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UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE AGRONOMÍA

MANUAL DE
PRACTICA PARA
BIOQUÍMICA.
ÁREA DE CIENCIAS
SUB ÁREA DE CIENCIAS QUÍMICAS

GUATEMALA ENERO 2010


ÍNDICE
CONTENIDO PAGINAS

ÍNDICE ..................................................................................................................................................................... 2
REUNIÓN DE INFORMACIÓN GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA ............................... 5
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................................... 5
2. OBJETIVOS ................................................................................................................................................................ 5
3. MATERIALES ........................................................................................................................................................... 6
4. METODOLOGÍA ....................................................................................................................................................... 6
PRACTICA No. 1 SELECCIÓN DE LA MUESTRA VEGETAL A TRABAJAR EN EL LABORATORIO .. 7
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................................... 7
2. OBJETIVOS ................................................................................................................................................................ 7
3. MATERIAL DE APOYO LAS BIOMOLÉCULA ................................................................................................. 8
4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO .......................................................................................................... 13
5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 15
6. METODOLOGÍA .................................................................................................................................................... 15
7. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA .................................................................................................................... 16
PRÁCTICA 2. PREPARACIÓN DE MUESTRAS VEGETALES PARA ANÁLISIS QUÍMICO SECADO,
MOLIDO Y TAMIZADO DE MUESTRAS VEGETALES ............................................................................... 17
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................................. 17
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 17
3. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................................................ 18
4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 2 .................................................................................. 21
5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 22
6. METODOLOGÍA .................................................................................................................................................... 23
7. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA .................................................................................................................... 24
8. PARA INCLUIR EN EL REPORTE DE PRÁCTICA: ..................................................................................... 24
9. INVESTIGAR .......................................................................................................................................................... 24
PRÁCTICA No. 3 EXTRACCIÓN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTEÍNAS EN MUESTRAS
VEGETALES......................................................................................................................................................... 25
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................... 25
[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 25
3. MARCO TEÓRICO. ............................................................................................................................................... 26
4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 3 ................................................................................ 31
5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 32
6. METODOLOGÍA ................................................................................................................................................... 33
7. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA .................................................................................................................... 36
8. PARA INCLUIR EN EL INFORME EN LA DISCUSIÓN.............................................................................. 37
PRÁCTICA 4 ESTUDIO DE AMINOÁCIDOS DE MUESTRA VEGETALES............................................. 38
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................... 38
2. OBJETIVOS: ............................................................................................................................................................ 38
3. MARCO TEÓRICO. ............................................................................................................................................... 39
4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 4 ................................................................................ 45
5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 47
6. METODOLOGÍA. ................................................................................................................................................... 48
7. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRÁCTICA: ..................................................................................... 53
8. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA .................................................................................................................... 54
9. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS PARA EL REPORTE ................................................... 54
PRÁCTICA No. 5 ESTUDIO DE AMINOÁCIDOS, CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS Y
ESPECTROFOTOMETRÍA. .............................................................................................................................. 56
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................... 56
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 56
3. MATERIAL DE APOYO CROMATOGRAFÍA (11)....................................................................................... 57
4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 5 ................................................................................ 64
5. MATERIALES DE LA PRÁCTICA V ................................................................................................................. 65
6. METODOLOGÍA .................................................................................................................................................... 66
7. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRÁCTICA: ..................................................................................... 72
Práctica No. 6 EXTRACCIÓN DE GLÚCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES ........................................ 75
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................... 75
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 75
3. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 76
4. METODOLOGÍA .................................................................................................................................................... 77

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

5. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA .................................................................................................................... 78


PRÁCTICA 7 ESTUDIO DE GLÚCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES ................................................... 79
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................... 79
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 79
3. MATERIAL DE APOYO GLÚCIDOS (CARBOHIDRATOS) (3,7,15,20) ................................................ 80
4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 7 ................................................................................ 87
5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 88
6. METODOLOGÍA .................................................................................................................................................... 89
7. PREPARACIÓN DE REACTIVOS ..................................................................................................................... 91
8. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRÁCTICA: ..................................................................................... 92
9. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA .................................................................................................................... 92
Práctica No. 8 EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES .......................................... 101
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................. 101
2. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 101
3. MATERIALES ...................................................................................................................................................... 102
4. METODOLOGÍA .................................................................................................................................................. 103
5. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA: ................................................................................................................. 104
Práctica No. 9 ESTUDIO DE LÍPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES .................................................. 105
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................. 105
2. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 105
3. MATERIAL DE APOYO ESTUDIO DE LÍPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES ............................... 106
4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 9 .............................................................................. 112
5. MATERIALES ...................................................................................................................................................... 113
6. METODOLOGÍA .................................................................................................................................................. 114
7. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA .................................................................................................................. 118
8. PARA EL REPORTE DE PRÁCTICA .............................................................................................................. 118
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................................. 120

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

REUNIÓN DE INFORMACIÓN GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

1. INTRODUCCIÓN

Para iniciar el Laboratorio de Bioquímica, se plantea esta primera reunión, de carácter obligatorio,
para enterar a los estudiantes de las disposiciones generales que aquí deberán cumplirse. Esta es
una parte del laboratorio que el estudiante suele obviar, pero que, por la trascendencia de la
misma, se plantea como parle de la asistencia.

Además de lo antes dicho, puede aprovecharse la reunión para que el estudiante conozca a su
instructor dé laboratorio y viceversa, con la finalidad de que se cimienten las bases de una buena
comunicación sobre la cual pueda edificarse el conocimiento.

A su vez, el instructor de laboratorio formará grupos de trabajo a quienes hará responsables de


un locker, con la finalidad de qué las actividades prácticas sé realicen con el mayor orden posible.

2. OBJETIVOS
2.1. GENERAL
Informar a los estudiantes de las disposiciones generales del laboratorio de Bioquímica.

2.2. ESPECÍFICOS:
Revisar el contenido del programa de Laboratorio de Bioquímica.
Revisar el reglamento de Laboratorio de Bioquímica.
Revisar las normas de cuidado de materiales dentro del laboratorio.
Dar lectura a los "aspectos a considerar para el buen uso del Manual de prácticas de
bioquímica.
Ampliar la información antes revisada, o bien aclarar aquellas dudas que el estudiante
pudiese tener sobre algún tópico de la información general del Laboratorio.
Formar los grupos de trabajo para el desarrollo ordenado del Laboratorio de Bioquímica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

3. MATERIALES

Programa de Laboratorio do Bioquímica.


Reglamento de Laboratorio de Bioquímica.
Reglamento para Uso de Materiales de Laboratorio.

4. METODOLOGÍA

El instructor de laboratorio habrá dé presentarse a los estudiantes y tomaré asistencia a


esta reunión.
El instructor de laboratorio repartirá los tres reglamentos mencionados en los listados
de “materiales" de esta sesión de laboratorio.
Se procederá a dar lectura al Programa de laboratorio de Bioquímica.
Se procederá a dar lectura al Reglamento dé laboratorio de Bioquímica.
Se procederá, a dar lectura al Reglamentó para uso de materiales de laboratorio.
El instructor de laboratorio ampliará aquella información que fuese requerida por los
estudiantes.
Se formarán grupos de trabajo con un máximo de 4 integrantes, para favorecer la
realización de las prácticas y el aprendizaje de los estudiantes.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRACTICA No. 1 SELECCIÓN DE LA MUESTRA VEGETAL A TRABAJAR EN EL


LABORATORIO

1. INTRODUCCIÓN

Algunas veces se ha escuchado en la Subárea de Ciencias Químicas, la inquietud de los estudiantes


por encontrar, desde el inicio, un "sentido" a los laboratorios de la Subárea. No han quedado de
lado aquellos estudiantes que ven al laboratorio simplemente como un requisito para la
aprobación del curso, y es qué mucho de lo que un estudiante puede aprovechar de un laboratorio,
está ligado con la manera en cómo se lo presenten.

Es por ello que ahora se inicia el Laboratorio de Bioquímica con los fundamentos que puedan
crear un espíritu de interés en el estudiante, esto es, algunas bases sobre las que pueda descansar
el proceso de aprendizaje en el laboratorio, con la pretensión de que el estudiante se sitúe en el
contenido del Laboratorio de Bioquímica y logre contextualizar él mismo en el campo de la
Agronomía.

Procurando no caer en la profundización teórica -lo cual corresponde a la teoría de curso- se hará
una breve descripción de lo que es una "Biomolécula", y junto a ello la identificación de las
moléculas que se estudiarán posteriormente en el Laboratorio.

Así mismo, se aprovechará la reunión de esta semana para adelantar un poco de la Práctica 2 a fin
de que no se sobrecargue de trabajo la semana asignada a dicha práctica.

2. OBJETIVOS

Explicar la importancia del laboratorio de Bioquímica dentro de la Carrera de Ingeniero


Agrónomo.
Ubicar el término "Biomolécula" en la Jerarquía Organizativa de la Vida.
Identificar las Biomoléculas y Macromoléculas que se van a trabajar en el laboratorio.
Seleccionar el material vegetal que se trabajará en el laboratorio.
Iniciar el proceso de preparación del material vegetal seleccionado.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

3. MATERIAL DE APOYO LAS BIOMOLÉCULA


c)
3.1. La materia viva posee diversas características (15)
Alguna vez estudiaste en Biología General lo que distingue a los organismos vivos de los objetos
inanimados; ahora mencionaremos uno de" estos atributos: "Un organismo vivo es
estructuralmente complicado y altamente organizado. Poseen intrincadas estructuras internas
(Fig. 1) y contienen muchos tipos de moléculas. Ello contrasta con la materia inanimada del
entorno -arcilla, arena, rocas, agua del mar que suele consistir en mezclas de compuestos químicos
relativamente simples.

C4 C3

Fig. 1 corte transe versal de hoja. Observe como se aprecia la organización y complejidad microscópica

"Cada uno de los componentes de un organismo vivo tiene una función específica. Esta afirmación
no es solamente cierta para estructuras macroscópicas como las hojas y los tallos, el corazón y los
pulmones, sino también para estructuras intracelulares microscópicas como el núcleo y los
cloroplastos".
La bioquímica trata de explicar la vida en términos químicos (5)
"Las moléculas que componen los organismos vivos cumplen todas las leyes familiares de
la química, pero también la interacción entre ellas, de acuerdo con otra serie de principios
a los que nos referiremos colectivamente como la lógica molecular de la vida. Estos
principios son un conjunto de relaciones que caracterizan la naturaleza, la función, así
como las interacciones de las Biomolécula.

"Si los organismos vivos se componen de moléculas intrínsecamente inanimadas, ¿cómo pueden
estas moléculas dar lugar a la remarcable combinación de características que llamamos vida?
¿Cuales la razón de que un organismo vivo parece ser más que la suma de sus partes inanimadas?

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

El objetivo fundamental de la ciencia 'bioquímica es el de determinar de qué modo interactúan los


organismos vivos con otros los conjuntos de moléculas inanimadas que constituyen los
organismos vivos para mantener y perpetuar la vida. En otras palabras, la bioquímica tiene como
objetivo explicar las estructuras y funciones biológicas en términos químicos. Aunque la
bioquímica proporciona conocimientos y aplicaciones prácticas que son importantes en medicina,
agricultura, nutrición e industria, su preocupación última es el prodigio de la vida misma.

3.2. Debajo de la diversidad biológica subyace una información química (15)


Por favor piense un poco en la diversidad de seres vivos que conoce. Piense en un conejo, en un
caballo, en un insecto -de los que se miran en Entomología General-, en un roble (Quercus sp), en el
frijol (Phaseolus vulgaris), piense en una bacteria o un hongo (de los que se pueden apreciar al
cursar Microbiología General). Si compara cada una de las cosas en las que pensó, en un principio,
parece haber muy pocas cosas en común.

Sin embargó, después de cien años de investigación bioquímica, resulta evidente que los
organismos vivos son notablemente similares en los niveles químico y microscópico.

3.3. Biomoléculas
Lehninger, Nelson y Cox (15) dicen que al comenzar el estudio de las biomoléculas y sus
interacciones, algunas cuestiones básicas requieren atención. ¿Qué elementos, químicos
pueden encontrarse en las células? ¿Qué tipos de moléculas conforman la materia viva?
¿En qué proporciones se hallan? ¿Cómo llegaron a formar parteado ella? ¿De qué manera
las moléculas presentes en las células vivas son especialmente adecuadas para cumplir su
cometido?

"Prácticamente todos los compuestos orgánicos a partir de los que se construyen los organismos
vivos son productos de la actividad biológica. Estas biomoléculas fueron seleccionadas a lo largo
del proceso de evolución biológica en razón de su idoneidad para llevar a cabo funciones
bioquímicas y celulares específicas".

3.4. Composición química (15)


"A principios del siglo diecinueve resultaba claro para los químicos que la composición de la
materia viva era sorprendentemente diferente de la del mundo inanimado.

3.5. La materia viva se compone principalmente en los elementos más ligeros


"Los cuatro elementos más abundantes en loa organismos vivos, en términos de porcentaje sobre
el número total de átomos, son el hidrógeno, el oxígeno, el nitrógeno y el carbono, que en conjunto
representan más del 99% de la masa de la mayor parte de los células.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

3.6. Las biomoléculas son compuestos de Carbono


"La química de los organismos vivos se organiza alrededor del elemento carbono, que representa
más de la mitad del peso seco de las células.

Recuerde un poco el contenido de curso de "Química Orgánica": "los átomos de carbono unidos
covalentemente pueden formar cadenas lineales, cadenas ramificadas y estructuras cíclicas y en forma
de celda. A estos esqueletos carbonados se les unen otros grupos de átomos, denominados grupos
funcionales, que confieren propiedades químicas específicas a la molécula.

“Las moléculas que contienen esqueletos carbonados unidos covalentemente se


denominan compuestos orgánicos; el número de ellos y su variedad son casi ilimitados.
La mayor parte de biomoléculas son compuestos orgánicos; podemos por tanto deducir que
la versatilidad de enlace del carbono constituyó un factor decisivo en la selección de los
compuestos de carbono para la maquinaria molecular de las células durante el origen y la
evolución de los organismos vivos"(15)

3.7. Los grupos funcionales determinan las propiedades químicas:


"Puede considerarse que la mayor parte de biomoléculas son derivados de los
hidrocarburos, compuestos que tienen un esqueleto de átomos de carbono unidos
covalentemente a los que sólo se unen átomos de hidrógeno.
Los esqueletos de hidrocarburo son muy estables. Los átomos de hidrógeno pueden ser
reemplazados por una amplia gama de grupos funcionales para dar lugar a las diferentes
familias de compuestos orgánicos.

"Muchas biomoléculas son poli funcionales y contienen dos o más tipos diferentes de grupos
funcionales, cada uno de ellos con sus propias características químicas y su reactividad propia: Los
aminoácidos, una importante familia de biomoléculas que actúan principalmente como
subunidades monoméricas de las proteínas, contienen como mínimo dos tipos diferentes de
grupos funcionales: un grupo amino y un grupo carboxílico. La capacidad de un aminoácido para
condensarse con otros aminoácidos para formar las proteínas depende de los propiedades
químicas de estos dos grupos funcionales''.

3.8. Reactividad química (15) .


"Los hidrocarburos saturados -moléculas con enlaces simples carbono-carbono y sin enlaces
dobles o grupos sustituyentes- no son fácilmente atacados por la mayoría de los reactivos
químicos; las biomoléculas, quo pueden, poseer diversos tipos de grupos funcionales, son mucho
más reactivas químicamente. Es posible analizar y predecir el comportamiento químico y las
reacciones de las biomoléculas a partir de los grupos funcionales que contienen".

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

3.9. Las macromoléculas y sus subunidades monoméricas (15)


"Muchas de las moléculas que se encuentran dentro de las células son macromoléculas,
polímeros de alta masa molecular construidos a partir de precursores relativamente simples.
Las macromoléculas pueden formar posteriormente estructuras
supra macromoleculares, dando lugar a las unidades funcionales del tipo de los ribosomas,
las membranas y los orgánulos (Ver Fig. 2) :

"Las macromoléculas son los constituyentes principales de los organismos. Prácticamente


toda la materia sólida de cualquier tipo de células es orgánica y se halla presente en cuatro formas:
proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos.

"Las proteínas, largos polímeros de aminoácidos, constituyen, el agua aparte, la


fracción celular mes importante; las proteínas son quizás las más versátiles de los
biomoléculas, en cuanto a sus múltiples funciones y propiedades. Los ácidos nucleicos,
DNA y RNA, son polímeros de nucleótidos. Participan en el almacenaje, transmisión y
traducción de la información genética. Los polisacáridos, polímeros de azúcares simples
como la glucosa, tienen dos funciones principales: como almacén de combustibles
energéticos y cómo elementos estructurales extracelulares.

Los lípidos, derivados hidrocarbonados grasos o aceitosos, sirven de componentes estructurales


do las membranas y de reserva de combustible rico en energía, además de cumplir otras
funciones.

"Las macromoléculas se construyen a partir de subunidades monoméricas. En las macromoléculas


proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos el número de subunidades monoméricas es muy
grande.

NOTA: Si esto último le confunde un poco, no se preocupe, pues esto es lo que se irá estudiando en
el laboratorio de Bioquímica.

Antes de continuar, se recordará un poco de lo visto en el Curso de Biología General,


respecta a la jerarquía de organización de un organismo vivo.
Esto servirá para poder ubicar el contenido del laboratorio de Bioquímica en un
contexto Agronómico, pues con esta Figura 2, es posible concatenar ideas, para ubicar
el sitio de las "Biomoléculas" en una planta (pilar fundamental de la Agronomía).

3.10. Existe una jerarquía en la estructura celular


"Las subunidades monoméricas (aminoácidos, azúcares simples como la glucosa, etc.), que se
unen para formar las macromoléculas, Son muy pequeñas comparadas con las macromoléculas
biológicas. Una molécula dé un aminoácido como la alanina tiene una longitud menor de 0.5 nm.
Lo hemoglobina, la proteína transportadora de oxígeno de los eritrocitos, está formada por
aproximadamente 600 aminoácidos unidos covalentemente en cuatro largas cadenas, que se

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

pegan en forma globular y se asocian en una estructura tetramérica con un diámetro de 5,5 nm.
Por su parte, las moléculas de proteína son pequeñas en comparación con los ribosomas (de
aproximadamente 20 nm de diámetro), que contienen aproximadamente 70 proteínas diferentes y
diversas moléculas de DNA. Los ribosomas, son a su vez, mucho más pequeños que orgánulos
cómo las mitocondrias, de diámetro aproximadamente igual a 1000 nm. Existe pues, un gran salto
desde las biomoléculas sencillas hasta las estructuras celulares que pueden observarse con el
microscopio óptico. (Ver Fig. 2)

Fig. 2 Organización jerárquica en la estructura celular

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO

1. ¿A qué se le llama la Lógica Molecular de la Vida?

