UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA

MONOGRAFÍA
“MÉTODO DE VALORACIÓN DE TIAMINA POR
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
SEGÚN LA USP 41 NF 36”

DOCENTE: Mg. Q.F. ARO DÍAZ, RUBÉN JESÚS

CICLO/GRUPO: IXB1
DÍA DE PRÁCTICA: MARTES

ALUMNOS:

 AZABACHE ROSALES, MARTHA JUDITH

 PINEDA MONSALVE, SOFÍA ROSMERY
 HERRERA RODRÍGUEZ, FRANK JEFERSON
CARÁTULA

TRUJILLO – PERÚ

2019
 ÍNDICE

CARÁTULA.....................................................................................................................................1

ÍNDICE.............................................................................................................................................2

RESUMEN........................................................................................................................................2

ABSTRACT......................................................................................................................................3

I. INTRODUCCIÓN....................................................................................................................4

II. OBJETIVOS.........................................................................................................................5

III. CUERPO...............................................................................................................................6

3.1. TIAMINA..........................................................................................................................6

3.2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN.........................................8

3.3. MÉTODO DE VALORACIÓN DE TIAMINA POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) SEGÚN LA USP 41 NF 369.............................................10

IV. CONSLUSIONES...............................................................................................................14

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................15

ANEXOS.........................................................................................................................................16
 RESUMEN

El presente trabajo es una monografía, que tiene como objeto central el estudio del Método
de Valoración de Tiamina por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) según la
USP 41 NF 36, para lo cual se realizó una revisión bibliográfica de diversas fuentes. Se
analizó la importancia del uso de farmacopeas. Asimismo, se buscó información sobre la
Tiamina y sus propiedades. Se buscó el fundamento del HPLC y de acuerdo a la USP 41
NF 36 se describió el procedimiento del Método para la Valoración de Tiamina en
preparados farmacéuticos sólidos (cápsulas y tabletas). Finalmente, concluimos que el uso
de las farmacopeas es importante porque aseguran la calidad y eficacia de los preparados
farmacéuticos.

PALABRAS CLAVES: Tiamina, HPLC, USP, cápsulas, tabletas, calidad, eficacia.

ABSTRACT

The present work is a monograph, whose main objective is the study of the Thiamine
Evaluation Method by High Resolution Liquid Chromatography (HPLC) according to USP
41 NF 36, for which a literature review was made from various sources. The importance of
the use of pharmacopoeias was analyzed. In addition, information was sought on thiamine
and its properties. The basis of HPLC was sought and according to USP 41 NF 36 the
method of the Method for the Evaluation of Thiamin in solid pharmaceutical preparations
(capsules and tablets) was described. Finally, we conclude that the use of pharmacopoeias
is important because they ensure the quality and efficacy of pharmaceutical preparations.

KEYWORDS: Thiamine, HPLC, USP, capsules, tablets, quality, efficacy.

 I. INTRODUCCIÓN

La Quinta Edición de la Real Farmacopea Española, aprueba los textos generales y

monografías que forman parte de la Farmacopea Americana. Ésta tiene la finalidad de
promover la salud pública mediante el establecimiento de normas comunes, reconocidas,
que puedan ser utilizadas por los profesionales de la salud, y en general, en todos los casos,
en los que sea relevante la calidad de los medicamentos. Tales normas pretenden garantizar
el empleo seguro de los medicamentos en pacientes y consumidores.1

La Farmacopea Americana, se utiliza ampliamente a escala internacional. Es el libro oficial,

actualizado y publicado periódicamente, que recopila las normas específicas, redactadas en
forma de monografías, que describen la calidad física, química y biológica que deben
observar las sustancias medicinales y excipientes, así como los métodos analíticos para su
control.1

Más de la mitad del contenido de cualquier farmacopea moderna está dedicado a los
métodos instrumentales de análisis y control de medicamentos, ya que, estos aspectos
constituyen un área de conocimiento de importancia fundamental, tanto en el desarrollo de
nuevos fármacos, como en el control de los ya existentes. La necesidad de garantizar la
eficacia, la seguridad y la calidad de los medicamentos, requiere de sistemas de
comprobación, supervisión y control, cada vez más sofisticados y supeditados, además, a
una normativa rigurosa y variable, según los avances científicos.2

