informações
permitiram propor 5 insaturações, três das quais foram atribuídas à três ligações
duplas e duas a dois ciclos.
Os valores observados em RMN de 1H e 13C, associado com a multiplicidade
dos hidrogênios, evidenciaram a presença da unidade 1,3-heptenila [ 0,88 (t, J = 7,2
Hz, 3H, H-18 C 13,7),  1,39 (m, 2H, H-17 C 2,4),  2,01 (m, 2H, H-16 C 34,7),  5,64
(dt, J = 14,8 e 7,2 Hz, 1H, H-15 C 134,8),  5,99 (dd, J = 14,8 Hz, 1H, H-14 C 129,6),
 6,13 (dd, J = 15,0 Hz, 1H, H-13 C 131,9) e  5,45 (dd, J = 15,0 Hz 1H, H-12 C
157
131,4)], o que foi corroborrado pelas correlações observadas no experimento 1H-1H

COSY, permitindo propor a estrutura parcial A.
Estrutura parcial A
Em continuidade à analise dos dados obtidos do experimento de COSY, outro

sistema de spins foi visualizado, o que adicionado aos valores dos deslocamentos
químicos dos carbonos e hidrogênios, assim como as respectivas multiplicidades
destes átomos, pemitiram propor a estrutura parcial B.
O O
H
Estrutura parcial B
A ciclização do anel ciclohexenico foi realizada com base nas correlações

observadas em HMBC entre H-8↔C-6/C-10 e H-9↔C-5. A conecção entre as
estruturas parciais A e B foi realizada com base na conectividade observada em
COSY entre H-12↔H-10.
O O
H
Estrutura parcial C
158
Com o conhecimento de  C-4 (CH, 82,7) e  C-3 (C, 109,9) a ciclização do anel
furano foi realizada e corroborrada pelos baixos valores de deslocamento químico
para os carbonos. Adicionalmente, a correlação observada entre H-19↔C-3 e H-
11↔C-3 permitiu o posicionamento da metoxila em C-3 ao invés de C-4. No segundo
caso observaríamos uma correlação a longa distância 3J com C-4 (C-H) e no primeiro
caso com um carbono quaternário (C-3).
As principais correlações observados no experimento de HMBC e COSY
confirmam a estrutura proposta para a substância 16 (Figura 73).
Figura 73: Correlações HMBC e 1H-1H COSY para 14
O H
H H 1H-1H
HO COSY
OH
correlação HMBC
H
A estereoquimica relativa do composto 14 foi determinada usando os valores

das constantes de acoplamento obtidos de RMN de 1H (Tabela 19) e ROESY (Figura
73). A correlação observada no experimento de ROESY dos hidrogênios H-5/H-4/H-
7/H3-11 indicam que esses hidrogênios encontram-se no mesmo plano da molécula.
A correlação observada entre H-10 e H-6, sugerem que estes estejam posicionados
na outra face da molécula, confirmando a estrutura proposta para 14.
159
Figura 74: Correlações observadas por ROESY para a substância 14
11
6 5
10
7
Tabela 19: Dados de RMN obtidos para a substância 14 (CDCl3, 400 MHz)
Posição 1
H H (J = Hz) 13
C C
3 - 109,9
4 4,02 (d, 8,0) 82,7
5 1,61 (q, 10,8) 53,1
6 3,57 (t, 8,0) 79,8
7 4,38 (s) 72,2
8 5,54 (s) 129,3
9 5,54 (s) 132,2
10 2,93 (t, 8,8) 44,3
11 1,35 (s) 18,3
12 5,45 (dd, 15,0) 131,5
13 6,13 (dd, 15,0) 131,9
14 5,99 (dd, 14,8) 129,4
15 5,64 (dt, 7,2; 14,8) 134,8
16 2,01 (m) 34,7
17 1,39 (m) 22,4
18 0,88 (t, 7,2) 13,7
19 3,27 (s) 48,9
Levantamento bibliográfico realizado na literatura indicou tratar-se de uma

