Identificación de epítopos de células β de protección de Atroxlysin-I (metaloproteinasa) de Bothrops asper, serpiente que predomina en la región andina de Colombia.

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SEGUIMIENTO DE PROYECTOS DE Código: IN-P01-F01

INVESTIGACIÓN Versión: 04
Fecha Aprobación:
PRESENTACIÓN DE PROYECTOS DE 05-06-2017
INVESTIGACIÓN
Identificación de epítopos de células β de protección de Atroxlysin-I

(metaloproteinasa) de Bothrops asper, serpiente que predomina en la región
andina de Colombia.
AUTORES
Ítem Nombres Cargo Identificación
1 Estudiante-Investigador 070100392014
GRUPO DE INVESTIGACIÓN:
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN:
Modelos experimentales para las ciencias zoohumanas.
RESUMEN
Las mordeduras de las serpientes son un problema de salud pública tanto en

Colombia como a nivel mundial, puesto que para contener los efectos colaterales
de las mordeduras de las serpientes requiere de suero antiofídico el cual es de
difícil acceso para las personas que han sido afectadas, en la presente
investigación se pretende estudiar el posible papel de Anticuerpos (Anti-ATR-I)
producidos a partir de inmunización con epítopes en ratones reconociendo una
toxina Atroxlysin-I (ATR-l) metaloproteinasa aislada del veneno de B. asper.
Luego de hacer una colecta de dichas por el departamento del Tolima y almacenar
sus venenos, estos se proceden a aislarse por medio de cromatografía de
exclusión por los métodos comerciales SephacryI S-200 y Sephadex G-50 y su
separación de acuerdo a su movilidad electroforética mediante SDS-PAGE,
finalmente la purificación de estas se solicitara a la empresa Tosoh Bioscience en
Stuttgart Alemania. De igual manera el secuenciamiento se realizara a través de
SGS. El alineamiento se realizara junto con secuencias extraídas de la base de
datos del NCBI con la ayuda del programa mega 7, se predecirán los epitopos a
través del software en línea de la IEDB, las estructuras secundarias se predecirán
a través de Protean de DNAStar. A partir de los resultados obtenidos se diseñara
los epitopos utilizando un robot Multipep (Intavis) y este epítopo diseñado se
encapsulan en liposomas donde se inmunizaran ratones Balb / c con el péptido
Teléfono: 2772040 – Página web: www.ut.edu.co/investigaciones - E-mail: din@ut.edu.co

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Después de inmunizado se mirar la dosis hemorrágica mínima (MHD), que

producirá una mancha hemorrágica de 20 mm de diámetro; estos resultados
indicaran que el anticuerpo diseñado utilizando los epítopos neutralizara
eficazmente el efecto del veneno.
COSTO
U.T. Fondo Investigaciones Otros Total

6753000 0 0 6753000
7. DURACIÓN: 6 meses

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JUSTIFICACIÓN
El sistema inmune es capaz de ejercer su acción protectora por medio de dos

mecanismos diferentes. Uno de ellos presenta sus defensas antes de la
exposición a microorganismos infecciosos u otras macromoléculas extrañas y por
tanto se denomina inmunidad natural (inespecífica o innata). Mientras que el otro
es un mecanismo inducido o estimulado por la exposición a sustancias extrañas,
son específicos para distintas macromoléculas y aumentan en magnitud y
capacidad defensiva con cada exposición sucesiva a una macromolécula en
particular. Estos mecanismos constituyen la inmunidad específica o adquirida
(Fainboim 2005).
La respuesta inmune de la inmunidad adquirida proporciona la capacidad de

reconocer y recordar patógenos específicos (Janeway et al., 2001) y ofrece
respuestas más potentes cada vez que el patógeno es reencontrado en
comparación a la inmunidad innata (Janeway et al., 2005).
El manejo de los Epítopos, que son los determinantes antigénicos reconocidos por
el sistema inmunitario, ha sido ampliamente utilizado para la formulación y diseño
de vacunas que sean efectivas. En los últimos tiempos se han realizado una gama
de trabajos en diversas aplicaciones para enfrentar desde virus, bacterias,
parásitos y toxinas de serpientes (Palomo et al., 2002).
Las técnicas actuales para combatir las mordeduras de serpientes se basan en la