2. ¿Cuál es el objetivo fundamental de la Ciencia Bioquímica?

3. ¿Cuáles son los dos niveles en los cuales los organismos vivos (por ejemplo, un roble, un
insecto o un hongo) son notablemente similares?

4. ¿En razón de qué surgieron las biomoléculas a lo largo del proceso de evolución biológica?

5. ¿Cuáles son los 4 elementos más abundantes en los seres vivos?

6. A su juicio personal y fundamentado en lo que ha leído, ¿qué es lo que determina las


propiedades químicas y el comportamiento de las biomoléculas?

7. Elabore una definición propia de Biomolécula, indique qué es una macromolécula. Además
explique si a su juicio hay alguna diferencia entre ambos términos.

8. Enumere las 4 macromoléculas que se presentan en el material de apoyo a esta práctica.


Además indique cuál de esas 4 es la que tiene mayor versatilidad de funciones y propiedades.

9. Señales las funciones generales de los ácidos nucleicos, los polisacáridos y los lípidos.

10. Esquematice lo que para usted significa la frase siguiente: las macromoléculas se construyen a
partir de subunidades monoméricas.

13
[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

11. Para resolver este tópico piense, por ejemplo, en un conjunto formado por varios
subconjuntos. Luego piense cómo la unión de estos lo hace a aquél.

12. Esquematice gráficamente, de manera clara y sencilla, cada uno de los términos señalados en
la Fig. 2 del Material de apoyo de esta práctica, procurando que su esquema guarde una
secuencia lógica. Por ejemplo: se le pudiera ocurrir esquematizar una hoja de Frijol como
ejemplo de Órgano.

13. Ordene ascendentemente (en función de su tamaño), los términos siguientes: órgano,
subunidad monomérica, organismo vivo, complejos supra moleculares, orgánulos, tejido,
macromolécula, sistema, célula.

14. Conteste con sinceridad si usted cree que ha podido ubicar el tema central de estudio de este
laboratorio (biomolécula) como parte integradora de una Planta. ¿Cree usted que al lograr esta
ubicación es posible enmarcar el Laboratorio de Bioquímica en un Contexto Agronómico?
Explique. Recuerde que su Instructor de Laboratorio está para asesorarle y ayudarle a resolver
sus dudas.

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5. MATERIALES
A cargo de cada estudiante

Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica


Cuaderno de prácticas de laboratorio.

6. METODOLOGÍA
Revisión del fundamento teórico y explicación del instructor de laboratorio:

Resolver un examen corto del fundamento teórico contenido en el "Material de Apoyo".


Revisión del cuestionario pre-laboratorio y solución a interrogantes de los estudiantes.
Entrega del cuestionario pre-laboratorio.

Identificación de las biomoléculas y macromoléculas que se estudiarán en el Laboratorio de


Bioquímica

Revisar de forma general el documento de laboratorio de Bioquímica, procurando


identificar las biomoléculas y macromoléculas que se tratarán en las prácticas respectivas.
Realizar un listado de las biomoléculas y macromoléculas que se van a trabajar en las prácticas
de laboratorio.
En el listado anterior, procure colocar al menos, dos ejemplos de cada biomolécula
macromolécula.

Selección del material vegetal a trabajar en el laboratorio:

Al observar los objetivos de su instructivo, se ve que durante el laboratorio de Bioquímica, se va a


estudiar las macromoléculas. En función de ello, la selección del material vegetal estará muy ligada
al contenido (en porcentaje peso/peso) de dichas moléculas.

El material a trabajar debe, cumplir con las características siguientes:

Que lo seleccionado sea un órgano vegetal (semilla, tallo, hoja, fruto, etc.) que no posea
demasiados pigmentos (como podría ser el caso del café o el laurel).
Que sea factible preparar harina de ese órgano vegetal
Para la selección de un material vegetal específico seguir las recomendaciones siguientes:
Que se tenga un porcentaje no menor que 10%, de al menos dos biomoléculas y/o
macromoléculas (proteínas, carbohidratos, lípidos).
Conocer la planta seleccionada.
Tener la facilidad de conseguir la planta.

15
[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Toda vez seleccionada la planta que se va a trabajar, cada sub-grupo de laboratorio, se dirigirá o.
su instructor para pedir por la aprobación de la planta a trabajar.

Para ello debe tener al menos dos opciones de plantas (que cumplan con lo señalado
anteriormente) y presentar al instructor una pequeña tabla con los datos siguientes:

Nombre común y nombre científico de la planta.


Lugar (es) donde se le puede conseguir (nombre del almacén u otro lugar de
suministro del material vegetal)
Contenido, en porcentaje, de biomoléculas y/o macromoléculas
Contenido de humedad
Porción no comestible de la planta.

Inicio del proceso de preparación de la muestra vegetal aprobada;

Cuando el instructor apruebe la planta a trabajar, los estudiantes procederán a


comprar el material suficiente para poder preparar una buena cantidad de harina de la
muestra vegetal. De 700 gramos en adelante, de material vegetal.
Cuando tengan la muestra vegetal, refiérase al numeral 6.1 de la práctica 2 (en caso
de semillas) y/o al numeral 6.4 de la práctica 2 (para el secado de la muestra vegetal).
Luego los alumnos averiguarán el porcentaje de humedad de la muestra vegetal,
utilizando el horno de convección (a una temperatura no mayor a 60oC).
Refiérase a la metodología que se emplea en el laboratorio de la Subárea de Ciencias
Biológicas de la FAUSAC, para averiguar el contenido de humedad de la muestra vegetal.
Para hacer esto puede serle de utilidad los numerales 6.1 y 6.2 del Instructivo de la
Práctica 2 de este laboratorio.
Anote los resultados de sus cálculos en su cuaderno de laboratorio y entréguelos
como parte de la Tarea No. 1.
Recuerde que el material vegetal que se va a utilizar en la siguiente práctica debe
llevarlo seco, para que su instructor autorice la realización de dicha práctica.

7. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA
Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE
LABORATORIO.
Tarea No. 1:

Usted deberá entregar individualmente un trabajo corto, escrito. Para ello debe resolver y realizar
aquello que esté planteado, que aparecen en el Instructivo de Práctica 1. La parte práctica indicada
en esos mismos será evaluada al momento de que los estudiantes lleven su material debidamente
seco, para la preparación de la harina, en la Práctica 2.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA 2. PREPARACIÓN DE MUESTRAS VEGETALES PARA ANÁLISIS


QUÍMICO SECADO, MOLIDO Y TAMIZADO DE MUESTRAS VEGETALES

1. INTRODUCCIÓN

En el laboratorio de Bioquímica, se plantea un estudio de proteínas, carbohidratos y lípidos dentro


de un contexto agronómico, y es por ello que el análisis de estas biomoléculas se hará en muestras
de vegetales.

No obstante el aplicar pruebas analíticas a muestras de vegetales a alguien le pudiese parecer


insuficiente para crear un contexto agronómico en cada práctica. En función de esto, se realizó una
planificación de actividades, la semana anterior (Práctica 1), y en esa oportunidad se pudo
seleccionar aquel vegetal, que por su contenido, de al menos dos de las tres moléculas biológicas
en cuestión, es adecuada para el trabajo a lo largo de todo el laboratorio.

Luego cada grupo de trabajo ha conseguido una muestra suficiente de la planta escogida. Así se
llega a la presente reunión de laboratorio, en donde la atención se centrará en preparar dicho
material vegetal, con lo, cual se pretende proveer al estudiante de herramientas de trabajo del
campo agronómico.

2. OBJETIVOS

Al finalizar la práctica, el alumno deberá estar en capacidad de:


Preparar muestras vegetales para el análisis a realizar en el laboratorio de Bioquímica de la
FAUSAC.
Utilizar de manera correcta, el equipo de laboratorio utilizado en la presente práctica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

3. MARCO TEÓRICO

Cuando se hace referencia a "preparar" muestras vegetales para análisis químico, en el contexto
del laboratorio de Bioquímica de la FAUSAC, se está hablando del proceso de colecta, secado,
molido y tamizado de dichas muestras. Este proceso incluye la "extracción" de los compuestos a
analizar, sin embargo, esto se deja como un apartado puesto que se estará trabajando más
adelante (16)

3.1. Recopilación botánica


Es el estudio botánico de la familia o género de plantas a investigar con el objeto de no cometer
errores en el momento de la recolección, pues en ocasiones hay varias plantas, miembros de
familias o géneros, que por lo común contienen las mismas sustancias de interés y debe decidirse
cuál planta escoger en el momento. (6)

3.2. Investigación bibliográfica de la planta de interés (6)


Consiste en hacer un estudio exhaustivo sobre todo lo que se encuentra escrito sobre
determinado género o familia del vegetal a investigar con el objeto de tener la mayor cantidad
posible de información y conocer, por ejemplo, que parte de la planta es rica en ciertos
constituyentes, qué tipo de constituyentes se conoce que contiene, qué parte de la planta
recolectar, qué método de extracción utilizar, etc.

La mayor cantidad de información sobre estudios químicos en plantas y sustancias aisladas de


ellas, son publicadas en revistas científicas de muy diversa índole, pertenecientes a las áreas de
Farmacia, Medicina, Agronomía, Botánica, Química, Zootecnia, etc.. Por lo tanto la localización de
datos sobre un vegetal puede ser muy dificultosa. Sin embargo utilizando publicaciones de
Chemical Abstraéis u otros abstractos de la rama de vegetales, puede facilitarse esta búsqueda
bibliográfica. Además, actualmente, el recurso Internet es de mucha ayuda.

3.3. Recolección de las muestras vegetales


Según Medinilla (lT), idealmente el análisis químico de muestras vegetales debería realizarse
sobre tejidos vegetales frescos. Sin embargo, muchas veces la planta a estudiar proviene de
lugares distantes, o quizás fue colectada en otro continente. En tales casos la planta debe ser
secada antes de la extracción de compuestos.

Debe cuidarse que el material vegetal bajo estudio se encuentre libre de contaminación con otra
planta. Asimismo, es esencial emplear plantas sanas, que no estén infectadas por virus, bacterias u
hongos. La razón de esto es que no solo podrían detectarse productos de síntesis microbiana, sino
que además estas infecciones podrían alterar seriamente el metabolismo de la planta y formarse
productos inesperados, quizás en grandes cantidades (lT).

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Es necesario reconocer de antemano al vegetal a recolectar entre grupos similares de plantas, así
como saber que parte o partes se van a colectar de acuerdo al interés del investigador. Es
imperativo llevar a cabo una recolección de acuerdo a las normas establecidas para ello. (6)

De la técnica do colecta de plantas en el campo, puede obtenerse una buena referencia


consultando el documento "Algunas indicaciones para la preservación de plantas", del Herbario de
la FAUSAC (13), razón por la cual no se detalla aquí.

3.4. Secado de las muestras vegetales


Medinilla (17), dice: "es esencial que la operación de secado se efectúe bajo condiciones
controladas para evitar que ocurran cambios químicos en los constituyentes. Toda muestra
vegetal debe secarse lo más pronto posible, evitando usar altas temperaturas, y preferiblemente con
una adecuada circulación de aire".

Según el documento "Métodos de Investigación Fitoquímica" (6), el secado de muestras vegetales


puede realizarse de 2 maneras:

3.4.1. Técnica de secado al sol:

Esta técnica es la más utilizada, debido a que no hay descomposición de constituyentes, por lo cual
es la técnica más recomendable. Secando sobre papel periódico cambiable cada 24 horas hasta unas 4
a 5 veces hasta la eliminación total del agua

3.4.2. Técnica de secado artificial:

Utilizando métodos eléctricos o de cualquier otro tipo. Es necesario no calentar a temperaturas


mayores de 60°C que podrían descomponer ciertos compuestos.

En el documento del Herbario de la FAUSAC (13), dice que en el proceso de colecta de muestras
vegetales, muchos buenos especímenes se pierden por pudrición. Por ello el secado de esas
muestras es imperativo. En ese documento se citan técnicas de colocación de muestras vegetales
en una "prensa", con el objeto de preservar de mejor forma la morfología de la planta, y proveer
una técnica fácil de secado -que es lo particularmente nos interesa -. Una vez hecho el paquete en la
"prensa", puede dejarse secando lejos de la intemperie y haciendo cambios constantes de papel
periódico, o bien utilizando una cámara desecadora, comúnmente utilizada en el herbario.

3.5. Molienda y tamizado del material vegetal


Moler es reducir un cuerpo a partes menudas, o aplastarlo mucho (de aquí en adelante
procuraremos no confundir este término con "macerar", por las razones que habrán de
explicarse posteriormente). Para el caso del análisis de las plantas en el laboratorio de
Bioquímica, se realiza la molienda con el fin de homogeneizar el material a analizar, pues muchas
veces, los compuestos químicos de interés se encuentran distribuidos heterogéneamente en un
órgano vegetal

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"La molienda debe efectuarse con el material ya seco; con el objeto de reducir a lo mínimo posible el
tamaño de la partícula del material a utilizar. Con raíces o material leñoso debe usarse un molino,
teniendo cuidado de que la fricción producida no eleve la temperatura del sistema para evitar
descomposiciones de principios activos o compuestos químicos de interés. Cuando el material es
ligero (hojas, tallos, flores, etc.) puede utilizarse un mortero manual" (1).

Para el tamizado se utiliza un tamiz de 20 mallas, con el objeto de dejar pasar únicamente
aquellas partículas más pequeñas y separarla de grumos que no suelen ser de interés.

3.6. Procesamiento de las semillas


En el laboratorio de Bioquímica de la FAUSAC suelen utilizarse semillas para el análisis de las
biomoléculas de interés. Por ello debe hacerse una breve referencia de aquellas razones en las que
se fundamentan algunos hechos de la metodología del instructivo de práctica.

Para principiar, se recomienda eliminar la testa de las semillas a usar, para evitar que exista una
interferencia de pigmentos (13). Sin embargo, esto se hace en función de que con el análisis a
realizar en este laboratorio, se pretende acercar al estudiante al estudio cuali-cuantitativo de
biomoléculas, y no se pretende hacer un análisis detallado de todas las moléculas para cada parte de
la planta a utilizar.

Es bueno hacer referencia a la definición de testa. Testa es la capa exterior de la semilla, y suele
conocerse vulgarmente como la "cascara" de la semilla. Algunas veces es difícil de eliminar (por
ejemplo en el frijol negro, Phaseolus vulgaris) y por ello se recomienda hacer un remojo de no más de
25 minutos para esa eliminación. Lo que sucede es que la testa no es impermeable y permite el paso
de agua hacia su interior, provocando que los tejidos internos de la semilla (endospermo y
embrión) absorban agua y se hinchen, facilitando de tal manera la eliminación de la testa.

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 2

1. ¿A qué se refiere la "preparación de muestras vegetales" para análisis químico, dentro del
contexto de laboratorio de Bioquímica de la FAUSAC?

2. ¿Cuál es la importancia de hacer un recopilado botánico y una investigación bibliográfica de


la planta de interés?

3. ¿Por qué debe cuidarse que el material vegetal bajo estudio debe estar sano?

4. ¿Qué documento se le recomienda aquí para la colecta y secado de material vegetal?

5. ¿Por qué razón la operación de secado debe hacerse bajo condiciones controladas?

6. ¿En qué consiste la técnica de secado artificial de muestras vegetales

7. Explique por qué cree que se hace la molienda del material vegetal.

8. ¿Qué es la testa de una semilla?

NOTA» Cada grupo de trabajo debe traer, para la realización de esta práctica, lo siguiente: La
muestra vegetal que se puso a secar días antes de la presente práctica, según lo estipulado por
el Instructivo de\ Práctica I. Esta muestra debe estar debidamente seca para no: dañar el
equipo de laboratorio, por ello su instructor revisará esto al inicio de la práctica.

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5. MATERIALES

Preparar el área de trabajo del área de trabajo:

01 Mortero y 01 pistilo (1 marceador)


02 espátulas
01 Becker de 600 ml
01 balanza mono plato
Papel periódico
01 tamiz de 20 mallas

A cargo del día de laboratorio:

01 horno de convección
Papel encerado
Etiquetas auto adhesivo
Tijeras
Masking tape

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6. METODOLOGÍA

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Nota: Debido a que la mayoría de grupos de trabajo utilizarán "semillas" de la planta de interés, la
metodología que se describirán será para ese órgano vegetal. En caso de utilizar otra parte de la
planta, consultar con su instructor de laboratorio.

7. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA
Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE
LABORATORIO.
Tarea No. 2: Usted deberá entregar individualmente un trabajo corto, escrito. Para
ello debe resolver y realizar aquello que esté planteado para el reporte.

8. PARA INCLUIR EN EL REPORTE DE PRÁCTICA:

Reporte la cantidad de semilla utilizada para preparar harina.


Reporte la cantidad de harina obtenida
Reporte el porcentaje de pérdida en el proceso de preparación de harina. Trate de
indicar las razones de pérdida de harina.
Indique qué cuidados especiales deberán aplicarse a la harina en su almacenamiento.
9. INVESTIGAR
¿Por qué debe eliminarse la testa de las semillas que se utilizaren como muestras
vegetales para el análisis en este laboratorio?
Refiérase a documentos de Tecnología de Semillas" o diríjase al Área Tecnológica
(Subárea de Manejo y Mejoramiento de Plantas) y pregunto sobre quien puede
asesorarle en este tópico.
¿Por qué se utiliza más la "técnica de secado al sol" que la de "secado artificial", en la
preparación de muestras vegetales para análisis químico?
¿Por qué es necesario calentar las muestras vegetales a temperaturas menores de 60 0C
en la técnica de secado artificial?
¿Cuál es la razón de efectuar la "molienda" con material vegetal seco?

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PRÁCTICA No. 3 EXTRACCIÓN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTEÍNAS EN


MUESTRAS VEGETALES

1. INTRODUCCIÓN

El contenido proteico es un componente de los análisis bromatológicos que se realizan en cultivos


para evaluar su calidad nutricional o para evaluar el efecto, en este aspecto, de algún tratamiento
practicado (16).

Para el estudio de las macromoléculas, en este laboratorio, han de realizarse pruebas analíticas
(cuantitativas y cualitativas). Dichas pruebas están diseñadas para llevarse a cabo en medio
acuoso. Es por ello que en esta práctica de laboratorio se prepararán soluciones salinas y acuosas
de proteínas a través del proceso de "Extracción de Proteínas" indicado más adelante.