substância inédita.
160
OH O
OH
HO
6 4 11
7 5 3
8 10
9
12 14 16 18
O composto 15 foi obtido como uma goma incolor e sua formula molecular foi
estabelecida como C16H24O4, de acordo com os dados obtidos de RMN. Os espectros
de absorção no UV e IV mostraram absorção máxima em  = 252 nm e 3404 e 1637
cm-1, respectivamente indicando a presença de grupos –OH e C=O.
Os dados obtidos de RMN da substância 15 foram similares com os obtidos
para a substância 14. O espectro de RMN de 1H revelou a presença de seis
hidrogênios olefínicos [H 5,90 (H-13, H-14), 5,51-5,64 (3H), 5,19 (H-12)], três prótons
oximetínicos [H 4,31 (H-3), 3,70 (H-6), 4,18 (H-7)], dois hidrogênios metínicos [H 3,04
(H-5); 3,40 (H-10)], dois grupos metilênicos [H 2,00 (H-16), 1,35 (H-17)] e dois grupos
metílicos [H 1,25 (H-11), 0,87 (H-18)] (Tabela 20).
O experimento de 1H-1H COSY mostrou o sistema de spin CH3-CH2-CH2-CH-
CH-CH-CH-, o que juntamente com as correlações observadas no experimento de
HMBC evidenciaram a presença da subunidade 1,3-heptenil assim como na
substância 14 (Figura 74).
O anel cicloexeno foi evidenciado devido a presença do sistema de spin -CH-
CH-CH- dos três grupos metínicos presentes em H 3,40 (H-10), 3,04 (H-5) e 3,70 (H-
6), da presença de dois carbonos em C 75,3 (C-6) e 73,4 (C-7), o deslocamento
químico destes carbonos sugerem a presença de grupos –OH ligados aos carbonos,
e devido a presença de dois hidrogênios olefinicos em H 5,54 (H-8, C 131,2) e 5,57
(H-9, C 127,8). A subunidade 1,3-heptenil foi conectada ao cicloexeno devido a
presença da correlação do H-10 com o H-12 no espectro de 1H-1H COSY.
A grande diferença presente no espectro de RMN de 1H da substância 15 para
a substância 14 foi a presença de um dupleto em  H 1,25 (H-11) e do quarteto em 
4,31 (H-3), que mostraram correlação no espectro de 1H-1H COSY. No experimento
de HMBC, H-11 mostrou correlação com a carbonila em C 214,5 (C-4) sugerindo a
161
presença da subunidade -CO-CH(OH)-CH3, a qual foi conectada ao anel cicloexeno

pela correlação em HMBC de H-5↔C-4. As principais correlações em HMBC e 1H-1H
COSY estão demostrada na Figura 75.
Figura 75: Correlações HMBC e 1H-1H COSY para a substância 15

OH O
H
OH
HO
4 11 1H-1H
7 5
COSY
3
correlação HMBC
9
12 14 16 18
Tabela 20: Dados de RMN obtidos para a substância 15 (400 MHz)

Posição 1
H H (J = Hz) 13
C C
1 - -
3 4,31 (quint, 6,8) 75,0
4 - 214,5
5 3,04 (t, 10,8) 52,8
6 3,70 (dd, 8,4) 75,7
7 4,18 (sl) 73,4
8 5,54 (m) 131,2
9 5,57 (m) 127,8
10 3,40 (t, 8,8) 43,0
11 1,25 (d, 7,2) 18,5
12 5,19 (dd, 14,8) 130,0
13 5,90 (m) 132,9
14 5,90 (m) 129,2
15 5,62 (m) 135,6
16 2,00 (m) 34,7
17 1,35 (q, 7,2) 22,3
18 0,87 (t, 7,2) 13,7
A estereoquímica relativa para 15 foi determinada utilizando os valores das

constantes de acoplamento obtidos no RMN de 1H. O tripleto em H 3,04 (H-5) com
constante de acoplamento J = 10,8 Hz estabelece a orientação ax-ax com o H-10 e
H-6 no anel cicloexeno, o tripleto remanescente em H 3,70 (H-6) com constante de
acoplamento de J = 8,4 Hz confirma a orientação ax-ax com H-5 e estabelece a
162
orientação ax-ax com H-7, confirmando a configuração relativa para a substância 15

(Figura 76).
Levantamento bibliográfico realizado na Web of science e Scinfinder indicou
tratar-se de uma substância inédita
Figura 76: Conformação cadeira para o composto 15
11
HO
HO
4 3
HO O
6
1
7 5
8 10 O
9
12 14 16 18
A substância 16 foi obtida como um sólido incolor. Sua fórmula molecular