inmunoterapia por antivenenos este es el único método aprobado por la
Organización Mundial de la Salud. A pesar de ser esta técnica eficaz, aun es
necesario reducir el número de muertes, por eso se están implementando nuevas
metodologías y diseños mucho más sofisticados, las características inmunológicas
de los venenos pueden ser analizadas a nivel molecular estudiando detalles de su
estructura antigénica fina con el propósito de delinear epítopos de toxinas para
células B y T (Lomonte 2012).

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Según la OMS cada año ocurren 300.000 mordeduras de serpientes, y de estas

aproximadamente entre 30.000 y 40.000 personas fallecen (Ferro et al. 2016),
estos números elevados hacen de esta una problemática de salud pública, una
gran cantidad de las mordeduras producidas en Colombia son procedentes de la
familia Viperidae, y de estas muchas pueden ser atribuidas a Bothrops asper
quien posee una poderosa toxina, de la cual posee una metaloproteina
denominada Atroxlysin-l capaz de generar además de la muerte, graves lesiones
permanentes hasta amputaciones, por generar hemorragias epidérmicas (Mora et
al., 2014).
Se ha demostrado que el único antídoto para contrarrestar el efecto del veneno

por la mordedura de B. asper es el suero antiofídico (Navarrete et al., 2017) capaz
de contrarrestar los efectos sistemáticos; aunque para los efectos locales no es
muy eficaz, esto quizás sea por el tiempo de administración después de la
mordedura (Vásquez et al., 2013). Por la baja eficacia de este suero y también el
no tener sitios especializados en zonas rurales para la administración de estos
sueros; que detenga la acción del veneno en el organismo evitando así dejar
secuela permanente o para siempre (Gonzales & Chippaux, 2010), por eso los
avances apuntan en el reemplazo de este suero por inmunización ya sea vacuna u
otros sueros antiofídicos más eficientes y de fácil acceso. La administración de
este suero tiene un máximo de seis horas luego de la mordedura de la serpiente,
donde solo va a detener la absorción del veneno por la piel y detener el sangrado
(Quesada & Aguilera, 2012), otros de los problemas de los sueros es su
dosificación, pues la cantidad de suero suministrado debe ser acorde con la
cantidad de veneno inoculado al organismo para su mayor eficacia, aunque se
tiene en cuenta que algunas serpientes inoculan alrededor de 100 mg de veneno
apropiadamente en su mordedura (Joly et al., 1987) no se tiene una cantidad
exacta de la dosis que deber ser suministrada del suero.

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MARCO TEÒRICO Y ANTECEDENTES
En el mundo existen alrededor de 3500 especies de serpientes, de las cuales el

