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Telas de alto rendimento produzem inibidores de moléculas pequenas de LeishmaniaCRK3

CYC6 Kinase dependente de ciclina

AbstractBackground Leishmaniaspecies são protozoários parasitas que possuem um ciclo


celular rigidamente controlado regulado por quinases dependentes de ciclina (CDKs). A cinase
3 relacionada ao Cdc2 (CRK3) uma CDK ineishmania essencial e ortóloga funcional da CDK1
humana pode formar um complexo ativo de proteína-quinase com as citocinas IL-CYCA e CYC6.
Aqui nós descrevemos a identificação e a síntese de inibidores específicos de pequenas
moléculas de LeyishmaniaCRK3 CYC6 expresso bacterianamente usando um teste de alta taxa
de transferência e química iterativa. Descrevemos também a atividade biológica das
moléculas frente aos parasitas Leishmania. Metodologia / Principais Descobertas Com o
objetivo de obter um complexo protéico quinase CYC6 ativo de LeishmaniaCRK3 CYC6
desenvolvemos um sistema de co-expressão e co-purificação para as proteínas
LeishmaniaCRK3 e CYC6. Esta enzima ativa foi utilizada em uma plataforma de triagem de alto
rendimento (HTS) utilizando um ensaio de polarização de fluorescência IMAP. Foram
realizadas triagens de bibliotecas twoquímicas e identificados inibidores específicos de CRK3
CYC6 que eram inativos contra a quinase dependente de ciclina humana CDK2 CycA.
Subsequentemente os melhores inibidores foram testados contra 11 outras proteínas quinases
de mamíferos. Doze dos mais potentes achados tiveram um núcleo de azapurina com relação
estrutura atividade (SAR) identificando os grupos funcionais nas posições 2 e 9 como essenciais
para CRK3 inibição e especificidade de CYC6 contra CDK2 CycA. A química iterativa permitiu a
síntese de vários derivados de azapurina com um composto 17 demonstrando uma atividade
anti-parasitária contra as formas promastigota e amastigota de L. principal. Após o segundo
HTS foram testados 11 compostos com núcleo de atiazole (ativo para CRK3 CYC6 e inativo
contra CDK2 CycA). Dez desses acertos demonstraram atividade antiparasitária contra a
promastigota. major.Conclusões / significância Os farmacóforos identificados a partir das telas
de alta taxa de transferência e as derivadas sintetizadas direcionam seletivamente a enzima
parasita e representam compostos para futuros programas de síntese de sucesso-para-
chumbo a desenvolver terapias contra as espécies de Leishmania. Os desafios permanecem na
identificação de inibidores específicos de CDK com a seletividade e a potência dos alvos contra
o parasita.

Introdução As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por Leishmania protozoários


parasitas pertencentes à família Trypanosomatidae. Existem mais de 20 espécies conhecidas e
subespécies deLeishmaniaprevalentes em 88 países em todo o mundo. Estes podem ser
agrupados em espécies do mundo antigo (África Ásia e Europa) e do novo mundo (as
Américas) de acordo com a sua distribuição geográfica.
(www.who.int/leishmaniasis/burden/en/). Várias formas clínicas da doença ocorrem;
leishmaniose cutânea difusa cutânea mucocutânea e visceral localizada. Estima-se que 350
milhões de pessoas estão em risco de infecção 1 com cerca de 12 milhões de pessoas
infectadas em todo o mundo. Há uma incidência anual de 05 milhão da forma visceral da
doença e 15 a 2 milhões de casos da forma cutânea da doença 2.
Introdução As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por Leishmania protozoários
parasitas pertencentes à família Trypanosomatidae. Existem mais de 20 espécies conhecidas e
subespécies deLeishmaniaprevalentes em 88 países em todo o mundo. Estes podem ser
agrupados em espécies do mundo antigo (África Ásia e Europa) e do novo mundo (as
Américas) de acordo com a sua distribuição geográfica.
(www.who.int/leishmaniasis/burden/en/). Várias formas clínicas da doença ocorrem;
leishmaniose cutânea difusa cutânea mucocutânea e visceral localizada. Estima-se que 350
milhões de pessoas estão em risco de infecção 1 com cerca de 12 milhões de pessoas
infectadas em todo o mundo. Há uma incidência anual de 05 milhão da forma visceral da
doença e 15 a 2 milhões de casos da forma cutânea da doença. 2 Existem vários medicamentos
atualmente recomendados para o tratamento da leishmaniose como os antimoniais
pentavalentes o estibogluconato de sódio. (Pentostam SSG) e anti-moniato de meglumina
(Glucantime); Anfotericina B e sua formulação lipídica AmBisome; Pentamidina Miltefosina
(Impavido) e Paromo-mycin 3. Mais dois medicamentos (Imiquimod e Sitamaquine) estão
sendo avaliados em ensaios clínicos. Entretanto o atual repertório de drogas para
leishmaniose é inadequado para uma variedade de razões; alta toxicidade baixa eficácia alto
custo via de administração indesejável janela terapêutica estreita e resistência a
medicamentos. De fato a extensa resistência aos antimenes pentavalentes foi relatada na
Índia 3. Portanto há uma necessidade urgente de desenvolver novas terapias para tratar a
leishmaniose e uma área sob investigação é o ciclo celular e proteinkinases 45.

