Sebenta Laboratorial Mico Carolina Fernandes 1

Sebenta
laboratorial
Micologia 2013/2014
Carolina Fernandes

Sebenta laboratorial

Meios de cultura

1-‐ Preparação de 100 mL
2-‐ Esterilização
3-‐ Distribuição em placas estéreis do meio a 55ºC
4-‐ Prova de esterilidade e secagem da superfície.
Utilização do meio preparado para a sementeira dos produtos na 2ª aula

A) Meio de PDA – Potato Dextrose Agar
Componentes g/L Preparação Esterilização pH
Infusão de batata-‐ Pesar 42,0g por Litro
200,0 de água destilada. Autoclave 121ºC por 5,6±0,2
Glucose-‐20,0 Dissolver com ajuda 15 minutos. a 25ºC
Agar-‐17,0 do calor

Para prevenir o crescimento bacteriana adiciona-‐se 1 ml de ácido láctico a 10% a cada 100ml de meio
esterilizado a 50ºC obtendo um pH= 3,5. O meio não deve ser aquecido antes da adição do ácido ao
invés pode ocorrer hidrólise do agar e destruição das propriedades do gel.
É um meio adequado para o isolamento e contagem de leveduras em bolores na manteiga, ou aqueles
que ocorrem na superfície de carnes frescas, carnes fumadas e produtos de salsicharia.
Minerais presentes no agar podem influenciar a formação de pimentação de certos fungos. E são as
impurezas da água e da batata que fornecem os sais minerais essenciais.
Se necessitamos de um meio não seletivo podemos usar este meio sem o acidificarmos ou então
usamos o meio Malt Extract Agar

B) Meio de SAB CHL 2-‐D – Gelose Sabouraud cloranfenicol 2 Agar
Componentes Preparação Esterilização pH
Peptona de caseína
(bovina)-‐5,0
Peptona de gelatina Pesar 45,5g por Litro
(bovina ou porcina)-‐ de água destilada. Autoclave 120ºC por 6,2
5,0 Dissolver com ajuda 15 minutos.
Glucose-‐20,0 do calor
Cloranfenicol-‐0,05
Agar-‐15,0

É um meio seletivo, que é assegurado pelo uso de cloranfenicol, recomendado para a cultura e o
isolamento das leveduras e dos fungos filamentosos.
A presença de peptonas e de glucose favorece o desenvolvimento das estirpes fúngicas.
O pH da gelose é ligeiramente ácido, favorecendo o crescimento de fungos em relação ao
desenvolvimento bacteriano, que é inibido devido à presença de cloranfenicol.
É necessário tomar certas precauções quanto ao uso do cloranfenicol que em certas quantidades pode
ser tóxico e poderá provocar cancro, sensibilização por inalação e por contacto com a pele. Logo é
necessário o uso de material e postura adequada no manuseamento deste.
Os frasco, cuidadosamente enroscados após utilização, armazenam-‐se entre os 2ºC e 30ºC até à data
de validade em local seco.
Resultados esperados:
Candida albicans: crescimento em 3 dias;
E. coli: inibição em 3 dias.

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C) Meio Biggy (Nickerson) Agar
Extrato de levedura-‐
1,0 Pesar 47,0g por Litro
Citrato de amónio e de água destilada.
bismuto-‐5,0 Dissolver com ajuda 6,8±0,2
Não autoclavar!
Sulfito de sódio-‐3,0 do calor à ebulição, a 25ºC
Glucose-‐10,0 durante não mais de
Glicina-‐10,0 um minuto.
Agar-‐18,0

Meio selectivo e diferencial e usado na detecção, isolamento e identificação de Candida. A
diferenciação de Candida é baseada em padrões de crescimento e pigmentação das colônias isoladas.