15% es considerado como peligroso para los seres humanos. Se estima que
existen 500 mil accidentes ofídicos cada año, de ellos el 10 % mueren (Portilla et
al., 2012). En Colombia país de variada topografía y formaciones vegetales son
abundantes y se encuentran desde las aguas del océano pacifico y el nivel del
mar, hasta las alturas de 3000 m.s.n.m aproximadamente. En las selvas de
bosque húmedo tropical tenemos la serpiente venenosa de mayor tamaño de
América, Lachesis muta, rieca, cascabel muda y en la selva amazónica, Eunectes
murinus (anaconda, guio) catalogada como la serpiente más voluminosa del
continente americano y quizá del mundo. En las islas de san Andres y
providencias son escasas pero en la isla Gorgona son más abundantes y se
encuentran especies venenosas como Bothrops atrox (Ángel, 1983), hacia el
interior del país podemos encontrar una especie de este mismo género
denominada bothrops asper causante de una gran cantidad de muertes, la
mordedura de esta induce con frecuencia un complejo cuadro de efectos locales,
entre los que sobresale la hemorragia, edema y la necrosis del musculo
esquelético, estos efectos se han observado tanto clínica como
experimentalmente y su desarrollo se inicia pocos minutos después de inoculado
el veneno (Piñero, 2006).
La forma tan rápida como estos efectos se desencadenan dificulta el éxito del
tratamiento seroterápico, especialmente en los casos en que la serpiente ha
inoculado una cantidad considerable de veneno y en los que el suero se
administra tardíamente. A nivel experimental, se ha demostrado que si el veneno
se incuba con el suero previo a su inoculación en ratones, la neutralización de la
mionecrosis y de la hemorragia es completa. Sin embargo, si el suero se
administra independientemente del veneno, o sea sin previa incubación, a
diferentes intervalos de tiempo después del envenenamiento, la neutralización de
estos dos efectos es sólo parcial (Gutiérrez, 1987). La interpretación de estos
hallazgos es clara el suero contiene anticuerpos capaces de neutralizar las
miotoxinas y hemorraginas del veneno; sin embargo, los efectos locales se
desencadenan con una rapidez tal que cuando el suero es inoculado ya se han
producido daños en el tejido muscular y su vasculatura (Gutierrez, 1987).
Un epítopo o determinante antigénico es la porción de una macromolécula que es

reconocida por el sistema inmunitario, específicamente la secuencia específica a
la que se unen los anticuerpos, receptores de las células B o de células T. Aunque
se piensa que los epítopos provienen de proteínas no propias, las secuencias que

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se obtienen del huésped que pueden ser reconocidas son también clasificadas
como epítopos (Palomo et al. 2002).
A finales del siglo XX Willem Van Eden et al. (1998) indujeron la artritis adyuvante
en ratas con un antígeno de Mycobacterium tuberculosis posteriormente se realizó
el aislamiento de líneas de células T artritogenicas y demostraron que el antígeno
critico de M. tuberculosis contenía un epítopo de reacción cruzada con un auto-
antígeno en cartílago de la articulación y que, al igual que las ratas con artritis
adyuvante, los pacientes que sufren de artritis reumatoide demostraron específica
reactividad de los linfocitos T a la M. tuberculosis en la fracción que contiene el
epítopo de reacción cruzada.
Entre los primeros trabajos realizados en EE.UU. se examinó el papel de la

difusión del epítopo en la patología de la encefalomielitis autoinmune experimental
de recaída-remisión (R-EAE). El uso de tolerancia inmunológica periférica inducida
como una sonda para analizar el repertorio neuropatológico de células T, muestra
que la mayoría de la reactividad immunopatologica durante la fase aguda de R-
EAE en ratones SJL / J inducida por la inmunización activa con la molécula
proteolipídica intacta (PLP) se dirige al epítopo PLP139-151 y que las respuestas
a los epítopos de PLP encefalitogénicas secundarias pueden contribuir a las
posteriores fases de recaída de la enfermedad.( BL McRae, 1995).
La vacunación contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-l)

requiere un inmunógeno que provoca una inmunidad protectora contra los virus
que muestran un alto grado de polimorfismo genético. Por lo tanto, la identificación
de epítopos neutralizantes que son compartidas por muchas cepas sería útil. En
estudios se establece un anticuerpo monoclonal humano (2F5) que neutraliza una
variedad de cepas de laboratorio y aislados clínicos de VIH-1. Y particularmente
en el realizado por MacEtral 2010 se define la secuencia de aminoácidos Glu-Leu-
Asp-Lys-Trp-Ala (ELDKWA) en el ectodominio de gp41 que el epítopo reconocido
por este anticuerpo. Se encontró que la secuencia se ha conservado en el 72% de
lo contrario serían muy variables los VIH-1 aislados. Mutantes de escape no se
detectaron en las células infectadas con VIH-1. Dada la variabilidad de secuencia
de epítopos neutralizantes se considera que es un obstáculo importante para el
desarrollo de vacunas de VIH, el epítopo de células B conservado que se describió
aquí es un candidato prometedor para la inclusión en una vacuna contra el SIDA.
Las aplicaciones en serpientes también ha sido ampliamente estudiada por

