Producción de bioetanol a partir de Chlorella vulgaris iomasa

Cultivada Con Plátano (Musa paradisiaca) Extracto De Cáscara

Obioma Kenechukwu Agwa, Ifeyinwa Geraldine Nwosu, Gideon Orkwagh

Abu
Department of Microbiology, University of Port Harcourt, Port Harcourt, Nigeria

Resumen
La viabilidad de la absorción de nutrientes por Chlorella vulgaris utilizando un
carbono barato, se estudió una fuente como el extracto de cáscara de plátano y
se utilizó su biomasa para la producción de bioetanol. Se obtuvieron cáscaras de
plátano verde, se procesaron y se infundieron durante 48 horas, extraído y
cultivado con la especie Chlorella por un período de catorce dias. Se hidrolizó el
contenido de carbohidratos en microalgas con ácido y enzima mientras que el
hidrolizado fermentó con una concentración del 10% de Saccharomyces sp. y
Aspergillus sp. a 30˚C y pH 4.5 usando “Separate, Hidrólisis y fermentación
(SHF) e hidrólisis separada y métodos de fermentación en co-cultivo (SHCF).
Los resultados muestran que la célula máxima obtuvo un crecimiento de 1.56
(OD) y una concentración de biomasa de 19 g / l con infusión de 48 hrs. El
resultado indicó que C. vulgaris utilizó medio PPE como único sustrato de
carbono y estimula la secreción de biomasa. El más alto obtuvo azúcar reductora
de 0,63 mg / ml después de la hidrólisis de la biomasa, mientras que el
rendimiento de producción de etanol de 0,33 g / l se obtuvo después de la
fermentación.

El rendimiento de la producción de etanol aumentó con el aumento del tiempo

de fermentación, mientras que el azúcar reductor se redujo después de cinco
días de fermentación.
El mayor porcentaje de etanol de 10.82% v / v se obtuvo del destilado., este
estudio demostró que la cáscara de plátano puede ser utilizada por C. vulgaris,
que proporciona una ruta viable para reducir el costo de producción de bioetanol
a partir de un sustrato de carbono para biomasa y producción de bioenergía.

Palabras clave
Bioetanol, Chlorella vulgaris, Fermentación, Hidrólisis, Cáscara De Plátano

1.Introducción

El 80% de la economía mundial depende en gran medida de la fuente de energía

fósil que es poco a poco con la industrialización, el consumo constante de
energía y la creciente población mundial. Esto ha llevado en consecuencia a un
rápido declive de combustibles fósiles.
e inestabilidad ambiental que estimuló a varios investigadores para la búsqueda
de eficiencia industrial alternativa, renovable y rentable. [1]. La producción de
biocombustibles surgió como una alternativa sostenible que compite para
satisfacer la demanda energética mundial [2]. Entre el biocombustible existente,
el bioetanol y el biodiesel se consideran la una alternativa prometedora. La cual
reemplaza al combustible fósil debido a sus ventajas de baja toxicidad y
biodegradabilidad [3]. El bioetanol es el biocombustible líquido más ampliamente
aceptado, producto debido a su uso como una combinación de gasolina en varios
porcentajes sin ninguna modificación del motor [4].

Los mayores productores de bioetanol del mundo, Brasil y EE. UU. Usan base
de grano materias primas como azúcar de caña, maíz y yuca, producción de
biocombustibles de primera generación, materia prima que aumenta la
competencia en alimentos o piensos frente a la producción de combustible.
La segunda generación de biocombustibles considera evitar la competencia
existente y centrarse en la materia prima de oro verde, residuos lignocelulósicos
como hierba, arroz
peladuras de paja y frutas agrícolas para su producción de bioetanol. Esta
materia prima es
renovables, de bajo costo y abundantes, pero su limitación de la naturaleza
cristalina.del material y dificultad para hidrolizar el componente de lignina ha
creado brecha en la producción de bioetanol [5]. De ahí los retos de la base de
grano y oro verde, las materias primas de combustible llevaron a la aparición de
la materia prima de tendencia mundial, algas
biomasa. La materia prima de biomasa de microalgas es la alternativa más
atractiva y renovable., recientemente ha sido estudiada para la producción de
bioetanol [6] [7]. Las microalgas generalmente consisten en 40% - 70% de
carbohidratos, 10% - 20% de proteínas y residuos compuestos de bajo peso
molecular tales como aminoácidos, aminas y ácidos grasos.
la microalga es considerada como una materia prima potencial para la
producción de bioetanol debido a su alto contenido de carbohidratos de biomasa
[8], alta tasa de crecimiento, alta fotosíntesis,eficiencia, capacidad de reparar el
efecto invernadero, naturaleza no competitiva con la producción de alimentos,
fácil de cultivar en lugares no agrícolas y la falta de lignina en la pared celular [9]
[10].