Contém o sulfito de bismuto que atua como um agente inibidor para suprimir o crescimento
bacteriano, o qual permite o crescimento de colônias isoladas de Candida. A Candida reduz o sulfito de
bismuto, resultando na pigmentação das colônias e, em algumas espécies, ocorre pigmentação no meio
circundante, assim através de um processo de redução de substrato, produz sulfeto de bismuto que se
combinam para produzir colônias pigmentadas de castanho ou preto e zonas de precipitado escuro no
meio circundante em algumas espécies.
A dextrose e o extracto de levedura fornecem os nutrientes presentes na formulação.
A cor nem sempre é nítida e o congelamento pode levar a perda da difusão da coloração.
Species of candida colonial morphology:
-‐ C. albicans: Smooth circular or hemispherical brownblack colonies; may have slight mycelial fringe;
no color diffusion into surrounding medium; no metallic sheen.
-‐ C. tropicalis: Smooth, discrete, dark brown to black colonies (may have black-‐colored centers); slight
mycelial fringe; diffuse blackening of medium after 72 hours; metallic sheen.
-‐ C. krusei: Large, flat, wrinkled silvery brown-‐black colonies with brown peripheries; yellow to brown
halo diffusion into medium; metallic sheen.
-‐ C. keyfr: Medium size, flat, dark reddish-‐brown glistening colonies; may have slight

D) Meio Mycosel Agar ou Mycobiotic ou Sabouraud com Cloranfenicol e Cicloheximida
Farinha de soja
digerida por enzimas-‐
Pesar 36,0g por Litro
10,0
de água destilada. Autoclave 118ºC por 6,9±0,2
Dextrose-‐10,0
Dissolver com ajuda 15 minutos. a 25ºC
Agar-‐15,5
do calor.
Cicloheximida-‐0,04
Cloranfenicol-‐0,05

É um meio que para além de inibir bactérias também inibe fungos, logo é um meio muito seletivo
usado na identificação de fungos patogénicos.
O meio com cicloheximida pode ajudar à identificação uma vez que permite selecionar os resistentes a
esse composto.
Se houver sobreaquecimento poderá pôr em causa as propriedade seletivas do meio devido à sua
destruição.
Ocorre um excelente crescimento em: Candida albicans , Trichophyton quinum e Trichophyton
verrucosum.
Ocorre inibição em: Aspergillus niger, Candida tropicallis e Staphylococcus epidermidis.



E) Meio de CHROMagar Candida: Fornecido já distribuído em placa (comercial)
Este meio é seletivo e diferencial permite distinguir várias espécies de Candida e outras leveduras
como o Cryptococcus. Tem a particularidade de ter uma mistura de substratos cromogéneos, cada um
deles dirigido a um sistema enzimático especifico de cada espécie, assim cada espécie terá uma cor
típica diferente:
-‐ Candida albicans: verde;
-‐ Candida Glabrata: rosa/roxo;
-‐ Candida Topicalis: azul;
-‐ Candida Kruseii: rosa (distingue-‐se do C. Glabrata por ser rugoso e seco);
-‐ S. cerevosoae: roxo;
-‐ C. neoformams: creme sujo;
-‐ Trichosporon spp.: azul acinzentado.

Outros meios possíveis:
F) Sabouraud Agar sem antimicrobianos (pH 5,6);
G) Malt Extact Agar;
H) Corn Meal Agar;
I) Meio com Ácido Caféico.



A) FUNGOS LEVEDURIFORMES

Meios de cultura – Resultados e observação das colónias.

1) Amostra: Ultralevur

Levedura: Saccharomyces boulardii (substância ativa)

Ação: normalizador da flora intestinal e antidiarreico microrgânico;
Uso: situações em que existam alterações do ecossistema intestinal, designadamente diarreias a
rotavírus, em crianças ou em casos de infeção por Clostridium difficile

Características da levedura:
Saccharomyces boulardii é uma levedura probiótica não patogénica (excepto em
imunocomprometidos) produzida por um processo patenteado que lhe permite sobreviver ao ácido
gástrico e resistir à proteólise. A temperatura ideal para a sua proliferação é de cerca de 30 °C e tem
capacidade para atingir rapidamente uma concentração elevada no sistema gastrointestinal, que
representa um meio ideal de proliferação. Mantém-‐se aí numa concentração constante na sua forma
viável. Não é afectado de forma negativa nem inibido pelos antibióticos e não altera o equilíbrio da
flora intestinal.
A Saccharomyces boulardii atua como uma flora temporária para proteger o sistema intestinal e
mantê-‐lo em bom estado de funcionamento. Colabora com o organismo para restabelecer a microflora.
Nos intestinos, produz ácido láctico e vitaminas B, e desloca as estirpes de leveduras problemáticas.
Quando se interrompe a toma do suplemento, a sua eliminação faz-‐se em poucos dias.