ejemplo la toxina Atroxlysin-I (ATR-I) es una metaloproteinasa hemorrágica del
veneno de serpiente (SVMP) de Bothrops atrox, la serpiente responsable de la
mayoría de las mordeduras en la región norte de América del Sur. Atr-I puede
producir efectos tóxicos en las víctimas, incluyendo hemorragia, inflamación,
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necrosis y la deficiencia de coagulación de la sangre. El mapeo de epítopes de

células B en SVMPs podría dar lugar a la identificación de moléculas no tóxicas
capaces de inducir anticuerpos neutralizantes y la mejora de la terapia anti-
veneno. Los resultados de este estudio proporcionan una base racional para la
identificación de epítopos neutralizantes en Atr-I toxina de veneno de serpiente y
muestran que el uso de péptidos sintéticos podría mejorar la generación inmuno-
terapéutica (Schneider et al. 2016).

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OBJETIVOS
OBJETIVOS GENERALES
 Evaluar la acción de los Anticuerpos (Anti-ATR-I) producidos a partir de

inmunización con epítopos en ratones Balb/c reconociendo la toxina
Atroxlysin-I (ATR-l) metaloproteinasa aislada del veneno de B. asper.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Identificar los epítopos para la toxina (ATR-l) producida por B. asper.
 Aislar y purificar el (ATR-I) de B. asper.
 Establecer el diámetro máximo de las hemorragias generadas por la acción

de (ATR-l) en los ratones Balb/c inmunizados con el epítopo.
 Establecer el diámetro mínimo de las hemorragias generadas por la acción

de Atroxlysin-I en los ratones Balb/c inmunizados con el epítopo.
 Identificar efectos secundarios generados por el epítopo en las ratas Balb/c

durante el proceso de inmunización.

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DISEÑO METODOLÓGICO
Ratones
Se expide permiso para la utilización de animales de investigación cientifica en
laboratorios al “Ministerio de Salud y Protección social” (Ley 84 de 1989) (botero
et al, 2013), ya que la investigación desde sus orígenes ha requerido la utilización
de animales de laboratorio desde sus primeros estudios anatómicos comparados,
hasta la utilización de ellos como reactivo biológico (Quintero Falla, 2014). Los
ratones Balb/c serán proporcionados por la Universidad Nacional de Colombia,
con un peso de 18 a 20 g aproximadamente (Cao et al., 2016).
La cepa de ratones Balb/c serán mantenidos en un entorno controlado, teniendo

en cuenta la guía de manejo y cuidado de animales de laboratorio, (Fuentes et al.,
2010).
Serpientes y Venenos
Las serpientes de colectaran en el departamento del Tolima a una altitud de 1000
m.s.n.m hasta 2700 m.s.n.m, según antecedentes de personas que han
observados estas serpientes, su recolecta se realizara por un profesional haciendo
uso de ganchos herpetológicos (Pereanez et al., 2008). Para la extracción del
veneno, se realizara mediante el método manual de ordeño de viperidos (López et
al, 2006). Posteriormente los individuos pueden ser regresados a su estado
natural o sacrificados, dependiendo de la categoría de amenaza (Pérez 2014).
Almacenamiento del veneno

Los venenos almacenados que se utilizan en la inmunización de animales para la
producción de antisueros deben ser tan similares como sea posible al veneno
fresco en sus propiedades antigénicas (Gene et al. 1985).Por tanto se
almacenaran en forma líquida a 27°C es adecuado según recomienda la
Organización Mundial de la Salud (2005).
Aislamiento y purificación de Antígeno ATR-I

Atroxlysin-I se aislara del veneno mediante dos cromatografías de exclusión
molecular de gel, cuyos métodos comerciales son Sephacryl S-200 y Sephadex G-
50, donde tiene un rango de tamaño de 1500 a 250000.
Para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética se analizaran

las fracciones mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico) (Sánchez et al., 2010).