C17H25O4 foi determinada utilizando os dados obtidos de RMN. O espectro de
absorção no ultravioleta mostrou absorção máxima de 234 nm e sugere a presença
de dienos conjugados. O espectro de RMN de 1H (Tabela 21) apresentou oito sinais
característicos de hidrogênio olefínicos [H 5,70 (H-8), 5,50 (H-9), 4,72 (11a), 4,64
(11b), 5,53 (H-12), 6,08 (H-13), 5,88 (H-14) e 5,61 (H-15)], três hidrogênios
oximetínicos [H 5,18 (H-4), 3,70 (H-6), 4,78 (H-7)], um hidrogênio metínico [H 3,64
(H-10)], dois grupos metilenios [H 1,99 (H-16) e 1,36 (H-17)] e um grupo metil [H 0,86
(H-18)]. Os sinais em H 5,70 (d, 13,0 Hz) e 5,50 (d, 10,0 Hz) foram atribuídos a dupla
163
ligação cis entre H-8 e H-9, respectivamente. A estereoquímica cis foi estabelecida
com base na constante de acoplamento entre H-8 e H-9.
O espectro de COSY mostrou correlação 1H-1H do hidrogênio H-7 (H 4,78) com
H-8 e H-6 (H 3,70) e H-10 (H 3,64) com H-9. Esses resultados juntamente com os
deslocamentos químicos do H-7 e H-6 estabelecem o esqueleto cicloexeno com a
dupla ligação entre C-8 e C-9, um grupo hidroxila conectado ao C-6 e ao C-7 e um
carbono quaternário em C-5. O deslocamento químico de C-7 (C 69,7) e C-6 (C 72,3)
confirmam a proposta estrutural para a substância 16.
Os quatro hidrogênios olefínicos remanescentes foram atribuídos ao H-12 (H
5,35), H-13 (H 6,08), H-14 (H 5,88) e H-15 (H 5,61), o qual possuem orientação trans
de acordo com as constantes de acoplamento de 15,2 Hz. No espectro de COSY o H-
13 mostrou correlação 1H-1H com o H-12 e H-14, da mesma maneira o H-15
apresentou correlação com H-14 e H-16 (H 1,99, 2H), e H-17 (H 1,36) com H-16 e
H-18 (H 0,86) formando a subunidade 1,3-heptenil. A conectividade da subunidade
1,3-heptenil com o cicloexeno foi confirmada pela correlação apresentada no espectro
de COSY do H-10 com o H-12.
Os espectros de RMN de 1H e 13C evidenciaram a presença de uma anel
ciclopentano, o qual contém um grupo éster devido a presença da carbonila em C
174,4 (C-1) no espectro de RMN de 13C. O espectro de 13C apresentou ainda carbonos
olefínicos de dupla terminal em C 156,8 (C-3) e C 89,1 (C-11, H 4,72 e 4,64), e um
carbono ligado a um grupo hidroxila C 69,1 (C-4). O espectro COSY apresentou as
correlações 1H-1H do H-11a (H 4,72) e H-11b (H 4,64) com o H-4 (H 5,18).
de ROESY e RMN de 1H. O sinal em H 3,70 (H-6) apresentou correlação com o H-10
e H-7, e H-4 com H-10, indicando que o H-4, H-6, H-7 e H-10 possuem a mesma
orientação espacial na molécula (Figura 77).
164
Figura 77: Correlações observadas em ROESY para o composto 16
A configuração absoluta da posição C-7 foi determinada utilizando o método

modificado de Éster de Mosher. A reação da substância 16 com (R)- e (S)-MTPA-Cl
forneceu (S)- e (R)-MTPA ésteres 16a e 16b, respectivamente (Figura 78). Análise
dos valores de  (S - R), confirmam a absoluta estereoquímica R para o C-7,
confirmando a absoluta estereoquímica para a substância 16. Esses dados
associados aos dados da literatura permitiram identificar a substâncias 16 como um
oxaspirol, e de acordo com a estereoquimica absoluta foi identificado como um novo
estereoisômero nomeado exaspirol E.
Figura 78: Valores de  [( em ppm) = S - R] para 16

165
Tabela 21: Dados de RMN obtidos para a substância 16 (CDCl3, 400 MHz)
Posição 1
H  (J = Hz) 13
C
1 - 174,4
3 - 156,8
4 5,18 (s) 69,1
5 - 57,9
6 3,70 (d, 7,6) 72,3
7 4,78 (d, 5,6) 69,7
8 5,70 (d, 10,0) 127,6
9 5,50 (d, 13,0) 129,3
10 3,64 (d, 6,4) 39,3
11a 4,72 (t, 2,0) 89,1
11b 4,64 (t, 2,0) 89,1
12 5,35 (dd, 15,2; 8,8) 126,4
13 6,08 (dd, 15,2; 10,4) 135,1
14 5,88 (dd, 14,8; 10,4 129,4
15 5,61 (dd, 15,2; 7,2) 135,8
16 1,99 (q, 7,2) 34,7
17 1,36 (sext, 7,2) 22,3
18 0,86 (t, 7,2) 13,7
11
HO
HO
4 3
HO O
6
1
7 5
8 10 O
9
12 14 16 18
A substância 17 foi isolada como um sólido branco amorfo. O espectro de