2) Amostra: Terra

A terra provém de uma região com presença de fazes de pombos que pode estar na origem de uma
doença chamada criptococose e que é transmitida por fungos (Cryptococcus neoformans) encontrados
nas fezes secas do animal. Não é uma doença comum e é mais prevalente em indivíduos com sida e
imunodeprimidos. É uma doença oportunista que pode dar origem a infeções pulmonares
(hystoplasma capsultatum), meningites (Cryptococcus neoformans) e doenças infecciosas agudas
(salmonela).
A infecção por este agente dá-‐se, geralmente, pela via aérea, através da inalação de esporos desse
fungo, resultando numa infecção primária. Após a infecção, o C. neoformans pode espalhar-‐se através
da circulação sanguínea ou linfática.

Levedura: Cryptococcus neoformans

3) Amostra: Exsudado oral

Para a colheita deste tipo de exsudado é utilizada uma zaragatoa. O paciente não pode fazer higiene
oral nem comer (no próprio dia), usar antibióticos, antimicóticos ou desinfectantes.

Levedura:
• Fungos filamentosos:
• Aspergillus fumigatus;


• Geotrichum candidum;
• Leveduras:
• Candida albicans;
• Candida glabrata;
• Candida krusei;
• Candida tropicalis;
• Saccharomyces cerevisiae.

4) Amostra: Fiambre
Levedura: Candida Zeylanoides, Debaryomyces hansenii, Rhodoturula rubra, Candida intermedia,
Penicillium.

Características da levedura:
-‐ Debaryomyces hansenii é a forma sexuada da C. famata.



Provas de identificação de fungos leveduriformes.

1-‐ Diferentes meios de cultura

Nº Levedura Chromagar BIGGY Mycosel
1 C. albicans Verde Castanho-‐escuro R
2 C. tropicalis Azul Castanho-‐escuro R
3 C. glabrata Rosa Castanho amarelado S
4 C. dubliniensis Verde Castanho-‐escuro R
5 C. neoformans Creme sujo Castanho S
6 C. krusei Rosa Castanho S
7 S. cerevisiae Roxo escuro Castanho S
8 C. parapsilosis Rosa Castanho S
9 R. glutinis Não cresce Castanho tijolo R
10 Trichosporonspp. Azul/acinzentado castanho R

2-‐ Descrição das colónias

Número Levedura Descrição de colónias
1 Candida albicans Brancas, cremosas, lisas, regulares e convexas
2 Candida tropicalis Semelhante a C. albicans.
3 Candida glabrata Semelhante a C. albicans.
4 Candida dubliniensis Semelhante a C. albicans.
5 Cryptococcus neoformans Mucóides (cápsula, aderem ao agar; se
perderam cápsula por repicagens sucessivas,
incubá-‐las em meio de Malt agar para induzir a
mucosidade).
6 Candida krusei Colónias secas, rugosas, espalmadas e
franjadas, com pseudohifas
7 Saccharomyces cerevisiae Cremosas, lisas, regulares; tipicamente cónicas .
8 Candida parapsilosis Cremosas. Semelhante à Candida glabrata, mas
maiores.
9 Rhodotorula glutinis Pigmento alaranjado(às vezes a coloração não é
homogénea).
10 Trichosporon spp. Secas, penugentas, crenadas, rugosas( contem
hifas e pseudo hifas quase como micélio dos
bolores).

Nota: No chromagar as Candida krusei, C. glabrata e C.parapsilosis têm colónias de cor rosa. Temos de
ver além das cores as características das colónias (textura…), se forem secas é a krusei, se forem
cremosas e pequeninas é C. glabrata, se forrem cremosas mas grandes, é C. parapsilosis.
Na levedura 9 para a identificação do género basta o meio de SBD e PDA, porque este género tem uma
cor característica salmão.



Amostra das aulas laboratoriais Descrição
Mesa 1 -‐ Saccharomyces boulardii (de acordo com o 7). Não tem cápsula.
Mesa 2 -‐ Cryptococcus neoformans Tem uma cultura de aspeto mucóide, e isto
é um indicador de presença de cápsulas.
Tom rosado em Chromagar, tamanho
médio e muito redondinhas.
Mesa 3 -‐ Candida zeylanoides ou C. famata Relativamente pequena, ovoide

Mesa 4 -‐ Candida albicans ou C. dubliniensis Cremosas e bem definidas. No meio de
biggy apresentam-‐se com cor castanha e
em chromagar verde. Cresceu em mycosel.