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La actividad proteolítica se realizara usando dimetilcaseína (DMC) y fibrina como

sustratos. Se disolverá 1 g de veneno destilófilizado en 6 ml de tampón de acetato
de amonio 50 mM (pH 7,3), que contenía NaCl 0,3 M y se centrifugara a 6000 g.
La solución sobrenadante (781 mg de proteína) se cargara sobre una columna
Sephacryl S-200 (2,5 x 100 cm). Después de concentrar con unidades de filtración
microconcentrífuga (Millipore Corp.), se aplicara el material activo (101 mg) a una
columna Sephadex G-50 (1,5 x 100 cm) y con Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), 2 MM de
CaCl _ {2}, a 8 ml / h. La proteinasa purificada, denominada atroxilina-I, se
concentra y se almacenara a 4ºC (Sánchez et al, 2010).
La proteína se manda a purificar a Tosoh Bioscience GmbH, en Stuttgart,

Alemania donde examinarían la pureza por RP – HPLC, finalizando con un test de
ELISA.
Secuenciación de la proteína
La proteína se mandara a secuenciar a la empresa SGS en Yokohama, Japón. La
cual se realizara mediante el uso de la secuenciación de degradación de Edman,
que se conoce también como secuenciación de fase gaseosa.
Alineación secuencial de proteínas de veneno de serpiente

Se seleccionaran secuencias de la base de datos NCBI para las toxinas de
veneno de serpiente. Las secuencias seleccionadas se alinearan en el programa
Mega7 junto con el producto de secuenciamiento de la proteína purificada. Se
selecciona una secuencia de la toxina que exhibía la homología más alta para la
predicción de epítopos (Schneider et al., 2016).
La predicción de epítopos lineales de secuencias de proteínas de veneno de

serpiente se realizara utilizando el software en línea de la IEDB con los siguientes
indicadores: Chou y Fasman β turn, Emini surface accessibility, Karplus y
flexibilidad de Schulz, antigenicidad de Kolaskar y Tongaonkar y hidrofilicidad de
Parker10,la predicción de la estructura secundaria de proteínas de veneno de
serpiente se realizara utilizando el módulo Protean de DNAStar con los siguientes
indicadores de predicción de antígenos: flexibilidad de la secuencia de proteínas,
accesibilidad a la superficie, hidrofilicidad y el índice antigénico Jameson-Wolf.
Basándose en los resultados de predicción de los dos paquetes de software, se

identificaran las regiones con buena consistencia para determinar los epítopos de
cada secuencia de proteína de veneno. Se seleccionaran dos epítopos,
consistentes en 12 aminoácidos cada uno, para cada toxina de veneno. Tandem
expresión de epítopos predicho y la preparación del antiveneno (Cao et al., 2016).

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Síntesis de los Epítopos

Después de identificar las dos regiones lineales de Atr-I se identificaron mediante
IEDB, Se diseñara un péptido (ATR-lPdz) que abarca las dos secuencias
identificadas, utilizando dos glicinas entre ellos como espaciadores ejemplo
(QKDSSKTLKSFG--GG--EFSDCSQNQYET). Los 2 péptidos se sintetizaran
mediante química de Fmoc (aminoácidos fueron de Sigma Aldrich) utilizando un
robot Multipep (Intavis), ese péptido diseñado se encapsula en liposomas
asolectina (Sigma Aldrich) (Schneider et al, 2016).
Ratones resistentes frente al antígeno.