Para conocer la importancia que los métodos de análisis presentan en el ciclo de vida de un
medicamento, basta con aproximarse a las diferentes etapas de su elaboración. De esta
forma, con las modernas técnicas instrumentales, se logra una información precisa y
completa de las propiedades fisicoquímicas de un fármaco en cualquier etapa de su
existencia.2

La cromatografía es usada principalmente para la separación de los componentes de una

muestra, mediante su distribución en dos fases, una estacionaria y otra móvil. La
estacionaria puede ser un sólido, un líquido retenido sobre un sólido o un gel. La fase
móvil puede ser líquida, sólida e inclusive un fluido supercrítico. Las principales
modalidades de la cromatografía incluyen a cromatografía gaseosa, cromatografía en capa
delgada, cromatografía en columna abierta y cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC). Esta última ha tenido una creciente difusión desde sus inicios hace más de treinta
años y es actualmente una de las técnicas más versátiles, empleada ampliamente en
laboratorios farmacéuticos, químicos, industriales y control de calidad de alimentos.3

El desarrollo de HPLC es atribuido a un "salto natural" de la cromatografía en columna,

frente a nuevas mejoras en rellenos, sistemas de inyección, bombas, detectores etc.
Originalmente el acrónimo de HPLC era de cromatografía líquida de alta presión, sin
embargo, fue cambiado por cromatografía líquida de alta resolución por dos razones, la
primera se quería enfatizar sobre las altas eficiencias de separación que se obtenían con los
nuevos rellenos y la segunda era que la presión empleada no constituía en sí, una variable
significativa del sistema.3

Los métodos de HPLC fueron inicialmente desarrollados en alimentos, para cuantificar:

aminoácidos, péptidos, proteínas, carbohidratos y vitaminas. Estos compuestos no podían
trabajarse adecuadamente con los equipos de cromatografía de gases disponibles en esos
momentos, ya que presentaban problemas como: baja volatilidad, dificultad para la
formación de sus respectivos derivados o inconvenientes para su separación de la matriz de
la muestra .Actualmente se han incrementado considerablemente el número de aplicaciones
en HPLC en alimentos, debido a nuevos desarrollos y mejoras como: automatización de los
equipos, desarrollo de detectores con alta sensibilidad y especificidad, nuevos rellenos de
columnas y mejor calidad de los mismos.4

Cualquier método desarrollado por HPLC debe ser validado para asegurar que es exacto,
específico y reproducible dentro de un rango de interés, en el cual se va a analizar un
analito o varios. Esto a su vez permite tener más confianza en que la metodología puede
ser transferida a otros laboratorios de análisis, para su correcta aplicación. 4

II. OBJETIVOS

2.1. Analizar la importancia del uso de farmacopeas.

2.2. Describir el método de valoración de tiamina por cromatografía líquida de

alta resolución (HPLC) según la USP 41 NF 36.
 2.3. Describir el equipo usado en la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC).

III. CUERPO

III.1. TIAMINA

La tiamina, conocida también como la vitamina B1, es importante para el crecimiento,

desarrollo y funcionamiento de las células del organismo. Fue la primera molécula que se
descubrió con características de vitaminas y como químicamente era una amina se
denominó ¨amina vitae (amina de vida), de ahí el origen del término vitamina. 5,6

A. QUÍMICA: La tiamina es una molécula que consta de dos estructuras cíclicas

orgánicas interconectadas, un anillo de pirimidina con un grupo amino y un anillo
tiazol azufrado, unido a la pirimidina por un puente metileno (el término tiamina
designa la presencia de azufre y de un grupo amino en la molécula). 6

B. CARACTERÍSTICAS:

 CLASIFICACIÓN: Está dentro de las vitaminas hidrosolubles, estas se

caracterizan por no estar asociadas a los lípidos alimenticios, normalmente
se excretan en pequeñas cantidades en la orina, no se almacenan en el
organismo en cantidades apreciables y la mayoría son componentes de
sistemas enzimáticos esenciales. 6

 PESO: Su fórmula molecular es C12H17N4OS+ y tiene una masa

molecular de 265.356 gr/ml. Es posible su síntesis enteral parcial por las
bacterias intestinales. 6

 FARMACOCINÉTICA:

ABSORCIÓN: Se realiza el intestino delgado (yeyuno, íleon) y una

pequeña parte en el colon, por un mecanismo pasivo (a dosis altas) y por un
 mecanismo activo (a dosis bajas), la cual es favorecida por la presencia de
vitamina C y ácido fólico, pero inhibida por la presencia de etanol (alcohol).
6

DISTRIBUCIÓN: Una vez absorbida, circula en sangre unida a globulinas

que la transportan a diversos tejidos del organismo. Su reserva en el cuerpo
es baja, de aproximadamente 30 mg. Los tejidos con mayor concentración
son el músculo esquelético (80 %), hígado, riñón, corazón y encéfalo. Su
vida biológica es de 9 a 18 días. 6

 FARMACODINAMIA: La forma activa de la vitamina B1 es el difosfato

de tiamina (DPT) o pirofosfato de tiamina (PPT), que se sintetiza a partir de
tiamina libre, ATP y magnesio, por acción de la enzima tiamina-
pirofosfoquinasa. En esta forma participa como Cofactor enzimático en
reacciones claves del metabolismo. Entre ellas:

1. La descarboxilación oxidativa de ácido pirúvico (metabolito

proveniente de la degradación de la glucosa en la vía glucolítica),
que constituye la principal fuente para la obtención de acetil CoA,
alimentador del Ciclo de Krebs. 6

2. La descarboxilación oxidativa del ácido α-cetoglutárico, metabolito

intermediario del Ciclo de Krebs, vía metabólica implicada en la
respiración celular, proceso que garantiza la formación de ATP
(energía metabólicamente útil) para que las células que forman partes
de todos los tejidos de nuestro organismo realicen sus diferentes
funciones. 6

3. La transformación de hexosas en pentosas, por acción de la enzima

transcetolasa que realiza su actividad catalítica en la vía de las ISSN
1028-9933 pentosas (transfiriendo grupos glicoaldehídos (CH2OH-
CO-), donde se forman sustancias tan importantes como el
NAHPHH+ (necesario para la síntesis de lípidos y el mantenimiento
 de la integridad de las membranas) y la ribosa 5 fosfato
(imprescindible para la formación de nucleótidos y ácidos nucleicos).

4. En la síntesis del neurotransmisor acetil colina. 6

C. INDICACIONES7

1. Profilaxis y tratamiento de deficiencia de tiamina - la deficiencia de tiamina

puede ocurrir como resultado de una nutrición inadecuada o mala absorción
intestinal. Síndromes de deficiencia que incluyen beri-beri y Encefalopatía de
Wernicke.

2. Otros usos incluyen diversos errores de metabolismo al nacer, tal como la

enfermedad de la orina de jarabe de arce.

En la mayoría de los casos, la administración parenteral sólo está indicada cuando la

administración oral no es aceptable (por ejemplo, si se producen náuseas o vómitos y en
estados preoperatorios y postoperatorios) o posible (por ejemplo, en síndromes de
malabsorción o después de resección gástrica). 7

III.2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

I. Fundamento: La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para

separar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no
polar (columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado
con RMe2SiCl. La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en
solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran
de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna.
Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la
muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza
de los compuestos a determinar. 8
 Esta técnica
está indicada para la separación de compuestos orgánicos semivólatiles. 6

II. PARTES DEL MODELO VARIAN 920 LC8

 Bomba de gradiente cuaternaria.

 Columna termostatizada rango de temperatura : ambiente+10ºC-65ºC.

 Automuestreador (200 vialesx2ml) con jeringa de inyección (0-50μl) con

posibilidad de realizar incrementos de 1μl.

 Detector PDA (diodo array) con un rango de longitudes de onda (190 -900 nm) con
lámpara de deuterio para UV y halógena de cuarzo para visible, con una resolución
espectral <1nm para el fotodiodo.

 Detector de Fluorescencia: Lámpara de Xe de 150W, y lámpara de Hg para

chequear la longitud de onda. Presión 145psi.

 Bomba de gradiente ternaria VARIAN INERT 9012.

 Detector Ultravioleta/Visible Jasco UV-975.

 Detector de Fluorescencia Jasco FP-920.

 Columnas disponibles: Vidac Hipersil (25mm x 4.6mm x 5μm) recomendada por

EPA para análisis de PAHs), C18 (15mm x 4.6mm x 5μm), C18 (25mm x 4.6mm x
5μm).