Nota: Teste a fresco com tinta da china para verificar a presença de cápsula. Esta prova só faz
sentido quando a cultura apresenta um aspeto mucóide. Só C. neoformans, na mesa 2 deram positivo,
no entanto há outras que podem ter cápsula, por isso temos de fazer outras provas para confirmar se a
amostra da mesa 2 é mesmo Cryptococcus neoformans, como a prova da urease 4 horas e fenolaxidase.

3-‐ Descrição microscópica das leveduras

Número Levedura Descrição de colónias
1 Candida albicans Pequenas, oval (limão), gemulação multilateral,
cremosas e definidas; sem hifas/pseudo (mas
atenção! Tem esta forma porque tínhamos uma
cultura jovem!), artroconídeos.
2 Candida tropicalis Média, oval, gemulação unipolar, cremosas e
bem definidas Semelhantes à Candida albicans.
3 Candida glabrata Oval, gemulação unipolar, sem as outras
estruturas; bastante pequenas! (relativamente
a 7).
4 Candida dubliniensis Mais ovais que a 1, mas Semelhante C. albicans.
5 Cryptococcus neoformans Pequena, oval, unipolar, com cápsula. Muito
redondas. Fizemos o teste com Fenoloxidase
devido à presença de cápsula.
6 Candida krusei Colónias secas, rugosas, espalmadas e
franjadas, com pseudohifas.
7 Saccharomyces cerevisiae Oval/redonda; gemulação unipolar(multi);
grande (relativamente a 3).
8 Candida parapsilosis Cremosas. Semelhante à Candida glabrata, mas
maiores.
9 Rhodotorula glutinis Pequena, redonda/ oval, unipolar, gemulação
lateral.
10 Trichosporon spp. Média, oval, gemulação uni/bipolar com
pseudohifas e artroconídeos. Com filamentos
rugosos.



4-‐ Prova dos ascósporos

Usa-‐se o meio de Ascospor agar ou meio de acetato de potássio. Neste meio
podemos identificar estruturas que são os ascos e que produzem ascósporos,
resultantes de uma reprodução sexuada; é uma estrutura típica dos fungos
ascomicéticos como a S. Cerevisiae. É semeado por estria à superfície e tem de ter
um controlo positivo também.
Por tudo isto, este teste leva à identificação presuntiva de leveduras ascomicética.
O meio tem acetato de potássio que induz a formação destas estruturas além de
baixo teor de açúcar (1 g/L) que inibe as formas vegetativas e a levedura entra
em ciclo sexuado formando os ascos. Estes ascos podem variar de aspecto dentro
do género mas na S. Cerevisiae, eles veem-‐se em trevo (são entre 1 a 4 e geralmente vê-‐se em trevo
porque um deles está encoberto) porém pode haver espécies que têm até 8.
Quanto à técnica, temos 2 tubos – um para o controlo positivo e outro que vai levar a nossa amostra.
O meio é em rampa e vai ser semeado por estria à superfície. Incubar a 22º a 25ºdurante 3 dias e
vamos observar.
As estruturas são parecidas com as que estão indicadas pela seta na imagem. Ter o cuidado de
esterilizar a ansa entre a repicagem de cada colónia; se o controlo positivo não der positivo teremos de
reincubar; tem de ser positivo para podermos fazer a outra leitura.
A estrutura em trevo pode ser evidenciada por uma coloração especial (Kinyoun) que é adaptada da de
Ziehl Nielsen:

Interpretação:
-‐ Teste positivo: observam-‐se ascos com ascósporos e blastósporos. Após coloração observam-‐se
ascósporos corados de vermelho, ascos e blastósporos corados de azul.
-‐ Teste negativo: presença de blastósporos com ausência de ascos e ascósporos. Após coloração
observam-‐se apenas blastósporos corados de azul
Notas: Na mesa 2 (TERRA) não fazia sentidos efetuar esta prova, pois esta levedura não é ascomicética,
mas sim basidiomicética. Na mesa 3, embora se saiba que as Candida sejam ascomicéticas, ainda não
foram encontradas nesta forma, por isso esta prova aqui não leva a nenhuma conclusão.