Se inmunizaran ratones Balb / c con el péptido que a la vez se encapsulara en
liposomas asolectina (Sigma Aldrich), de epítopo preparado, 13 dosis subcutáneas
con intervalos de 14 días, tendremos animales de control que fueron inmunizados
con liposomas vacíos (sin antígeno) (Schneider et al, 2016), utilizando el péptido
creado como antígeno (50 μg por inyección por ratón). Para la primera
inmunización (Cao et al, 2016).
Tolerancia de los ratones a los Epítopos

Se tomarán 14 ratones variedad Balb / c, de los cuales, 1 individuo será destinado
como control (-), este será sacrificado para realizar una biopsia que servirá como
patrón para las respectivas comparaciones con las diferentes fases de inoculación
de los epitopos; por cada fase de inoculación se sacrificará 1 individuo para
observar mediante biopsia el impacto que está sufriendo el organismo frente a la
administración de estas sustancias exógenas.
Identificación del antígeno inmunoprotector por neutralización de la

actividad hemorrágica.
La neutralización de la actividad hemorrágica se realizara de la siguiente manera.
Se prepararon diluciones de veneno de serpiente e inyección intradérmica en la
piel posterior de ratones Balb / c (0,1 ml / inyección) de la metaloproteinasa. Los
ratones se sacrificaran 24 horas después, y se retira la piel de la espalda para
medir el diámetro de las manchas hemorrágicas subcutáneas. La dosis
hemorrágica mínima (MHD) se definirá como la dosis de la metaloproteinasa de
serpiente, que producirá una mancha hemorrágica de 20 mm de diámetro. (Cao et
al., 2016) comparando con los organismos de control y determinar el papel de los
(anti ATR-I).

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(2013). Uso tradicional de las plantas en la region de Antioquia -Colombia. En
J. Alarcon, Soluciones de la etnobotànica para la picadura de serpientes.
Antioquia, Colombia.

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PROCEDIMIENTO PRESENTACIÓN Y SEGUIMIENTO DE Código: IN-P01-F01
PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN
Versión: 04
Fecha Aprobación:
PRESENTACIÓN DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN
01-06-2017
CRONOGRAMA*:
Tiempo (meses)
Actividad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
x
Expedición de permiso
x
Adquisición de ratones
X
Colecta Bothrops asper
X X X X X X
Inmunización de ratones
X
Cromatografía de exclusión molecular
X X
Purificación de proteínas
X
Alineación de epitopos
X
Síntesis de epitopos
X
Evaluación de antígeno
*Si requiere más tiempo, anexe hoja adicional del cronograma.

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Versión: 04
Fecha Aprobación:
01-06-2017
PRESUPUESTO*
____________________________________________________________________________________________
Cuadro 1.- Descripción de costos de personal
Tiempo Costos
Nombre de Función en el
Formación Dedicación Duración U.T. Adm. Fondo de Otros Total
Investigadores proyecto1
(H/Semana) Central $ Invest. U.T. $ $ $
Mario Nicolas Daza Pregrado Investigador 40 6 0 0 0 0
principal
Rafael Augusto Pregrado Investigador 40 6 0 0 0 0
Ramirez principal
Wilmer Alejandro Pregrado Investigador 40 6 0 0 0 0
Gutierrez principal
Nelson Fernando Pregrado Investigador 40 6 0 0 0 0
Niño principal
Duvan Felipe Pregrado Consultor 30 1 737500 0 0 737500
Zambrano
Total Costo de Personal 73750000 0 0 737500

1 Debe identificar el nivel de investigador Principal, coinvestigador, auxiliar, consultor.
* En los cuadros de presupuesto se pueden adicionar filas si son necesarias.

