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CURSO MICROBIOLOGÍA.
Directora Curso:
La práctica del laboratorio se realizó los días 16, 17 y 18 de Mayo del 2.015, en los
laboratorios, de la sede principal de la UNAD José Celestino Mutis, en la ciudad de Bogotá.
En el laboratorio se revisaron las temáticas: Análisis microbiológico del suelo, rec uentos
microbianos: Recuentos viables (recuento en placa en superficie y Número más probable) y
determinación de microorganismos patógenos del suelo.
3. MATERIALES Y METODOLOGÍA.
Composición
El método del Número más probable (NMP) (Most probable number - MPN - en inglés),
también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos
cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia
positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se
emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible.
Para el presente informe se presentan los datos de los grupos 1, 2 y 3 en la siguiente tabla.
Dilución NMP
10 -5 3
10 -6 3
10 -7 3
2
Dilución NMP
10 -5 0
10 -6 0
10 -7 0
Dilución NMP
10 -5 0
10 -6 0
10 -7 0
De acuerdo a la tabla anterior se puede observar que el grupo 1 tiene resultados positivos
para la presencia de coliformes ya que el caldo lactosado verde bilis brillante reacciona con
el grupo coliforme con la fermentación de la lactosa (turbidez) con producción de ácido y
gas (Burbuja).
Analizando la tabla de NMP se busca el número 3-3-3 dado que es positivo en las tres
diluciones y aparece que es > 1100 lo cual es positivo para la presencia de coliformes dado
que la muestra estaba inculada con cepas de E. coli
Medio SIM
Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro
de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Siembra
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con
aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la
punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es
importante que la siembra se realice en línea recta.
Incubación
Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.
Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich.
Resultados
Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de
siembra.
Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el
medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de
Kovac´s o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.
SIM MUESTRA
GRUPO RESULTADO RESULTADO
S I M INICIAL
1 E. coli - + +
2 Salmonella
+ - +
enteritidis
3 E. coli - - -
4 Enterobacter
- - +
aerogenesis
2-Desaminación de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna
cepas de Morganella spp.
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)
Microorgani smos Color en el pico de f lauta Color en la base del tubo Ennegrecimie nto del medio
P roteus mirabilis A T C C 4 3 0 7 1 Rojo A marillo N egativo
Salmonella typhimurium ATCC 14028 P úrpura P úrpura P os itivo
Salmonella enteritidis A T C C 1 3 0 7 6 P úrpura P úrpura P os itivo
P rovidenc ia s pp. Rojo A marillo N egativo
C itrobac ter freundii P úrpura A marillo P os itivo
M organella s pp.* Rojo A marillo N egativo
E dwars iella s pp. P úrpura P úrpura P os itivo
Klebs iella pneumoniae ATCC 7 00 6 0 3 P úrpura P úrpura N egativo
E s c heric hia c oli A T C C 2 5 9 2 2 P úrpura P úrpura N egativo
*Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la lisina.
MUESTRA
GRUPO LIA RESULTADO
INICIAL
1 E.coli -
2 Salmonella enteritidis -
3 E. coli -
4 Enterobacter
-
aerogenesis
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El
citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de
ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color
amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan
la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la
influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
Teroricamente la prueba para Salmonella enteritidis debe tomar tonalidades descritas en la
tabla pero en laboratorio la prueba es negativa quizá por la temperatura o porque no se
cumplieron las 24 horas completas.
1 E. coli -
2 Salmonella enteritidis +
3 E. coli -
4 Enterobacter aerogenesis +
Salmonella enteritidis es positiva para esta prueba dado que se observó crecimiento y color
azul en el pico, alcalinidad.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador
rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduc e a
sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico
sulfuro de hierro de color negro.
TSI MUESTRA INICIAL RESULTADO
GRUPO
G L S GAS H2S
1 E. coli + + + - -
2 Salmonella
+ + - + +
enteritidis
3 E. coli - - - - -
4 Enterobacter
+ + + + -
aerogenesis
Agar OF
Medio de cultivo utilizado en las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana en base al
metabolismo oxidativo-fermentativo de las bacterias Gram negativas, a la movilidad y
producción de gas.
Siembra
Inocular, por cada hidrato de carbono que se use y para cadamicroorganismo en estudio, 2
tubos conteniendo el medio O.F. y el mismo hidrato de carbono. Rotular un tubo con la
inscripción: “Abierto” y otro tubo con la inscripción: “Cerrado” (sellado).