5-‐ Prova dos Clamidósporos

Em Corn Meal agar (tween 80), a Candida albicans forma esporos de
resistência (característica que não é exclusiva desta levedura). É um meio
pobre (milho), com baixo teor de glucose e baixa tensão de O2 que induz
portanto a formação dos clamidósporos.
Esquema que está ao lado:
- no quandrante 1 vamos usar um controlo positivo que temos
sempre que ler antes de ler a prova na amostra; se controlo positivo der
negativo, deve voltar-‐se a incubar ou tomar outro tipo de precauções,
portanto é essencial que asseguremos de que o controlo positivo gera
clamidósporos para podermos prosseguir com a leitura da prova. Dividir na tampa (com
aqueles risquinhos todos e escrever o nº. na tampa. A sementeira faz-‐se depois de esterilizar a
ansa: vai-‐se buscar cultura e semeia-‐se num dos quadrantes com uma estria curta à superfície,
colocamos a ansa na lateral e cortamos o meio 3 vezes até tocar no plástico.


Para reduzirmos ainda mais o contacto com o O2 passamos uma lamela à chama, arrefecemos e
coloca por cima.
-‐ Os outros 3 quadrantes levam as amostras de todas as bancadas e o procedimento é todo igual.
No final a placa é selada com parafilme.
Nota: ao baixarmos a tensão de O2 e com o Tween 80 há a indução da produção pelo controlo
positivo (C. albicans) de hifas e pseudohifas e também dos clamidósporos, que se formam pelo
espessamento da parede celular das leveduras, quer a nível terminal ou intercalar; o meio pobre é
de propósito para induzir).

Interpretação (Observa-‐se a 10x):
-‐ Teste positivo: para C. albicans – observam-‐se Clamidósporos
(verde), hifas e pseudohifas e balstoconídeos (seta)
-‐ Teste negativo: para C. albicans ausência de clamidósporos.
Presença de blastósporos associados ou não a hifas e pseudohifas.

6-‐ Prova da filamentação/ Tubo germinativo

Esta prova permite fazer uma identificação presuntiva de C.
albicans. Acontece que a levedura incubada em soro (humano/ bovino fetal) que é um meio específico
e a 37ºC (porque ela resiste à temperatura) durante 2 horas e meia vai formar tubos germinativos que
é o início de uma hifa verdadeira e que não apresenta contrição no seu ponto de origem.
Na aula tínhamos 3 eppendorfs: Um para suspender a amostra, outro o controlo positivo e outro o
negativo.
Para esta prova há alguns cuidados a ter:
- Não partir para o teste com uma cultura envelhecida, tem de ser jovem senão vamos passar
para o soro hifas verdadeiras e vão dar um falso positivo (colónias têm de ser cremosas e não
penugentas); interessa só levar formas leveduriformes.
- Nunca fazer uma suspensão muito densa porque se levar muita cultura é reduzido o nº. de
células que forma o tubo e dificulta, a leitura, portanto, criar uma suspensão pouco densa
- Cuidado com o tempo de incubação pois não deve ser mais de 2 /2h30 (porque outras espécies
ao fim de 4 horas também formam tubos germinativos e podemos dar um falso positivo).
- O último cuidado é usar sempre um controlo positivo – aqui é mais
importante porque temos soros e pode gerar-‐se com facilidade um falso
negativo.
A execução é parecida com o teste dos ascósporos: tiramos uma gota de
cada e colocamos na mesma lâmina; vemos primeiro o controlo positivo e
só depois deste dar bem, passamos para a nossa amostra. Um resultado
positivo é bem evidente aparecendo tubos com significativa frequência;
nos casos em que há poucos, podem aparecer pseudotubos germinativos
(gémula alongada) que têm uma constrição no ponto de crescimento nem sempre bem evidente.

Interpretação:
-‐ Teste positivo – observam-‐se tubos germinativos (projeções em tubo,
com paredes paralelas e sem constrições na origem, a partir da célula
mãe).
-‐ Teste negativo – apenas são observadas formas leveduriformes ou
pseudo tubo germinativo.


7-‐ Prova da Urease
Trata-‐se de uma prova bioquímica usada na identificação de leveduras dos géneros Cryptococcus,
Rhodotorula e Trichosporos incubadas a 22º-‐25ºC. O Cryptococcus neoformans é um exemplo de
levedura capaz de produzir urease após 4h. Pelo contrário, outras leveduras, como a maioria das
espécies do género Candida, não produzem esta enzima.