Con la finalidad de no confundir al estudiante en su proceso de aprendizaje, en esta práctica se


pretende dar a conocer cómo caracterizar a la macromolécula "Proteína", sin profundizar, todavía,
en las subunidades monoméricas que le componen. Así que se detendrá, por el momento, en el
estudio a través de dos pruebas de caracterización de proteínas, que son: La Prueba de Biuret y la
Prueba de Metales Pesados.

Es necesario mencionar, que el estudio cuantitativo de proteínas se realizará en una práctica


posterior, a fin de evitar que se sobresature el contenido de prácticas de laboratorio siguientes.

2. OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de:

Efectuar extracción salina y extracción acuosa de las proteínas de una muestra Vegetal.
Efectuar la prueba de Biuret para la detección de proteínas y/o péptidos (de al menos dos
enlaces peptídicos), en los extractos.
Efectuar la prueba de "Precipitación Proteica por Metales Pesados" para la detección de
proteínas en los extractos.
Utilizar adecuadamente el equipo y cristalería de laboratorio empleado en la presente
práctica.

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3. MARCO TEÓRICO.

3.1. Proteínas
“La importancia de las proteínas fue reconocida a comienzos del S. XIX por Mulder (1838): En las
plantas y animales hay presente una sustancia que, sin duda es la más importante entre las
sustancias conocidas de los seres vivos, y sin ella, la vida sería imposible en el planeta.

Esta sustancia se llama proteína. El nombre proteína atestigua la importancia que


sematribuye a esta clase de biomoléculas". (19)

Bohinski (2) dice lo siguiente: "Cada proteína es única en términos de estructura y función. No
obstante, también existen numerosas semejanzas entre las proteínas. Su característica más
común es que todas son polímeros formados por aminoácidos, los cuales son sus monómeros,
éstos se unen en forma covalente unos a otros en secuencia mediante lo que se llama un enlace
peptídico. La estructura resultante, que tiene forma de cadena, recibe el nombre de polipéptido,
o simplemente péptido. Cuando un polipéptido consta de 50 o más residuos (unidades) de
aminoácidos (un mínimo arbitrario) ya se considera una proteína".

Como dicen Lehninger, Nelson y Cox (15), casi todo lo que sucede en la célula requiere la
intervención de una o más proteínas. Las proteínas proporcionan estructura, catalizan
reacciones celulares y llevan a cabo una multitud de tareas. Su papel central en la célula queda
reflejado en el hecho que la información genética se expresa en último término en forma de
proteínas. En una célula típica existen miles de proteínas diferentes, cada una codificada por
un gen y encargada de realizar una tarea específica. Las proteínas se encuentran entre las
macromoléculas biológicas más abundantes y son también extremadamente versátiles en sus
funciones. Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en el interior de las
células, pues constituyen el 50% o más de su peso seco.

Las proteínas ocupan una posición central en la composición y en funcionalismo de la materia


viva. Las actividades físicas y químicas que constituyen la vida de la célula están catalizadas
por enzimas, las cuales son todas de naturaleza proteica (19).

3.2. Extracción proteica


La visión bioquímica general sobre la estructura y función de las proteínas proviene del
estudio de muchas proteínas individuales. Los métodos de separación de proteínas
aprovechan las propiedades tales como la carga, tamaño y solubilidad, que varían en una y
otra proteína (15).

La Extracción de Proteínas tiene que ver mucho con su solubilidad en diversos


compuestos. Dado que muchas proteínas se unen a otras biomoléculas, las proteínas
también se pueden separar en base a sus propiedades ligantes. La fuente de una proteína es

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generalmente un tejido o células microbianas. Las células deben romperse liberando la


proteína en una solución denominada extracto crudo.

Proteína: del griego protos, primero. Mulder en 1838 introdujo esta palabra con el sentido de "de
primer orden, o sea, la sustancia más importante de la materia viva,

Para el caso particular de los laboratorios de Bioquímica de la FAUSAC, interesa la extracción


acuosa y la extracción salina. Se suelen preparar soluciones de proteína a razón de 5 g. de
proteína por litro de solvente. La caseína se disuelve en un poco de NaOH (6N), la albúmina,
gelatina y peptona se disuelven en solución salina (NaCl 0.2N) (19)

3.3. Composición de las proteínas


En la práctica siguiente, se verá cómo las proteínas se conforman a partir de aminoácidos. El
objeto de colocar aquí, un poco sobre "composición de Proteínas", es para tocar un poco lo de la
solubilidad de las proteínas y con ello comprender un poco mejor el tema de la "Extracción de
Proteínas".

Según Lelninger (15), del aislamiento de muchas proteínas en forma pura y cristalina, se ha
aprendido que todas contienen carbono, hidrógeno, nitrógeno y oxígeno, y casi todas
también azufre. Asimismo, hay proteínas que contiene elementos adicionales, como
fósforo, hierro, zinc y cobre. Lehninger(15) y Bohin.ski(2) coinciden en que las proteínas se
dividen en dos clases principales basándose en su composición: Proteínas simples y
Proteínas conjugadas.

1. LAS PROTEÍNAS SIMPLES: son aquellas que por hidrólisis producen solamente
aminoácidos, sin ningún otro producto principal, orgánico o inorgánico. Comprenden los
siguientes grupos:
 Albúminas: Solubles en agua, coagulan por el calor y precipitan con las soluciones
salinas saturadas.
 Globulinas: Solubles en soluciones diluidas de sales de ácidos y bases fuertes (NaCl
por ejemplo); insolubles en agua pura o en soluciones salinas de mediana
concentración; coagulan por el calor.
 Glutelinas: Solubles en ácidos y álcalis diluidos; insolubles en los solventes neutros;
coagulan por el calor. Ejemplo: glutelina del trigo.
 Prolaminas: Solubles en alcohol de 70 a 80%; insoluble en alcohol absoluto, en agua
y en otros solventes neutros. Ejemplos: la zeína del maíz y la gliadina del trigo.
 Albuminoides: Solubles en todo solvente neutro y en ácidos y álcalis diluidos. En este
grupo entran las proteínas de sostén. Ejemplo: queratina, colágeno.
 Histidias: Solubles en agua y en ácidos muy diluidos; coagulables por el calor.
Predominan los aminoácidos básicos.

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 Protaminas: Poli péptidos básicos, solubles en agua predominan aminoácidos


básicos en su estructura; precipitan a otras proteínas. Se encuentran principalmente en las
células huevo.

2. Las PROTEÍNAS CONJUGADAS son aquellas que por hidrólisis producen no solamente
aminoácidos, sino también otros componentes orgánicos o inorgánicos (esta porción no
aminoácido, de una proteína conjugada se denomina grupo prostético). Las proteínas
conjugadas pueden subdividirse de acuerdo con la naturaleza química de sus grupos
prostéticos, y pueden identificarse así:
 Nucleoproteínas: Compuestos formados por una o varias moléculas de proteína unidas al
ácido nucleico.
 Glucoproteías: Compuestos que tienen carbohidratos como grupos prostéticos. Ejemplo:
la mucina.
 Fofoproteínas: Compuestos con un radical que contiene fósforo que no sea ni un
fosfolípidos ni ácido nucleicos. Ejemplo: la caseína.
 Cromoproteínas: Compuestos conjugados con un grupo cromóforo. Ejemplos:
hemoglobina, citocroruo y flavoproieínas.
 Lipoproteínas: Poseen grasas neutras (triglicéridos) u otros lípidos tales como fosfolípidos
y colesterol.
 Metaloproteínas: Resultan de la unión con un metal.
 Flavoproteínas: Tienen una flavina como grupo prostético. De vez en cuando pueden estar
presentes dos o más grupos prostéticos idénticos o diferentes.

3.4. Configuración (forma) de las proteínas


Según la forma o estructura tridimensional de las proteínas, estas pueden ser: fibrosas y
globulares.

Las proteínas fibrosas tienen formas moleculares muy alargadas. Como dicen Sniith y
Woocl(19), son insolubles en medio acuoso. Dentro de ellas encontramos: Cartílagos, tendones,
cabello, seda, exoesqueleto de los insectos, etc...

Las proteínas globulares son más compactas que las fibrosas; en general son más solubles
que las proteínas fibrosas. Incluyen la mayoría de enzimas, muchas hormonas y otros como los
anticuerpos (2,19).

3.5. Extracción salina de las proteínas


Según White, et.aL (20), las sales pueden disminuir o aumentar la solubilidad de una proteína.
El efecto salino haciendo mayor la cantidad de proteína disuelta se conoce como salling-in, o
solubilidad por salado.

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Como usted recordará, del contenido teórico de la Química General II, la solubilidad de cualquier
sustancia depende de la afinidad relativa entre la correspondiente a las moléculas del soluto entre
sí y la existente con las moléculas del solvente. Como dicen White et.al. (20): "Cualquier factor que
disminuya las interacciones entre las moléculas del soluto tenderá a aumentar la solubilidad. En el
efecto salling-in, los pequeños iones de las sales neutras interaccionarán con los grupos iónicos de
las moléculas proteicas, disminuyendo la interacción proteica y, por tanto, favoreciendo la
solubilidad".

3.6. Reacciones de color de proteínas (20)


Aún cuando todas las proteínas son: Compuestos formados por aminoácidos unidos por enlaces
peptídicos, estas sustancias presentan variaciones considerables en sus propiedades químicas y
biológicas.

Las proteínas reflejan las propiedades químicas de los aminoácidos que estas contienen en su
estructura. Muchas de las reacciones de color de las proteínas dependen de la presencia de un
aminoácido en su molécula.

3.7. Prueba de precipitación proteica con metales pesados


Esta prueba permite detectar la presencia de proteínas. La precipitación de las proteínas se llama
"desnaturalización". En ella hay pérdida de la actividad biológica de la molécula. La
desnaturalización puede ser causada por: a) agentes físicos o b) por agentes químicos.

La prueba se basa en que no todas las proteínas son igualmente sensibles a los agentes
desnaturalizantes y esta propiedad puede usarse para remover ciertas proteínas de una mezcla.

A pH 7 o por encima de él, las proteínas están usualmente cargadas negativamente, así que la
adición de metales cargados positivamente neutraliza la carga y la proteína precipita. La
precipitación por metales pesados es, por lo tanto, más efectiva a valores de pH neutros o
ligeramente alcalinos, pero la solución no puede ser muy alcalina porque se corre el riesgo de que
se precipiten hidróxidos de los metales. El precipitado es frecuentemente soluble en exceso de
iones de metal pesado, ya que tal exceso confiere a las partículas, cargas positivas estables.

Figura 3: Resultados de prueba de nitrato de plata, así como la reacción.

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Figura 4: Resultados de la prueba de (CH3COO)2Pb


Fuente: Marvin Pec.

3.8. Biuret
El ion cobre formará un complejo con las proteínas de una manera similar al que forma con el
amonio. El complejo en el caso de las proteínas es rojo o violeta, y azul en el caso del amonio. La
prueba es positiva cuando la muestra analizada posee, al menos, dos enlaces peptídicos
(tripéptidos, polipéptidos y proteínas); esto quiere decir que los aminoácidos y los dipéptidos dan
una prueba negativa de Biuret.

La sustancia más simple que tiene dos uniones peptídicos es el Biuret (NH2CONHCONH2) y esta es
la razón por la cual esta reacción lleve el nombre de Biuret.

O C C O

HN NH

R CH HC R
Cu2+
O C C O

HN NH

R CH HC R

Figura 5: Resultados de prueba de Biuret y figura que muestra la interacción entre cobre y aminoácidos

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 3

1. Elabore una definición propia de: proteína.

2. ¿Cuáles son los cinco elementos que se encuentran más comúnmente en las
proteínas?

3. ¿Cómo pueden clasificarse las proteínas según su "composición"?

4. ¿Cuál es la diferencia entre una proteína simple y una proteína conjugada?

5. Mencione tres proteínas simples que sean solubles en agua.

6. De una definición de grupo prostético. Mencione al menos tres compuestos que pueden, existir
corno grupos prostéticos, en las proteínas.

7. ¿Qué tipo de proteína -según su configuración- es más "soluble"? ¿Las fibrosas o las
globulares?

8. ¿A qué se refiere la "solubilidad por salado" o salting-in?

9. ¿A qué se le llama "desnaturalización" de proteínas?

10. A pH 7 o por encima de él, las proteínas precipitan cuando se les adicionan metales pesados.
¿Por qué? Además, ¿por qué en esta reacción la solución no debe estar demasiado alcalina?

11. ¿Qué característica debe tener un compuesto para dar positiva la prueba de Biuret?

12. Indique el cambio que evidencia un resultado positivo para la prueba de "Metales Pesados" y
para la prueba de "Biuret".

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5. MATERIALES
A cada del grupo de trabajo:

Balanza mono plató


2 Becker de 150 ml.
2 erlenmeyer de 50 ml.
1 anillo de hierro
1 espátula
12 tubos de ensayo

A cargo del día de laboratorio:

Centrífuga manual Solución NaCl 10.2N]


2 varillas de agitación Solución Acetato de Pb
Probeta de 25 ml Refrigeradora
1 plancha agitadora Papel filtro Whatman
1 embudo plástico Centrifugadora
1 soporte universal Solución de HCl (6N)
Agua destilada 1 beacker de 500 mL
Solución de Biuret [0.2M Solución de Sulfato Cu [0.2M]
1 estufa eléctrica 1 gradilla de metal
Papel parafilm No. 42 2 tubos p/centrífuga
Papel encerado Etiquetas autoadhesivas
2 probetas de 10 ml. Solución Nitrato de Hg 10.2M
1 piceta Centrifugadora
4 tubos de ensayo c/tapón de rosca-1
pinza p/tubo de

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6. METODOLOGÍA

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PRUEBAS DE CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS

El siguiente cuadro, es una guía para el estudiante para que sepa qué muestras se van a analizar
con cada prueba, en esta práctica.

CUADRO 1. Resumen de pruebas cualitativas, a realizar a soluciones patrones y extractos de


proteínas.

PRUEBA

METALES PESADOS BIURET

MUESTRA A ANALIZAR
Extracto Acuoso
Extracto Salino
Peptona
Albumina
Caseína
Gelatina

NOTA: Las soluciones patrón (peptona, albúmina, caseína y gelatina) son proteínas. Estas
soluciones se utilizan para que el estudiante tenga cuatro "testigos" de resultados positivos en
cada prueba. En otras palabras, estas soluciones sirven para poder observar como es el resultado
positivo para cada una de estas pruebas.

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7. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA

Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO.

La metodología de evaluación también incluye un Informe de práctica. Este informe puede hacerse
en parejos o individualmente, y debe incluir:

Carátula
RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
Resultados de práctica.
Estos se presentan según las siguientes indicaciones:

Para los resultados de los numerales 6.1 y 6.2 de la metodología, solamente resuelva lo que se le
indica en los "cuadritos negros" que allí aparecen.

Para los numerales 6.3 y 6.4, primeramente debe presentar un cuadro de resultados pura cada
prueba: Siga el modelo indicado en el Cuadro 2.

CUADRO 2. Resultados de la prueba de BIURET con las cuatro soluciones patrón y los dos
extractos de proteínas.

MUESTRA ANALIZADA COLORACIÓN OBTENIDA DICTAMEN


Extracto Acuoso
Extracto Salino
Peptona
Albúmina
Caseína
Gelatina

REFERENCIA: Coloración = color observado como resultado de la prueba Dictamen =


prueba positiva (+) o negativa (-).

Además del cuadro anterior, para los numerales 6.3 y 6.4, debe incluir el análisis y explicación
de los dos cuadros de resultados, a fin de establecer la presencia o ausencia de proteínas en cada
muestra problema. (Para el caso de la explicación que se le pide, haga énfasis sobre si hay
concordancia de los resultados prácticos con el fundamento teórico. Si no hubiese tal
concordancia, plantee una justificación valida).

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Resuelva los "cuadros" que aparezcan en su metodología (6.3 y 6.4); debe presentarlos
también, intercalados con los resultados, y análisis de resultados. Esto puede servirle también
como una guía para ou análisis de resultados.

8. PARA INCLUIR EN EL INFORME EN LA DISCUSIÓN

¿Qué es una solución patrón? ¿Qué utilidad encontrada con el uso de este tipo de soluciones en la
presente práctica?

De la extracción de proteínas:

¿Cuál cree que es (son) la(s) razón(es) para realizar dos tipos de extracción de proteínas?

¿Cuántos tipos de "extracción de proteínas" existen y cuáles son? ¿En qué se diferencian estos
tipos de extracción?

¿Qué tipo de proteína -según su configuración- es más "soluble"? ¿Las fibrosas o los globulares? En
función de ello ¿qué tipo de proteína -según su configuración- habrá en mayor cantidad en sus
"Extractos de proteínas"?

Esquematice (utilice dibujos sencillos: No se complique) el procedimiento general para extraer


proteínas de una muestra vegetal. Sugiera usted el solvente para extracción (agua o solución
salina)

¿En qué se basa la prueba de Precipitación proteica por metales pesados?


¿Qué resultado indica una prueba positiva en esta prueba?
¿Qué se logra identificar con esta prueba?
¿En qué se basa la prueba de Biuret?
¿Qué resultado indica una prueba positiva en esta prueba?
¿Qué se logra identificar con esta prueba?

Haga un listado de los tipos de proteínas que se pueden extraer con Agua. (Vea la parte
Composición de las Proteínas" de su material de Apoyo a la práctica)

Haga un listado de los tipos de proteínas que se pueden extraer con Solución salina. (Vea la parte
"Composición de las Proteínas" de su material de Apoyo a la práctica)

A qué se refiere la solubilidad por salado o "salting in"? ¿Qué tiene que ver con esta prueba de la
práctica?

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PRÁCTICA 4 ESTUDIO DE AMINOÁCIDOS DE MUESTRA VEGETALES

1. INTRODUCCIÓN

En la práctica anterior se ha efectuado el estudio cualitativo de proteínas de una muestra vegetal.


Esta vez el estudio recae en las unidades que componen a las proteínas; usted recordará que en la
práctica 1 se mencionó que las proteínas se construyen a partir de aminoácidos, los cuales son las
subunidades monoméricas que se unen para formar esas macromoléculas.
Tal como se verá más adelante, pueden obtenerse aminoácidos libres a partir de la hidrólisis de
proteínas. Esto es, entonces, la primera parte de esta práctica, la “hidrólisis de proteínas”; luego,
mediante el análisis de “los hidrolizados”, se habrá de comprobar si la hidrólisis de las proteínas
fue o no fue completa.

