05/06/2019

Cristalografía de proteínas

Outline
• Un poco de historia
• Cómo ver la estructura de una proteína?
• Difracción y reconstrucción
• Cristales!
• Cristalización
• Adquisición de datos
• Interpretación y calidad

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Cristales
• Apreciados por estética 
y rareza
• S. XVII, consideración 
de que los cristales 
podían ser arreglos de 
partículas esféricas en 
forma simétrica

La primera proteína
cristalizada?
• F.L.Hünefeld. Die 
Chemismus in der 
thierischen 
Organisation, 
J.prakt.Chem. 16, 152; 
1839 pp160‐161.
• Hemoglobina (?) de 
sangre de cerdo (Fig.7) 
y humana (Fig.8).

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Micrografías de Hb (Blutroth) de
distintas especies (Preyer, 1871)

Rayos X (X= Desconocido)

Wilhelm
Conrad
Roentgen

Bertha
Roentgen,
1895

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Rayos X!
Roentgen (1895)  Max von Laue (1912), cristales 
descubrimiento como redes de difracción

Difracción en proteínas,
pepsina (1934)
• Xtales de proteína  no difracción 
• Hodgkin y Bernal, pepsina en líquido! 

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Biological Crystallography

Las proteinas dieron un

patron de difraccion
definido (1938)

CONCLUSION:
Las proteinas tienen una
estructura definida!!

Difracción en proteínas,
pepsina (1934)
“The conception that crystallised pepsin is pure and that the enzyme is a protein, 
requires further proof, as it has been shown to be a compound body.” E. 
Waldschmidt‐Leitz Ann.Rev.Biochem. 1, 69; 1932

J. D. Bernal and D. Crowfoot, Nature (London) 133, 794 (1934).

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Primera estructura de proteína

resuelta por difracción de RX

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Primera estructura de proteína

resuelta por difracción de RX

Myoglobin (1959)

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Sperm Whale Myoglobin

Vs. Horse Hemoglobin (la segunda!)

Evolutionary Connection through structure!

Cómo “ver” moléculas?

• ߣ no debe ser superior al tamaño del objeto que 
quiero ver
• Distancias interatómicas ~ 1.5Å (0.15 nm) → Rayos
X

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Rayos X (X= Desconocido),

Wilhelm Conrad Röntgen, 1895
• Cada átomo (e‐) dispersa 
radiación en todas 
direcciones
• La radiación dispersada se 
“pierde” en la radiografía
• Los materiales mas 
densos en e‐ (anillo) son 
opacos
• La radiografía colecta la 
radiación que pasa
• Hay información en la 
radiación dispersada? 

Los rayos X son ondas!

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Las ondas interfieren y producen

difracción

Una rendija Dos rendijas Dos rendijas

Cambia el ancho Cambia el ancho Cambia la distancia
Misma distancia Mismo ancho

Mapa de difraccion de Laue Max von Laue

Primer patron de Corriendo la Patron del

difraccion de Laue pelicula ZnS(cubico)
Sulfato de cobre fotografica 1913
 

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Como sacar info de

difracción?

William H. Bragg

William L. Bragg

Dispersión “en fase”: interferencia

constructiva

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Dispersión “en antifase”:

interferencia destructiva

Cristal… muuuchos planos! Ley

de Bragg es más estricta

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Los átomos formas muchos

planos diferentes
• Solo se ven los haces 
“permitidos”
• Cada Spot resulta de un 
conjunto de planos
• Haces difractados = 
REFLEXIONES
• Conociendo los ángulos se 
pueden calcular las 
distancias de cada conjunto 
de planos
• Los átomos estan en la 
intersección de los planos

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Y una proteína?
• En moléculas complejas, 
cada parte de la 
molecula difracta hacia 
direcciones distintas 
haciendo el análisis 
mucho mas complejo
• Tomando todas las 
difracciones en UNA 
SOLA DIRECCION y  
SUMANDOLAS (integral)

Pero… difracta(ría) una

proteína???

Sí

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No solo eso…
• En el patrón de difracción de una proteína está la 
información necesaria para reconstruir la densidad 
electrónica. A partir del análisis de Fourier.

pará… pará… pará…

• En las últimas dos slides
• Desapareció la geometría/trigonometría (?)
• Aparecieron integrales (??)
• Apareció Fourier (???)
• Desaparecieron los cristales (???????)
• Como volvemos?. En este orden
• Fórmula de Euler
• Suma sobre todo el volumen
• Inversión de la difracción para reconstruir
• Necesidad de muchos difractores ordenados
• Vamos paso a paso

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La fórmula de Euler

• Establece una relación entre la 
función exponencial y las 
funciones trigonométrica
• Sirve para simplificar (mucho!) el 
análisis de funciones periódicas

Cómo generalizamos la
dispersión para cualquier objeto?
• Tomamos el haz que incide como un 
vector k, y el difractado como k’. 
Definimos su magnitud como 1/λ
• Tomamos un origen arbitrario y 
calculamos la diferencia en el camino de 
la luz difractada entre el origen y cada 
punto
• La diferencia en el paso es una 
diferencia de fase. La dipersión de todo 
el objeto se suma, considerando la 
dispersión de cada punto y la 
representación compleja de la diferencia 
de fase. Ponemos el vector s=k‐k’ y 
llegamos a una descripción completa

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So what?
• La fórmula a la que llegamos se parece notablemente a 
la transformada de Fourier

• Que tiene la propiedad maravillosa de poder invertirse

• Es decir que si conozco la difracción, puedo calcular la 
posición de todos los dispersores de mi objeto!!!
• Listoooo…..