O autor SummaryCRK3 uma proteína cinase de serina / treonina relacionada com cdc2 da
famíliaCDK é essencial para a transição através do ponto de verificação G2-Mphase do ciclo de
Leishmaniacell. O sistema de expressão e purificação foi desenvolvido para produzir L ativo.
majorCRK3 em complexo com cyclinpartner CYC6. CRK3 O CYC6 foi utilizado para desenvolver
um teste de rastreio de alto rendimento (HTS) utilizando a tecnologia de polarizao por
fluoresccia IMAP. Foram pesquisadas duas bibliotecas quicas de composto contra CRK3 CYC6 e
o rastreio rastreado contra um complexo CDK2 CycA complexo de cinase dependente de
humano. Foram identificadas duas famílias químicas principais de inibidores que inibiram
especificamente quinase dependente de ciclina theleishmanial as azapurinas e os tiazoles. A
análise da relação entre a atividade da estrutura (SAR) dos achados identificou os grupos
químicos ligados ao arcabouço de zeazurina que são essenciais para a inibição da atividade da
proteína quinase CRK3 CYC6. Os resultados de CRK3 CYC6 foram subsequentemente testados
contra um painel de 11 cinases de mam�ero incluindo CDK1 humano CYCB CDCD2 humano
CYCA e CDK4 humano CYCD1 para determinar a sua selectividade. Compostos seletivos para
CRK3 CYC6 foram testados contra Leishmania. Progresso na sintetização dos derivados
potentes e seletivos dos achados do HTS é discutido com o intuito de avaliar seu potencial para
o desenvolvimento de novas terapêuticas contra a leishmaniose.

Várias doenças são atribuídas a defeitos nas vias de sinalização celular controladas por
proteína-quinase incluindo câncer e doença inflamatória 67 abrindo a possibilidade de projetar
inibidores da proteína quinase para corrigir esses defeitos. De fato o Imatinibe (Gleevec) que
inibe a tirosina quinase Ableson (Abl) já está licenciado para o tratamento da Leucemia
Mielóide Crônica (CML). 8 Vários inibidores químicos pequenos de quinases dependentes de
ciclina (CDKs) estão sendo submetidos a ensaios clínicos para avaliar sua eficácia. eficácia
intrometer câncer. A justificativa para o seu desenvolvimento decorre do fato de que a
desregulação da sinalização de CDK em muitos cânceres resulta em proliferação não-verificada
9. Exemplos notáveis incluem o alvocidibe (flavopiridol) e o seliciclibe (CYC202 ou R-
roscovitina). O alvocidibe foi o primeiro inibidor da CDK a atingir testes clínicos 10 é um
inibidor da CDK não purina que inibe uma ampla variedade de CDKs e outros alvos
intracelulares. 12. Pode induzir parada celular tanto nas fronteiras G1-S como G2-M 13 e
inibe o crescimento de várias linhagens de células tumorais sólidas 14. O seliciclib é um
inibidor mais seletivo da CDK e demonstrou uma maior atividade tumoral contra xenoenxertos
de tumores humanos. Estudos em ciclos de leveduras e mamíferos estabeleceram as
principais CDKs e ciclinas que estão envolvidas na regulação do ciclo celular. Este trabalho é
relevante para o estudo do ciclo celular do parasita uma vez que os homólogos de muitas
dessas proteínas reguladoras do ciclo celular foram identificados em protozoários. parasitas
por exemplo CRK3 inLeishmania 16 e T. brucei 17; ciclinas mitóticas emTrypanosomabrucei
18. Devido ao seu papel fundamental no ciclo celular estas proteínas oferecem uma área
atrativa para a descoberta e desenvolvimento de fármacos contra tripanosomatídeos. Análise
do genoma dos três parasitas tripanossomatídeos L. maior t. bruceiandT. cruzi revela que a
família CDK em tripanossomatídeos é relativamente grande comparada a outros organismos
unicelulares com 11 inT. bruceiandL. majorand 10 inT. cruzi. Além disso 10 cyclins putativos
CYC2-11 foram identificados em todos os três parasitas 4 .Leishmania tem uma ciclina
adicional CYCA que está ausente de ambos. bruceiandT. Cruzi