El desarrollo de esta práctica continúa con un estudio cualitativo de los hidrolizados obtenidos; es
este el momento en que el estudiante de laboratorio centrará su atención en los aminoácidos y
podrá detectar su presencia/ausencia.

Esta práctica es una de las más que necesita más tiempo para su realización. A sí que deben
emplearse al máximo las dos horas de laboratorio y en caso de no poder terminar con la
metodología de práctica, se tendrá que trabajar en otro momento, acordado por el instructor y los
estudiantes, dentro de la semana asignada para esta práctica.

2. OBJETIVOS:

Al finalizar la práctica, el estudiante deberá estar en la capacidad de:

Efectuar la hidrólisis ácida e hidrólisis alcalina de proteínas extraídas de la muestra


vegetal.
Determinar la presencia o ausencia de aminoácidos en hidrolizados de proteínas.
Determinar la presencia o ausencia de aminoácidos con núcleo aromático, en hidrolizados
de proteínas.
Determinar la presencio o ausencia de aminoácidos fenólicos, en hidrolizados de proteína.
Determinar la presencia o ausencia de thioaminoàcidos, en hidrolizados de proteína.
Determinar la presencia o ausencia de aminoácidos con grupo imidazol, en hidrolizados de
proteínas.
Utilizar “soluciones patrón”, para obtener resultados positivos que actúen como “testigos”
en cada prueba de esta práctica.
Utilizar adecuadamente el equipo y cristalería de laboratorio empleado en la presente
práctica.

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3. MARCO TEÓRICO.

La hidrólisis proteica es el proceso de rompimiento del enlace peptídico con lo que se producen
pépticos y/o aminoácidos libres. La hidrólisis proteica puede ser de tres tipos: ácida, alcalina o por
enzimas (10,15)

La hidrólisis con ácido o base no es específica y existen algunos aminoácidos que sufren
modificaciones o pueden ser destruidos. Mediante la hidrólisis enzimática es posible romper los
enlaces peptídico entre residuos de aminoácidos específicos. La hidrólisis es un proceso
fundamental para llegar a determinar la secuencia de aminoácidos que conforman la estructura
primaria de la proteína. (15).

Hidrólisis de las proteínas mediante ácido: (De Harper (10) y Lehninger (15)): la mayoría de las
proteínas son completamente hidrolizadas hasta sus aminoácidos constituyentes calentando a
110oC durante 20 a 70 horas en HCL 6N. La hidrólisis se realiza en un tubo cerrado. El hidrolizado
resultante contiene los aminoácidos en forma de clorhidratos.

Sin embargo, no todos los aminoácidos de un péptido o de una proteína determinada se


recuperarán cuantitativamente. Esto quiere decir lo siguiente:

Todo el triptófano y cantidades variables se serina y treonina son destruidos.

Los grupos amida de la glutamina y la asparagina resultan hidrolizados, con producción de los
ácidos glutámico y aspàrtico y de iones amonio.

Hidrólisis de las proteínas por álcali: esta se usa para recuperar el triptófano y la tirosina, los
cuales no se destruyen por hidrólisis alcalina. Sin embargo, la hidrólisis alcalina provoca la
destrucción de la arginina, la cistina, la serina y la treonina; todos los aminoácidos son
racemizados. Por ello el método se emplea para la determinación por separado del triptófano, que
es estable a la calefacción con bases. (10,15)

3.1. Aminoácidos
Anteriormente se citó a Bohinski (2) para conocer que la característica más común de las
proteínas es que todas son polímeros formados por aminoácidos. Este autor dice que los
aminoácidos son monómeros que se unen en forma covalente unos a otros en secuencia
mediante lo que se llama un enlace peptídico, y dan por resultado una estructura que tiene forma
de cadena; esa estructura recibe el nombre de polipéptido, o simplemente péptido.

Cuando un polipéptido consta de 50 o más residuos (unidades) de aminoácidos (un mínimo


arbitrario) ya se consideran una proteína.

“El primer aminoácidos que se aisló de una proteína fue la glicina (del griego glykis, dulce, pues la
sustancia tiene cierto sabor dulce); la obtuvo Braconnot, en 1820, al hidrolizar la gelatina con

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ácido sulfúrico diluido, en un intento de averiguar si la gelatina, como la celulosa, produciría un


azúcar por hidrólisis. Durante un período de 50 años, el aislamiento de aminoácidos a partir de
hidrolizados de proteína era una cuestión de azar, más que un problema de investigación
sistemática” (10).

“A partir de estos bloques unitarios, los aminoácidos, los diferentes organismos pueden fabricar
productos tan diversos como enzimas, hormonas, anticuerpos, la proteína del cristalino del ojo,
antibióticos, venenos de hongos y muchas sustancias con actividades biológicas distintas” (15)

3.2. Estructura de los aminoácidos características generales


“Se sabe que existe alrededor de 300 aminoácidos diferentes de origen natural. Muchos de ellos
solo se observan en determinadas formas de vida, y algunos solo aparecen en una especie. Sin
embargo, todos los organismos usan solo 20 de ellos para la biosíntesis de proteínas, lo que
constituye un notable ejemplo de la unidad bioquímica en la biosfera” (2).

Como señala Lehinger, Nelson y Cox (15), debido a que cada uno de esos aminoácidos tiene una
cadena lateral propia que determina sus propiedades químicas, se puede considerar a este
grupo de 20 moléculas precursoras como el alfabeto en el que está escrito el lenguaje de la
estructura proteica . Las células pueden producir proteínas con propiedades y actividades
claramente diferentes uniendo los mismos 20 aminoácidos en multitud de combinaciones y
secuencias distintas.

Como dice Bohinski (2) y White & Handler (18), casi todos los aminoácidos (salvo la Prolina y la
hidroxiprolina) son alfa-aminoácidos pues tienen un grupo amino (-NH2) y Un grupo carboxilo (-
COOH) unidos al mismo átomo de carbono, llamado alfa.

Cada aminoácido posee propiedades únicas debido a la variación en la estructura de los Grupos R
(el grupo R se refiere a la cadena lateral del aminoácido).

Lehninger, Nelson y Cox (15) dicen que algunos aminoácidos son mucho menos frecuentes q otros.
Por ejemplo, muchas proteínas poseen relativamente pocos restos de Histidina y de triptófano.

3.3. Reacciones químicas de los aminoácidos


Alfa-amino más característica y más ampliamente utilizada es la reacción de la Las reacciones
químicas de los aminoácidos son las de sus grupos funcionales, es decir, las de los grupos alfa-
carboxilo y alfa-amino, así como las de los grupos funcionales presentes de las cadenas laterales.

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Una de las reacciones del grupo ninhidrina, que puede utilizarse para valorar los aminoácidos
cuantitativamente en cantidades muy pequeñas (15)

3.4. Solubilidad de los aminoácidos


La naturaleza del radical R de los aminoácidos, puede ser, por un lado, hidrofílico o Hidrofóbico y,
por otro, acida, básica o neutra. Fieser y Fieser (10) señalan que como los aminoácidos contienen
simultáneamente grupos carboxilo y amino, se comportan como sustancias anfóteras que se
ionizan como ácidos y como bases.

“En el laboratorio de Bioquímica de la FAUSAC, se acostumbra preparar soluciones patrón de


aminoácidos a razón de 1g de aminoácidos por litro de agua destilada.

Para disolver los aminoácidos hay que considerar si estos son ácidos, básicos o neutros. Así: los
aminoácidos se disuelven en agua y agregando unas gotas de HCl 1N; por otro lado los
aminoácidos básicos se disuelven agregando, al agua, unas gotas de NaOH6N. Los aminoácidos
neutros se disuelven simplemente en agua” (5, 16).

Esto de aminoácidos ácidos, neutros o básicos depende del grupo R de los aminoácidos. Para
profundizar en ello se recomienda referirse al capítulo 5 de Lehninger, Nelson y Cox (15)

3.5. Proteínas vegetales y nutrición humana (18)


Salisbury y Ross (18) señalan lo siguiente: “ seres humanos y otros animales dependen de los
vegetales para obtener muchos de sus aminoácidos, por lo que la composición proteínica de
semilla, hoja y tallo es importante para la dieta. Nosotros y otros animales, utilizamos estos
aminoácidos para formar nuestras propias proteínas y como fuente alimenticia ( de energía ).
Aunque los humanos adultos podemos sintetizar la mayor parte de los aminoácidos que
necesitamos, a partir de carbohidratos y diversos compuestos orgánicos nitrogenados, hay ocho
aminoácidos que debemos obtener del alimento. Estos son: leucina, isoleucina, valina, lisina,
metionina, triptófano, fenilalanina y treonina. Además parece que sólo se pueden formar
cantidades adecuadas del aminoácido azufrado Cisteínas cuando se dispone de suficiente
metionina (otro aminoácido azufrado ), y Utilizamos la fenilalanina para sintetizar tirosina, que
de lo contrario también seria Esencial en la dieta.

“La mayor parte de las proteínas en la dieta humana provienen de semillas, en especial granos
de cereales como maíz, trigo y arroz. Una contribución menor, pero aún importante, la hacen
semillas de leguminosas como fríjol, chícharo y soya.

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Comparados con casi cualquier proteína animal, las proteínas de los granos de cereal tienen bajo
contenido de lisina, mientras que las semillas de las leguminosas tienen bajo contenido de
metionina. Los agricultores están logrando algunos avances con la introducción de especies
nuevas o hibridas con mayor contenido proteínico y mayores porcentajes de aminoácidos
esenciales”.

Cuadro 3. Contenido proteico y composición de aminoácidos de algunos cereales y Leguminosas.

3.6. PRUEBAS DE CARACTERIZACIÓN CUALITATIVA DE AMINOÁCIDOS: (5,16)

a) Prueba de la ninhidrina:

Esta prueba se utilizará en este laboratorio para la detección de aminoácidos. Al reaccionar la


Ninhidrina, un agente oxidante poderoso, con cualquier alfa – aminoácido a un pH entre 4 y 8 se
forma un compuesto azulado o violeta. Con la prolina o Hidroxiprolina, que poseen un grupo
amino libre, el color producido es amarillo.

Fig. 6. Reacción de Ninhidrina

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b) Prueba de sanger:

En solución débilmente alcalina, el 1-fluor-2,4-dinitrobenceno (FDNB) convierte cualquier


aminoácido en su derivado 2,4 dinitrofenicado, por sustitución de un hidrogeno del grupo-amino en
un grupo 2,3-dinitrofenilo. En esta prueba, el desarrollo de un precipitado amarillo denota la
presencia de aminoácidos.

Fig. 7. Reacción de Sanger

c) Prueba xantoproteica:

Los aminoácidos que poseen un núcleo aromático forman nitro derivados de color amarillo
cuando se calientan con acido nítrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color
naranja. Por lo tanto, el aparecimiento de color naranja, en esta prueba, denota la presencia de
aminoácidos aromáticos.

Las proteínas que contienen triptófano, tirosina, y fenilalanina, dan prueba positiva. Esta prueba la
realizan inadvertidamente los estudiantes cuando derraman ácido nítrico sobre su piel.

Figura No. 8 coloracion de los extractos tanto acido como basico despues de la aplicación de acido nitrico. Ademas de
la coloracion de los patrones

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d) Prueba de millon:

Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con el reactivo de Millon
formando compuestos rojos. Los únicos aminoácidos fenólicos son la tirosina y sus derivados y
solamente ellos dan una reacción positiva.

Fig. 9 Reacción positiva de millon

e) Prueba del sulfuro:

Los thioaminoácidos reaccionan en medio alcalino con el acetato de plomo, precipitando sulfuro de
plomo (de color negro) como uno de los productos.

Fig. 10 Reacción de Sulfuro

f) Prueba del bromo:

El bromo actúa en medio alcalino con aminoácidos que poseen el grupo imidazol (como la
Histidina), provocando una reacción de adición al eliminar un doble enlace. El compuesto así
formado posee una cloración azul- violeta. Esto quiere decir, que cuando en esta prueba se
produce un color azul-violeta, se denota la presencia de Histidina.

Figura No. 11 Reacción del bromo.

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 4

1. ¿Qué Es la hidrólisis proteica?

2. ¿Qué tipo de hidrólisis se utiliza para la determinación por separado del triptófano? Explique.

3. Elabore una definición propia de: Aminoácido.

4. ¿A qué se refiere el término alfa-aminoácido?

5. ¿A qué se refiere el grupo R que poseen los aminoácidos?

6. Mencione al menos 5 productos que se pueden formar a partir de las distintas combinaciones
de aminoácidos:

7. ¿Qué grupos funcionales son los que propician las reacciones químicas de los aminoácidos?

8. ¿Cómo disolvería usted 3 gramos de un aminoácido cuyo grupo R es de naturaleza alcalina?

9. En la reacción de Nihidrina ¿Qué reacción provoca una coloración azulada o violeta? ¿Cuál
reacción provoca un color amarillo?

10. Explique en qué consiste la prueba de Sanger, la prueba Xantoprotéica, la prueba de Millon, la
prueba de Sulfuro y la prueba del Bromo.

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11. Investigue a que se refieren los términos: aminoácido fenolico, thioaminoacido, y aminoácido
con grupo imidazol. Consulte a su instructor de laboratorio, a su catedrático de curso o en
alguno de los libros que se le sugieren como bibliografía del curso.

12. ¿Cuáles son los 8 aminoácidos que los adultos debemos obtener del alimento?

13. Refiérase al cuadro 1 del material de apoyo de esta práctica. Observe los aminoácidos que allí
se le presentan. Diga cuáles de ellos se trabajarán en esta práctica (vea cuadro 2 que está en el
instructivo de practica).

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5. MATERIALES

A cargo del grupo de laboratorio:

Extracto acuoso
A cargo del auxiliar de laboratorio
Extracto salino
1 estufa eléctrica colocada en una
Muestra desconocida
campana de gases
4 beackers de 50 Ml
1 beacker de 500 mL
2 varillas de agitación
Recipiente de polietileno con solución
1 pizeta
NaOH (6N)
4 tubos grandes con tapón de rosca
Agua destilada
Etiquetas autoadhesivas
1 gradilla de metal grande
Gotero de pico de gallo con acido nítrico
4 frascos con gotero para cada una de las
(ubicado en campana de gases)
siguientes soluciones:
Gotero pico de gallo con acido sulfúrico
NaOH (1N), NaOH(GN), HCl(6N), Y
(ubicado en lavadero de laboratorio)
HCl(1N).
Gotero pico de gallo con solución de
30 tubos de ensayo
bromo (ubicado en campana de gases)
2 gradillas de metal
Gotero pico de gallo con carbonato de
2 pinzas p/tubo de ensayo
Amonio (ubicado en campana de gases)
1 estufa eléctrica
Solución de HCl (6N)
2 probetas de 10 mL
Solución HCl
1 beacker de 500 mL
Autoclave
1 beacker de 100 ml
Mechero de Meckler
Frasco gotero identificado para cada una
Manguera de hule
de las siguientes soluciones:
Trípode para autoclave
Nihidrina, FDNB, Millon, NaNO2 1 % y
Rollos de papel pH
acetato de plomo 2%
Potenciómetros (medir pH).

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6. METODOLOGÍA.

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NOTA IMPORTANTE TODO LO QUE SOBRE DE “EXTRACTO DE PROTEÍNAS” DEBE SER


ALMACENADO NUEVAMENTE EN REFRIGERACIÓN, PARA SER UTILIZADO EN LA PRÁCTICA 5

PRUEBA DE CARACTERIZACIÓN CUALITATIVA DE AMINOÁCIDOS

El cuadro siguiente es una guía para el estudiante para que sepa que muestras se van a analizar en
las pruebas de esta práctica.

Cuadro 4. Resumen de pruebas cualitativas, a realiza a soluciones patrones e hidrolizados de


proteínas y muestra desconocida.

PRUEBAS 
MUESTRAS A Ninhidrina Sanger Xantoproteica Millón Sulfuro Bromo
ANALIZAR 

Hidrolizado      
acuoso básico
Hidrolizado      
acuoso acido
Hidrolizado      
salino básico
Hidrolizado      
salino básico
Muestra      
desconocida
SOLUCIÓN
PATRÓN 
Lisina  
Triptófano   
Tirosina    
Leucina  
Histidina   
Cisteína   
Fenilalamina   
TOME EN CUENTA LA LIMPIEZA DE LA CRISTALERÍA PARA LA REALIZACIÓN DE ESTAS
PRUEBAS EN LA PRESENTE PRÁCTICA

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7. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRÁCTICA:

Responda, como trabajo post laboratorio, las cuestiones siguientes:


Usted observa en el cuadro 4 una serie de cheques ( ) que le indican que prueba realizarle a
cada muestra o solución patrón. Para cada una de las muestras o soluciones patrón,
justifique por que se le deben realizar las pruebas señaladas por los cheques. Ejemplo:
Porque en la lisina se van efectuar solamente las pruebas de la Ninhidrina y la Sanger.
¿Qué es una solución patrón? ¿Por qué se utiliza?
Haga un listado de las soluciones patrones que se usaran en cada prueba. ¿Qué
utilidades(es) ha encontrado en el uso de soluciones patrón?
¿Qué es la hidrólisis proteica?
Esquematice de forma sencilla el procedimiento general para realizar hidrólisis a una
solución extracto de proteínas.
¿En qué consiste la hidrólisis proteica mediante acido?
¿En qué consiste la hidrólisis proteica de álcali? ¿Para que se utiliza ese tipo de hidrólisis?
A su criterio ¿Cuál es la razón de mantener la temperatura de la autoclave en un rango que
no sobrepase los 228º F?
Investigue en que otros lugares de la Facultad de Agronomía existen autoclaves. Además
indique si hay diferencias entre los autoclaves que encontró.
Indique el procedimiento general para detectar, visualmente, la presencia del triptófano en
una muestra recién colectada de granos de cebada. (si usted plantea que se debe efectuar
hidrólisis, indique y justifique cual utilizaría, la acida o la alcalina).
¿Cuál es la utilidad de la prueba Biuret? ¿Qué se logra identificar con esta prueba?
¿Qué le indicaría un resultado negativo de esta prueba? ¿y un resultado positivo?
Para la comprobación de una hidrólisis completa debe hacer una comparación entre el
resultado obtenido para cada hidrolizado en dos pruebas que son la de Biuret y la de la
Ninhidrina.
Diga si la siguiente explicación es falsa o verdadera, justifique su respuesta: “Se tiene una
solución X a la cual se le han aplicado las metodologías de hidrólisis. Esta solución ha dado
positivo la prueba de Biuret, y un resultado negativo en la prueba de la Ninhidrina. Por eso
podemos decir que en la solución X hemos identificado solamente “aminoácidos” y por lo
tanto estaremos hablando de una hidrolisis “completa” de proteínas.
Utilizando los resultados de la Ninhidrina y de Biuret de cada uno de los hidrolizados y
justificando su respuesta indique si cada una de las hidrólisis fue o no fue completa.
De una razón válida para la aplicación de la prueba de Biuret y de la Ninhidrina como
comprobante de hidrólisis proteica completa. (En otras palabras, ¿Por qué se usa Biuret
para ver si hubo o no una hidrólisis completa de proteínas?)