Tipos de muestras: Aguas, suelos, alimentos, extractos, etc. (para cualquier tipo de
matriz contactar con el laboratorio).8
III.3. MÉTODO DE VALORACIÓN DE TIAMINA POR
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) SEGÚN
LA USP 41 NF 369

El siguiente procedimiento se puede usar para determinar la tiamina en los siguientes

artículos:

 Cápsulas de vitaminas oleosolubles e hidrosolubles

 Tabletas de vitaminas oleosolubles e hidrosolubles

 Cápsulas de vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales

 Tabletas de vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales

 Cápsulas de vitaminas hidrosolubles

 Tabletas de vitaminas hidrosolubles

 Cápsulas de vitaminas hidrosolubles con minerales

 Tabletas de vitaminas hidrosolubles con minerales

Este procedimiento que implica la extracción de tiamina de la formulación mediante

el diluyente, calor y agitación mecánica.

1. REACTIVOS9

A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, la

solución estándar, las soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan
según se indica a continuación.

 DILUYENTE: Acetonitrilo, ácido acético glacial y agua

 FASE MÓVIL: Una mezcla de metanol, ácido acético glacial y agua que
contenga 140 mg de 1-hexanosulfonato de sodio por 100 mL.

 SOLUCIÓN ESTÁNDAR: Transferir 20 mg de ER Clorhidrato de

Tiamina USP a un matraz volumétrico de 200 mL y agregar 180 mL de
 Diluyente. Sumergir el matraz en un baño de agua caliente manteniendo
a 65° -70° durante 10 minutos, agitando regularmente, o usando un
mezclador de vórtice, hasta que se disuelva todo el material sólido.
Enfriar de manera rápida a temperatura ambiente en un baño de agua fría
durante 10 minutos y diluir con Diluyente a volumen.

2. SOLUCIÓN MUESTRA PARA CÁPSULAS9

A. Pesar no menos de 20 cápsulas en un frasco de pesada tarado.

B. Abrir las cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el

contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas lavando con varias porciones de éter.

C. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las cápsulas vacías en el frasco
de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por cápsula.

D. Transferir una porción del contenido de las cápsulas, equivalente a 2,5 mg

de clorhidrato de tiamina, a un tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar 25, 0
mL de Diluyente y mezclar usando un mezclador de vórtice durante 30
segundos para suspender el polvo completamente.

E. Sumergir el tubo de centrífuga en un baño de agua caliente manteniendo a

65° -70°, calentar durante 5 minutos y mezclar en un mezclador de vórtice
durante 30 segundos.

F. Volver a colocar el tubo en el baño de agua caliente, calentar durante 5

minutos adicionales y mezclar en un mezclador de vórtice durante 30
segundos.

G. Filtrar una porción de la solución, enfriar a temperatura ambiente y usar el

filtrado transparente. (Usar el filtrado dentro de las tres horas de su
filtración)

3. SOLUCIÓN MUESTRA PARA TABLETAS9

 A. Reducir a polvo fino no menos de 30 tabletas. Transferir una porción del
polvo, equivalente a 2,5 mg de clorhidrato de tiamina, a un tubo de
centrífuga de 50 ml.

B. Agregar 25,0 ml de Diluyente y mezclar usando un mezclador de vórtice

durante 30 segundos para suspender el polvo completamente.

C. Sumergir el tubo de centrífuga en un baño de agua caliente mantenido a 65º-

70º, calentar durante 5 minutos y mezclar en un mezclador de vórtice
durante 30 segundos.

D. Volver a colocar el tubo en el baño de agua caliente, calentar durante 5

minutos adicionales y mezclar en un mezclador de vórtice durante 30
segundos.