absorção no UV mostrou absorção máxima em  = 235 nm sugerindo a presença de
ligações duplas conjugadas. O espectro de RMN de 1H apresentou sinais
característicos dos oxaspirois e muito similares aos apresentados para o composto
anterior, sugerindo se tratar de um estereoisômero.
166
O espectro de RMN de 1H apresentou seis sinais característicos de hidrogênios

metínicos olefínicos [H 5,83 (H-8), 5,80 (H-9), 5,36 (H-12), 6,00 (H-13), 5,97 (H-14) e
5,65 (H-15)], um metileno olefínico em 4,93 (11a), 4,76 (11b) e um carbono sp2 em
156,8. Também foram visualizados três hidrogênios oximetinicos [H 5,30 (H-4), 4,04
(H-6 e H-7)], um hidrogênio metínico [H 3,34 (H-10)], dois grupos metilenicos alifáticos
em [H 2,02 (H-16) e 1,38 (H-17)] e uma metila em [H 0,88 (H-18)]. Adicionalmente,
no experimento de RMN de 13C foi observado em valor em 172,4 que foi atribuído a
uma lactona de 5 membros.
Os sinais em H 5,74 (d, 10,0 Hz) e 5,58 (dd, 10,0 e 2,0 Hz) foram atribuídos a
ligação dupla cis entre H-8 e H-9, respectivamente.
O espectro de COSY mostrou correlação 1H-1H dos hidrogênios em H 4,04 (H-
6/H-7) com o H-8 ( 5,83) e o H-10 com H-9 e H-12. Esses resultados juntamente com
os deslocamentos químicos do H-7 e H-6 estabelecem o esqueleto cicloexeno com a
dupla ligação entre C-8 e C-9, um grupo hidroxila conectado ao C-6 e ao C-7 e um
carbono quaternário em C-5. O deslocamento químico de C-7 (C 69,8) e C-6 (C 71,4)
confirmam a proposta para a substância 17.
Os quatro hidrogênios olefincos remanescentes foram atribuídos ao H-12 (H
5,36), H-13 (H 6,00), H-14 (H 5,97) e H-15 (H 5,65), o qual foi estabelecido a
orientação trans comparando-se com os dados de RMN de 1H obtidos anteriormente
da substância 16. Comparando-se os dados de RMN de 13C e 1H da substância 16
com a 17 pode-se estabelecer a subunidade 1,3-heptenil presente na estrutura da
substância 17. A conectividade da subunidade 1,3-heptenil com o cicloexeno foi
confirmada pela correlação apresentada no espectro de COSY do H-10 com o H-12.
Os espectros de RMN de 1H e 13C evidenciaram a presença de uma anel
ciclopentano, o qual contém um grupo éster devido a presença da carbonila em C
172,4 (C-1) no espectro de RMN de 13C. O espectro de 13C apresentou ainda carbonos
olefinicos de dupla terminal em C 156,2 (C-3) e C 90,3 (C-11, H 4,93 e 4,76), e um
carbono ligado a um grupo hidroxila C 69,9 (C-4).
de ROESY e RMN de 1H. O sinal em H 3,70 (H-6) apresentou correlação com o H-10
e H-7, o H-4 apresentou correlação com o H-10, indicando que o H-4, -6, H-7 e H-10
possuem a mesma orientação espacial na molécula (Figura 79).
167
Figura 79: Correlações ROESY observadas para 17
HO
HO
H O
HO
H O
A configuração absoluta de C-7 foi determinada utilizando o método modificado

de Éster de Mosher. A esterificação da substância 17 com (R)- e (S)-MTPA-Cl
forneceu os ésteres (S)- e (R)-MTPA 17a e 17b, respectivamente (Figura 80). Análise
dos valores de  (S - R), confirmaram a estereoquímica absoluta R para o C-7.
Considerando que a estereoquímica relativa de 17 foi estabelecida da pela
análise de RMN e ROESY e que a determinação da configuração absoluta de C-7 foi
estabelecida, foi possível determinar a configuração absoluta para o oxaspirol C. Esta
substância é descrita na literatura, no entanto a configuração absoluta não havia sido
descrita, sendo esta uma informação nova. A substância 17 apresenta atividade
antibiótica contra os Bacillus subtilis com MIC de 50 μg mL-1 (DOI et al., 1985).
Figura 80: Valores de  [( em ppm) = S - R] para 17