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Para Ninihidrina, Sanger, Xantoproteica, Millon, Sulfuro, bromo colocar lo siguiente.

¿En que se basa esta prueba?


¿Qué expresa para usted un resultado positivo da la prueba? ¿Que se logra identificar
con esta prueba.

8. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA

Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO


PRELABORATORIO.
La metodología de evaluación también incluye un informe de práctica. Este informe
puede hacerse en parejas o individualmente, y debe incluir:

Carátula

9. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS PARA EL REPORTE

Resultados de práctica. Estos se presentan según las siguientes indicaciones:

Para los resultados de los numerales 6.1, 6.2, 6.3 y 6.4 solamente debe resolverse los
cuadritos negros que aparezcan allí.
Posteriormente presente resueltos los cuadros negros que aparezcan en la metodología
(numerales 6.5 al 6.10). Procure colocar el titulo de cada pareja de respuestas (es decir
el titulo del numeral).
Para los resultados de los numerales 6.5, 6.6, 6.8, 6.9 y 6.10, también debe presentarse
un cuadro de resultados para cada Muestra Problema, (hidrolizado acuoso acido,
hidrolizado salino acido, hidrolizado acuoso básico, hidrolizado salino básico y Muestra
desconocida). Loa cuadros deben seguir el siguiente modelo…

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CUADRO 5. Cuadro de resultados de las pruebas realizadas a la muestra de

HIDROLIZADO ACUOSO ACIDO:

NOMBRE DE LA PRUEBA pH COLORACIÓN DICTAMEN


Biuret
Ninhidrina
Sanger
Xantoproteica
Millon
Sulfuro
Bromo

REFERENCIA: pH = VALOR EN NUMERO

Coloración = color observado como resultado de la prueba

Dictamen = prueba positiva (+) o negativa (-).

OJO: Utilice como criterio de dictamen, los resultados obtenidos con las
soluciones patrón.

Procure Intercalar Los Resultados De Cada Muestra Con Su Análisis respectivo.

Toda vez presentados estos resultados, se realizara un análisis y explicación de cada


cuadro, a fin de establecerla presencia o ausencia de aminoácidos en cada muestra
problema. Si sus resultados se lo permiten, también debe indicar el nombre o nombres
posibles de aminoácidos identificados.
Para el caso de la explicación que se le pide, haga énfasis si hay concordancia, plantee una
justificación valida.
Compare los resultados de sus muestras problemas con los resultados con las soluciones
patrón y tener otro criterio de análisis.
Como una guía de análisis le recomienda utilizar la solución a los cuadritos negros que
aparecen para cada parte de la metodología.

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PRÁCTICA No. 5 ESTUDIO DE AMINOÁCIDOS, CROMATOGRAFÍA DE


AMINOÁCIDOS Y ESPECTROFOTOMETRÍA.

1. INTRODUCCIÓN

Esta semana, continua es estudio de aminoácidos y proteínas. Son prácticas de aplicación


frecuente en los laboratorios de análisis de bioquímica y hoy se pretende que el estudiante
tenga un contacto con estas prácticas. Debido a lo extenso de la metodología de las prácticas
pasadas, estas moléculas biológicas no se han podido estudiar de una sola vez y por ello se
emplea una semana más.

La cromatografía es una técnica que sirve para separa, identificar y a veces purificar una
mezcla compleja de solutos solubles en un solvente común. Esta semana se utilizara esta
técnica para que el estudiante tenga un contacto con esta alternativa de análisis cualitativo de
sustancias en este caso con aminoácidos. Por ende tratara de enlazarse lo obtenido con la
cromatografía.

La continuación al estudio de proteínas se hace desde un punto de vista cuantitativo y para ello
se utiliza una técnica denominada Espectrofotometría.

2. OBJETIVOS

Al finalizar la práctica, es estudiante deberá estar en capacidad de:

Utilizar la técnica ¨ Cromatografía en Capa Fina ¨ como parte del análisis


cualitativo de aminoácidos de la muestra vegetal.

Utilizar ¨ Espectrofotometría ¨ en la cuantificación de proteínas extraídas de la


muestra vegetal.

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3. MATERIAL DE APOYO CROMATOGRAFÍA (11)

La cromatografía es una técnica que sirve para separar identificar y a veces purificar una
mezcla compleja de solutos solubles en un solvente común.

Como dice Gaxiola (11), una mezcla de sustancias que van a ser separadas se aplica en solución
a un medio de sostén. Este puede ser papal, una capa de sílice, o una columna rellena de resina
absorbente o de intercambio iónico. La prueba consiste en que se deja correr por el medio de
sostén un solvente revelador y dicho solvente lava junto con el la mezcla de las sustancias
aplicadas previamente. En el proceso, las diferentes moléculas de la mezcla son arrastradas por
el lavado a distintas velocidades, resultando en su separación.

En la mayoría de los métodos cromatográficos la separación está basada en un proceso de


reparto múltiple o uno continuo de absorción – desorcion, aunque en la práctica existe una
combinación de ambos, dominando más o menos uno y otro tipo.

El grado de la separación depende de cuatro fuerzas que operan independientemente una de la


otra. Estas son: (1) la velocidad de flujo del solvente, (2) la solubilidad de las sustancias en el
solvente, (3) los efectos de fraccionamiento, y (4) los efectos de absorción. Los dos primeros
factores son responsables de la movilización de la mezcla de sustancias a través del medio de
sostén y los dos últimos factores con responsables del retardo del movimiento de la mezcla a
través del medio de sostén.

El flujo del solvente es el mismo para todas las sustancias presentes en la mezcla. Si todas las
sustancias fueran completamente solubles, no habría separación. No obstante, por fortuna es
muy raro que las sustancias tengan la misma solubilidad en cualquier solvente.
Consecuentemente, si la sustancia es muy soluble, tendera a movilizarse a través del medio de
sostén y aparecerá en el frente del solvente en movimiento. Por otra parte, si es relativamente
insoluble, tendera a permanecer en su punto de origen. Por lo tanto, uno de los factores
primordiales que determinan la separación cromatográfica es la combinación de la solubilidad
y del flujo del solvente. Los otros factores, los factores retardantés, son igualmente importantes
y merecen alguna discusión.

Hay cuatro tipos principales de procedimientos cromatográficos, cada uno de los cuales está
basado en ciertos principios físicos. Ellos son: (1) cromatografía por fragmentación; (2)
cromatografía por absorción; (3) cromatografía por intercambio iónico, y (4) cromatografía
con filtración en gel.

En la cromatografía de absorción existe, como mínimo, un sistema de tres componentes-


absorbente, medio de elusión (disolvente) y compuesto cromatografíado. El comportamiento
cromatográficos depende tanto del absorbente como del medio de elusión. Entre los
absorbentes más utilizados en la cromatografía en la capa fina, se encuentran los óxidos, óxidos
hidratados y sales. Los más comunes son la gel de sílice (silicagel) y el oxido de aluminio
(alúmina).

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3.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (11)

La cromatografía en capa fina es una técnica muy utilizada en la actualidad, por su gran rapidez
y versatilidad. También se conoce como cromatografía en columna abierta o cromatografía en
película delgada. Es una técnica donde la separación ocurre sobre una capa delgada de
adsorbente que está adherida a un soporte inerte, generalmente vidrio. Se pueden usar
variedad de adsorbentes, desde la gel de sílice o la alúmina hasta la celulosa la cual la
separación es similar a la cromatografía de papel. Se diferencia de la hecha en papel porque la
separación ocurre más rápido, las manchas son más discretas y compactas, y se pueden usar
reactivos detectores corrosivos sin dañar el substrato o el adsorbente.

El disolvente utilizado para la separación se mueve sobre esta capa fina, ya sea hacia arriba,
por capilaridad (cromatografía ascendente) o hacia abajo, por gravedad (cromatografía
descendente). La separación de sustancias se basa en sus características de polaridad. Por
consiguiente, una sustancia polar se moverá muy lentamente con relación al frente del
disolvente, mientras que una sustancia no polar se moverá más rápido.

Bajo ciertas condiciones experimentales, el movimiento de una sustancia en particular es


constante, con respecto al movimiento del frente de un disolvente determinado. Esta constante
se llama “valor Rf” y se define como:

3.1.1. CTIVACIÓN DE LAS PLACAS:

Antes de que se puedan usar las placas, generalmente deben ser calentadas para retirar el agua
que actúa como una impureza y evita una buena separación. Con frecuencia el agua está
firmemente ligada al adsorbente, por lo cual se debe calentar la placa fuertemente. La
magnitud del calor depende del tipo de separación que se requiere.

Para compuestos hidrofílicos o polares, el secado al aire o con un secador de pelo son
generalmente adecuados; pero para los compuestos hidrofóbicos o no polares es necesario un
calentamiento más intenso. Las placas de alúmina o silicagel con adhesivo requieren ser
secadas al aire durante aproximadamente 30 minutos y después ser activadas en un horno a
10°C (nunca arriba de 105°C) alrededor de 30 minutos.

Las placas de óxido de aluminio y de silicagel sin adhesivo requieren secado al aire durante 1.5
a 2 horas y ser activadas en el horno a 120°C durante aproximadamente 60 minutos.

3.1.2. APLICACIÓN DE LA MUESTRA:

La muestra se aplica en solución con una micro pipeta o con tubo capilar en cantidades de
aproximadamente 5 micro litros. Esto asegura que la mancha no se extienda. Una mancha ideal
tendrá más o menos 5 mm de diámetro.

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La mancha debe ser secada tan pronto como sea posible, usando un secador de pelo (esto
además evita que la mancha se extienda). Si la solución está diluida, se pueden repetir muchas
aplicaciones en el mismo sitio una vez que la anterior se ha secado. Debe tenerse cuidado de no
sobre cargar la mancha, de lo contrario se presentará el rayado (escurrimiento). Otro factor
importante es que debe tenerse cuidado de no maltratar la capa delgada del adsorbente
durante el manchado.

Con paciencia y con práctica resulta posible no tocar la capa con el extremo de la micro pipeta
(o tubo capilar) durante el manchado o el trazado de una placa para CCD. Aún más, dado que la
capa está adherida a su soporte inerte de vidrio o de aluminio, no es necesario usar placas de
vidrio para sostener el cromatograma durante el manchado.

3.1.3. REVELADO DEL CROMATOGRAMA:

Existen numerosos métodos para detectar sustancias en los cromatogramas. Algunos de ellos
usan sistemas físicos, pero la mayoría utiliza métodos químicos.

Las técnicas para localizar en el cromatograma sustancias, que no son visibles, se clasifican en
tres categorías:

a. Nebulización: En esta técnica el reactivo se disemina en forma de fino aerosol sobre la


cromatoplaca mediante un atomizador. Debe aplicarse en un gabinete cerrado
(campana de extracción de gases) para gases y para vapores a fin de evitar que el
reactivo penetre en el laboratorio. Si ésta se hace muy cerca del papel o la cromatoplaca,
se aplicará demasiado reactivo y hará que se corra el cromatograma. Es preferible
colocar el atomizador a 30-38 cms del cromatograma.

b. Inmersión: Esta es mejor que la nebulización por numerosas razones, ya que no se


requiere de gabinete contra emanaciones en muchos casos; es mucho más fácil obtener
una aplicación uniforme del reactivo detector. Se necesita un recipiente
(preferentemente plástico) que contenga el solvente. La cromatoplaca se pasa
uniformemente dentro del solvente de inmersión y se cuelga para que se seque.

c. Exposición a gas o vapor: Está requiere equipo especial y por ello no se trata aquí.

3.1.4. PRESERVACIÓN DE LOS CROMATOGRAMAS DE CAPA DELGADA:

Con la mayoría de las placas rociadas con ácido, o con reactivos que producen colores que se
desvanecen con rapidez (como la ninhidrina), no sólo es difícil almacenarlos como referencia,
sino que también resulta caro, ya que las placas de vidrio se pueden volver a usar. Tan pronto
como se seque un cromatograma rociado, las manchas deberán ser delineadas con un lápiz
afilado o con un alfiler y se deben rastrear. Debido a que los colores tienden a desteñirse
después de algún tiempo, es recomendable hacer una copia del original tan pronto como sea
posible.

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3.2. ESPECTROFOTOMETRÍA (9)

Uno de los métodos fisicoquímicos más empleados en análisis bioquímico es el de la medida de


la absorción o emisión de energía radiante. La gran difusión de esta técnica es consecuencia de:

1. El amplio intervalo de longitudes de onda o de frecuencias de energía radiante y sus


diferentes modos de interacción con la materia.

2. La existencia en el mercado de instrumentos de medida cada vez más precisos.

3. Las ventajas inherentes al método.

La energía radiante se define como la energía transmitida en forma de radiación


electromagnética. Esta energía puede ser absorbida, transmitida, reflejada y refractada por
muchas sustancias en diferentes estados de agregación (sólido, líquido, disolución, gas), si la
radiación incidente tiene una longitud de onda apropiada.

En espectrofotometría, la energía que incide sobre una muestra, es una radiación


monocromática (energía radiante de una sola longitud de onda, o por razones prácticas, una
banda muy estrecha de longitudes de onda). Las medidas de la radiación transmitida se
realizan mediante aparatos muy sensibles como el espectrofotómetro.

Un espectrofotómetro consta de una Fuente de radiación; Dispersor de longitud de onda


(prisma de cuarzo o de vidrio o de NaCl); Lentes; Células espejos; y un Detector
(Fotomultiplicador). (Vea figura 1)

Cuando se encuentra un sistema coloreado o un color producido en una reacción, es preciso


una investigación para desarrollar una determinación espectrofotométrica adecuada del
constituyente, para lo cual es necesario hacer una selección de la longitud de onda analítica.

3.2.1. NATURALEZA DE LA ABSORCIÓN DE ENERGÍA RADIANTE

El espectro de la energía radiante, contado a partir de la de menor longitud de onda (o, lo que
es lo mismo, e la de más alta frecuencia), incluye los rayos cósmicos, las radiaciones gamma, los
rayos X, la región del ultravioleta, la región de la luz visible, la zona del infrarrojo y l región de
las ondas de radio. Tanto los átomos como las moléculas pueden adoptar varios estados
electrónicos o diversos niveles de energía. La absorción de energía involucra la transición de
los electrones a niveles energéticos más elevados; cuanto más larga es la longitud de onda de la
radiación absorbida, menor es la transformación energética por esa absorción. Ahora bien,
estas son normas generales, válidas para todos los casos, pero cuando se pretende interpretar
con más detalle los fenómenos de absorción, las cosas se hacen bastante más complicadas,
especialmente en el caso de las moléculas orgánicas.

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3.2.2. LEYES DE LA ABSORCIÓN DE LA ENERGÍA RADIANTE

Estas Leyes hacen referencia a las relaciones existentes entre la magnitud de la absorción de
energía radiante y la cantidad de la sustancia absorbente. Para un sistema absorbente
(solución) dado, a una longitud de onda concreta y con una determinada intensidad de la
energía incidente, hay dos variables que influencian la intensidad de la absorción: la
concentración del absorbente y el espacio recorrido por la radiación energética a través de la
solución.

La ley de Beer, expresa la absorción de un rayo de energía radiante, efectuada por un


absorbente determinado, en las siguientes condiciones:

a) Se supone que la energía radiante es monocromica (es decir, con una longitud de onda
única).

b) El medio es homogéneo o isótropo (es decir, su índice de refracción es idéntico en todas


direcciones).

c) La absorción del solvente es despreciable.

d) No hay asociación ni disociación de las moléculas absorbentes.

e) No existe reacción entre el absorbente y las moléculas del solvente.

La ley de Beer afirma que, si se cumplen esos requisitos, la absorción, A, es directamente


proporcional a la concentración del absorbente y a la longitud del trayecto recorrido por la
energía radiante a través de la solución.

De aquí se puede escribir:

Donde:

A1: Absorción de una solución problema (de la que se quiere averiguar la concentración)

A2: Absorción de una solución patrón de concentración conocida.

C1: Concentración de la solución problema

C2: Concentración de la solución patrón (estándar)

Esta es una fórmula que se aplicara en esta práctica de laboratorio, a pesar de que “las lecturas
de un instrumento determinado –espectrofotómetro- pueden variar significativamente en el
curso de unas pocas semanas a consecuencia del desgaste de sus componentes”, puesto que
“todo esto no representan un problema cuando se calculan los resultados deduciéndolos de la
comparación de la absorción del problema con la de un patrón” (9).

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“La dificultad es grave, en cambio, cuando hay que deducir los resultados a partir de valores
establecidos de absorción, sea por no disponer de patrones, sea por no resultar practico
analizar un patrón simultáneamente con cada problema o grupo de problemas” (9).

3.3. PROCEDIMIENTO A REALIZAR EN ESPECTROFOTOMETRÍA (9)

3.3.1. DETERMINACIÓN DEL ESPECTRO DE ABSORCIÓN

Este se estudia en el espectrofotómetro la disolución del constituyente que se analiza, después


de desarrollado el color, determinándose su espectro de absorción. La longitud de onda
seleccionada es normalmente una, a la que la diferencia entre la absorbencia del compuesto
coloreado y el reactivo sea máxima. Aunque la longitud de onda conseguida no sea muy
sensible, debe ser segura.1

3.3.2. BLANCO DE REACTIVOS

Generalmente cuando se hace una determinación con un problema, se hace una lectura similar
sustituyendo la solución problema por agua o por el o los reactivos que sirvan para detectar la
sustancia problema. Esta última lectura es la del blanco de reactivos y sirve para determinar la
absorción de la solución problema no derivada de la sustancia cuya concentración se trata de
medir si no de los reactivos en sí. En esta práctica la absorción en blanco se debe a la razón que
se explica seguidamente:

En esta práctica se utilizara la prueba de Biuret para detectar la sustancia problema de nuestro
interés: Proteínas. Piense en el reactivo de Biuret. Es de color azul ¿recuerda? Cuando se utiliza
este reactivo para detectar proteínas, y medir su concentración, sucede que la lectura en
espectrofotómetro es la suma del color del reactivo de Biuret mas el color de la sustancia
problema. Por ello se hace necesario hacer una corrección.