Las microalgas son microscópicas unicelulares y fotosintéticas. El organismo

comúnmente encontrado en el medio ambiente acuático. En la naturaleza,
generan hasta hasta el 50% del oxígeno atmosférico, así como la captura del
CO2 emitido en el invernadero.

Las microalgas poseen un aumento en el contenido de carbohidratos son

materias primas excelentes para la producción de biocombustibles. C. vulgaris
constituye un 37% - 55% de carbohidratos de peso seco, contenido que proviene
de la celulosa y hemicelulosas en la pared celular y almidón en el cloroplasto [6].
Sirven diversas aplicaciones comerciales e industriales.
En la producción alimentaria, agrícola médica e incluso nutracéutica. Se puede
cultivar de forma autótrofa, heterótrofa o mixotrófica. El cultivo de C. vulgaris
utilizando fuente de carbono orgánico producido mejoró mayor biomasa de
carbohidratos que su cultivo autótrofo [11] [12]. Cuando se cultiva en medio
limitado de nitrógeno y fósforo, lípidos y carbohidratos se sintetizan
simultáneamente utilizando el sustrato de carbono [13]. El sustrato de carbono
como el glicerol crudo residual se obtuvo después de la producción de biodiesel,
desechos agrícolas convertidos en azúcares y materiales celulósicos, atrapados.
El CO2 emitido por las industrias y la melaza de caña de azúcar pavimentada de
manera exitosa, la roducción de biomasa a partir de microalgas. Las cáscaras
de plátano se producen como subproductos de procesamiento de plátano, que
es alto en contenidos minerales tales como potasio y fósforo. Es una fuente
importante de polifenoles, carotenoides, fibra dietética y
otros compuestos bioactivos [14]. Las aplicaciones potenciales de biotecnología
incluyen fuentes de ganado rumiante [15], fuente de energía en la producción de
biogás [16], producción de jabón [17] y en el manejo de diversas enfermedades.
Debido a sus propiedades ulcerogénicas, antimicrobianas, analgésicas, anti-uro-
littias [18].
La explotación de la materia prima de especies de Chlorella utilizando desechos
animales tales como el desperdicio de aves como medio de crecimiento resultó
en un alto rendimiento de biomasa de 2.5 g / l bajo la condición mixotrófica [19].
La mayoría de los investigadores desvían la explotación de biomasa de algas
para la producción de biodiesel en lugar de bioetanol debido al bajo rendimiento
de azúcar después de la hidrólisis de los gránulos de almidón intracelular. Debido
al alto costo de los carbohidratos la mezcla de enzimas que requirió el desarrollo
de una alternativa rentable para la creación de múltiples carbohidrasas. Esto
requiere un desarrollo simple de Tecnologías como la combinación de ácido
diluido o hidrólisis alcalina con enzima con sacarificación [20].
Las algas verdes, C. vulgaris utilizadas para este estudio se cultivaron a bajo
costo.
medio de extracto de cáscara de plátano y la biomasa extraída se explotó como
carbono
Fuente para la producción de bioetanol utilizando la fermentación por hidrólisis
separada.
(SHF) y tecnologías de fermentación de cocultivo de hidrólisis separada (SHCF).
2. Materiales y métodos
Toma de muestras y procesamiento: La muestra de suelo utilizada para este
estudio se obtuvo de un sitio de descarga de desechos dentro de en el campus
de Abuja, se usó Choba en Uniport para el aislamiento de Bacillus cereus. La
muestra de suelo se recogió con una botella con tapón de rosca etiquetada estéril
usando una barrena de suelo de unos 30 cm de profundidad. La muestra fue
transportada al Laboratorio Industrial de investigación en microbiología para el
análisis. Se compró vino de palma fresco desde el Hospital Universitario de
Enseñanza del Jardín de los Arbustos y Transportes hasta el Laboratorio y
utilizado para el aislamiento de Saccharomyces cerevisiae. Y comida en mal
estado.
La muestra utilizada para el aislamiento de Aspergillus niger se extrajo de un
desecho de un vertedero del campus de Abuja, Uniport. Esto fue recogido con
una bolsa de nylon estéril e inmediatamente transportado al laboratorio para su
posterior análisis. Las enzimas en el estudio se utilizaron amilasa y celulasa. La
amilasa se obtuvo de Aspergillus niger aislado de una muestra de alimento en
mal estado e identificado en la microbiología Laboratorio siguiendo
procedimientos estándar por [21] [22]. Se obtuvo celulasa de Bacillus cereus
aislado de una muestra de suelo y cultivado usando el método de [23]. Se
recolectaron cáscaras de plátano verde en diferentes mercados dentro de Puerto
Metrópolis de Harcourt, estado de Rivers, Nigeria, secada al sol, molida en polvo
fino utilizando un mezclador mecánico (modelo Corna, 562), infundido en agua
destilada durante 48 h, extraído y almacenado en una botella estéril para su uso
posterior. La cáscara de plátano el extracto se esterilizó en autoclave a 121 ° C
durante 20 minutos y se enfrió a temperatura ambiente. La alga cosechado se
inoculó por duplicado en 250 ml que contiene 100 ml de extracto en la proporción
de 1:10. Ellos fueron incubados en 30 ° C bajo iluminación natural durante 14
días con agitación intermitente a intervalos regulares Intervalos para asegurar un
crecimiento homogéneo [19].
Aislamiento y caracterización de microorganismos:

Se cultivó Aspergillus niger en un medio PDA incubado a 30 ° C durante 72 h.

Las esporas puras de A. niger se desprendieron de sus placas de agar, se
inocularon en pre-esterilizado 10 ml de caldo de dextrosa de patata e incubado
a 30 ° C durante tres días. Saccharomyces cerevisiae se cultivó utilizando un
medio sólido en g / l: extracto de levadura 10, peptona 20, glucosa 20, agar 15 y
pH 7,5. Acerca de 1 ml de vino de palma se diluyó en serie en solución salina
fisiológica estéril y alícuotas
de la dilución se colocaron asépticamente en el medio induplicado por el Método
de placa de extensión para agar sintético de levadura modificado previamente
preparado, inoculado en 10 ml de caldo con extracto de levadura peptona
dextrosa (YEPD) e Incubado a 30ºC durante 12 h. El medio fue suplementado
con 1% de ácido láctico para prevenir el crecimiento bacteriano; se incubaron a
30 ° C durante 24 - 48 h [24]. DO. vulgaris se cultivó en un nuevo medio de agar
sintético [25] con tetraciclina
y nistatina (antibióticos) para eliminar el crecimiento de bacterias y hongos,
respectivamente.

El medio consiste en la siguiente sal en g / l: nitrato de potasio 0.132, sodio

silicato 0.666, fosfato monosódico 0.666 y EDTA 0.666. El pH fue ajustado a 7.5
antes del autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Las placas fueron incubadas
durante aproximadamente tres a cinco días bajo iluminación natural (luz solar)
para monocultivo desarrollo. Las colonias fueron cosechadas, transferidas
asépticamente a un matraz cónico estéril de 250 ml, almacenado en un
refrigerador a 4 ° C hasta su uso posterior.

Estas Se utilizaron medios de crecimiento para la fermentación.

Producción de bioetanol: diversos métodos utilizados para la producción de
bioetanol a partir de la cáscara de plátano implica el monitoreo del crecimiento y
la extracción de biomasa Hidrólisis enzimática, fermentación y destilación.
Monitoreo del crecimiento y extracción de biomasa:
Las condiciones de crecimiento se monitorizaron a intervalos de tres días para
la célula de algas.