168
Tabela 22: Dados de RMN obtidos para a substância 17 (400 MHz)

Posição 1
H  (J = Hz) 13
C
1 - 172,4
3 - 156,2
4 5,30 (sl) 69,9
5 - 56.5
6 4.04 (m) 71,4
7 4,04 (m) 69,8
8 5,74 (d, 10,0 Hz) 127,7
9 5,58 (dd, 10,0 Hz, 2,0 Hz) 128,9
10 3,34 (dd, 9,2; 4,0) 39,6
11a 4,93 (t, 2,4) 90,3
11b 4,76 (t, 2,4) 90,3
12 5,36 (dd, 14,0 Hz) 126,8
13 6,00 (m) 134,3
14 5,97 (m) 129,4
15 5,65 (m) 136,1
16 2,02 (q, 7,2) 34,8
17 1,38 (q, 7,6) 22,4
18 0,88 (t, 7,2) 13,8
11
O
HO
3
HO O
1
7 5
10 O
A substância 18 foi isolada em mistura como um solido amarelado. Inúmeras

tentativas de purificação foram realizadas, no entanto com resultado negativo. Deste
modo decidimos pela determinação estrutural em mistura.
169
O espectro de absorção no UV mostrou absorção máxima em  = 228 nm. O

espectro de RMN de 1H apresentou sinais similares aos apresentados para os
compostos anteriores, sugerindo se tratar da mesma classe química.
A substância 18 foi isolada como uma mistura de enantiomeros. O espectro de
RMN de 1H apresentou sinais característicos da subunidade 1,3-heptenil,
apresentando os sinas do H-18 (H 0,84; t, J = 7,2 Hz), H-17 (H 1,35; q, J = 7,6 Hz),
H-16 (H 1,98; m) e dos hidrogênios olefinicos H-12 a H-15 (H 5,08-6,15). O espectro
de RMN de 1H apresentou os sinais característicos dos hidrogênios carbinólicos (H
4,03 e 4;63) do hidrogênio metínico H-10 (H 3,41) e dos hidrogênios da dupla ligação
terminal H-11 (H 5,04 e 5,39). Esses dados associados aos dados obtidos da
literatura foi possível identificar a substância 18 como oxaspirol B. O oxaspirol B
apresentou atividade antibiótica contra os Bacillus subtilis com MIC de 10 μg mL-1.
Os compostos isolados pertencem a classe dos oxaspirois, a biossíntese

desses compostos ocorre pela via policetidica. A proposta biossintética para a
formação dos oxaspirois e seus derivados baseia-se na condensação de sete
molécula de acetil-SCoA, acompanhada de condensação, podendo seguir por duas
vias diferentes, uma sendo a reação com o succinil-CoA (via biossintética 1) e a outra
reagindo com o ácido pirúvico (via biossintética 2). Nas Figura 81 e Figura 82,
encontra-se uma possível rota biossintética para os compostos (MURAKAMI et al.
2009; MURAKAMI, TAKADA, HASHIMOTO 2009).
170
Figura 81: Proposta biossintética para o oxaspirol E e C
O SEnz
O
O
7x
SCoA O
O O O
[O] O A
Redução/Desidratação
O X
HO
HO
B O
O
HO
OH OH
y
O via 1 via 2
Succinil-CoA ácido pirúvico
(forma enólica)
O OH
O
X
O OH
O O HO
HO
HO
HO C F
oxaspirol (E/C)
O OH O OH
OH X O
O OH O OH
HO HO
HO HO
D E
tipo ácido fumárico tipo oxaloacetato

171
Figura 82: Proposta biossintética para os derivados do oxaspirol
H2O
O
O OH
HO
HO F
oxaspirol
OH
OH O HO
COOH
O
O OH
HO
HO J
G
HO
forma ceto
descarboxilação descarboxilação
metilação no -OH
OH
HO O
O
O
HO
H HO K
HO
14
migração
1,2-cetoalcool
O
OH
HO
HO I
15
7.1.6 Resultado obtido dos ensaios biológicos realizados com as substâncias

puras
Os compostos 16-18 foram testados nos ensaio de citotoxicidade e todos os

compostos foram inativos nas concentrações testadas.
172
Conclusão
8 CONCLUSÃO
Observamos neste trabalho que o uso de modificadores epigenéticos, no cultivo