Al colocar el espectrofotómetro en absorción “0” (100% transmitancia) con agua u otro


solvente, entonces la lectura del problema corresponde a la absorción del problema en si mas
la del blanco de reactivos. Se lee luego el blanco de reactivos, frente al mismo solvente
empleado antes y el valor de esta última se resta a la absorción de la solución problema
(extracto de proteínas). El valor de absorción que ahora se tiene, representa presumiblemente,
la absorción debida a la sustancia que se trata de determinar, siempre, que no existan
sustancias que interfieran en la calibración.

3.3.3. USO ADECUADO DE LAS “CUBETAS”

La conservación de las cubetas exige que se les trate correctamente. Hay que evitar hacerles
ralladuras o ponerlas en contacto con sustancias químicas capaces de alterar sus

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características ópticas. Por lo tanto no se deben usar, para limpiarlas, ni acido sulfúrico
concentrado, ni tampoco soluciones fuertemente alcalinas. Lo más conveniente es un
detergente de actividad moderada (no excesivamente alcalino) o, también, algún solvente
orgánico.
Las superficies ópticas deben limpiarse con un trozo de tejido blando con papel para limpiar
los cristales de la guías, y no deben tocarse con los dedos mientras se hacen las lecturas.

Figura No. 12 Espectrofotómetro utilizado en el laboratorio de bioquímica.


Fuente: MPH

Referencia:
Bausch & Lomb, Modelo 1. Escala de lectura
Spectronic 20 2. Luz piloto
3. Escala de longitud de onda
4. Control para seleccionar la longitud de onda
5. Control de intensidad de luz
6. Interruptor de corriente y control de cero
7. Compartimiento de la muestra

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 5

1. ¿Qué es la cromatografía? ¿En qué consiste esta prueba?

2. ¿Cuáles son las 4 fuerzas que determinan el grado de separación de sustancias en la


cromatografía?

3. ¿A qué tipo de procedimiento cromatográfico pertenece la “cromatografía fina” (esta se


usara en la práctica)?

4. ¿Cuál sería el comportamiento de una sustancia relativamente insoluble, en un proceso


de separación cromatografía? ¿Qué sucedería si la sustancia fuese muy soluble?

5. ¿Explique en qué consiste la cromatografía de absorción?

6. ¿Qué tipos de “adsorbentes” se pueden utilizar en la cromatografía de capa fina?

7. ¿Qué es la “activación de de placas en la cromatografía en capa fina?

8. Enumere tres cuidados que se debe tener presentes en la aplicación de la muestra en la


cromatoplaca:

9. ¿En qué consiste la técnica de “nebulización” para el revelado de cromatograma?

10. ¿Cómo se preservan los cromatogramas de capa delgada?

11. Elabore una definición propia de espectrofotometría.

12. ¿Para qué se utiliza espectrofotómetro?

13. ¿Qué condiciones debe cumplir la absorción de un rayo de energía radiante según la Ley
de Beer?

14. ¿Qué dice la Ley de Beer? Para responder a esta pregunta puede también referirse a
Lehninger, Nelson y Cox.

15. Trate de explicar con sus palabras lo que es un blanco de reactivos. Si se le dificulta
mucho, por favor preguntarle a su instructor de Laboratorio o Catedrático de curso.

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5. MATERIALES DE LA PRÁCTICA V

A cargo de cada grupo de trabajo:

Cromatoplaca de aluminio con sílica gel


Extracción acuosa
Extracción salina
Un lápiz o un portaminas de grafico
1 regla graduada
1 gradilla de metal
1 beacker de 50 ml
3 tubos capilares
1 pinza /tubo de ensayo
2 probetas de10 ml
Muestra problema
1 cromatografía
9 tubos de ensayo
2 pipetas Mohr (1ml y 5 ml)
1 Kleenex

A cargo del día de laboratorio:

1 caja de placas cromatografías de aluminio con: Sílica


Gel como medio de sostén.
Tubos capilares
Cono(s) de hilo
1 Objeto puntiagudo (navaja, clavo, etc) y/o ganchos plásticos de ropa
Papel filtro
Espectrofotómetro de Bausch y Lomb Modelo Epectronic 20
2 Cubetas (recipientes para lectura en espectrofotómetro)
1 mechero bunsen
Solución n-butanol, acido acético, agua
1 nebulizador de vidrio
1 manguera de hule
1 caja de Kleenex

Además las soluciones siguientes:

Sulfato de sodio al 26.6 % Estándar de albumina de concentración conocida (preparado a base


de reactivo o de “clara de huevo”), Reactivo de Biuret, Agua destilada, Alcohol etílico, Acetona.

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6. METODOLOGÍA

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7. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRÁCTICA:

Resuelva lo siguiente:

Definir Cromatografía. ¿En qué consiste esta prueba?

Enumere las cuatro fuerzas, de acción independiente, que definen el grado de separación de
sustancias en la cromatografía. ¿Cuáles de esos factores son responsables de la
movilización de la mezcla de sustancias a través del medio de sostén?

¿Cuál es la diferencia entre la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina?


Señale al menos 3 recomendaciones para la aplicación de muestras en las cromatoplacas.

Elabore un flujo grama de la metodología para realizar “cromatografía en capa fina”. (No es
necesario que sea muy específico, puede hacer simplemente un bosquejo de dicha
metodología).

Indique que soluciones utilizo en la cromatografía (muestra problema y soluciones patrón)


y explique el fundamento que le ayudo a decir que soluciones utilizar.

Calcule el valor de Rf para todas las manchas.

Vea la formula que aparece en su material de apoyo a la práctica.

Con base a los valores Rf obtenidos, identifique de ser posible, la muestra desconocida.

Compare los Rfs de cada una de las manchas obtenidas de sus muestras de “hidrolizado”,
con los obtenidos para los aminoácidos patrón.

Analice la correspondencia existente entre estos resultados y los de las pruebas de color,
desarrolladas en la práctica 2 parte II.

Resuelva lo siguiente:

Indique como se activa una cromatoplaca.

¿Cuál es la razón de utilizar tubos microcapilares?

¿Cuál es la razón de esperar a que se seque cada aplicación?

¿Por qué se coloca papel filtro mojado con “eluente”?


¿Por qué se marca con lápiz la posición del frente del disolvente?

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¿Qué indicaría para usted el aparecimiento de una mancha de un color muy diferente al
azul o violeta que denota aminoácidos según la prueba de la Ninhidrina?.

Indique las dimensiones de una cromatoplaca completa (de donde su instructor de


laboratorio recorto varias porciones). ¿Cuáles son las dimensiones de la sección de
cromatoplaca que usted utilizo en esta práctica?

Investigue si una cromatoplaca se recorta o si se utiliza completa. ¿Por qué se uso una
cromatoplaca “recortada”?

¿Todas las cromatocamaras son iguales a las que se utilizaron aquí? Justifique su
respuesta; si hubiese cromatocámaras de “fabrica” ¿Cuál es su tamaño? Además trate de
justificar por qué aquí se usaron cromatocamaras pequeñas.

 Responda las siguientes preguntas:

¿Qué es espectrofotometría? ¿Qué es un espectrofotómetro?

¿Por qué hay que limpiar tan minuciosamente la “cubeta” antes de agregar la solución que
se medirá en el espectrofotómetro?

¿Por qué se utilizó una longitud de onda de 540 nm, en el espectrofotómetro, para realizar
esta práctica de laboratorio?

¿Qué es un blanco de reactivo?

Elabore una tabla para indicar el contenido de los 9 tubos de ensayo identificados con
letras mayúsculas.

Justifique los pasos 6. 2 g y 6.2 h de la metodología de esta práctica.

 Se le sugiere leer el tema “blanco de reactivos” de el material de apoyo a esta práctica o


consultar a su instructor de Laboratorio o Catedrático de Curso.

 Reporte los datos siguientes:

Lectura (absorbancia y transmitancia) para las soluciones siguientes: blanco de reactivo


(Na2SO4 + Biuret); Estándar (albúmina); Solución problema (extracto).

Concentración [% peso/volumen] de proteínas en el “extracto acuoso” de proteínas. (utilice


la fórmula incluida en el Material de apoyo a esta práctica).

Concentración [% peso/volumen] de proteínas en el “extracto salino” de proteínas. (utilice


la fórmula incluida en el Material de apoyo a esta práctica.

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 Investigue lo siguiente:

Cantidad (en gramos) de Proteínas (solubles en agua) en 100 gramos de harina vegetal
seca.

Cantidad (en gramos) de Proteínas (solubles en agua) en 100 gramos de muestra vegetal
húmeda.

Cantidad (en gramos de Proteínas (solubles en agua) en 100 gramos de muestra vegetal
seca.

 Para resolver esto tome en consideración los siguientes datos:

Concentración [1% peso/volumen] de proteínas en el “extracto acuoso” de proteínas.

La cantidad obtenida de Extracto Acuoso en la práctica 3 de este Manual de Prácticas.

La Cantidad de Harina Vegetal utilizada para preparar el Extracto Acuoso.

La cantidad de Muestra Vegetal (semilla, hoja, etc.) utilizada para preparar la harina vegetal
y la Cantidad de Harina Vegetal preparada.

El % de humedad de su Muestra Vegetal.

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Práctica No. 6 EXTRACCIÓN DE GLÚCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES

1. INTRODUCCIÓN
Los glúcidos han sido conocidos durante mucho tiempo como carbohidratos, pero en la actualidad
suele usarse más el nombre “glúcido”.

Según Lehniger, Nelson y Cox (15), los glúcidos son las biomoléculas más abundantes en la
naturaleza. Cada año, el proceso de la fotosíntesis llevado a cabo por plantas y algas convierte más
de 1000.000 millones de toneladas métricas de CO2 y H2O en celulosa y otros productos
vegetales.

Ciertos glúcidos (como el azúcar y el almidón) son fundamentales en la dieta humana de la mayor
parte de países, y la oxidación de glúcidos es la principal ruta de obtención de energía en la
mayoría de células no fotosintéticas. Los polímeros insolubles de glúcidos actúan como elementos
estructurales y de protección en las paredes celulares de bacterias y plantas y en los tejidos
conjuntivos y envolturas celulares anímales. Otros polímeros de glúcidos funcionan como
lubricantes de articulaciones óseas o como adhesivos celulares.

En esta práctica de laboratorio se trabajará una metodología sencilla para la extracción de


glúcidos (carbohidratos). Aquel fundamento teórico que se ha seleccionado para el trabajo con
esta biomolécula, se presenta en la Práctica 7 de este Manual. Por ello no encontrará usted aquí
cuestionario pre laboratorio.

2. OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de:

Utilizar el “Sistema Soxhlet” para la extracción de glúcidos de una muestra vegetal


pulverizada.
Utilizar adecuadamente la cristalería y equipo a emplear un esta práctica de
laboratorio.

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3. MATERIALES
A carga de cada grupo de trabajo:

Harina de muestra vegetal (preparada y almacenada desde la Práctica 2 de este


laboratorio).
Un destilador Soxhlet contenido en una caja de cartón: esto incluye: un refrigerante o
condensador, una cámara de extracción, un balón de fondo plano de 250 ml y dos
mangueras de hule largas.
1 mechero
1 manguera de hule
1 soporte universal
1 anillo de hierro
1 rejilla de asbesto
2 pinzas fisher
1 erlenmeyer de 250 ml

A cargo del día de laboratorio

1 caja con perlas de ebullición


- papel parafilm - fósforos

NOTA: Del destilador Soxhlet cabe señalar que es un sistema de cristal que requiere de mucho
cuidado en su manejo, pues es muy frágil. En función de esto es posible que alguno(s) o todos
los grupos utilicen un sistema aleatorio que venga a sustituir a este destilador, pero esto será
decisión de la Subárea de Ciencias químicas y la explicación pertinente de su uso estará a cargo
del Instructor de Laboratorio.

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4. METODOLOGÍA

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5. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA
Esta práctica será evaluada junto con la practica 7. así que esta vez no habrá entrega de
cuestionario pre laboratorio, ni examen cortó ni entrega de informe.

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PRÁCTICA 7 ESTUDIO DE GLÚCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES

1. INTRODUCCIÓN

Los carbohidratos también llamados hidratos de carbono o glúcidos, son compuestos de amplia
distribución en la naturaleza, la mayoría son de origen vegetal formados durante el proceso de la
fotosíntesis. Los carbohidratos son los principales componentes de casi todas las plantas y
comprenden del 60 al 90 % de su masa seca. Los hidratos de carbono son sustancias orgánicas que
contienen grupos aldehídos o cetónicos potenciales (que en su estado libre poseen un intenso
poder reductor) y numerosos grupos alcohólicos secundarios y primarios. A causa de la similitud
de sus estructuras y reacciones, resulta difícil identificarlos y determinarlos.

Se crea un contexto agronómico en las prácticas de laboratorio de Bioquímica, de la FAUSAC, al


estudiar los carbohidratos extraídos de una muestra vegetal. Para el mencionado estudio, se ha de
trabajar con reacciones características de las biomoléculas (aplicación de pruebas para su
caracterización cualitativa) en el “extracto de la muestra vegetal), en el “extracto hidrolizado de la
muestra vegetal”, a la par de soluciones patrones de carbohidratos.

2. OBJETIVOS

Al finalizar la práctica, el estudiante deberá estar en la capacidad de:


Aplicar técnicas químicas en la caracterización de carbohidratos en una muestra vegetal.
Señalar los criterios de clasificación y caracterización de los carbohidratos.
Manipular adecuadamente, la cristalería, reactivos y equipo a utilizar en la presente
práctica.

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3. MATERIAL DE APOYO GLÚCIDOS (CARBOHIDRATOS) (3,7,15,20)

Según Lehninger, Nelson y Cox (15), loe glúcidos son las biomoléculas más abundantes en la
naturaleza. Cada año, el proceso de la fotosíntesis llevado a cabo por plantas y algas convierte más
de 100.000 millones de toneladas métricas de CO2 y H2O en celulosa y otros productos vegetales.

Ciertos glúcidos (como el azúcar y el almidón) son fundamentales en la dieta humana de la mayor
parte de países, y la oxidación de glúcidos es la principal ruta de obtención de energía en la
mayoría de células no fotosintéticas. Los polímeros insolubles de glúcidos actúan como elementos
estructurales y de protección en las paredes celulares de bacterias y plantas y en los tejidos
conjuntivos y envolturas celulares animales. Otros polímeros de glúcidos funcionan como
lubricantes de articulaciones óseas o como adhesivos celulares.

Los glúcidos han sido conocidos durante mucho tiempo como carbohidratos, pero en la actualidad
suele usarse más el nombre "glúcido". Literalmente, carbohidrato significa hidrato de carbono.
Este nombre derivó de investigaciones de los primeros químicos, cuyos análisis demostraron que
contenían únicamente carbono, hidrógeno y oxígeno. Ahora se sabe que algunos carbohidratos
contienen nitrógeno y azufre, además de los 3 elementos ya mencionados. Muchos glúcidos
comunes cumplen la fórmula empírica (CH2O)n, mientras que otros no. En definitiva no son
compuestos hidratados, como lo son muchas sales inorgánicas (CuSO4.5H20). La mayor parte de
sustancias de este tipo tienen fórmulas empíricas que sugieren que son `hidratos' de carbono, en
los que la relación C:I3:0 es de 1:2:1. (3, 20)

Como señalan I-P-hninger, Nelson y Cox (15), los glúcidos o carbohidratos son
polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas, o bien, sustancias que dan lugar a estos compuestos
después de su hidrólisis. En otras palabras los, carbohidratos son aldehídos o cetonas
polihidroxiladas o productos derivados de ellos por oxidación, reducción, sustitución o
polimerización. (20)

Los carbohidratos son los principales componentes de casi todas las plantas, comprenden del 60 al
90% de su masa seca. Los vegetales usan los carbohidratos tanto como fuente de energía así como
tejido de sostén, de la misma manera que los animales emplean las proteínas. Los vegetales
sintetizan sus propios carbohidratos a partir del dióxido de carbono del aire y del agua del suelo
(3, 7)

El hombre no sólo utiliza carbohidratos en su alimentación (aproximadamente del 60 al 65% en


masa de su dieta media), sino también para su vestimenta (algodón, lino, rayón), habitación
(madera), combustible (madera) y productos de papel (madera). (3, 7)

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3.1. CLASIFICACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS (3,7,15,20)

Los carbohidratos se pueden clasificar según sus productos de hidrólisis ácida. Se aceptan tres
categorías: Monosacáridos, Oligosacáridos y Polisacáridos (la palabra "sacárido" viene del griego
sakkharon, que significa azúcar).

3.1.1. Monosacáridos:

Son azúcares simples y no pueden fragmentarse en moléculas más pequeñas por hidrólisis.
Consisten de una sola unidad de un polihidroxialdehído o cetona. Los monosacáridos son sólidos
incoloros y cristalinos solubles en agua e insolubles en disolventes no polares. La mayoría tienen
sabor dulce. Los monosacáridos, por el grupo carbonílico, pueden ser aldosas (contienen un grupo
aldehído; ejemplo glucosa) o cetosos (contienen un grupo cetónico; ejemplo fructosa). A su vez, los
monosacáridos, pueden clasificarse por el número de átomos de oxígeno: hexosas (glucosa,
galactosa, manosa, fructosa), pentosas (arabinosa, xilosa, ribosa), tetrosas, treosas (treosa,
eritrosa).

3.1.2. Oligosacáridos:

Consisten en cadenas cortas de unidades de monosacáridos unidas por los característicos


enlaces glucosídicos. Los más abundantes son los disacáridos, que producen dos moléculas de
monosacáridos por hidrólisis. Aquí los monosacáridos están unidos mediante "enlaces glucosídicos".
Incluyen: sacarosa, lactosa y maltosa. Todos los monosacáridos y disacáridos comunes
tienen nombres que terminan con el sufijo "-osa". La mayor parte de oligosacáridos que
tienen tres o más unidades de monosacáridos, no se encuentran libres sino que se unen a otro tipo de
moléculas (lípidos o proteínas) formando estructuras híbridas (glucoconjugados).

3.1.3. Polisacáridos:

Consisten en cadenas largas de centenares o miles de unidades de monosacáridos; es decir, los


polisacáridos forman muchas moléculas de monosacáridos por hidrólisis. Son los carbohidratos
más abundantes en la naturaleza; sirven como componentes estructurales de las células y como
sustancias alimenticias de reserva. Aquí encontramos: almidón, glicógeno y celulosa.

