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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA Código

FACULTAD DE INGENIERÍA
Departamento de Ingeniería de Alimentos Página
Maestría en Ciencias Agroalimentarias

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y LOS PARAMETROS KM


Y VMAX DE LA GLUCOAMILASA EN LA PRODUCCION DE DE D-GLUCOSA A
PARTIR DE MALTODEXTRINAS UTILIZANDO EL METODO DE DNS.
HUMBERTO PEREZ TAMARA
RESUMEN
la cinética enzimática permite calcular parámetros referentes
a la actividad de una enzima y así ver que tan efectiva es en
cuanto a la capacidad de producir producto a partir de
sustrato, además es conveniente estudiarlas debido a que son
eficientes y menos costosas en muchos casos, tienen un alto
grado de especificidad y adaptabilidad. Este estudio midió la
actividad enzimática de la glucoamilasa en diferentes
condiciones de reacción en cuanto a la concentración del
sustrato, la velocidad máxima Vmax de reacción y la constante
de Michaelis-Menten Km. Para lo cual se desarrollaron
reacciones de sacarificación con concentraciones de
maltodextrinas al 1%, 2%, 3%, 4%, 5% y 6%. Se tomaron muestras
del sistema cada 10 min hasta llegar a 80 min y se llevaron a
un baño de ebullición por 5 min para inactivar la enzima y
detener la reacción, se determinaron azucares reductores por
el método DNS a cada muestra, a partir de esto se obtuvieron
los parámetros cinéticos y la actividad enzimática. Expresando
que Vmax calculado estuvo por encima de los valores
experimentalmente se obtuvieron, es decir, que los tiempos de
reacción fueron insuficientes para alcanzar la Vmax se reacción
a las condiciones de trabajo. Además se identifico la
existencia del efecto de la concentración de sustrato sobre la
actividad enzimática, dado que la actividad enzimática fue en
aumento, en función del aumento de la concentración de
sustrato.
Palabras clave: Actividad, Enzimática, Velocidad Vmax, Km,
Sustrato, Glucoamilasa

ABSTRACT

Enzymatic kinetics allows to calculate parameters referring to


the activity of an enzyme and thus see how effective it is in
terms of the ability to produce product from substrate, it is
also convenient to study them because they are efficient and
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less expensive in many cases. A high degree of specificity and


adaptability. This study measured the enzymatic activity of
glucoamylase under different reaction conditions in terms of
substrate concentration, the maximum reaction rate Vmax and
the Michaelis-Menten Km constant. For this purpose,
saccharification reactions with concentrations of
maltodextrins were developed. 1%, 2%, 3%, 4%, 5% and 6%.
Samples of the system were taken every 10 min until reaching
80 min and were taken to a boiling bath for 5 min to inactivate
the enzyme and stop the reaction, reducing sugars were
determined by the DNS method to each sample, from this obtained
the kinetic parameters and the enzymatic activity. Expressing
that calculated Vmax was above the experimentally obtained
values, that is, that the reaction times were insufficient to
reach the Vmax reaction to the working conditions. In addition,
the existence of the effect of substrate concentration on
enzyme activity was identified, since the enzymatic activity
was increasing, depending on the increase in substrate
concentration.
Key words: Activity, Enzymatic, Speed Vmax, Km, Substrate,
Glucoamylase

INTRODUCCION
Los principios generales de la cinética de las reacciones
químicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las
enzimas, es así como L. Michaelis y M. Menten lograron
desarrollar una ecuación modelo que se ajusta al comportamiento
de las enzimas en una reacción (Lehninger A. 1978). A partir
de esta ecuación se pueden dilucidar parámetros experimentales
catalíticos propios de la enzima, como su Km (constante de
Michaelis-Menten) para un sustrato, con base en la
linealización de la ecuación de la velocidad, llamada modelo
lineal de Lineweaver-Burk (Voet D, et al 2006). La constante
de Michaelis-Menten (Km) es una magnitud determinada
experimentalmente y definida como la concentración de sustrato
a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la
velocidad máxima (Lehninger A. 1978).
La glucoamilasa (glucano 1,4-α-glucosidasa) es una enzima
fúngica, extracelular, producida comercialmente con
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Aspergillus niger o Rhizopus sp., que libera unidades de d-