do micro-organismo, para promover a expressão gênicas das vias biossintéticas
podendo alterar a produção metabólica do fungo, havendo um aumento de 9,2 vezes
na produção em relação a massa, bem como a produção de novos compostos. Essa
técnica se demostrou de fácil manipulação e rápida na avaliação da variação
metabólica do fungo testado.
O crescimento em escala ampliada e estudo químico do fungo Lecythophora
sp. nos permitiu identificar 2 (14 e 15) compostos diferentes presentes no cultivo com
modificador epigenético, comparando-se com o cultivo sem modificador,
demostrando, dessa maneira, que o uso da epigenética pode ser um meio fácil para
a produção de novos compostos.
Apesar dos compostos conhecidos terem atividade antifúngica relatada, os
compostos 16-18 não foram ativos nos ensaios realizados.
O estudo com fungos endofíticos de liquens são importantes devido aos poucos
estudos relacionados a esta classe de micro-organismos, o isolamento das estruturas
inéditas 14 e 15 comprovam a necessidade de estudos químicos com essa classe de
fungos.
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185
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medicinal plant Moringa oleifera Lam. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, v. 28, n. 5, p. 2107-2112, 2012.
186
ANEXOS
Figura 83: Espectro de Massas de alta resolução para a substância 1 (Ej-f3)
Intens. -MS, 5.4min #320
x104
117.0191
2.5
2.0
118.0148
1.5
1.0
0.5
112.9853 131.0835
151.0387
147.0467 153.0179
110.9758
135.0426 145.0512
129.0202 149.0463
0.0
100 110 120 130 140 150 m/z
187
Figura 84: Espectro de Massas de alta resolução para a substância 1 (Ej-fv2)
Intens. -MS, 2.5-4.9min #(149-295)
x104
117.0191
1.5
1.0
0.5
118.0180
112.9855 129.0190
139.0002 151.0399
0.0
100 110 120 130 140 150 m/z
188
Figura 85: Espectro de Massas de alta resolução para a substância 4
Intens. +MS, 2.5-3.6min #(150-215)
x105
317.1317
611.2777
333.1088
461.1957 551.3500 755.3392