Interpretação
-‐ Teste Positivo: aparecimento de uma cor rosa forte, devida à alcalinização e do indicador vermelho
de fenol que devido ao amoníaco formado da hidrólise da ureia muda para esta cor. A Rhodotorula
glutinis dá positivo em 24h e o Trichosporon spp. Ao fim de 72h.
-‐Teste negativo: Aparecimento de cor amarela, devida à acidificação.

8-‐ Prova da sensibilidade à Cicloheximida
O teste em termos de execução é semelhante ao anterior tendo como diferenças:
-‐ os dois tubos são incubados a 22-‐24ºC;
-‐ os meios serão diferentes havendo um meio de Sabouraud que servirá de controlo positivo e o outro
o meio de Mycobiotic agar que vai ser o selectivo e que contém a cicloheximida, temos de ter o mesmo
cuidado do padrão de estriamento e inóculo.
O controlo positivo se não crescer pode querer dizer que temos uma cultura morta, não é viável ter
apenas o meio selectivo e se não crescer referimos apenas que é sensível.

Interpretação:
-‐ Teste positivo: crescimento a 25ºC e a 37 ºC
-‐ Teste negativo: crescimento a 25ºC e ausência de crescimento a 37 ºC.

9-‐ Prova da Fenoloxidase
Contém ácido cafeico em que se houver a presença da enzima fenoloxidase haverá
aparecimento no tubo em rampa, uma coloração castanha que se deve à
transformação do ácido cafeico em compostos melânicos.

Interpretação:
-‐ Teste positivo – crescimento com cor castanha.
-‐ Teste negativo – crescimento sem cor castanha (bege).

10-‐ Sementeira de um sistema de identificação API32C
É um sistema padronizado para identificação das leveduras pelas suas propriedades bioquímicos e
fisiológicos, com 32 testes de assimilação miniaturizados e uma base de dados. Contém 32 cápsulas
que contêm cada um substrato carbonado sob forma desidratada. A levedura a analisar é colocada em
suspensão num meio semi-‐sólido. Após 24h-‐48h de incubação, o crescimento em cada cúpula lê-‐se
com os aparelhos ATB Expression ou mini API, ou visualmente. A identificação é obtida com um
sistema de identificação.
As culturas têm de estar puras e jovens para serem metabolicamente ativas. E estarem num meio
seletivo. A incubação é feita a 29º ± 2ºC durante 24h-‐48h e a identificação não válida antes de 48h de
incubação.
É necessário ter cuidado quando se vai tirar a cultura do meio de sabouroud, uma vez que este meio
contém glucose podendo dar um falso positivo, já que o nosso controlo positivo é a glucose.



11-‐ Sementeira de um sistema de identificação API Candida
É um sistema de identificação de espécies que aparecem mais em clínicas, padronizado, destinado à
identificação em 18-‐24h das leveduras mais frequentemente encontradas em microbiologia
clínica. A galeria de API candida engloba 10 tubos que contém substratos desidratados, para
efetuar 12 testes de identificação (acidificação dos açúcares ou reações enzimáticas). As
reações traduzem-‐se por mudanças de cor espontâneas – prova colorimétrica. As galerias
conservam-‐se entre 2º-‐8ºC e meios em 2º-‐30ºC dentro de embalagem até à data de validado.
Tem um indicador de pH devido à presença de açucares. . Como estamos á procura de
leveduras patogénicas incubamos a 37º de 18 a 24h. Se ultrapassar a concentração, adiciona-‐
se soro fisiológico estéril. Cobrir a entrada dos pocinhos com parafina líquida.
Este teste só identifica as espécies Candida. A leitura é feita pelo + e – que vão dar um numero com 4
dígitos.

Também é necessário ter o mesmo cuidado que o API 32C, no entanto, nesta prova devemos ter uma
cultura mais densa, já que quanto mais densa, mais atividade irá ter.

12-‐ Sementeira de um sistema de identificação API Fungiview
É uma prova utilizada na clínica, também colorimétrica pela variação do pH, mas trata-‐se de um
sistema misto. Tem antifúngicos (usados topicamente), mas está desatualizado.
Tem dois meios diferentes de cultura:
- R1: faz parte da identificação;
- R2: faz testes de susceptibilidade.
No R1 faz-‐se a comparação da turvação com tubo que já vem no kit e verifica-‐se se têm a mesma
turvação. Pegamos em 100ul de R1 para R2 e a incubação é feita a 37ºC entre 24h-‐72h.
O controlo aqui tanto pode ser amarelo como cor-‐de-‐rosa, porque como é um método colorimétrico
dado pela variação do pH, se der amarelo quer dizer que cresceu e acidificou o meio, se ficar cor-‐de-‐
rosa, quer dizer que produz a urease que alcaliniza o meio. Se não apresentar qualquer cor, não houve
crescimento.
O poço controlo também nos indica a presença ou não de urease.