glucosa de los extremos no reductores del almidón y de
oligosacáridos como las maltodextrinas. Esta habilidad de
degradación del almidón a glucosa tiene una gran aplicación
industrial en el proceso de producción de jarabes de glucosa,
materia prima en panadería, en la industria de bebidas y en
infinidad de procesos biotecnológicos de los cuales los más
representativos son la producción de fructosa y etanol
(Jennylynd AJ, Byong HL.1997).
Se han llevado a cabo un gran número de estudios empleando
glucoamilasa para obtener jarabes glucosados de almidón con
enzimas comerciales y enzimas de cepas aisladas; igualmente se
han probado sistemas de inmovilización, sistemas de retención
por membrana, etc., con el fin de mejorar la economía del
proceso (Agudelo B,et al 2004, Kovalenko GA,et al 2006). En
muchas de estas investigaciones se han empleado enzimas
comerciales; sin embargo, la dinámica de incorporación de
nuevas enzimas al mercado hace que en el curso de pocos años
los resultados alcanzados sean mejorados con nuevas enzimas.
La tradicional enzima amiloglucosidasa AMG 300L®, de
Novozymes, es una de las más empleadas para la sacarificación
de maltodextrinas (Nebesny E,et al 2004, (Mera I, Carrera CJ.
2005). Con esta enzima se han alcanzado conversiones de
maltodextrinas hasta del 90% en azúcares reductores en 72 h de
tratamiento, empleando concentraciones de AMG 300L® de 0,75
AGU/mL para tratar soluciones de hasta 60 g de maltodextrinas/L
(Mera I, Carrera CJ. 2005, Flores O, Uribe N. 2001).
El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-
ácidodinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos
presentes en una muestra, seguido de la determinación
espectrofotométrica a 575nm de los azúcares reductores. Esta
técnica sirve para cuantificar los azucares reductores
producidos durante una fermentación o para cuantificar los
productos de una reacción enzimática. (Miller GL, 1959)
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MATERIALES Y METODOS

Reactivos

Se empleon las enzimas Glucoamilasa.


Las maltodextrinas, un digerido enzimático de almidón de maíz
con un 25% de azúcares reductores.
Acido 3,5-dinitrosalicílico DNS

Sacarificación enzimática de maltodextrinas

Con el fin de evaluar el efecto de la concentración de enzima


y de sustrato sobre la formación de azúcares reductores y la
velocidad de reacción, las reacciones de sacarificación se
llevaron a cabo a 28°C en Erlenmeyer de 500 mL con 300 mL de
volumen de reacción en una solución buffer de acetato (0,1 M)
pH 4,3. Se prepararon 6 concentraciones de maltodextrinas al
1%, 2%, 3%, 4%, 5% y 6%. Se tomaron muestras del sistema en
diferentes tiempos (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 min) y
se llevaron a un baño de ebullición por 5 min para inactivar
la enzima y detener la reacción.

Determinación de azúcares reductores

La determinación de azúcares reductores se realizó por el


método de ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS (Miller GL, 1959).
Una vez detenida la reacción, se hizo dilución de 0,1:12 cada
muestra se centrifugó y a 1 mL del líquido claro se le adicionó
1 mL de solución de DNS. La mezcla se calentó durante 5 minutos
hasta ebullición, se enfrió en un baño de hielo y se midió la
absorbancia de la muestra a 575 nm en un espectrofotómetro.
Modelo matemático de la cinética

El modelo general propuesto para describir la hidrólisis en un


sistema por lotes se presenta en las ecuaciones 1, 2 y 3. La
expresión cinética de velocidad de hidrólisis propuesta es
tipo Michaelis Menten.
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𝒅[𝑺]
= −𝒗 𝑬𝒄 𝟏
𝒅𝒕

𝒅[𝑷]
=𝒗 𝑬𝒄 𝟐
𝒅𝒕
𝑽𝒎𝒂𝒙[𝑺]
𝒗= 𝑬𝒄 𝟑
𝑲𝒎 + [𝑺]
Donde [s] y [p] son la concentración de maltodextrinas y de
azúcares reductores en Mm/mL respectivamente. Vmax (Mm/mL-min)
y Km (Mm/mL) son parámetros del modelo que representan la
velocidad máxima de formación de azúcares reductores y la
concentración de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la
velocidad máxima, respectivamente.