683.4267
0
100 200 300 400 500 600 700 800 m/z
189
Figura 86: Espectro de RMN de 1H da substância 4 (DMSO-d6, 500MHz)
190
Figura 87: Espectro de RMN de 13C da substância 4 (DMSO-d6, 125 MHz)
191
Figura 88: Espectro de HMQC da substância 4 (DMSO-d6)
192
Figura 89: Espectro de HMBC da substância 4 (DMSO-d6)
193
Figura 90: Espectro de COSY 1H-1H da substância 4 (DMSO-d6)
194
Intens. +MS, 2.5-4.8min #(151-288)
x105
301.1360
1.50
576.2780
1.25
155.0594
1.00
437.2029
0.75
331.1467
0.50 317.1122
715.3520
243.1049
188.0802
0.25
279.1541
122.0388
382.1779
507.3214
0.00
200 300 400 500 600 700 m/z
195
Figura 92: Espectro de RMN de 1H da substância 5 e 6 (DMSO-d6, 500 MHz)
196
Figura 93: Espectro de RMN de 13C da substância 5 e 6(DMSO-d6, 125 MHz)
197
Figura 94: Espectro de HMQC da substância 5 e 6(DMSO-d6)
198
Figura 95: Espectro de HMBC da substância 5 e 6(DMSO-d6)
199
Figura 96: Espectro de COSY da substância 5 e 6(DMSO-d6)
200
Figura 97: Espectro de ROESY da substância 5 e 6 (DMSO-d6)
201
Intens. +MS, 2.9-6.2min #(176-370)
x104
315.1162
393.2921
275.0871
2
253.1027
551.3499 595.3744
639.4015
507.3231
4.0162
0
200 300 400 500 600 700 m/z
202
Figura 99: Espectro de RMN de 1H para a substância 7 (CDCl3)
203
Figura 100: Espectro de HMQC para a substância 7 (CDCl3)
204
Figura 101: Espectro de HMBC para a substância 7 (CDCl3)
205
VanessaFr01-P9_esipos_1106201201_120605172101 #5-39 RT: 0.05-0.47 AV: 35 NL: 7.18E1
Figura 102: Espectro de Massas de baixa resolução para a substância 8
T: ITMS - c ESI Full ms [50.00-800.00]
60.23
100
90
80
70
60
50
62.20
40
201.67
30
20 75.29
10 77.26 219.84
235.83
98.46 181.80
0
100 150 200 250 300 350
m/z
206
Figura 103: Espectro de RMN de 1H da substância 8 (DMSO-d6)
207
Figura 104: Espectro de RMN de HMBC da substância 8 (DMSO-d6)
208
Figura 105: Espectro de RMN de COSY da substância 8 (DMSO-d6)
209
VanessaFr01-P10_esineg_1106201201_120605172101 #29 RT: 0.29 AV: 1 NL: 4.28E2
Figura 106: Espectro de massas de baixa resolução para a substância 9
T: ITMS - c ESI Full ms [55.00-400.00]
205.36
100
90
80
70
60
50
40 207.11
30
20
209.89
10 62.42 221.53
203.16 255.46 321.18 339.64 373.38
0
100 150 200 250 300 350 400
m/z
210
Figura 107: Espectro de RMN de 1H da substância 9 (DMSO-d6)
211
Figura 108: Espectro de HMQC da substância 9 (DMSO-d6, 500 MHz)
212
Figura 109: Espectro de HMBC da substância 9 (DMSO-d6, 500 MHz)
213
Figura 110: Espectro de COSY da substância 9 (DMSO-d6, 500 MHz)
214
Figura 111: Espectro de massas de baixa resolução para a substância 10
Vanessa_Fr01_P11_esipos_1206201201_120611161116 #18 RT: 0.13 AV: 1 NL: 3.86E3
T: ITMS + c ESI Full ms [55.00-800.00]
205.18
100
90
80 279.12
70
Relative Abundance
60
50
40 187.30
85.06
30
207.26
20
219.26 301.30 345.26 391.13 443.62
107.08
10 149.21 261.34 317.42
117.10
0
100 150 200 250 300 350 400
m/z
215
216
Figura 113: Espectro de HMQC da substância 10 (DMSO-d6)
217
Figura 114: Espectro de HMBC da substância 10 (DMSO-d6)
218
Figura 115: Espectro de COSY da substância 10 (DMSO-d6)
219
Figura 116: Espectro de NOESY da substância 10 (DMSO-d6)
220
Intens. +MS, 2.3-5.1min #(138-306)
x105
413.2616
1.0
217.0436
0.8
588.4052
0.6 441.2933
0.4
233.1221
157.0810
0.2 177.0519
196.0904 301.1362
393.2920
604.3805
457.2677
284.3261 487.3537509.1756531.3798
0.0
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z
221
Figura 118: Espectro de RMN de 1H da substância 11 (CDCl3, 500 MHz)
222
Figura 119: Espectro de HMQC da substância 11 (CDCl3, 500 MHz)
223
Figura 120: Espectro de HMBC da substância 11 (CDCl3, 500 MHz)
224
Figura 121: Espectro de COSY da substância 11 (CDCl3, 500 MHz)
225
Figura 122: Espectro de RMN de 1H dsa substâncias 12 e 13 (CDCl3, 500 MHz)
226
Figura 123: Espectro de Massas de alta resolução para as substâncias 12 e 13
Intens. +MS, 2.0-3.5min #(119-206)
x104
217.0438
8
413.2619
4 267.1077
195.0626 441.2939
301.1369
2
177.0520 487.3561
588.4052
393.2931 531.3821
245.1246
329.1679 355.2771 619.4333
283.1003
547.3549
157.0810 503.3310 635.4058
0
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z
227
Figura 124: Espectro de RMN de 1H das substâncias 3 (CDCl3, 500 MHz)
228
Figura 125: Espectro de RMN de 1H da substância 14 (CDCl3)
229
Figura 126: Espectro de RMN de 13C da substância 14 (CDCl3)
230
Figura 127: Espectro de HMQC da substância 14 (CDCl3)
231
Figura 128: Espectro de HMBC da substância 14 (CDCl3)
232
Figura 129: Espectro de COSY da substância 14 (CDCl3)
233
Figura 130: Espectro de ROESY da substância 14 (CDCl3)
234
235
236
237
238
239
Figura 136: Espectro de RMN de 1H da substância 16 (400 MHz, CDCl3)
240
241
242
243
244
245
246
Figura 143: Espectro de HSQC da substância 17 (CDCl3)
247
248
249
250
251

Bioprospecção Dos Fungos Endofíticos Associados À Espécie Vegetal Eugenia Jambolana

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Bioprospecção Dos Fungos Endofíticos Associados À Espécie Vegetal Eugenia Jambolana

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UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“Júlio de Mesquita Filho”

