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TEMA 10 Y 11
Separación de los
pigmentos vegetales
coloreados
CROMATOGRAFÍA
Martin y Synge (1941)
Aplicaron técnicas cromatográficas para estudiar la composición de aminoácidos en
lana. Idearon la cromatografía de reparto.
Entrada de la
fase móvil
DETECTOR
Cromatograma
REPRESENTACIÓN DE UN CROMATOGRAMA
Efecto de
retención Efecto de
arrastre
Ejercido sobre los
componentes de la mezcla
por la fase estacionaria que Ejercido por la fase móvil que
está situada en el soporte. los empuja a través del
camino recorrido.
Según el dispositivo utilizado
para poner en contacto la fase
estacionaria y la fase móvil
TIPOS DE
CROMATOGRAFÍA
CROMATOGRAFÍA
SOPORTE Columna
Columna Plano
Columna Columna
Cromatografía en
columna
Cromatografía Plana
Tipos de cromatografía
Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en
contacto la fase estacionaria y fase móvil:
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Banda inicial
con los solutos
A
AyB
Empaquetado de la columna B
(fase estacionaria) suspendida
en el disolvente
(fase móvil)
Disco poroso
Emerge B Emerge A
CROMATOGRAFÍA PLANA
Cromatografía en Papel
Fase estacionaria Fase móvil
Hoja de papel de Agua, etanol.
celulosa de elevada
pureza recubierta de
una capa de agua
Tipos de cromatografía
Según los estados de las fases implicadas, en especial de la
fase móvil
CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA DE
CROMATOGRAFÍA FLUIDOS
DE GASES DE LÍQUIDOS SUPERCRÍTICOS
Adsorción
Afinidad Reparto
Exclusión Intercambio
molecular iónico
MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA
SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
Cromatografía de adsorción
El soluto presente en una fase móvil líquida o
gaseosa se adsorbe a las partículas sólidas de
la fase estacionaria. La separación de los
diferentes solutos se debe al equilibrio entre
las fases estacionaria y móvil.
Cromatografía de reparto
Los componentes de la fase móvil son
LO SIMILAR ES SOLUBLE retenidos por la fase estacionaria liquida en
EN LO SIMILAR función de su solubilidad en ella. Si las dos
son liquidas se tiene un proceso de
extracción en continuo.
MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA
SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
Cromatografía de afinidad
Se basa en la unión reversible entre el
analito de interés y un ligando específico,
inmovilizado en un soporte sólido inerte.
Ejemplo: Anticuerpo-proteína.
Instrumentación Cromatográfica
CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)
La cromatografía de gases incluye todos los sistemas cromatográficos
en los que la fase móvil es un gas.
La muestra se volatiliza y se
inyecta en la cabeza de una
columna cromatográfica. La
elución se produce por el
flujo de una fase móvil de un
gas inerte.
HORNO
Instrumentación Cromatográfica
Cromatografo de Gases
Instrumentación Cromatográfica
Columna
Desgasificador
Horno para
la columna
Eluente
Reservorio del
Desechos Detector
solvente
Instrumentación Cromatográfica
Cromatografo HPLC
APLICACIONES
Control
Química de
calidad
Bioquímica
Investigación
APLICACIONES
Proteínas
Ácidos nucleicos
Otras biomoléculas
Permite determinar:
Influencia de campo
cargado eléctricamente
- +
Ánodo Cátodo
+ - + -
V=qE/f
FUNDAMENTO
DIFUSIÓN
MIGRACIÓN:
Es el movimiento de las especies producido por una fuerza externa
que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su
intensidad.
CONVENCIÓN:
Se trata de un fenómeno no deseable en electroforesis. Consiste en el
transporte de todo tipo de especies, cargadas y no cargadas.
Fenómenos que pueden originarse en el sistema
electroforético
FLUJO TÉRMICO
Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina
una resistencia dada, se produce calor. Por tanto, el sistema
electroforético no es isotérmico.
FRICCIÓN
La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al
moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que
están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al
movimiento.
Métodos
Electroforesis libre (en disolución)
Geles
En Papel Sílice
(a través de una matriz porosa)
Agarosa Policramida
Electroforesis libre: sin la presencia de soporte
Tiselius
Electroforesis zonal: presencia de soporte
Método sencillo y
rápido
• Proteínas
Separación de: • Oligonucleótidos
• Carbohidratos
Papel • Lípidos
• Se desgarra fácilmente
• Distorsiona las bandas
Desventajas • Se produce interacción entre
las proteínas y los grupos
hidroxilo de la celulosa
Electroforesis en Papel
Medios de Soporte
• Técnica económica,
Almidón fácil y rápida.
• Buena resolución
• Separación de moléculas
Agarosa grandes (virus, ácidos
nucleicos).
Electroforesis en Geles de Poliacrilamida
(PAGE)
Polimerización de
acrilamida
Químicamente inertes
Polisacárido obtenido de
algas
Isoelectroenfoque
TIPOS DE
ELECTROFORESIS
Electroforesis capilar
Electroforesis
bidimensional
Cubeta vertical u
horizontal donde se
coloca el soporte
Sistema de
revelado y lectura Buffer
(Detector)
COMPONENTES DE UN SISTEMA
ELECTROFORÉTICO
Estándares y
2 electrodos
muestra
Fuente de poder
COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO
Capilares de sílica
(75 μm x 60 cm) Temperatura constante
(20 – 30º C)
Detección UV
Electrolitos Muestras y
Estándares
Electroforesis capilar
VENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR
Alta resolución.
Rápida separación.
Automatización.
Reproducibilidad.
Proteínas.
Péptidos.
Amino ácidos.
Ácidos nucleicos.
Iones inorgánicos.
Bases orgánicas.
Ácidos orgánicos.
APLICACIONES DE LA
ELECTROFORESIS