REULTADOS Y DISCUCION
Construcción de la Curva patrón
Cuadro 1. Absorbancias de las muestras de concentración (µg/mL)
conocida a una longitud de onda de 575 nm medidas en un
espectrofotómetro.

ml S/n
Tubo mL agua Concentración Absorbancia
Estándar (µg/mL)
1 0 1 0 0
2 0,2 0,8 200 0,038
3 0,4 0,6 400 0,093
4 0,6 0,4 600 0,162
5 0,8 0,2 800 0,241
6 1 0 1000 0,291
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Gráfico 1. Recta de calibración generada con concentraciones


en µg/mL y absorbancias a 575 nm de 6 patrones de glucosa

Recta de Calibracion
0,35
y = 0,0003x - 0,0149
0,3 R² = 0,9899
0,25
Adsorbancia nm

0,2

0,15

0,1

0,05

0
0 200 400 600 800 1000 1200
-0,05
Concentracion ppm

Es a partir de esta gráfica que se obtiene por el método de


regresión matemática una ecuación lineal y = 0,0003x - 0,0149,
con un coeficiente de correlación (R²) de 0,9899; por
medio de la cual se pudo calcular la concentración de
la muestra incógnita.
Cálculo de la concentración de la muestra incógnita de la
dilución 0,1:12 a partir de la ecuación lineal se tiene lo
siguiente:
Absorbancia = 0,0003C2 - 0,0149, despejamos C2 y tenemos
entonces
𝐴𝑏𝑠 + 0,0149
𝐶2 =
0,0003
Para cada valor de absorbancia tenemos un C2 que corresponde a
P dilución en los cuadros 2-7, a partir de C2 calculamos la
concentración presente en la alícuota inicial de 0,1 Ml,
utilizando la siguiente ecuación 4:
C1 V1 = C2 V2 Ec. 4
𝐶2 𝑉2
𝐶1 =
𝑉1
Donde V1= 0,1 mL, V2=12 mL
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Cuadro 2. Absorbancia de la muestra en una dilución de 0,1:12


para una concentración de 1% del sustrato y 0,5 mL de Enzima.

P
Sustrato Tiempo Absorbancia DILUCION PRODUCTO U Mm/min
% (min) nm Mm/mL mL
µg/mL
1% 0,00 0,006 69,67 0,046
1% 10,00 0,008 76,33 0,051 0,0025
1% 20,00 0,012 89,67 0,060 0,0015
1% 30,00 0,012 89,67 0,060 0,0010
1% 40,00 0,016 103,00 0,069 0,0009
1% 50,00 0,020 116,33 0,078 0,0008
1% 60,00 0,027 139,67 0,093 0,0008
1% 70,00 0,036 169,67 0,113 0,0008
1% 80,00 0,044 196,33 0,131 0,0008

Gráfico 2. Recta de velocidad e reacción para una concentración


de 1% del sustrato y 0,5 mL de Enzima

VELOCIDAD DE REACCION µg/mL min


0,140
y = 0,001x + 0,0372
0,120 R² = 0,9168
Glucosa µg/mL

0,100

0,080

0,060

0,040

0,020

0,000
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00
Tiempo min
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Cuadro 3. Absorbancia de la muestra en una dilución de 0,1:12


para una concentración de 2% del sustrato y 0,5 mL de Enzima.

P
Sustrato Tiempo Absorbancia DILUCION PRODUCTO U Mm/min
% (min) nm Mm/mL mL
µg/mL
2% 0,00 0,012 89,67 0,060 -
2% 10,00 0,015 99,67 0,066 0,0033
2% 20,00 0,016 103,00 0,069 0,0017
2% 30,00 0,034 163,00 0,109 0,0018
2% 40,00 0,051 219,67 0,146 0,0018
2% 50,00 0,057 239,67 0,160 0,0016
2% 60,00 0,063 259,67 0,173 0,0014
2% 70,00 0,076 303,00 0,202 0,0014
2% 80,00 0,079 313,00 0,209 0,0013

Gráfico 3. Recta de velocidad e reacción para una concentración


de 2% del sustrato y 0,5 mL de Enzima

VELOCIDAD DE REACCION µg/mL min


0,250

y = 0,0021x + 0,0485
0,200 R² = 0,9651
Glucosa µg/mL

0,150

0,100

0,050

0,000
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00
Tiempo min
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Cuadro 4. Absorbancia de la muestra en una dilución de 0,1:12


para una concentración de 3% del sustrato y 0,5 mL de Enzima.