VANESSA MARA CHAPLA

Bioprospecção dos fungos endofíticos associados à espécie

Bioprospecção dos fungos endofíticos associados à espécie

Tese apresentada ao Instituto de Química,

Orientadora: Prof. Dra Angela Regina Araujo

Nome: Vanessa Mara Chapla

(1) Doutorado em Química – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita

(2) Mestrado em Química – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

(3) Graduação em Química Bacharelado - Universidade Estadual do Oeste do

(1) Bolsista de Doutorado – CAPES (2010-2014)

(2) Bolsista de estagio de doutoramento – CAPES (2012-2013)

Artigos completos publicados em periódicos

1. CHAPLA, V. M., BIASETTO, C. R., ARAUJO, A. R.

2. SILVA, Cristiana Da, SAVARIZ, Franciele Cristina, FOLLMANN, Heveline Dal

Trabalhos Apresentados em Congressos

1. CHAPLA, V. M., CAVALHEIRO, A. J., BOLZONI, V.S., FERREIRA, P. M. P.,

2. ARAUJO, A. R., CHAPLA, V. M., LOPES, M.N., SILVA, D.H.S., CAVALHEIRO, A.

6. CHAPLA, V. M., SOMENSI, A., CAVALHEIRO, A. J., BOLZANI, V. S., ARAUJO, A.

9. CHAPLA, V. M., ZANARDI, M. L., LOPES, M.N., CÂMARA, M.P.S., ARAUJO, A.

12. CHAPLA, V. M.; OLGUIN, C. F. A.; BRAUN, G.; CORNELIUS T. F. M.

13. CHAPLA, V. M.; OLGUIN, C. F. A.; BRAUN, G. Avaliação da atividade citotóxica

14. SILVA, C.; CHAPLA, V. M.; CAMPOS, S. D. Substituição e modificação do cimento

15. CHAPLA, V. M.; OLGUIN, C. F. A. Investigação fitoquímica do extrato hexânico

CHAPLA, V. M. Palestra Intitulada: Avaliação Química e biológica do fungo endofítico

Monografias de conclusão de curso de aperfeiçoamento/especialização

Participou da comissão organizadora do I Encontro Paranaense de Estudantes de

Estágio docente em Química Orgânica Experimental II - UNESP (março de 2009 a

Bolsista didático – Professora da disciplica de Química Orgânica I (4 horas/semana,

Iniciação Científica (IC) voluntária concedida pela PICV/UNIOESTE/PRPPG (2007).

A UNESP e ao Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química- Araraquara, pela

Á CAPES pelas bolsas concedidas e a FAPESP pelo financiamento.

Um lugar onde as pessoas

Sozinho pelas ruas de São Paulo

Os produtos naturais têm desempenhado um papel importante pela humanidade, no

Palavras-chave: Fungos endofíticos, Eugenia jambolana, epigenética, Saccharicola

Keywords: Endophytic fungi, Eugenia jambolana, epigenetic, Saccharicola sp.,

Figura 1: Substâncias bioativas isoladas de fungos endofíticos ............................... 38

Figura 40: Espectro de RMN de 1H do extrato do fungo Ej-fv4 em DMSO-d6 (500

Figura 66: Fluxograma da obtenção e triagem dos extratos brutos obtidos de

Figura 96: Espectro de COSY da substância 5 e 6 (DMSO-d6).............................. 200

Figura 130: Espectro de ROESY da substância 14 (CDCl3)................................... 234

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AChE Enzima Acetilcolinesterase

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

LISTA DE SUBSTÂNCIAS IDENTIFICADAS

3 Parte experimental ............................................................................................. 62

3.3 Isolamento das cepas fúngicas .................................................................... 64

4.6.2 Determinação estrutural da substância 5 ............................................ 111

6 Parte experimental ........................................................................................... 140

6.5 Cultivo em escala ampliada do fungo Lecythophora sp e obtenção do extrato

1.1 Produtos naturais

Os produtos naturais são em geral, de origem pré-biótica ou originam-se de

entidades químicas introduzidas no mercado entre 1981 a 2002, cerca da metade

são considerados uma fonte importante de metabólitos bioativos com atividades

Estima-se que o Reino Fungi apresente, aproximadamente, 1,5 milhões de

classes de substâncias que podem ser utilizadas na indústria farmacêutica (humana

1.3 Fungos endofíticos

O termo endófitos, originalmente descrito por De Bary em 1866, refere-se a

micro-organismos endofíticos de plantas de diferentes ecossistemas (KUSARI;

1.3.1 Interação com o hospedeiro

Apesar de espécies dos gêneros Phomopsis, Phoma, Colletotrichum e