Crecimiento y cuantificación de biomasa. Se recogieron muestras y

posteriormente analizado para determinar la densidad óptica (ABS) usando un
espectrofotómetro UV (modelo 721 UV-VIS) [26], el peso seco de la célula se
midió utilizando una centrifugadora (modelo spin ACL270) a 12,000 rpm durante
15 minutos. El residuo se lavó dos veces con solución salina fisiológica (0,85%
p / v, NaCl), se secó en un horno a 60 ° C en una Pesar previamente el papel de
filtro hasta peso constante. La cantidad de microalgas secas se midió como peso
seco celular [27]. Utilizando un matraz cónico de 250 ml, unos 100 ml de la
biomasa de C. vulgaris se calentó para concentrar la biomasa de algas a una
temperatura de 100 ° C, y luego se enfrió a 45 ° C en un baño de agua. El peso
seco de la celda de la biomasa calentada también se determinó la Hidrólisis por
Ácido y Sacarificación por Enzima:

La biomasa de algas concentrada se sometió a un tratamiento previo con ácido

diluido utilizando 10% de H2SO4 2 N, autoclavado a 121 ° C durante 45 minutos
y neutralizado a pH 4,8 utilizando tampón citrato. La solución se incubó con 3%
de cada uno ya preparado el cóctel de enzimas en bruto y se mantiene en un
baño de agua durante 12 h a 45 ° C.

La solución Se centrifugó a 9000 rpm durante 15 minutos, se analizó el azúcar

reductor total y almacenado como hidrolizado de azúcar para la fermentación
[29] [30].

Fermentación:
El hidrolizado de azúcar de algas se complementó con los siguientes nutrientes:
Sulfato de amonio (2 g / l), monofosfato de potasio (1 g / l), dihidrógeno de
potasio, Fosfato (1 g / l), sulfato de zinc (0.2 g / l), sulfato de magnesio (0.2 g / l)
y extracto de levadura (2 g / l), esterilizado a 121 ° C durante 25 minutos [31]. El
pH de la medio se ajustó a 4,5 y cada matraz cónico que contiene 100 ml de la
la muestra se inoculó con 10% de preparaciones de medio de crecimiento de S.
cerevisiae,
A. niger y / o combinación de ambos por duplicado. Se incubaron a 30 ° C durante
120 horas [28].

Métodos analíticos:
Estimación de azúcares reductores.
Para la determinación de azúcar reductor se utilizó el método del ácido 3,5-
dinitosalicíclico, la concentración del azúcar reductor presente en la muestra fue
estimada por el agregando 1 ml de reactivo DNS a 1 ml de cada una de las
muestras y luego se hervió durante 5 minutos y se diluye con 10 ml de agua
destilada. La absorbancia se determinó a 540 nm utilizando espectrofotómetro
UV-VIS. El valor de concentración fue extrapolado de la curva estándar de
glucosa [32].

Estimación de la concentración de etanol

Se adoptó el método del cromado Dubios para la estimación del etanol [33]. 5 ml
de Cada muestra se trató con 2 ml de reactivo de cromato. La mezcla fue
permitida reposar durante una hora y la absorbancia medida a 588 nm usando
Espectrofotómetro UV-VIS [34].
Proceso de destilacion

Se adoptó el método según [35] para la destilación de la fermentación en medio

al etanol. El aparato de destilación con matraz de fondo que contiene el caldo de
fermentación se adjuntó en un extremo y un matraz de recepción en otro extremo
para recoger el destilado. Una manta térmica con la temperatura de 78ºC para
calentar el matraz de fondo redondo hasta que se destiló completamente. El
porcentaje de etanol del destilado fue estimado y extrapolado del etanol.