Se debe informar: producción de ácido (A), ácido con gas (AG), alcalino (K) o sin cambio (-).
También, puede informarse si el organismo es móvil, cuando crece lejos de la línea de
inoculación.
MUESTRA RESULTADO
GRUPO OF
INICIAL
1. E-coli +
2. Salmonella enteritidis +
3. E. coli -
4. Enterobacter aerogenesis +
El medio basal O.F., fue desarrollado por Hugh y Leifson, para evidenciar la importancia del
significado taxonómico del metabolismo oxidativo-fermentativo de los hidratos de carbono
por las bacterias Gram negativas.
Prueba de UREA.
Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad ureásica.
Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Siembra
Sembrar un inóculo denso a partir de un cultivo puro de 24 horas.
Incubación
A 35-37 ºC, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12,24 y 48 horas de incubación.
Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar hasta 72 horas.
Resultados
1 E. coli -
2 Salmonella
-
enteritidis
3 E. coli -
4 Enterobacter
-
aerogenesis
La prueba dio negativa para urea al parecer porque las bacterias de estudio son
descomponedoras de urea pero lentas ya que teóricamente se recomienda visualizar a las
72 horas y solo se revisó a las 24 horas. Aunque comparado con la muestra inicial se
observan cambios en la coloración como turbiedad y otras que se tornan rosadas.
MR-VP Medio
Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer.
Es particularmente útil para la clasificación de enterobacterias.
Siembra
Por inoculación directa, a partir del cultivo en estudio.
Incubación
En aerobiosis, a 35-37°C por 3 días.
Resultados
Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio.
Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio
al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente
durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.
1 E-coli -
2 Salmonella enteritidis +
3 E. coli +
4 Enterobacter aerogenesis -
10 -5 -
10 -5 -
10 -5 -
10 -5 -
Para esta prueba se sembró de la dilución 10-5 del suelo y dio negativo por lo cual se
describe la ausencia de Pseudomonas aeruginosa.
1 E.coli -
2 Salmonella
+
enteritidis
3 E. coli +
4
Enterobacter -
aerogenesis
En el medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios
para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos, la
concentración de fosfatos estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de
piocianina y piorrubina.
YDCA
indican los componentes del medio: Yeast (levadura), ‘calcium carbonate’ (carbonato de
calcio), dextrosa y agar.
Resultados
GRUPO VDCA MUESTRA INICIAL RESULTADO
1 E-coli -
2 Salmonella
-
enteritidis
3 E. coli -
4 Enterobacter
-
aerogenesis
Agar EMB
Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de
bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el
desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.
Siembra
En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Incubación
De 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un
mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos
Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o
sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y
azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas.
Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo
metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o
rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento
de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el
desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como
colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias
oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas
no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de
azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo
de especies de Salmonella y Shigella.
GRUPO EMB MUESTRA INICIAL RESULTADO
1 E-coli -
2 Salmonella
-
enteritidis
3 E. coli -
4 Enterobacter
-
aerogenesis
Agar ENDO
Desarrollado para el recuento de coliformes totales en agua, bebidas y otras muestras por
medio de la técnica de filtración por membrana.
Siembra
Filtrar la muestra a analizar. El volumen que se filtra depende de la probable contaminación
de la muestra.
- Embeber la almohadilla con el caldo m-Endo hasta la saturación (la cantidad de medio de
cultivo depende del grado de absorción de la misma).
- Apoyar la membrana filtrante sobre la almohadilla embebida con el medio de cultivo.
Incubación
Incubar las placas a 35-37 °C por 24 horas. Ocasionalmente, los microorganismos no
coliformes pueden producir brillo metálico. Para confirmar las colonias sospechosas,
transferirlas a tubos con caldo verde brillante y bilis al 2%, con campanitas de Durham.
Incubar los tubos por 24-48 horas a 35-37 °C. Los coliformes habrán producido gas por
fermentación de la lactosa, al cabo de ese período.
Resultados
El recuento debe realizarse en aquellas placas que contengan entre 20 y 80 colonias y no
más de 200, ya que se trata de un medio selectivo.
La concentración microbiana debe expresarse como el número de microorganismos
presentes en 100 ml de muestra.
