UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

Nombres: Danny Guacalés, Anderson Rodríguez, Jefferson Ushigua

Carrera: Ingeniería Bioquímica

Ciclo Académico: Marzo 2018 - Agosto 2019

Asignatura: Ingeniería de las Enzimas

Nivel: Octavo

Profesor: Mg. Cecilia Carpio

Fecha de Realización: 24/06/2017

Fecha de Presentación: 01/07/2017

TEMA:

“EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA”

I. OBJETIVOS

GENERAL

 Identificar la temperatura en la cual la enzima β-amilasa presenta la máxima

velocidad de reacción.

ESPECÍFICOS

 Determinar la velocidad de reacción de la enzima β-amilasa a diferentes temperaturas.

 Definir la temperatura en la cual la enzima pierde actividad.
II. CÁLCULOS Y RESULTADOS

Tabla 1. Curva estándar de maltosa

Maltosa Absorbancia
(mg/mL) (540 nm)
0.000 0.000
0.370 0.116
0.774 0.306
1.186 0.463
1.616 0.614
2.020 0.777

0.900
0.800 y = 0.3935x - 0.0144
R² = 0.9975
0.700
Absorbancia (540 nm)

0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500
Maltosa (mg/mL)

Figura 1. Curva estándar de maltosa

Cálculo de concentración de maltosa

De la ecuación de la recta

𝑦 = 0.3935𝑥 − 0.0144

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0.3935[𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎] − 0.0144

𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 + 𝟎. 𝟎𝟏𝟒𝟒
[𝑴𝒂𝒍𝒕𝒐𝒔𝒂] =
𝟎. 𝟑𝟗𝟑𝟓
Cálculo demostrativo:
0.032 + 0.0144
[𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎] =
0.3935
𝑚𝑔
[𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎] = 0.118
𝑚𝐿
 Tabla 2: Cuantificación de maltosa catalizada por β-amilasa. Dilución 1/50

Abs. 540 nm

20 °C 30 °C 40 °C 50 °C
Tiempo Abs Maltosa Tiempo Abs Maltosa Tiempo Abs Maltosa Tiempo Abs Maltosa
(min) (mg/mL) (min) (mg/mL) (min) (mg/mL) (min) (mg/mL)
2 0.032 0,118 3 0.157 0,4356 3 0.171 0,471 3 0.167 0,461
4 0.158 0,438 6 0.230 0,6211 6 0.362 0,957 6 0.302 0,804
6 0.310 0,824 9 0.285 0,7609 9 0.453 1,188 9 0.425 1,117
8 0.497 1,300 12 0.345 0,9133 12 0.609 1,584 12 0.590 1,536
10 0.685 1,777 15 0.417 1,0963 15 0.795 2,057 15 0.657 1,706

Tabla 3: Cuantificación de maltosa catalizada por β-amilasa. Dilución 1/50

Abs. 540 nm

60°C 70 °C 75 °C
Tiempo Abs Maltosa Tiempo Abs Maltosa Tiempo Abs Maltosa
(min) (mg/mL) (min) (mg/mL) (min) (mg/mL)
3 0.211 0,573 3 0.577 1,503 3 0.270 0,723
6 0.369 0,974 6 0.625 1,625 6 0.309 0,822
9 0.426 1,119 9 0.633 1,645 9 0.364 0,962
12 0.434 1,140 12 0.845 2,184 12 0.374 0,987
15 0.499 1,305 15 0.907 2,342 15 0.402 1,058

2.5

2
Maltosa (mg/mL)

1.5 30°C
40°C
1 50°C
60°C
70°C
0.5
75°C
20°C
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (min)

Figura 2. Maltosa obtenida a diferentes temperaturas

Cálculo de la velocidad inicial de reacción a tiempo único de 6 min
𝒚𝟐 − 𝒚𝟏
𝒑𝒆𝒏𝒅𝒊𝒆𝒏𝒕𝒆 =
𝒙𝟐 − 𝒙𝟏

Cálculo demostrativo

0.824 − 0
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 =
6−0
𝑚𝑔 𝑀𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 0.137
𝑚𝑙 𝑅𝑥 ∗ 𝑚𝑖𝑛

0.3

0.25 20 °C
Maltosa (mg/mL)

0.2 30°C
0.15 40°C

0.1 50°C

0.05 60°C
70°C
0
0 1 2 3 4 5 6 7 75°C
Tiempo (min)