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Versión: 04
Fecha Aprobación:
01-06-2017
Descripción de viajes (Sólo se incluyen viajes relacionados con la metodología del proyecto) :
Costos
Estadía 1 U.T. Adm. Fondo de Otros $ Total
No. Lugar Valor Pasaje Justificación
(días) Central $ Invest. U.T. $
$
Falan 120000 3 Recolecta de B. asper 120000 0 0 120000
Payandé 60000 3 Recolecta de B. asper 60000 0 0 60000
chaparral 120000 3 Recolecta de B. asper 120000 0 0 120000
Totales 300000 0 0 300000

1 Debe incluir el nombre o nombres de los usuarios de los viajes.
Descripción de Insumos y Materiales:

Costos
Nombre Uso Cantidad U.T. Adm. Fondo de Otros Total
Central $ Invest. U.T. $ $ $
Ratones Balb/c Inmunización y evaluación 30 450000 0 0 450000
frente al metaloproteasa
Caja o jaula Resguardo de los ratones 7 210000 0 0 210000
Lecho o cama Ambientación 7 60000 0 0 60000
Agua Hidratación ratones 7 10000 0 0 10000
Alimento Nutrición ratones 24 168000 0 0 168000
Gancho herpetológico Captura de serpiente 3 240000 0 0 240000
Recipientes de plástico Transporte de serpientes 3 60000 0 0 60000
Vaso de precipitado Recolección de veneno 4 30000 0 0 30000
Membranas Recolección del veneno 1 150000 0 0 150000
Jeringas Inoculación 200 25000 0 0 25000
Totales 1403000 0 0 1403000

Puede considerarse como insumos: muestras vegetales, de fauna, flora, reactivos, bibliografía, software.

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Versión: 04
Fecha Aprobación:
01-06-2017
Descripción Servicios Técnicos:

Costos
Nombre Justificación Cantidad U.T. Adm. Fondo de Invest. Otros Total
Central $ U.T. $ $ $
PCR SDS-page Separación de la proteína 1 500000 0 0 500000
Sephacryl S-200/ Cromatografía de 1 350000 0 0 350000
Sephadex G-50 exclusión molecular
Purificación de proteína en Extracción de la proteína 1 1000000 0 0 1000000
Alemania
Secuenciación de la Secuenciación 1 2000000 0 0 2000000
proteína
Síntesis de los epitopos 1 1200000 0 0 1200000
Totales 5050000 5050000
Costo total del proyecto:

Los rubros parciales deben trasladarse al formato del Costo Total:
Nombre U.T. Adm. Central $ U.T. Fondo de Invest. $ Otros $ Total $
Personal 7375000 0 0 737500
Insumos y Materiales 1403000 0 0 1403000
Viajes 300000 0 0 300000
Servicios Técnicos 5050000 0 0 5050000
Construcciones 0 0 0 0
Mantenimiento 0 0 0 0
Administración *(% valor del proyecto) 0 0 0 0
Totales 6753000 0 0 6753000
* Hasta un 10% del valor del Proyecto.

Fecha Aprobación:
INVESTIGACIÓN
RESULTADOS ESPERADOS
Se espera obtener un efecto positivo en la administración de epitopos al ratón,

puesto que, al momento de agregar los epitopos al cuerpo del animal, estos no
serán rechazados, ni causaran efectos no deseados como la muerte de los
individuos, también que el aislamiento del Atroxlysin I a través de la cromatografía
de exclusión molecular proporcione cantidad suficiente de dicha metaloproteinasa.
Y por ultimo esperamos que en la piel de los ratones inmunizados se reduzca
marcadamente el diámetro de la hemorragia. Estos resultados indicaran que el
anticuerpo diseñado utilizando los epítopos neutralizara eficazmente el efecto del
veneno.

Fecha Aprobación:
INVESTIGACIÓN
SUGERENCIA DE PARES (Proyectos de Docentes). Ingrese los datos de

cuatro (4) Pares Evaluadores de COLCIENCIAS que puedan evaluar su
proyecto.
Nombres E-mail Teléfono

Liliana Francys Turner lfrancist@ut.edu.co
Daniel Urrea laurrea@ut.edu.co
Gustavo Vallejo gvallejo@ut.edu.co

Identificación de epítopos de células β de protección de Atroxlysin-I (metaloproteinasa) de Bothrops asper, serpiente que predomina en la región andina de Colombia.