Resultados

FIAMBRE TERRA EXSUDADO ORAL ULTRALEVUR

C. Zeylanoides ou Cryptococcus neoformans C.albicans ou Saccharomyces
C. famata C.dubliniensis boulardii
Meio de Colónias Rosa violeta ou creme a Colónias verdes Colónias roxas
Chromagar Brancas branco
Prova dos Negativo Negativo Negativo Negativo
ascósporos
Prova dos Negativo Negativo Positivo Negativo
Clamidósporos
Prova do Tubo Negativo Negativo Positivo Negativo
germinativo
Prova da Urease Negativo Positivo Negativo Negativo
Prova da Sensível Sensível Resistente Sensível
sensibilidade à
Cicloheximida
Prova da Negativo Positivo Negativo Negativo
Fenoloxidase
API32C Perfil inaceitável Cryptococcus neoformans Candida albicans Saccharomyces
(reisolar ou cerevisiae
reincubar)
API Candida C.famata Cryptococcus neoformans Candida albicans/ Saccharomyces
Trichosporon spp. Candida cerevisiae
dubliniensis
API Fungiview Resistente a 3 Cryptococcus Candida albicans/ Saccharomyces spp.
AB Trichosporon spp. Candida
Resultado Rhodotorula dubliniensi
inconclusivo
Temperatura a Sim Sim Sim Sim
25º C
Temperatura a Não Sim Sim Sim
37ºC



B) FUNGOS FILAMENTOSOS

Meios de cultura – Resultados e observação das colónias.

1)Amostra: TERRA
Fungos: agentes etiológicos das dermatofitoses – Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton

2) Amostra: AR
Fungos: Aspergillus spp. e Fungos Negros (Demáceos) como o: Alternaria spp., Cladosporium
spp., Drechslera spp.

3) Amostra: QUEIJO CAMEMBERT E ROQUEFORT
Fungos: Penicillium roqueforti e Penicillium camemberti

Características:
1) Queijo Camembert: Os fungos são colocados na superfície onde obtém o oxigénio
necessário à sua sobrevivência.
2) Queijo Roquefort: Os fungos são injetados no interior do queijo. Este queijo tem um aspeto
esburacado devido à necessidade dos fungos obterem oxigénio.
Nota: No queijo camembert a colonia observada pode corresponder ao fungo camembert ou
ao gothricum candidum (fungo usado no controlo durante a produção).

4) Amostra: MORANGOS
Fungos: zigomicetos -‐ Mucor spp. (M. hiemalis, M. piriformis, M. mucedo) e Rhizopus spp. (R.
stolonifer)

Características:
Rep. assexuada -‐ Produção de esporangiósporos (esporos endógenos)
Rep. sexuada -‐ Produção de zigósporos

Notas das aulas:
• Isola-‐se os bolores em meio de SBD (apenas para isolar, porque para os bolores usam-‐
se meios em rampa) ! repicagem para rampa de SBD ! analise da macro e
microscopia

• Erros cometidos na avaliação:
Técnica asséptica: se usámos água estéril ou soro estéril temos de utilizar material estéril e
com técnica asséptica adequada.

• Preparações são agora sempre feitas com um líquido de montagem (azul de lactofenol)
que seca menos rápido, já que vamos precisar de mais tempo para observar. O azul
serve para observar melhor as estruturas que não tenham coloração ou sejam difíceis
de observar, o fenol é o antisséptico. Utiliza-‐se as objetivas de 10x e 40x. As estruturas


mais jovens coram mais facilmente com o azul enquanto as mais velhas já têm cor
própria.

• Diferenciação das hifas:
-‐ Agregados polihifais:
. Esclerócitos/excloródio – hifas micélio vegetativo ! têm funções de proteção;
. Sinenas – reprodução assexuada ! agregados de hifas longitudinais;
. Picnídios – reprodução assexuada ! hifas formam um ninho;
. Peritécios – reprodução sexuada (ascósporos).
-‐ Monohifal:
. Rizóides;
. Micélio em raquete (não se conhece função);
. Hifas candelabro (não se conhece função).