Not so fast…
• f(S) es un número complejo
• Las intensidades de las reflexiones nos informan 
sobre el módulo de f(S)… no tenemos la 
dirección/fase
• Es importante? Veamos gráficamente

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Analicemos imágenes
• Imaginemos que la fase 
diera “color” a los puntos 
de difracción
• Que darían un punto, una 
molécula y un … pato?
• Puedo “ir y volver” de la 
difracción a la imagen!! 

El problema de las fases

• Puedo ir y volver de imagen a 
difracción mientras tenga fases 
(“color”)
• La difracción medida no tiene 
signo (es en “blanco negro”)
• Tengo que ponerle un valor de 
fase a cada punto para ir para 
atrás!!!
• Que pasa si a la intensidad del 
gato le doy las fases del pato?

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“Cristal” 1d
• Fourier nos dice que podemos 
reconstruir la función como 
suma de funciones periódicas
• En este caso, se obtiene con tres 
componentes mayoritarias
• En la difracción sale la frecuencia 
(ángulo) y la amplitud 
(intensidad) pero NO la fase…
• Y la fase es esencial para que la 
reconstrucción funcione!

Pongamos que resuelvo lo de las

fases. Listooo…
• Not so fast. Empezamos hablando de cristalografía
• Para qué quiero un cristal?
• Con una sola molécula se me complican:
• Orden/orientación (solucionable, ponele…)
• Intensidad de dispersión!!
• El cristal pone a difractar muuuchas moléculas. Y como 
están organizadas, todas están “de acuerdo”

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Por qué cristales?

• La difracción de rayos X de una sola molécula sería muy 
débil
• En un cristal una gran cantidad de moléculas están 
acomodadas en la misma orientación
• Las ondas difractadas se suman y aumentan la señal
• Los cristales son “amplificadores” de la difracción

Los griegos llamaron cristal al cuarzo, κρνσταλλοσ (cristallos = frío + goteo)

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Pero da lo mismo?
• Recordemos la 
molécula
• Pongamos muchas 
juntas
• La difracción es la 
convolución de la 
difracción de la 
molécula y de sus 
posiciones
• Ahora se parece más a 
lo que vemos, eh?

Cristalización de macromoléculas
 Muestra pura, estable y homogenea!
 Control de calidad:
 SDS-PAGE (puede ser insuficiente)
 MS, DLS, IEF, Geles nativos
 Cromatografia de exclusion
 Fuentes de heterogeneidad: conformacion, formas
oligomericas, modificaciones post-traduccionales,
oxidacion de cadenas laterales, deamidacion,

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Cristalización de macromoléculas
 Cuanta proteina necesitamos?
 Cantidad: 10 mg (para empezar)
 Concentracion: 5 mg/ml – 200 mg/ml

 Muestra en buffer a baja concentracion

 Agregado de agentes extra (DTT, TCEP, EDTA), glicerol

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Cristalización de macromoléculas
 Principio  Sobresaturación: contactos ordenados entre
proteínas
 Básicamente por prueba y error
… pero hay recetas
 pH
 Sales: aniones orgánicos, fuerza ionica
 Precipitantes: (NH4)2SO4 , PEGs, MPD
 temperatura

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Solubilidad de proteínas. Diagramas de

fase

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Métodos usados en cristalización

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Gota colgante (hanging drop)

 cristales caen sobre la

interfase agua-aire
✗ Difícil de automatizar

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Gota “sentada” (sitting drop)

 cristales caen sobre el

plástico
✗ Fácil de automatizar (gotas
de nanolitros)
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Un cristal en el ensayo… proteína o sal?

49 Biofísica 2018 7/6/2018

Complejos proteína-ligando

Soaking

Co-crystallization

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Automatización de los ensayos: robots,

hoteles …

51 Biofísica 2018 7/6/2018

Proteínas de membrana

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Si puede fallar, va a fallar....que puede

aparecer?

Clear Drop Matter in Drop Gels

Precipitate Oils

53 Biofísica 2018 7/6/2018

Tipos de cristales

1D: Needles 2D - plates

3D: Boulders

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aldo-keto reductasa humana

Complejo proteína-DNA

Metalloprotease FtsH Complejo proteína HPV

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Cómo se “monta” un cristal?

CryoLoops are available in 10 and 20

micron diameters. These CryoLoops are
used to mount, freeze, and secure the
crystal during cryocrystallographic
procedures and x-ray data collection.

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Adquisición de datos

Fuentes de rayos X:
•Rayos X emitidos de blancos de Cu bombardeados con electrones de alta energía,
emiten a long. De onda carácterísticas (CuKalpha, 1.5418 Å ≈ distancia C-C)
•Sincrotrón
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Adquisición de datos

Sincrotron
Longitud de onda variable
Rayos X de alta intensidad

Difractometro de laboratorio
(in-house)
Bruker D8 QUEST (opertativo
desde Marzo 2014)
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Sincrotrones

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Sincrotrones, líneas

60 Biofísica 2018 7/6/2018

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Sincrotrones, líneas

61 Biofísica 2018 7/6/2018

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