E. Filtrar una porción de la solución, enfriar a temperatura ambiente y usar el

filtrado transparente. (Usar el filtrado dentro de las tres horas de su
filtración)

4. SISTEMA CROMATOGRÁFICO9

 Modo: HPLC

 Detector: UV 280 nm

 Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1

 Velocidad de flujo: 1 mL/min

 Volumen de inyección: 10 μL

5. APTITUD DEL SISTEMA

 Muestra: Solución estándar

 Requisitos de aptitud: Desviación estándar relativa: No más de 3,0%

6. ANÁLISIS9
  Muestras: Solución estándar y Solución muestra apropiada

Para productos que contengan clorhidrato de tiamina, calcular el porcentaje de la

cantidad declarada de clorhidrato de tiamina (C12H17CIN 40S · HCI) en la porción
de muestra tomada:

 ru = respuesta del pico de tiamina de la Solución muestra apropiada

 rS = respuesta del pico de tiamina de la Solución estándar

 CS = concentración de ER Clorhidrato de Tiamina USP en la Solución

estándar (mg/ml)

 Cu = concentración nominal de clorhidrato de tiamina en la Solución

muestra apropiada (mg/ml)

Para productos que contengan mononitrato de tiamina, calcular el porcentaje de la

cantidad declarada de mononitrato de tiamina (C12H17N50 4S) en la porción de
muestra tomada:

 ru = respuesta del pico de tiamina de la Solución muestra apropiada

 rS = respuesta del pico de tiamina de la Solución estándar

 CS = concentración de ER Clorhidrato de Tiamina USP en la Solución

estándar (mg/ml)
  Cu = concentración nominal de mononitrato de tiamina en la Solución
muestra apropiada (mg/ml)

 M,1 = peso molecular de mononitrato de tiamina

 M,2 = peso molecular de clorhidrato de tiamina

IV. CONSLUSIONES

IV.1. Analizamos la importancia del uso de farmacopeas.

IV.2. Describimos el procedimiento del método de valoración de tiamina por

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) según la USP 41 NF 36.

IV.3. Describimos las partes el equipo VARIAN 920 LC.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Farmacopea de los Estados Unidos de América, USP 41 –NF-36: Estados unidos. (2018). p. 20-21
INTERNET. [visto el 17/07/2019]. Disponible en :
http://www.academiadefarmaciadearagon.es/docs/Documentos/Documento72.pdf

2. Farmacopea de los Estados Unidos de América, USP 41 –NF-36: Estados unidos. (2018). p. 22-23.
INTERNET. [visto el 17/07/2019]. Disponible en :
http://www.academiadefarmaciadearagon.es/docs/Documentos/Documento72.pdf

3. QUATTROCCHI, O., ANDRIZZI, S., Y LABA, R. Introducción a la HPLC. Aplicación y práctica.

(2010) Editorial. Artes Gráficas Farro. Buenos Aires. Argentina pp. 407 INTERNET. [visto el
17/07/2019]. Disponible en :
https://www.researchgate.net/publication/315771927_Introduccion_a_la_HPLC_Aplicacion_y_Pract
ica

4. MATISSEK, R. Cromatografía líquida moderna de alto rendimiento - Fundamentos y desarrollos. En

"Cromatografía líquida de alto rendimiento en control e investigación de alimentos"(2011) Editorial
 tecnómica. pp. 383. INTERNET [visto el 17/07/2019]. Disponible en :
https://www.researchgate.net/publication/315771927_Introduccion_a_la_HPLC_Aplicacion_y_Pract
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5. NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (NIH). Datos sobre la tiamina. INTERNET [visto el

18/07/2019]. Disponible en: https://ods.od.nih.gov/pdf/factsheets/Thiamin-DatosEnEspanol.pdf

6. FERNÁNDEZ FALCÓN L, et al. Algunas consideraciones acerca de la tiamina o vitamina B1. Rev
Inf Cient 2013; 81(5). INTERNET [visto el 18/07/2019]. Disponible en:
file:///C:/Users/Efe/Downloads/Dialnet-AlgunasConsideracionesAcercaDeLaTiaminaOVitaminaB1-
6146104.pdf

7. MINSA. Tiamina Clorhidrato Tableta 100mg. INTERNET [visto el 18/07/2019]. Disponible en:
http://www.digemid.minsa.gob.pe/UpLoad/UpLoaded/PDF/Tiamina_Clorhidrato_Tableta.pdf

8. MIRANDA AVELINA, et al. Cromatografía Líquida (HPLC). INTERNET [visto el 18/07/2019].

Disponible en: https://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-gases%20l%C3%ADquidos.pdf

9. Farmacopea de los Estados Unidos de América, USP 41 –NF-36: Estados unidos. (2018). p. 6687-
6688

ANEXOS

1. USO DE LA FARMACOPEA USP 51 NF36