P
Sustrato Tiempo Absorbancia DILUCION PRODUCTO U Mm/min
% (min) nm Mm/mL mL
µg/mL
3% 0 0,018 109,67 0,07
3% 10 0,028 143,00 0,10 0,0048
3% 20 0,039 179,67 0,12 0,0030
3% 30 0,060 249,67 0,17 0,0028
3% 40 0,076 303,00 0,20 0,0025
3% 50 0,082 323,00 0,22 0,0022
3% 60 0,094 363,00 0,24 0,0020
3% 70 0,101 386,33 0,26 0,0018
3% 80 0,118 443,00 0,30 0,0018

Gráfico 4. Recta de velocidad e reacción para una concentración


de 3% del sustrato y 0,5 mL de Enzima

VELOCIDAD DE REACCION Mm/mL min


0,35

0,30
y = 0,0028x + 0,074
R² = 0,9865
Glucosa Mm/mL

0,25

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo min
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Cuadro 5. Absorbancia de la muestra en una dilución de 0,1:12


para una concentración de 4% del sustrato y 0,5 mL de Enzima.

Sustrato Tiempo Absorbancia P DILUCION PRODUCTO U Mm/min


% (min) nm µg/mL Mm/mL mL
4% 0 0,021 119,67 0,080
4% 10 0,040 183,00 0,122 0,0061
4% 20 0,068 276,33 0,184 0,0046
4% 30 0,082 323,00 0,215 0,0036
4% 40 0,098 376,33 0,251 0,0031
4% 50 0,125 466,33 0,311 0,0031
4% 60 0,159 579,67 0,386 0,0032
4% 70 0,171 619,67 0,413 0,0030
4% 80 0,201 719,67 0,480 0,0030

Gráfico 5. Recta de velocidad e reacción para una concentración


de 4% del sustrato y 0,5 mL de Enzima

VELOCIDAD DE REACCION Mm/mL min


0,600

0,500 y = 0,005x + 0,0732


R² = 0,9922
Glucosa Mm/mL

0,400

0,300

0,200

0,100

0,000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo min
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Cuadro 6. Absorbancia de la muestra en una dilución de 0,1:12


para una concentración de 5% del sustrato y 0,5 mL de Enzima.

Sustrato Tiempo Absorbancia P DILUCION PRODUCTO U Mm/min


% (min) nm µg/mL Mm/mL mL
5% 0 0,040 183,00 0,122
5% 10 0,045 199,67 0,133 0,0067
5% 20 0,055 233,00 0,155 0,0039
5% 30 0,079 313,00 0,209 0,0035
5% 40 0,094 363,00 0,242 0,0030
5% 50 0,128 476,33 0,318 0,0032
5% 60 0,151 553,00 0,369 0,0031
5% 70 0,190 683,00 0,455 0,0033
5% 80 0,223 793,00 0,529 0,0033

Gráfico 6. Recta de velocidad e reacción para una concentración


de 5% del sustrato y 0,5 mL de Enzima

VELOCIDAD DE REACCION Mm/mL min


0,600
y = 0,0052x + 0,0727
0,500 R² = 0,9573
Glucosa Mn/ml

0,400

0,300

0,200

0,100

0,000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo min
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Cuadro 7. Absorbancia de la muestra en una dilución de 0,1:12


para una concentración de 6% del sustrato y 0,5 mL de Enzima.

Sustrato Tiempo Absorbancia P DILUCION PRODUCTO U Mm/min


% (min) nm µg/mL Mm/mL mL
6% 0 0,043 193,00 0,129 -
6% 10 0,045 199,67 0,133 0,0067
6% 20 0,062 256,33 0,171 0,0043
6% 30 0,088 343,00 0,229 0,0038
6% 40 0,116 436,33 0,291 0,0036
6% 50 0,132 489,67 0,326 0,0033
6% 60 0,161 586,33 0,391 0,0033
6% 70 0,188 676,33 0,451 0,0032
6% 80 0,236 836,33 0,558 0,0035

Gráfico 7. Recta de velocidad e reacción para una concentración


de 5% del sustrato y 0,5 mL de Enzima

VELOCIDAD DE REACCION Mm/mL min


0,600

0,500 y = 0,0053x + 0,0838


R² = 0,9679
0,400
Glucosa Mm/mL

0,300

0,200

0,100

0,000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo min
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Utilizando la ecuación de Lineweaver y Burk determinamos las


variables 𝐾𝑚 y 𝑉𝑚𝑎𝑥 de la cinética de enzimática presentada
en la siguiente cuadro 8

[S] Sustrato P producto 1/[S] 1/[P](


Mm/mL Mm/min mL (Mm/mL)-1 Mm/min mL)-1
0,00240 0,001 417 1000,000
0,00480 0,0021 208 476,190
0,00720 0,0028 139 357,143
0,00960 0,005 104 200,000
0,01200 0,0052 83 192,308
0,01440 0,0053 69 188,679