3. Resultados

Después de 48 h de infusión en agua destilada, el extracto se inoculó con la

célula de algas. Se monitorizó utilizando densidad óptica y peso seco celular.
La cultura tuvo una obvia. Crecimiento desde el día inicial hasta el final.
Después de la fase de retraso (unos dos días), Las células algales entraron en
su fase de crecimiento logarítmico. Luego, los crecimientos celulares, entró en
la fase estacionaria después del día doce (Figura 1).
La biomasa extraída de carbohidratos tuvo una composición inicial de azúcar
de 0.39, 0.36, 0.40 y 0.63 en mg / ml después de ácido, enzima, pretratado con
vapor y combinado los procesos de hidrólisis ácido-enzimática respectivamente
(Figura 2).
Durante la fermentación, la concentración de etanol produce la fermentación y
los caldos inoculados con S. cerevisiae, A. niger por separado y su co-cultivo
yresultó en un aumento constante desde el inicio de la fermentación hasta la
final día.
 El caldo de fermentación inoculado con co-cultivo de S. cerevisiae y A. niger.
registró el mayor rendimiento de etanol (0,33 g / l), seguido directamente por la
fermentación en caldo inoculado con moho (0.25 g / l), que finalmente fue
arrastrado por fermentación, caldo inoculado con levadura (0.23 g / l) (Figura
3).
Después de cinco días de fermentación a 30 ° C y pH 4.5, se consumió el
azúcar reductor.
altamente por medio de caldo de fermentación inoculado con A. niger de 0.63 a
0.09 in
mg / ml, seguido de caldo inoculado con co-cultivo de los dos organismos de
0.63 - 0.10 en mg / ml mientras que el azúcar menos consumido se registró con
la fermentación caldo de S. cerevisiae de 0,63 a 0,13 en mg / ml (Figura 4).

La densidad celular obtenida de los caldos de fermentación indicó que El mayor

incremento fue registrado por el caldo de fermentación inoculado con moho.
que aumentó de 0.08 (OD) en el primer día de la fermentación a 1.23
(SOBREDOSIS). El caldo de fermentación inoculado con co-cultivo de levadura
y moho mostró un aumento rápido de 0.03 (OD) en el primer día a 1.18 (OD) en
el último día de la fermentación. El rendimiento de biomasa de levadura de la
fermentación aumentó gradualmente desde 0.07 (OD) en el primer día de la
fermentación hasta el tercer día donde el crecimiento disminuyó gradualmente
a 0.75 (OD) en el quinto día de la fermentación (Figura 5).
El caldo de fermentación de co-cultivo mostró el mayor porcentaje de etanol
que los caldos de fermentación separados. El porcentaje del rendimiento de
etanol de la se observó que el destilado del co-cultivo de S. cerevisiae y A.
niger era el más alto (10.82% v / v), seguido por el caldo de fermentación del
molde (9.13% v / v) mientras que el menor se registró como caldo de
fermentación de levadura (7.90% v / v) (Figura 6).

4. Discusión

Actualmente, se ha dirigido una atención significativa hacia la máxima

microalga. Producción de biomasa mediante estrategias rentables. Se ha
observado que aproximadamente el 80% del costo total de producción en el
cultivo de microalgas es carbono sustrato [3]. Estudios recientes se están
nfocando en microalgas más baratas. Los métodos de producción de biomasa,
como la disminución del costo del sustrato de carbono mediante el uso de
fuentes de carbono alternativas o baratas como desechos de aves de corral
[19], aplicaciones de aguas residuales [36], cultivo de microalgas utilizando
hidrolizado de maíz en polvo [37]. [38] se observó que la asimilación de la
fuente de carbono orgánico por parte de las microalgas depende de la cepa de
las condiciones celulares y de cultivo. El tamaño del inóculo disponible en los
medios de cultivo, así como la cantidad de sustrato de carbono agregado al
cultivo afecta El aumento del crecimiento de algas.
En este estudio, se eligieron extractos de cáscara de plátano para el cultivo de
algas debido a su alto contenido de carbohidratos y la presencia de Otros
contenidos de micronutrientes que son uno de los requisitos básicos para las
células.
Los resultados muestran los efectos del extracto de cáscara de Musa
paradisiaca sobre el crecimiento celular de algas y la producción celular de
biomasa en condiciones mixotróficas durante catorce días.

Después de la inoculación de microalgas a extractos de cáscara de plátano,

inicialmente, la densidad celular, permaneció inactivo y las células se
adaptaron al nuevo entorno. A a los tres días se observó una fase de retraso en
la que los cultivos de microalgas mostraron ligero crecimiento a medida que la
célula destina la mayoría de los recursos a la adaptación fisiológica inducido
por el nuevo entorno [39]. Esta fase de retraso fue precedida por una rápida
Fase de crecimiento exponencial en el día cinco porque la pequeña población
inicial no es nutrientes limitados. A medida que los nutrientes se agotan, la fase
de crecimiento disminuye Y la biomasa celular experimentó un aumento lineal.
La fase de crecimiento permanece estacionada.