Aquí puede hacerse una subdivisión más: se tienen por un lado los homoopolisacáridos
(moléculas muy grandes compuestas únicamente por un tipo de monosacárido) y por otro lado los
heteropolisacaridos (se forman a partir de dos o más unidades básicas y están frecuentemente
asociadas con proteínas; cuando predomina el carbohidrato el compuesto se conoce como
proteoglicano o mucoproteína, pero sin el carbohidrato es el componente menor, se le conoce
como glicoproteína).

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Casi todos los monos y disacáridos son sólidos cristalinos, de sabor dulce y fácilmente solubles en
agua. Los polisacáridos frecuentemente son compuestos amorfos, insolubles e insípidos, con
masas molares sumamente grandes.

Los carbohidratos también pueden clasificarse en función de sus propiedades "reductoras", de


acuerdo a su capacidad para reducir soluciones con iones metálicos como Cu+2 y Ag+1.

Un carbohidrato reductor es todo carbohidrato que se reduce sin necesidad de hidrólisis previa.
Se caracterizan por poseer sus grupos aldehídicos o cetónicos libres, es decir, que no forman parte
de uniones glucosídicas. En los carbohidratos, los grupos aldehídicos y cetónicos se encuentran en
forma de hemiacetales, por lo que su poder reductor es menor que el de un aldehído o cetona
libres.

El poder reductor también varía entre loa diferentes tipos de carbohidratos (aldosas y cetosas,
monosacáridos y disacáridos), por lo que el tiempo en que se realiza la reducción del cobre, a una
temperatura controlada, permite identificar en una muestra el tipo de carbohidrato reductor que
se encuentra presente.

Todos los monosacáridos y algunos disacáridos son reductores; los polisacáridos contienen sólo
un grupo reductor por varios cientos o más de residuos, así que, en la práctica no son reductores.

3.2. HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS (3)

La hidrólisis de los carbohidratos es la liberación de las unidades monómeras, los monosacáridos,


a partir de carbohidratos que se componen de por lo menos dos de éstas unidades. Esto quiere
decir que la hidrólisis sucede desde los disacáridos hasta los polisacáridos.

Por ejemplo, la escama es un disacárido de molécula demasiado grande por lo que no puede pasar
a través de las membranas celulares por lo que el cuerpo humano es incapaz de utilizarla como tal,
por lo que debe fragmentarse en sus componentes (glucosa y fructosa) por hidrólisis. Esta
reacción es catalizada por enzimas en el cuerpo humano, y en el laboratorio puede llevarse a cabo
utilizando ácido clorhídrico. El almidón, un polímero de glucosa, se hidroliza también por enzimas
y ácidos obteniéndose glucosa al final.

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3.3. PRUEBAS PARA CARBOHIDRATOS (3, 7, 8, 20)

3.3.1. Prueba de molish

Esta prueba es utilizada para identificar la presencia de carbohidratos, incluso


glucoproteínas. El resultado positivo (indicado por la aparición de un anillo púrpura) se da con todos los
carbohidratos más superiores que las tetrosas.

El ácido sulfúrico concentrado hidroliza enlaces glicosídicos para dar monosacáridos que
pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus derivados. Estos productos pueden
condensarse con compuestos fenólicos como el -naftol para dar sustancias coloreadas
(mayormente púrpuras).

Figura No. 13 Resultado de la prueba de molish.


Fuente: MPH.

3.3.2. Prueba de benedict:

Esta prueba se realiza en condiciones moderadamente alcalinas. Es una prueba sumamente


sensible para detectar la presencia de carbohidratos, pero no específica para los azúcares en
particular (el reactivo de Benedict demuestra la presencia hasta de 0.01% de glucosa en
agua). Esta reacción suele usarse para demostrar la presencia de carbohidratos reductores,
y se basa en la reducción del ion cúprico, en medio alcalino, para formar óxido cuproso [Cu 2O].

Los aldehídos, al igual que muchos otros compuestos, dan prueba positiva con el reactivo de
Benedict. La formación de un precipitado de óxido cuproso es el criterio para una prueba
positiva. El color del precipitado puede ser rojo, pardo naranja, amarillo o amarillo verdoso,
dependiendo de la naturaleza y cantidad del agente reductor presente.

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El reactivo de Benedict es reducido por O-hidroxialdehidos, por O-hidroxicetonas y por O-


cetoaldehídos. Las moléculas que sólo contienen el grupo funcionar alcohol, se oxidan con la
solución de Benedict.

Figura No. 14 Prueba de benedict dando una coloración anaranjada.

3.3.3. PRUEBA DEL, YODO:

Se utiliza para la detección de polisacáridos y para seguir el curso de la hidrólisis, a través del
cambio gradual de color que se produce entre el "hidrolizado" y el yodo. Esto se debe a que
el yodo forma complejos coloreados de adsorción con los polisacáridos. El almidón da un
color azul o negro azulado con el yodo, mientras que el glicógeno y el almidón parcialmente
hidrolizado dan una coloración pardo rojiza o violeta rojizo.

Figura No. 15 Coloración de los extractos con la prueba de yodo dando una coloración azul.

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3.3.4. PRUEBA DE BARFOED:

La prueba o reacción de Barfoed se emplea para diferenciar entre mono y disacáridos. La base de
esta prueba la constituye la diferente velocidad de la reacción con el acetato cúprico. La velocidad
de la reacción se determina por la velocidad de formación de Cu2O. Concentraciones equimolares
de monosacáridos y disacáridos poseyendo un grupo reductor por molécula reaccionan con el
reactivo de Barfoed a velocidades distintas. Una clara diferencia entre mono y disacárido, es su
tamaño molecular, lo que parece constituir un factor limitante en la velocidad de la reacción.
También pueden estar implicados otros factores, tales como una interacción más compleja con los
dos anillos monosacáridos. Ello parece suficiente para suponer que las moléculas más pequeñas
tienen una mayor reactividad.

La prueba es positiva por el aparecimiento de un color rojo ladrillo, que se debe al aparecimiento
de precipitado 0120 (a pesar de ser el mismo precipitado formado con Benedict, el color obtenido
en estas pruebas es diferente).

Figura No. 16 coloración que se obtiene con la prueba de barfoed en glucosa y fructuosa.

3.3.5. PRUEBA DE SELIWANOFF

Esta prueba permite diferenciar las aldohexosas de las cetohexosas en base a sus velocidades de
reacción. El HCl caliente deshidrata a las cetohexosas para formar hidroximetilfurfural mucho más
rápido que a las aldohexosas correspondientes.

Las cetosas se deshidratan más rápido que las aldosas, dando derivados de furfural, que—,
condensados con resorcinol, dan un complejo rojo.

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Esta reacción está basada en la transformación de la fructosa en un derivado del furfural por la
acción del calor y el ácido clorhídrico. Como ya se mencionó, este derivado se condensa con el
resorcinol para formar un compuesto rojo. La reacción la dan todas las cotosas.

La concentración del azúcar y el tiempo de calentamiento deben ser controlados cuidadosamente.


Un calentamiento prolongado hace que la glucosa y otras aldosas den positiva la reacción. Las
pentosas reaccionan con esta prueba dando un producto de color verde a azul.

Figura No. 17 Coloración de los extractos y patrones con la prueba de seliwanof.

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 7

1. Elabore una definición propia de: carbohidrato (glúcido)

2. Mencione al menos 5 funciones de los glúcidos.

3. ¿Cómo se pueden clasificar a los carbohidratos según sus productos de hidrólisis ácida?

4. Elabore una definición para "monosacáridos". Señale las características generales de este
grupo y además indique cuál(es) monosacáridos se usará(n) en esta práctica.

5. ¿Cuáles la diferencia entre aldosa y cetosa?

6. ¿Qué es un oligosacárido?

7. Elabore una definición para "disacárido”. Señale las características generales de este
grupo y además indique cuál(es) disacárido(s) se usarán en esta práctica.

8. Elabore una definición para "polisacárido". Además indique cuál(es) polisacárido(s) se


usará(n) en esta práctica.

9. ¿Qué es un carbohidrato reductor? ¿Qué caracteriza a los carbohidratos reductores?

10. Diferencie a los monosacáridos y disacáridos; de los polisacáridos, en función de su solubilidad y de su


propiedad "reductora'.

11. ¿Qué es hidrólisis de carbohidratos?

12. ¿Para qué se utiliza la prueba de Molisch? ¿Qué cambio indica una prueba de Molisch
positiva?

13. ¿En qué consiste la prueba de Benedict? ¿Cuál es su utilidad?

14. ¿Qué se puede detectar con la prueba del yodo? ¿Qué cambio indica que la prueba es positiva?

15. ¿Cuál es la utilidad de la prueba de Barfoed? ¿en qué se fundamenta esta prueba?

16. ¿Qué compuesto es identificado en la prueba de Seliwanoff, cuando el resultado es un


complejo color rojo?

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5. MATERIALES

Preparar el área de trabajo del área de trabajo:

30 tubos de ensayo
2 gradillas de metal
1 pinza p/tubo de ensayo
1 estufa eléctrica
2 probetas de 10 ml
1 beacker de 600 ml
1 pizeta
1 beacker de 100 ml
tubos de ensayo grandes
frascos con gotero identificados en función de su contenido, así:
-naftol; Benedict; Solución de Yodo; Barfoed; Seliwanoff.
Muestras de extracto, de extracto hidroliza.do, de almidón hidrolizado y de sac-fruosa
hidrolizada.

A cargo del día de laboratorio:

Agua destilada
2 goteros pico de gallo con ácido sulfúrico (en lavaderos)
1 gotero pico de gallo con ácido clorhídrico (en la campana de gases). - Frascos con
gotero con las soluciones siguientes:
Celulosa, AL-pidón, Sacarosa, Lactosa, Maltosa, Glucosa, Fructosa.

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6. METODOLOGÍA

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 VER PREPARACIÓN DE LOS REA CTIVOS.

N o t a : L a L I M P I E Z A de la cristalería es fundamental para las pruebas a realizar en esta


práctica de laboratorio

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El cuadro siguiente es una guía para el estudiante para que sepa que muestras se van a analizar en
las pruebas de esta práctica.

Cuadro 6. Resumen de pruebas cualitativas, a realiza a soluciones patrones e hidrolizados de


carbohidratos y muestra desconocida.

PRUEBAS 
MUESTRAS A Molisch Benedict Yodo Barfoed Seliwanoff
ANALIZAR 
1. Extracto     
2. Extracto
    
Hidrolizado
3. Celulosa
 
(Papel Bond)
4. Almidón  
5. Almidón
    
Hidrolizado
6. Sacarosa   
7. Sacarosa
   
Hidrolizada
8. Lactosa   
9. Maltosa   
10. Glucosa    
11. Fructosa    
12. Muestra
   
desconocida

7. PREPARACIÓN DE REACTIVOS

a) Prueba de Benedict:

El reactivo de Benedict se p re p a ra disolviendo 1..3 g de curato de sodio y 10 gramos de


carbonato de sodio en aproximadamente 80 ml de agua tibia. Si la solución está turbia, filtrar.
Colocar en una probeta de 100 ml y se completa con agua hasta la marca de 85 ml. Enseguida, se
disuelven 1.73g de sulfato de cobre en aproximadamente 10 ml de agua destilada. Se mezclan las
dos soluciones y se agitan. Se diluye la solución a 100 ml con agua destilada (en un balón
volumétrico de 1OOmL).

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b) Prueba del Yodo:

Esta solución de yodo es al 5mmol I2 por litro de solución de KI al 3% p/v,

c) Prueba de Barfoed:

El reactivo de Barfoed se prepara utilizando 13.3 g de acetato de cobre en 200 mL de agita destilada,
más 1.8 mL de ácido acético glacial.
d) Prueba Seliwanoff.

El reactivo de Seliwanoff se prepara utilizando 0.5g de resorcinol por cada litro de HCl 3M.

8. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRÁCTICA:


Explique el por qué de la distribución de las muestras, del cuadro anterior, para cada prueba de
caracterización. En otras palabras, justifique el uso de cada muestra en cada prueba que se le
indica en el cuadro 6.

9. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA
Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO

La metodología de evaluación incluye también un Informe de práctica. El informe puede hacerse


en parejas o individualmente, y debe incluir:

Carátula

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

Resultados de práctica. Estos se presentan según las siguientes indicaciones:


Es un cuadro de resultados para CADA UNA DE LAS 12 MUESTRAS (Vea el cuadro 6). Los cuadros
deben seguir el modelo del Cuadro 7, presentado a continuación:

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CUADRO 7. Cuadro de resultados de las pruebas realizadas a la muestra de EXTRACTO DE


CARBOHIDRATOS

NOMBRE DE LA PRUEBA COLORACIÓN DICTAMEN

Molisch

Benedict

Yodo

Barfoed

Seliwanoff

REFERENCIA: Coloración = color observado como resultado de la prueba


Dictamen = prueba positiva (+) o negativa (-).

NOTA: Procure intercalar los resultados con su respectivo análisis explicación.

Análisis y explicación de cada cuadro de resultados, a fin de establecer la presencia o


ausencia de glúcidos en cada muestra problema. (Para el caso de la explicación que se le
pide, haga énfasis sobre si hay concordancia de los resultados prácticos con el fundamento
teórico. Si no hubiese tal concordancia, plantee una justificación válida).

Dar solución a los "cuadros" que aparezcan en su metodología y presentarlos también,


intercalados con los resultados y análisis de resultados.

Como una guía de su análisis se le recomienda utilizar la “solución” a los cuadritos que
aparecen para cada parte de la metodología.

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Práctica No. 8 EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES

1. INTRODUCCIÓN

Cuando se iniciaban las prácticas de laboratorio de Bioquímica, se hacía referencia al estudio de


las tres biomoléculas más importantes: proteínas, carbohidratos y lípidos. Con el estudio de esta
práctica se iniciara el trabajo con los “lípidos”.

Los lípidos forman un grupo heterogéneo de compuestos orgánicos y son componentes


importantes de los tejidos vegetales y animales. Poseen características comunes de solubilidad
(poco o nada solubles en agua, pero solubles en solventes no polares como cloroformo, éter,
etanol, benceno, etc.).

Los lípidos constituyen el grupo de compuestos de reserva de energía más importante en el reino
animal. En contraste, los vegetales almacenas casi toda su energía en forma de carbohidratos,
fundamentalmente como almidón. Los lípidos sirven de aislamiento a los órganos vitales,
protegiéndolos de los golpes y manteniendo la temperatura optima del cuerpo. Los lípidos forman
parte integral de la estructura de la membrana celular y, como tales, están asociados con el
transporte a través de las membranas celulares.

Los aceites vegetales tienen un sin número de aplicaciones industriales, medicinales, etc. Y existe
gran cantidad de especies que son cultivadas para extraer y procesar los aceites presentes en sus
semillas, hojas u otros órganos.

En esta práctica de laboratorio se trabajara una metodología sencilla para la extracción de lípidos.
Aquel fundamento teórico que se ha seleccionado para el trabajo con esta biomolecula, se presenta
en la practica 9 de este manual. Por ello no encontrara usted aquí cuestionario pre laboratorio.

2. OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de:


Utilizar el “sistema soxhlet” para la extracción de lípidos de una muestra vegetal
pulverizada.
Utilizar adecuadamente la cristalería y equipo a emplear en esta práctica de laboratorio.

LABORATORIO BIOQUÍMICA 101


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3. MATERIALES
A cargo de cada grupo de trabajo:

Harina de muestra vegetal (preparada y almacenada desde la practica 2 de este


laboratorio).

NOTA: es posible que su instructor de laboratorio decida asignar una muestra vegetal a cada
grupo. Esto se hará con la finalidad de que todos los grupos trabajen con un vegetal con un
contenido relativamente alto de LÍPIDOS (por ejemplo maní, ajonjolí, etc.).

Un destilador soxhlet contenido en una caja de cartón: esto incluye: un refrigerante o


condensador, una cámara de extracción, un balón de fondo plano de 250 ml. y dos
mangueras de hule largas.

1 mechero
1 anillo de hierro
1 erlenmeyer de 250 ml.
1 manguera de hule
1 rejilla de asbesto
1 soporte universal
2 pinzas fisher

A cargo del día de laboratorio:

1 caja con perlas de ebullición.


Solvente n-hexano o algún otro solvente apolar que le indique su instructor de
laboratorio.Papel parafilm
Fósforos.

NOTA: del destilador soxhlet cabe señalar que es un sistema de cristal que requiere de mucho cuidado
en su manejo, pues es muy frágil. En función de esto es posible que algunos o todos los grupos utilicen
un sistema aleatorio que venga a sustituir a este destilador, pero esto será decisión de la Subarea de
Ciencias Químicas y la explicación debida estará a cargo del Instructor de Laboratorio.

LABORATORIO BIOQUÍMICA 102


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4. METODOLOGÍA

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5. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA:
Esta práctica será evaluada junto con la practica 9. Así que esta vez no habrá entrega de
cuestionario pre laboratorio, examen corto ni entrega de informe.

LABORATORIO BIOQUÍMICA 104


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Práctica No. 9 ESTUDIO DE LÍPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES

1. INTRODUCCIÓN

En la práctica anterior se han extraído lípidos de una muestra vegetal. Ahora se procederá a
realizar una metodología sencilla para estudiar cuantitativa y cualitativamente esta Biomolécula.
Respecto a ella aquí se presenta el fundamento teórico para hacer más accesible el conocimiento
dentro del laboratorio.

Si usted compara los contenidos de las biomoléculas en los vegetales, podrá notar que
“regularmente” son los lípidos los de menor proporción. Esto no se debe a que carezcan de
importancia, sino que las plantas han creado un medio de almacenamiento de energía a través de
almidón y utilizan los lípidos sobre todo en el transporte a través de las membranas celulares
(Según White et.al. (20)).

Los lípidos son moléculas biológicas fundamentales en las plantas, como se citó anteriormente, y
por ello, en esta práctica, se buscara, a través de experiencias sencillas, que el estudiante obtenga
bases para realizar pruebas de caracterización de lípidos en muestras vegetales, utilizando
adecuadamente la cristalería, equipo y reactivos necesarios.

2. OBJETIVOS

Al finalizar la práctica, el estudiante deberá estar en capacidad de:

Determinar experimentalmente el porcentaje de pureza del extracto de lípidos de la


muestra vegetal.

Realizar las pruebas de “solubilidad de lípidos” y de “instauración” como estudio cualitativo


de caracterización de lípidos de la muestra vegetal.

Obtener experimentalmente el índice de Saponificación de los lípidos de la muestra vegetal.

Obtener experimentalmente el índice de acidez de los lípidos de la muestra vegetal.

Manipular adecuadamente, la cristalería, reactivos y equipo a utilizar en la presente


practica.