Figura 3. Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción

Cálculo de la temperatura real

𝑻. 𝒓𝒆𝒂𝒍 = 𝟎. 𝟏(𝑻. 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂) + 𝟎. 𝟗(𝑻. 𝒔𝒖𝒔𝒕𝒓𝒂𝒕𝒐)

Cálculo demostrativo

𝑇. 𝑟𝑒𝑎𝑙 = 0.1(20°𝐶) + 0.9(20°𝐶)

𝑇. 𝑟𝑒𝑎𝑙 = 20°𝐶

Cálculo de la velocidad relativa

𝑽𝟎 (𝒕𝒆𝒎𝒑𝒆𝒓𝒂𝒕𝒖𝒓𝒂)
𝑽𝒓𝒆𝒍𝒂𝒕𝒊𝒗𝒂 (%) = ∗ 𝟏𝟎𝟎
𝑽𝟎 (𝒎á𝒙𝒊𝒎𝒂)

Cálculo demostrativo

0.137
𝑉𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 (%) = ∗ 100
0.271

𝑉𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 (%) = 50.554

 Cálculo de la Actividad

Dada la ecuación
𝜷−𝒂𝒎𝒊𝒍𝒂𝒔𝒂
𝑨𝒍𝒎𝒊𝒅ó𝒏 + 𝑯𝟐 𝑶 → 𝒎𝒂𝒍𝒕𝒐𝒔𝒂 + 𝒅𝒆𝒙𝒕𝒓𝒊𝒏𝒂𝒔

𝒎𝒈 𝒎𝒂𝒍𝒕𝒐𝒔𝒂 𝟏 𝒎𝒎𝒐𝒍 𝒎𝒂𝒍𝒕𝒐𝒔𝒂 𝟏𝟎𝟑 𝝁𝒎𝒐𝒍𝒆𝒔 𝒎𝒂𝒍𝒕𝒐𝒔𝒂

𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅 = 𝒑𝒆𝒏𝒅𝒊𝒆𝒏𝒕𝒆 ∗ ∗ ∗
𝒎𝑳 𝑹𝑿 ∗ 𝒎𝒊𝒏 𝑷𝑴 𝒎𝒂𝒍𝒕𝒐𝒔𝒂 𝟏 𝒎𝒎𝒐𝒍 𝒎𝒂𝒍𝒕𝒐𝒔𝒂
𝑽𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 𝑹𝑿
∗ ∗ 𝑭𝑫
𝑽𝒔𝒐𝒍. 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂
Cálculo demostrativo:

𝑚𝑔 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 103 𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 = 0.137 ∗ ∗
𝑚𝐿 𝑅𝑋 ∗ 𝑚𝑖𝑛 342.3 𝑚𝑔 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑎
1 𝑚𝐿 𝑅𝑋
∗ ∗ 500
0.1 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙. 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
𝑈𝐼
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 = 2001,169
𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙. 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
Tabla 4. V relativas de reacción a diferentes temperaturas

Temperatura Temperatura Temperatura Tiempo V0 V relativa Actividad

enzima sustrato real (min) Maltosa (mg (%) (UI/mL
(mg/mL) Maltosa/mL sol.
Rx* min Enzima)
20 20 20 6 0,824 0,137 50.554 2001,169
30 30 30 6 0,6211 0,104 38.376 7595,676
40 40 40 6 0,957 0,159 58.672 11612,621
50 50 50 6 0,804 0,134 49.446 9786,737
60 60 60 6 0,974 0,162 59.779 11831,727
20 70 65 6 1,625 0,271 100 19792,580
20 75 69.5 6 0,822 0,137 50.554 10005,843

120.00

100.00
Velocidad relativa (%)

80.00

60.00

40.00

20.00

0.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura real (°C)

Figura 4. Relación entre temperatura y la velocidad de reacción de β amilasa

III. DISCUSIÓN

La actividad enzimática viene regulada por la temperatura de la solución enzimática. La temperatura