Hasta los catorce días, cuando todos los nutrientes se agotaron y la

biomasa.Después de catorce días de cultivo, la biomasa obtenida fue de 2.4 g /
l, que fue superior a las reportadas por [31] después de dos meses de cultivo de
A. platensis, se produjeron aproximadamente 2,0 - 2,2 g / l de concentración de
biomasa. [40] trabajo acordado con este estudio que ilustró que la alta densidad
celular en el mixotrófico C. vulgaris

El cultivo se debió a la consecuencia vigorizante del crecimiento de la luz y la

fuente de carbono (CO2) en el cultivo, el resultado es equivalente a cuando se
cultiva con glucosa. Informes anteriores han demostrado que el sistema por lotes
de mixotrophic.
El cultivo posee la capacidad de elevar significativamente la concentración de la
célula y la producción de biomasa de la microalga [41]. Basado en estos
hallazgos, el extracto de cáscara de plátano puede ser un medio para cultivar y
enriquecer microalgas. Biomasa para la producción a gran escala.

Después de la extracción de carbohidratos, la cuantificación de la biomasa

aumentó a 13 g / l
que en comparación con los valores de cuantificación máxima de biomasa
contabilizado por [42] y [43]. Integración de ácido diluido y enzimas crudas en el
la hidrólisis de la biomasa de Chlorella exhibió la mejor eficiencia de
sacarificación y mayor rendimiento de etanol. Esto es como resultado el proceso
combinado tiene la capacidadDescomponer hidratos de carbono de la pared
celular no desorganizados de la biomasa de microalgas. Las microalgas abarcan
una base energética potencialmente atractiva y sostenible para laProducción de
bioetanol con la perspectiva de un combustible de transporte renovable. Que
puede sustituir a la gasolina. El aumento gradual de la densidad celular a partir
del día.

Uno al quinto día de fermentación sugirió que los azúcares en los hidrolizados
Se utilizaron como fuentes de carbono para la producción de etanol en lugar de
la producción celular y esto es como resultado de la capacidad del moho y la
levadura para hidrolizar y Convertirlos en bioetanol. La microalga de la biomasa
se hidroliza en este trabajo. fueron fermentados por Aspergillus niger,
Saccharomyces cerevisiae y co-cultivo de ambos. La fermentación de co-cultivo
de A. niger y S. cerevisiae produjo el mayor rendimiento. Etanol durante el
período de fermentación que con su proceso SHF. Tambien mas alto
El porcentaje de etanol en los destilados se obtuvo mediante el proceso SHCF.
Esta Puede deberse a diversas mezclas de azúcares como las hexosas y
pentosas liberadas en los hidrolizados que no pueden ser utilizados por S.
cerevisiae pero se hidrolizaron a azúcares fermentables por A. niger. Este
organismo es capaz de producir Hidrolasas de carbohidratos y ciertas enzimas
como amilasas, celobiasas, xilanasas que degradan los polisacáridos sin
almidón resultando en un aumento relacionado en la cantidad de azúcares
solubles disponibles en el caldo de fermentación [44] [45] [46].
La susceptibilidad de algunos azúcares obtenidos después de la hidrólisis por A.
niger durante
El proceso de fermentación a la actividad fermentable de S. cerevisiae se
convirtió en Mayor causando aumento correspondiente en el rendimiento de
etanol. El resultado obtenido de Este estudio coincide con el estudio sobre la
producción de etanol por sacarificación simultánea y co-cultivo de A. niger y S.
cerevisiae fermentación de cáscara de ñame que declaró que la mayoría de los
sustratos se utilizaron para la producción de etanol en Co-cultivo de fermentación
[47].

5. Conclusión

El resultado de este estudio muestra que Chlorella vulgaris puede utilizar cáscara
de plátano El extracto como único sustrato de carbono para la producción de
biomasa proporciona un desarrollo viable y sostenible y el proceso de gestión de
residuos para reducir el costo de la producción de bioenergía. Asimismo, co-
cultivo de técnica de fermentación que involucra a S. cerevisiae y A.
Níger dio un rendimiento de etanol mucho mejor que su contraparte de
monocultivo.