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3. MATERIAL DE APOYO ESTUDIO DE LÍPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES

3.1. LÍPIDOS (15,20)


Los lípidos se encuentran generalmente distribuidos en la naturaleza como esteres de ácidos
grasos de cadena larga. Forma un grupo heterogéneo de compuestos orgánicos y son componentes
importantes de los tejidos vegetales y animales. Poseen características comunes de solubilidad
(poco o nada solubles en agua, pero solubles en solvente no polares como cloroformo, éter, etanol,
benceno, etc.)

Los lípidos constituyen el grupo de compuestos de reserva de energía más importante en el reino
animal. En contraste, los vegetales almacenan casi toda su energía en forma de carbohidratos,
fundamentalmente como almidón. Los lípidos sirven de aislamiento a los órganos vitales,
protegiéndolos de golpes y manteniendo la temperatura óptima del cuerpo. Los lípidos forman
parte integral de la estructura de la membrana celular y, como tales, están asociados con el
transporte a través de las membranas celulares.

Los aceites vegetales tienen un sin número de aplicaciones industriales, medicinales, etc, y existe
gran cantidad de especies que son cultivadas para extraer y procesar los aceites presentes en sus
semillas, hojas u otros órganos.

3.2. CLASIFICACIÓN DE LOS LÍPIDOS (15,20)

A diferencia de los polisacáridos y proteínas, los lípidos no son polímeros –no poseen unidad
monómerica repetitiva-. Sin embargo, al igual que los carbohidratos, pueden clasificarse en base a
sus productos de hidrólisis y según su semejanza en cuanto a estructura molecular. Se clasifican
así:

1. Lípidos simples

2. Lípidos compuestos

3. Esteroides.

3.2.1. LÍPIDOS SIMPLES:

Se subdividen en:

Grasas y aceites (triacilgliceroles):

Producen ácidos grasos y glicerol (un alcohol trihidroxilado) por hidrólisis. Se les llama
“triacilgliceroles”, debido a que son esteres que se componen de tres ácidos grasos unidos al
glicerol.

LABORATORIO BIOQUÍMICA 106


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Se dice que un lípido es una grasa si se encuentra en estado sólido a 25’C y un aceite, si ésta es
líquido o la misma temperatura.

Estos compuestos constituyen la mayor parte de los lípidos ingeribles. Son degradados
parcialmente por las lipasas en el intestino y luego son re-esterificados en la mucosa intestinal.

Un ácido es un ácido monocarboxilico de cadena larga continua. La presencia de dobles enlaces en


ellos disminuyo el punto de fusión del compuesto. Estos ácidos pueden ser saturados o
insaturados. En general cuando mayor sea el grado de instauración de un ácido graso, tanto
menor será su punto de fusión. Las grasas están formadas por una gran proporción de ácidos
grasos insaturados y los aceites tienen más proporción de ácidos grasos insaturados.

Los ésteres de glicerol y ácidos grasos se conocen como acilgliceroles. Los triacilgliceroles son la
forma predominante en la naturaleza. Los acilgliceroles on moléculas no cargados y por ello se
conocen también como “lípidos neutros”

Los lípidos pueden ser oxidados en el hígado para suministrar energía o pueden ser depositados
como grasa en regiones características donde actúan como depósitos de reserva a largos plazo y
como aislamiento térmico. En algunas semillas los triacilgliceroles se almacenan en fomra de
aceites. Los lípidos que se obtienen de fuentes animales, por lo general son sólidos, en tanto que
los aceites normalmente son de origen vegetal. Por ende es común hablar de grasas animales y de
aceites vegetales.

Ceras:

una cera es un éster de un alcohol alifático superior y un ácido graso de cadena muy larga.
Producen ácidos grasos y alcoholes de cadena larga por hidrólisis. Las ceras no se hidrolizan con
facilidad, por lo tanto, resulta útil como recubrimientos protectores. En las células, las ceras son
cubiertas a prueba de agua para proteger contra infecciones, daño mecánico o ganancia excesiva
de agua.

3.2.2. LÍPIDOS COMPUESTOS

Se subdividen en:

Fosfolipidos:

Producen por hidrólisis ácidos grasos, glicero, ácido fosforito y un alcohol nitrogenado. Los
fosfolípidos, tambien llamados fosfáticos, son lípidos compuestos qué se derivan del fosfato de
glicerol. Químicamente son similares a los triacilgliceroles ya que son ésteres de ácidos grasos y
glicerol, pero además contienen ácido fosfórico eterificado con un alcohol.

LABORATORIO BIOQUÍMICA 107


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Son especialmente abundantes en el hígado, cerebro y tejido espinal y se localizan en las


membranas externas de casi todas las células.

Son los lípidos de mayor polaridad. Se supone que su función fundamental es la de actuar como
un agente emulsionante en las superficies de las membranas celulares, donde los lípidos
insolubles en agua y los materiales solubles en ella deben ser capaces de asociarse
inmediatamente.

Glicolípidos:

Producen por hidrólisis ácidos grasos, esfingosina o glicerol y un carbohidrato. Existen algunos
grupos de compuestos que contienen estructuras tanto de lípidos como de carbohidratos.
Aquellos que son solubles en agua reciben el nombre de liposacáridos y se consideran como
derivados de carbohidratos. Aquella que sigue siendo solubles en disolventes orgánicos no
polares se clasifican como glicolípidos. Un grupo de glicolípidos contiene ácidos grasos, glicerol y
diversos carbohidratos.

Esfingolípidos:

Producen por hidrólisis ácidos grasos, esfingosina, ácido fosfórico y un componente alcohólico. Se
encuentran en las membranas de plantas y animales, pero sólo muy poco cantidad en los
depósitos de grasa. Aquí, el esqueleto de la molécula es el alcohol aminado esfingosina en lugar de
glicero. También están presentes en ellos, ácidos grasos, fosfato y un compuesto alcohólico.

Lipoproteínas:

En los materiales biológicos se encuentran frecuentemente asociados con proteínas formando


complejos lipoproteínicos. Las lipoproteínas solubles se encargan principalmente del trasporte
los lípidos en la sangre, mientras que las insolubles constituyen la parte principal de muchas
membranas biológicas.

3.2.3. Esteroides:

Los esteroides son compuestos que poseen una estructura fenantrénica muy diferente de los
lípidos formados por ácidos grasos. Se hallan en tejidos vegetales y animales, levaduras y hongos
y pueden existir libre o combinación con ácidos grasos o carbohidratos. Puesto que los esteroides
esenciales son hidrocarburos de masa molar grande, son solubles solo en los disolventes de
grasas. Difieren de los demás lípidos en cuanto a que no experimentan saponificación.

El esteroide mejor conocido y más abundante en el cuerpo humano el “colesterol”. Se encuentra


sobre todo en el cerebro y el tejido nervioso. Es el principal componente de los cálculos biliares,
de las cuales puede separarse como sólido cristalino de color blanco. Aproximadamente el 95 %
de las muertes debidas a enfermedades cardiovasculares directamente ligadas a la arteriosclerosis

LABORATORIO BIOQUÍMICA 108


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(endurecimiento de las arterias que producen enfermedad cardiaca degenerativa apoplejía y


otras enfermedades arteriales). La arterosclerosis (una forma de arteriosclerosis) resulta de la
deposición de un exceso de colesterol.

3.3. PRUEBAS CUALITATIVAS DE LÍPIDOS (15,20)

3.3.1. SOLUBILIDAD:

Las propiedades de solubilidad de los lípidos son una función de su estructura tipo alcano. Los
grupos principales de los lípidos tienen características de solubilidad diferentes y esta propiedad
se usa su extracción y purificación a partir de materiales biológicos.

La mayoría de los lípidos son solubles en etanol, pero forman una emulsión de gotas pequeñas
cuando se les agrega agua. Esto da a la suspensión una apariencia lechosa característica y
constituyente una prueba muy sensible para grasas.

3.3.2. INSTAURACIÓN:

Los ácidos grasos presentes en las grasas animales están generalmente saturados, mientras que
aquellos presentes en los aceites vegetales contienen uno o más enlaces dobles. La hidrogenación
de estos enlaces convierte los aceites vegetales líquidos en grasas sólidas, siendo esto lo se hace
comercialmente para la producción comercial de margarina.

Los halógenos17 pueden unirse fácilmente a los enlaces dobles. La decoloración de una solución de
bromo o yodo por un lípido indica la presencia de los enlaces doble.

3.4. PRUEBAS CUANTITATIVAS DE LÍPIDOS (14,15,20)

Un análisis químico completo de las grasas encontradas en la naturaleza es un procedimiento


bastante dispendioso (costoso), pero hay un número de mediciones tales como el valor de acidez,
el índice de saponificación y el índice de yodo, que dan información útil acerca de la composición y
pureza de una grasa determinada.

3.4.1. ÍNDICE DE ACIDEZ:

“Por ACIDEZ de un lípido se entiende el contenido de ácidos grasos libres de un aceite o una grasa
y se expresa en porcentaje en masa de ácido oleico, palmítico o láurico, según la naturaleza del
producto que se trate”

LABORATORIO BIOQUÍMICA 109


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Las grasas almacenadas pueden enranciarse debido a la oxidación de los dobles enlaces para
formar peróxido y su hidrólisis por microorganismos con liberación de ácidos grasos. La cantidad
de ácidos grasos libres, da por lo tanto, un índice de la frescura y calidad de la grasa.

Como dice el documento de ICAITI (14) el “índice de acidez es la cantidad de hidróxido de potasio
necesario para neutralizar la acidez y se expresa en miligramos de KOH requeridos

Para neutralizar los ácidos grasos libres presentes en un gramo de producto”.

En otras palabras, el valor de acidez es el número de miligramos de KOH requeridos para


neutralizar los ácidos grasos libres presentes en un gramo de grasa.

Es una medida de los ácidos grasos libres de un lípido. La reacción es simplemente la titulación de
un ácido (el graso) y una base fuerte. Para neutralizar los ácidos grasos libres de la cantidad de
lípidos analizados se efectúa la conversión a un gramo de grasa y se expresa el resultado como IA.

En el documento de ICAITI (14) está indicado que la acidez y el índice de acidez se calcula
aplicando las siguientes ecuaciones y promediando los resultados obtenidos en las
determinaciones en duplicado. Es decir que para obtener valores confiables es necesario repetir,
al menos una vez, la prueba de IA.

Donde:

V=Volumen de la solución de hidróxido de potasio empleado en la titulación, en centímetros


cúbicos.
N=Normalidad de la solución de hidróxido de potasio.
m=Cantidad de Lípido en gramos.

Nota: Tenga cuidado de no confundir la masa “m” con la masa del “extracto”
El IA también puede calcularse utilizando un procedimiento estequiométrico. Para ello el
estudiante deberá consultar su memoria y algún texto utilizando en la Química General 1 y 2.

LABORATORIO BIOQUÍMICA 110


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3.4.2. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN: (14,15)

La hidrólisis de los triacilgliceroles puede efectuarse por varios procedimientos, los más comunes
utilizan álcalis o enzimas llamadas lipasas. La hidrólisis alcalina recibe el nombre de
saponificación, debido a que uno de los productores de la hidrólisis es un jabón, de ordinario, de
sales de sodio o potasio de los ácidos grasos.

Esta reacción de hidrólisis también proporciona un método analítico, útil para la determinación de
una constante, el índice de saponificación, el cual es característico de los lípidos simples.

El índice de saponificación de un lípido se define como el número de miligramos de hidróxido de


potasio necesario para saponificar un gramo de grasa o de aceite. También puede definirse como
el número de miligramos de KOH que se requiere para neutralizar la masa molar media del lípido.

El índice de saponificación da una idea del tipo de ácidos grasos presentes en el lípido ya que entre
más larga sea la cadena hidrocarbonada, menor será la cantidad de ácido liberado por gramo de
lípido. En otras palabras, un índice de saponificación pequeño de un ácido o aceite indica una
masa molar elevada.

Materia insaponificable de un lípido es el conjunto de sustancias que se encuentran disueltos en


los cuerpos grasos, no saponificables por álcalis, pero solubles en los solventes ordinarios de los
aceites y grasas.

Experimentalmente, una muestra pesada de grasa se saponifica con una Cantidad X de una
solución alcohólica valorada de hidróxido de potasio. Después de la saponificación, el exceso de
álcali (cantidad y) se titula con ácido valorado.

Usando la cantidad de mililitros de ácido valorado qu se emplearon en la titulación, se averigua los


ml de KOH que sirvieron para saponificar los lípidos (cantidad Y)

Para su cálculo puede serle útil la ecuación siguiente:

Cantidad X = Cantidad Y + Cantidad Z

Utilizando esta ecuación puede averiguarse la Cantidad de Z, es decir, los ml de KOH que se
emplearon en la saponificación. Ya con esto puede averiguarse el IS.

3.4.3. PORCENTAJE DE PUREZA (%) (14,15)

Para el caso de las prácticas de laboratorio de Bioquímica de la FAUSAC, el porcentaje de pureza


va a representar los gramos de lípido contenidos en 100 gramos del extracto que se obtuvo. Dicho

LABORATORIO BIOQUÍMICA 111


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porcentaje se hace necesario para realizar el cálculo del índice de acidez y el índice de
saponificación.

En la actualidad para el análisis de lípidos se emplean la cromatografía gas-liquido y la


cromatografía en capa fina identificación cualitativa de lípidos y ácidos grasos componentes y la
determinación cuantitativa del porcentaje de cada componente presente.

4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRÁCTICA 9

1. Elabore una definición propia de: lípido.

2. ¿Cómo almacenan energía los animales? ¿Como lo hacen las plantas?

3. Enuncie una diferencia entre polisacárido y proteínas respecto a los lípidos.

4. ¿Qué es un triacilglicerol? ¿Cuál es la diferencia entre grasa y aceite?

5. ¿Cómo es el punto de ebullición de un lípido respecto al grado de saturación de sus ácidos

grasos?

6. ¿Cuáles son los productos de la hidrólisis de una cera?

7. ¿Qué es un fosfolípido? ¿Cuál se supone que es su función fundamental?

8. ¿Cuál es la diferencia entre un glicolípido y un esfigolípido?

9. De una definición de lipoproteína.

10. ¿Cuál es la diferencia de los esteroides respecto a los demás lípidos?

11. ¿Cómo se detectaría la presencia de lípidos en una solución de etanol con agua?

12. ¿Cuál es la diferencia entre ácido graso de grasas animales y ácido graso de aceite vegetal?

13. ¿Qué es acidez de un lípido?

14. ¿Qué es el índice de acidez de un lípido? Según su material de apoyo ¿de cuántas maneras

puede calcularse el IA de un lípido?

15. ¿Qué es una materia insaponificable?

16. ¿Qué es saponificación? ¿Qué es índice de saponificación?

LABORATORIO BIOQUÍMICA 112


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17. Explique la diferencia entre índice de Acidez e índice de Saponificación.

5. MATERIALES
A cargo de cada grupo de trabajo:

5 tubos de ensayo.
1 gradilla de metal.
1 pinza p/tubo de ensayo.
1 estufa eléctrica.
2 probetas de 10 mL.
1 baño de maría metálico.
2 soportes universales.
2 pinza para bureta.
1 balanza mono plato.
2 Erlenmeyers de 100 mL.
1 varilla de Vidrio.
1 probeta de 25 mL.
1 frasco gotero con etanol. -
1 frasco gotero c/fenoftaleina.
50 ml de extracto de lípidos.

A cargo del día de laboratorio:

Agua destilada.
Solución de KOH [0.5 M]
Solución de HCl [0.5 M].
Alcohol etílico.
Solución de KOH [0.1 N]
Un frasco gotero con solución de I2 en CHCl3 (cloroformo), al 1%p/v.
Un frasco gotero con solución de Br2 en agua, al 1%p/v.
Dos balanzas semianalíticas.

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6. METODOLOGÍA

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7. EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA

 Examen Corto con un nivel de dificultad similar al CUESTIONARIO PRE LABORATORIO.

 La metodología de evaluación también incluye un Informe de prácticas. Este informe puede


hacerse en parejas o individualmente, y debe incluir:

 Carátula.

 Resultados y Análisis de Resultados.

Resultados de práctica. Estos se presentan según las siguientes indicaciones:

Aquí ha de hacerse la presentación que se considere más conveniente. Pueden utilizar esquemas,
cuadros y/o frases para expresar lo observado durante la práctica. Aquí se incluyen también los
resultados de la solución a los cuadros negros.

NOTA: Procure intercalar los resultados con su respectivo análisis y explicación.

8. PARA EL REPORTE DE PRÁCTICA

Análisis y explicación de cada cuadro de resultados, es decir, expresar en palabras aquello


que el estudiante crea tiene relevancia mencionar como parte del informe y que ha influido
en los resultados presentados con anterioridad. (Para el caso de la práctica con el
fundamento teórico. Si no hubiese tal concordancia, plantee una justificación válida).
Dar solución a los “cuadros” que aparezcan en su metodología y presentarlos también,
intercalados con los resultados y análisis de resultados.
Como una guía de su análisis se le recomienda utilizar la “solución” a los cuadritos que
aparecen para cada parte de la metodología.
Resuelva lo siguiente y colóquelo al final de su Informe de práctica.
o Investigue qué utilidad tiene calcular el “índice de yodo” en lípidos.
o ¿Qué es un aceite esencial y qué relación tiene con los lípidos?
o Dibuje la estructura de un triacilglicerol, un fosfoglicérido y un esfigonlípido.
o ¿Por qué los asteroides y las vitaminas liposolubles son considerados como lípidos?
¿Qué es el Índice de saponificación?
¿Para qué utilizo el “porcentaje de pureza” del extracto, para averiguar el IS?
¿Cómo se define la Acidez de un Lípido?
¿Cómo se define el índice o valor de acidez?
¿Cuál es la importancia de utilizar el valor “porcentaje de pureza” para el cálculo acidez?
Justifique su respuesta.
Señale la utilidad de la prueba de yodo.

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¿Ha podido identificar algo con la prueba de yodo?


¿Qué es un halógeno? ¿Qué es un halogenuro? ¿Qué relación tienen estos términos con esta
parte de la metodología?
Si usted es observador notará que la metodología de la prueba de instauración está
planteada para utilizar dos halógenos, uno en un solvente apolar (cloroformo) y otro en un
solvente polar (agua). Trate de explicar la razón de este hecho particular de esta parte de la
metodología.

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de Química biológica. Departamento de Bioquímica, Manual de prácticas de laboratorio,
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16. MANCILLA, R..Manual de prácticas de bioquímica. Escuela de Química Farmacéutica,


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