ENDO ENDO BACTERIA
ENDO ENDO 10-5
Grupo Bacteria CONOCIDA
10 E-5
Conocida
1 E-coli
+ -
2 Salmonella
enteritidis - -
3 E. coli
- -
4
Enterobacter - -
aerogenesis
Muestra de suelo
Luego se introduce, por capilaridad entre la cámara y el cubre, el líquido con las células a
contar, generalmente tras una dilución previa; puesto que la cámara tiene dos zonas esto
permite hacer dos recuentos simultáneamente. Se observa la retícula al microscopio con el
aumento adecuado y se cuentan las células.
A partir del número de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el
campo de la retícula, se calcula la concentración de células en la muestra líquida aplicada.1
Reticulo Neubauer.jpg
En la retícula central, la cámara de Neubauer tiene un cuadrado primario que contiene
nueve cuadrados secundarios, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados
terciarios. El cuadrado secundario central contiene no 16, sino 25 cuadrados, cada uno de
ellos dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. En los bordes de este cuadrado central
se cuentan los hematíes, utilizando sólo los cuadrados de los bordes del terciario central y
uno de los centrales. En los secundarios de los
bordes superiores e inferiores de la cámara se hace
el recuento leucocitario. Grupo 2
Cuadrícula 1
Grupo 1 35 39 35 53
Cuadrícula 1 40 29 41 41
26 2 6 5 37 42 28 31
5 10 7 9 33 25 40 31
-- - - - Ʃ
9 15 18 52 Total 580
Ʃ 40 27 31 66 Cuadrícula 2
Total 164
39 29 42 38
Cuadrícula 2
4 - - 9 33 32 33 44
- - - - 28 25 31 30
- - - - 27 41 42 28
9 15 18 52 Ʃ
Ʃ 16 18 28 6 Total 537
Total 81 Cuadrícula 3
Cuadrícula 3 25 37 35 33
1 15 4 3 32 27 25 25
1 - 9 - 30 30 38 29
1 1 11 9 34 32 30 30
- 5 4 1
Ʃ
Ʃ 3 21 28 4
Total 56 Total 492
Cuadrícula 4 Cuadrícula 4
18 13 10 16 35 36 37 29
6 10 7 4 34 81 29 30
5 9 26 10 29 30 35 31
2 2 4 3 32 34 28 -
Ʃ 31 34 47 34 Ʃ
Total 141 Total 513
Ʃ= 164+81+56+141= 442 Ʃ= 580+537+492+513= 2.122
Promedio= 110,5
Promedio= 530.5
UFC/gr= 110,5*6*10= 6.630
UFC/gr= 530.5*6*10= 31.830
4.4 Resultados de observación de hongos
Todos los hongos son organismos eucariotes y poseen al menos nucleo y membrana
nuclear, retículo endoplásmico, mitocondrias y aparato secretor. Los hongos crecen en dos
formas básicos: levaduras y mohos. Los mohos son hongos filamentosos multicelulares
cuya forma y estructura tenida en cuenta a partir de sus característic as macro y
microscópicas permiten su clasificación. Macroscopicamente se tendrán en cuenta las
características de las colonias en los medios de cultivo. Microscopicamente lo será la
existencia y características de sus estructuras.
Su forma es filamentosa y
de tipo tubular con paredes
celulares, pudiendo
presentar tabiques (hifas
septadas) o no (hifas
aseptadas) y que contienen
en su interior citoplasma
que viene a ser una
sustancia similar a la clara
de huevo junto con
pequeñas estructuras con
morfologías y funciones
determinadas denominadas
organoides.
CONCLUSIONES
Las pruebas bioquímicas sirven para hacer identificación de familias sin embargo la
identificación hasta especie es muy compleja.
La cámara de neubauer se usa para hallar densidad poblacional pero deben hacerse varia
repeticiones para sacar promedios ya que se observaron diferencias significativas en el
ejercicio que se hizo.
El video sobre la vida en el suelo es un objeto de aprendizaje que permite acercarnos al
universo microbiano y la relevacia para todos los ciclos biogeoquímicos.
BIBLIOGRAFÍA.
Cerrato, R. F., & Alarcón, A. (2002). La microbiología del suelo en la agricultura sostenible.
Universidad Autónoma del Estado de México, Programa Editorial Universitario.