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PROCEDIMIENTO PRESENTACIÓN Y Página 1 de 21

SEGUIMIENTO DE PROYECTOS DE Código: IN-P01-F01

Identificación de epítopos de células β de protección de Atroxlysin-I

Modelos experimentales para las ciencias zoohumanas.

Las mordeduras de las serpientes son un problema de salud pública tanto en

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Después de inmunizado se mirar la dosis hemorrágica mínima (MHD), que

U.T. Fondo Investigaciones Otros Total

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El sistema inmune es capaz de ejercer su acción protectora por medio de dos

La respuesta inmune de la inmunidad adquirida proporciona la capacidad de

Las técnicas actuales para combatir las mordeduras de serpientes se basan en la

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Según la OMS cada año ocurren 300.000 mordeduras de serpientes, y de estas

Se ha demostrado que el único antídoto para contrarrestar el efecto del veneno

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MARCO TEÒRICO Y ANTECEDENTES

En el mundo existen alrededor de 3500 especies de serpientes, de las cuales el

Un epítopo o determinante antigénico es la porción de una macromolécula que es

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Entre los primeros trabajos realizados en EE.UU. se examinó el papel de la

La vacunación contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-l)

Las aplicaciones en serpientes también ha sido ampliamente estudiada por

necrosis y la deficiencia de coagulación de la sangre. El mapeo de epítopes de

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 Evaluar la acción de los Anticuerpos (Anti-ATR-I) producidos a partir de

 Identificar los epítopos para la toxina (ATR-l) producida por B. asper.

 Aislar y purificar el (ATR-I) de B. asper.

 Establecer el diámetro máximo de las hemorragias generadas por la acción

 Establecer el diámetro mínimo de las hemorragias generadas por la acción

 Identificar efectos secundarios generados por el epítopo en las ratas Balb/c

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La cepa de ratones Balb/c serán mantenidos en un entorno controlado, teniendo

Almacenamiento del veneno

Aislamiento y purificación de Antígeno ATR-I

Para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética se analizaran

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La actividad proteolítica se realizara usando dimetilcaseína (DMC) y fibrina como

La proteína se manda a purificar a Tosoh Bioscience GmbH, en Stuttgart,

Alineación secuencial de proteínas de veneno de serpiente

La predicción de epítopos lineales de secuencias de proteínas de veneno de

Basándose en los resultados de predicción de los dos paquetes de software, se

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Síntesis de los Epítopos

Ratones resistentes frente al antígeno.

Tolerancia de los ratones a los Epítopos

Identificación del antígeno inmunoprotector por neutralización de la

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Ángel, R. (1983). Serpientes de Colombia. Revista Facultad Nacional de

Botero, L., & Gómez, R. M. (2013). Uso de animales de laboratorio en Colombia:

EF Sanchez, FS Schneider, A. Yarleque, MH Borges, M. Richardson, SG

Fainboim, L., & Geffner, J. (2005). Introducción a la inmunología humana.Cap 11.

Gutiérrez, J. M. (1987). Regeneración muscular posterior a mionecrosis inducida

Lomonte, B. (2012). Identification of linear B-cell epitopes on myotoxin II, a Lys49

López-Jonsthon, J. C., & Rangel, J. L. H. (2006). Caracterizacion toxinologica del

Markland fs JR., Swenson S. Snake venom metalloproteinases.

McElrath, M. J., & Haynes, B. F. (2010). Induction of immunity to human

Mora-Obando, D., Guerrero-Vargas, J. A., Prieto-Sánchez, R., Beltrán, J.,

Teléfono: 2772040 – Página web: www.ut.edu.co/investigaciones - E-mail: din@ut.edu.co

striking interspecific variation with Bothrops asper venom. Journal of

Navarrete Espinel, M. A., & Zumba Abdo, M. E. (2017). Inhibición de la actividad

Organización Mundial de la Salud. (2005). Manual de Bioseguridad en el