Curso de Instrumentación y Metrología

Microscopía: Conocer las diferentes partes de un microscopio óptico compuesto, el cuidado y manejo integral del
mismo. Principios de la óptica y el manejo de lentes.
Marco Antonio Giraldo Oficina 6-431 mantonio.giraldo@udea.edu.co

Introducción
- Cuando la luz cambia de medio de propagación, parte de ella es reflejada y
parte transmitida (refractada). Se cumple que el ángulo del rayo reflejado es
igual al incidente, mientras que el refractado cambia el ángulo de acuerdo a la
ley de refracción (Ley de Snell).
- El índice de refracción, n, es una medida de en cuánto se ve reducida la
velocidad de la luz en un medio determinado: n = c/v. Cada material tiene un
índice de refracción que lo caracteriza.
- Si el área limítrofe es curva, la variación en el ángulo de refracción es mayor. Es
por ello que las lentes tienen formas curvas.
- Una lente es un sistema óptico que posee dos superficies refractoras. Cuando los
rayos entran paralelos al eje de la lente, se refractan hacia un punto que llamamos
foco. De igual forma, al entrar pasando por el foco, se refractan paralelos.
- El microscopio simple es el más sencillo. Consiste en una lupa que agranda la imagen del objeto observado.
- Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos luminosos que la
atraviesan.
- Una de ellas (el objetivo) se sitúa cerca del objeto que se quiere estudiar. El
objetivo forma una imagen real aumentada e invertida. Se dice que la imagen es
real porque los rayos luminosos pasan realmente por el lugar de la imagen.
- La imagen es observada por la segunda lente (ocular) que actúa sencillamente
como una lupa. El ocular está situado de modo que no forma una segunda
imagen real, sino que hace divergir los rayos luminosos, que al entrar en el ojo
del observador parecen proceder de una gran imagen invertida situada más allá
del objetivo. Como los rayos luminosos no pasan realmente por ese lugar, se
dice que la imagen es virtual.
- El ocular tiene generalmente un aumento de 10x; es decir, aumenta una imagen 10 veces su tamaño normal. Existen
objetivos “en seco” (4x, 10x y 40x) y “de inmersión” (90x, 100x).
- El poder de resolución del microscopio es la capacidad de mantener separados dos puntos que a simple vista parecen
uno solo. Entre menor sea el límite de resolución mayor será el poder de resolución. O sea, un equipo óptico con un
L.R.= 0,01 mm tiene mayor P.R. que otro que tiene un L.R.= 0,02 mm.
- El poder de resolución del microscopio no guarda relación con el aumento. Depende de la apertura numérica de la
lente y de la longitud de onda de la luz utilizada.

- Poder de aumento: Capacidad de los lentes para aumentar el tamaño de los objetos
observados. Para saber cuantas veces está aumentada la imagen real del objeto, se multiplica el
número en el ocular por el número marcado en el objetivo.
- La resolución de un microscopio óptico está limitada por los efectos de difracción. Utilizando
longitudes de onda de 500 mm un microscopio óptico no puede “resolver” objetos más
pequeños que de unos cientos de nanómetros, independientemente de lo cuidadosamente que se
construyan las lentes.
- El aumento total más idóneo debe estar comprendido entre 500 y 1000 veces la apertura
numérica del objetivo. Considerando el objetivo de la imagen: 500 · 0,65 = 325 aumentos y 1000 ·
0,65 = 650 aumentos
- Un ocular 20x producirá imágenes de mayor aumento (800) pero serán poco nítidas.
- La profundidad de foco expresa la cualidad de un objetivo de poder presentar perfectamente
detalladas los diversos planos de una preparación sin variar la posición de enfoque. Depende del
diseño del objetivo y es inversamente proporcional al cuadrado de la apertura numérica (N.A.)
- La apertura numérica es un número que caracteriza el rango de ángulos para los cuales el sistema
acepta luz. Recíprocamente, también está relacionado con el ángulo de salida del sistema.
Microscopio de fluorescencia
- Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de
onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de
un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante
sobre un fondo oscuro.
- La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada.
- La luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz
de excitar al fluorocromo antes de incidir sobre la muestra.
- La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda
de emisión del fluorocromo.