Como antecipado evidências sugerem que CDKs de tripanossomatídeos controlam o ciclo


celular do parasita e que a interação com ciclinas é crucial para essa atividade. TheL. O
majorCDK CRK3 pode complementar um sensível à temperatura. pombecdc2 mutante nulo 19
demonstrando sua homologia funcional a cdc2 / CDK1. O geneforL. O mexicanaCRK3 (99%
idêntico ao L. majorCRK3) é essencial como convém a um regulador crucial da divisão celular.
A atividade da CRK3 foi atingida no pico da fase G2 / M do ciclo celular e a inibição da CRK3in é
vivenciada na parada do ciclo celular 20. A análise de sequências indica que o CRK3 contém
resíduos e domínios conservados em outros organismos; Domínio PSTAIRE envolvido na
ligação da ciclina Thr-14 e Tyr-15 que são necessários para a ligação de ATP e Thr-161 o
resíduo da alça T fosforilada por uma CDK activatingkinase 21. No presente estudo
reconstituímos o complexo ACCR3 CYC6 in vitro; determinou o substrato peptídico ótimo para
o complexo; adaptou um teste robótico de alto rendimento para uso com CRK3 CYC6;
rastreou aproximadamente 30.000 compostos e descobriu novos fármacos seletivos para
parasitas que poderiam ser desenvolvidos em terapias para tratar theleishmaniases e encurtar
o processo de descoberta de drogas.

Materiais e MétodosLeishmaniaCRK3 expressão e co-purificação do complexo de proteína


quinase CYC6E. As células coliBL21 (DE3) pLys-S foram transformadas com plasmídeo pGL1218
(CYC6his) e plaqueadas numa placa LB-ágar com antibiótico (50 mg / mL) e cloranfenicol (38
mg / mL) anti-bióticos. Bactérias expressando CYC6 foram então novamente transformadas
com plasmídeo pGL751a (CRK3his) e plaqueadas em placas LB-ágar suplementadas com
antibióticos de canamicina (25mgml21) ampicilina (50mgml21) e cloranfenicol (38mgml21).
Uma colônia de co-transformada E. Utilizaram-se culas coliBL21 (DE3) pLys-S para inocular 5
ml de meio LB com antibiicos de canamicina (25 mgml21) ampicilina (50mgml21) e
cloranfenicol (38mgml21) e cresceram com agitao a 37uCeguro. A cultura bacteriana de 5 ml
foi diluída para 1 litro com meio LB mais antibióticos e a cultura foi cultivada a 37ºC até que
fosse anod600 nm de 07. A cultura de 1 litro foi então transferida para a temperatura de
indução de 19ºC por 30 minutos e a expressão proteica induzida com IPTG 1 mM. As culturas
foram induzidas a 19ºC durante a noite com agitação. Após 16 horas as células foram colhidas
a 40006g por 15 minutos e ressuspensas em PBS gelado pH 74 suplementado com DNAse-1
(10mgml21) (Invitrogen) e Lisozima (100mgml21) (Sigma) por 60 minutos em gelo. O lisado
celular foi sonicou 4630 seg (30 seg. ligado / 30 seg. desligado) colhido a 120006g durante 20
minutos e o extracto solel filtrado atrav de uma seringa de filtro de 02mm. As prote�as
foram purificadas por cromatografia BioCAD utilizando uma coluna carregada com Ni2 de
quelato met�ico seguida por uma coluna de filtra�o em gel Hiload 16/60 Superdex-200. O
lisado de c�ulas bacterianas foi carregado na coluna Ni2 pr�equilibrado com tamp� de
lavagem (Na2HPO4 50 mM NaCl 300 mM pH 80 e imidazole 50 mM) e as prote�as ligadas
n� especificamente foram lavadas com o tamp� de lavagem de coluna Ni2.CRK3 CYC6 foi
elu�o 1 mL min21 com um gradiente linear de imidazole 50-500 mM em tampão de lavagem
em 10 volumes de coluna (1 volume de coluna = 175 mL). As fracções contendo a maior parte
da proteína detectada por absorvância a 280 nm foram reunidas e carregadas numa coluna de
filtração em gel Hiload 16/60 Superdex-200 equilibrada com tampão de filtração em gel /
tampão de armazenamento enzimático (HEPES 20 mM pH 74 NaCl 50 mM 2 mM EGTA 2
mMDTT e 002% Brij-35). O complexo foi eluído a 1 ml min21 com tampão de filtração em gel /
tampão de armazenamento de enzima e as fracções foram recolhidas. As frações contendo
CRK3his e CYC6his

as proteínas foram determinadas tanto por coloração com Coomassie blue gel como por
Western blot e subsequentemente reunidas em conjunto. As fracções reunidas tinham glicerol
adicionado a 10% do volume final junto com os inibidores de protease completos livres de
EDTA da Roche foram quantificados e armazenados a 280 uC

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