Gráfico 8. Recta del inverso velocidad de obtención de producto


vs inverso concentración del sustrato

CINETICA DE LA GLUCOAMILASA
1200,000
y = 2,4011x - 6,139
1/P producto (Mm/mL min)-1

1000,000 R² = 0,992

800,000

600,000

400,000

200,000

0,000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
1/[S] Sustrato (Mm/mL)-1

Según la ecuación de Lineweaver y Burk tenemos:


1 𝐾𝑚 1 1
= + 𝑬𝑪. 𝟓
𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥
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𝐾𝑚 1
= 2,4011 𝑦 = 6,139
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥

1
𝑽𝒎𝒂𝒙 = = 0,1629 𝑀𝑚/𝑚𝑖𝑛
6,139

𝑲𝒎 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 ∗ 2,4011 = 0,1629 𝑀𝑚/ min∗ 2,4011

𝐾𝑚 = 0,39 𝑀𝑚/mL

A partir del valor obtenido de Vmax encontramos que este valor


está por encima de los valores experimentalmente se obtuvieron,
es decir, que los tiempos de reacción fueron insuficientes
para alcanzar la Vmax. Adicional a esto los altos valores de
Km que se encontraron en este trabajo permiten indicar que los
ensayos se hicieron a muy bajas concentraciones de sustrato,
muy por debajo de los valores de Km. Esto quiere decir que si
se incrementa la concentración de maltodextrinas muy por encima
de 0,014 Mm/mL, y a mayor concentración de enzima, se podrían
obtener mayores velocidades de hidrólisis y, por consiguiente,
menores tiempos de tratamiento.

Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad


enzimática
Manteniendo la concentración de enzima constante, y aumentando
la concentración de maltodextrinas (sustrato) se observó un
comportamiento sigmoidal a medida de la actividad enzimática
fue aumentando en función del aumento de la concentración del
sustrato cuadro 9 y grafico 9
Cuadro 9. Concentración de sustrato y actividad enzimática
[S]
Sustrato U Mm/min
Mm/mL mL
0,00240 0,0008
0,00480 0,0013
0,00720 0,0018
0,00960 0,003
0,01200 0,0033
0,01440 0,0035
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Grafico 9. Efecto de la concentración de sustrato sobre la


actividad enzimática

ACTIVIDAD ENZIMATICA
0,004
0,0035
Mm/min mL

0,003
0,0025
0,002
0,0015
0,001
U

0,0005
0
0,00000 0,00200 0,00400 0,00600 0,00800 0,01000 0,01200 0,01400 0,01600
[S] Sustrato Mm/mL

La actividad enzimática fue en aumento, en función del aumento


de la concentración de sustrato (grafico. 9). Esto se debe a
que, mientras haya suficiente cantidad de enzimas, entonces al
aumentar la cantidad de sustrato, aumentará la cantidad de
complejos enzima-sustrato (ES) y se degradará la
maltodextrinas más rápido en aquellas muestras que tengan mayor
cantidad de ésta. Sucede que al haber más moléculas de
sustrato, aumenta la probabilidad de que las moléculas de
maltodextrinas se encuentren con el sitio activo de la enzima,
haciendo más rápida la catálisis, y generando más glucosa en
el mismo periodo de tiempo, razón que se traduce en el aumento
de la actividad enzimática.

En algún punto también se espera que la actividad enzimática


deje de aumentar, y se haga constante e independiente de la
cantidad de sustrato, pues la enzima pasa a ser el factor
limitante de la formación de complejo ES y por tanto de la
velocidad de reacción del proceso.
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FACULTAD DE INGENIERÍA
Departamento de Ingeniería de Alimentos Página
Maestría en Ciencias Agroalimentarias

CONCLUSIONES
De este trabajo se puede concluir que Vmax está por encima de
los valores experimentalmente se obtuvieron, es decir, que los
tiempos de reacción fueron insuficientes para alcanzar la Vmax
se reacción a las condiciones de trabajo. También podemos
deducir que si se incrementa la concentración de maltodextrinas
muy por encima de 0,014 Mm/mL, y a mayor concentración de
enzima, se podrían obtener mayores velocidades de hidrólisis
y, por consiguiente, menores tiempos de tratamiento.
También se puede afirmar que existió un efecto de la
concentración de sustrato sobre la actividad enzimática, dado
que la actividad enzimática fue en aumento, en función del
aumento de la concentración de sustrato.

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