óptima o intervalo de temperatura de cada enzima es diferente y cuando varía, cambia la velocidad de
reacción de esta, hasta el punto de que a temperaturas muy altas la enzima puede llegar a
desnaturalizarse (LEHNINGER, NELSON, & COX, 2006). En la presente practica se ensayó con la
enzima β-amilasa a 7 diferentes temperaturas (Ver tabla 2), se tomaron valores de absorbancia a
diferentes tiempos de reacción para determinar la concentración de maltosa la cual es un producto
generado de la actividad de la enzima pues actúa sobre el almidón, rompiendo unidades dando como
resultado maltosa. (Chavez, Diaz, & Delfin, 2002). Con las concentraciones de maltosa fue posible el
cálculo de la velocidad inicial tomando en cuenta los respectivos tiempos de reacción, en la tabla 4 se
muestran las velocidades iniciales para cada temperatura, en la figura 3 cuyos valores son los de las
pendientes de las curvas. Con las velocidades iniciales se calculó la velocidad relativa en base a la
división de las velocidades iniciales a cada temperatura sobre la velocidad máxima la cual se logró a la
temperatura de 65°C con un valor de 0,271 mg/ml.min y la velocidad mínima obtuvo un valor de 0,104
mg/ml.min a una temperatura de 30°C, además se calculó la actividad enzimática donde la mayor
actividad fue presentada en la temperatura a 65 °C con un valor de 19792,580 UI/mL sol. Enzima. Por
cada 10°C de incremento la velocidad de reacción se duplica, las reacciones catalizadas por enzimas
siguen esta ley general, pero debido a que las enzimas son proteínas a partir de ciertas temperaturas
empiezan a desnaturalizarse por el calor. (Cedillo Jiménez & Hernández López, 2010). Datos
bibliográficos indican que la actividad máxima de la β-amilasa de soya es a temperaturas entre 60 y 65
°C y empieza un declive de actividad significativo a temperaturas de 70 °C en adelante. (Universidad
de Chile, 2007). Lo cual se puede ver claramente en la figura 4 en la cual el pico más alto es a la
temperatura de 65°C y decae significativamente a 70°C, también se nota un aumento gradual en la
actividad conforme aumenta la temperatura debido a que la temperatura provee a la enzima de la energía
necesaria para transformar el sustrato en producto. En procesos industriales lo que se busca es una
mayor actividad de la enzima en menor tiempo lo cual se logra con ensayos de este tipo en los cuales
se conoce la temperatura optima de actividad de la enzima.

IV. CONCLUSIONES
 Se determinó que la velocidad máxima de reacción se obtuvo en la temperatura de 65
°C con un valor de 19792,580 UI/ml de solución enzima, identificándose como la
temperatura óptima de actividad enzimática.
 Una vez trabajado con la enzima en un rango de temperaturas que va desde 20°C hasta
69,5 °C, se determinó la velocidad de hidrólisis en cada una de ellas, considerando los
valores de concentración de azucares reductores obtenidos en los diferentes tiempos de
reacción.
  La β-amilasa perdió actividad a la temperatura de 65.5°C, esto se puede concluir en
vista de que se observa un descenso brusco en la velocidad de hidrolisis presentada en
la figura N° 4
V. RECOMENDACIONES
 Evitar someter la enzima a estabilidad térmica elevada. En el caso de realizar la
actividad enzimática a temperaturas mayores a 70°C se recomienda temperar
únicamente al sustrato para impedir la inactivación de la enzima.
 Controlar el tiempo de reacción de la enzima al sustrato para evitar errores en la
determinación de la actividad, para ello se recomienda prever la adición de la enzima
y del reactivo DNS para detener la reacción en el tiempo establecido.

VI. BIBLIOGRAFIA

Chavez, M., Diaz, J., & Delfin, J. (2002). Principios basicos y aplicados. Buenos Aires: Goudelias.

Cedillo Jiménez, C.A.; Hernández López, J.L. (2010). Determinación de la actividad enzimática de
peroxidasas (catalasa). Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en Electroquímica.
Querétaro, México. Recuperado de:
http://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-
2010/12%20Verano%20Ciencia%20Region%20Centro/UAQ%20Cedillo%20Jimenez.pdf. el
1 de julio del 2019.

Lehninger, a., Nelson, d., & Cox, M. (2006). Principios de Bioquimica (Cuarta ed.). Barcelona:
Omega.

Universidad de Chile. (2007). VII. APLICACIÓN DE PREPARADOS ENZIMÁTICOS EN LAS

DIFERENTES INDUSTRIAS ALIMENTARIAS. Obtenido de Repositorio Ciencias Quimicas:
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/
parte07/01.html. el 1 de julio del 2019.