• Técnica da fita cola, não serve para zigomicetos, porque não leva agar.

• Observações macroscópicas
-‐ Devemos descrever o relevo: centro elevado ou depressivo, sulcos radiais.
-‐ Pigmento: cor que apresenta, se a cor difunde ou não para o meio de cultura.
-‐ Colónias de fungos negros – micélio septado melanizado, o que o define é o verso negro! Pois
há colónias que têm esporos negros, mas não são fungos negros (A.niger).
-‐ Quando estamos a comparar o que estamos a observar com o atlas temos de ter em atenção
se as condições de crescimento são as mesmas.



Fungos filamentosos dados

A) Zygomycetes

A classe Zygomycetes compreende fungos filamentosos
hialinos com hifas geralmente largas e cenocíticas (não-‐
septadas) e ramificações comumente em ângulos de 90°.
Septos somente podem ser observados nos esporangióforos,
em secções próximas aos esporângios ou em hifas
vegetativas de culturas maduras. Os Zygomycetes são assim
chamados porque, com a reprodução sexuada, formam
esporos reprodutivos denominados zigósporos. Os
zigósporos desenvolvem-‐se dentro de estruturas com parede
espessa; chamadas zigosporângios. A reprodução assexuada ocorre através da produção de
esporangiosporos contidos em estruturas saculiformes denominadas esporângios. Diferente
do processo de conidiogênese, onde elementos da hifa são convertidos em conídios, a
formação de esporangiosporos ocorre como resultado da clivagem do protoplasma contido no
esporângio. O micélio septado melanizado é o que o define é o verso negro! Pois há colónias
que têm esporos negros, mas não são fungos negros (A.niger)
Dentro desta temos os géneros Mucor, Rhizopus, Absidia e Syncephalastrum

1) Rhizopus spp



Rhizopus stolonifer

Rhizopus oryzae

Macromorfologia da colónia: Assemelha-‐se ao “algodão-‐doce” e as colônias são brancas e
tornam-‐se cinzas ou marromamareladas com o tempo. Reverso branco.

Micromorfologia: Hifas asseptadas. Rizóides estão na base do dos esporangióforos, que
podem estar em grupo ou ser apenas um emergir dos rizóides. Os esporangióforos são longos
e no seu ápice forma-‐se um esporângio contendo esporangiosporos e uma columela em forma
de guarda chuva após ocorrer desintegração do esporângio. Os esporos são rugosos ou
estriados Este género diferencia-‐se do Mucor pela presença de estolões, rizóides e
esporangióforos não ramificados.

2) Mucor

Mucor plumbeus

Mucor racemosus

Macromorfologia da colónia: Desenvolve-‐se rapidamente na superfície do agar assemelhando
ao “algodão-‐doce”, inicialmente brancas e tornando-‐se cinzas ou marrom-‐acinzentadas com o
tempo. Reverso branco.

Micromorfologia: Hifas largas e não septadas. Esporangióforos longos e frequentemente
ramificados que sustentam esporângios cheios de esporangiosporos. Columela presente. A
parede do esporangióforo rompe-‐se exteriorizando. É o único dos zigomicetos que temos de
identificar que tem colarinho e que o esporângio acaba dentro da bola.


3) Absidia

Macromorfologia da colónia: Meio de SAB: esbranquiçado, fica cheio, até parece que não
cresceu, micélio muito invasivo

Micromorfologia: Apófise, columela (forma de losango) esporângio em forma de
funil; esporângios abertos e fechados;
-‐ Abre em forma de funil para a columela;
-‐ Esporangióforo ramificado abre em funil;
-‐ Micélio não septado;
-‐ Esporângio alongado;
-‐ Rizóides discretos (irregulares).
A Absidia destaca-‐se aqui por ter além de uma columela em forma triangular e com colarinho,
uma dilatação do esporangióforo em forma de cálice e que se denomina de apófise
Nota: A Absídia só dá para distinguir pela abertura em funil da apófise para o esporângio.

B) Hialinos Filamentosos de Hifas Septadas

A hialo-‐hifomicose é uma infecção causada por fungos hialinos, de hifa septada, pertencentes
às classes Ascomycetes, Coelomycetes, Hyphomycetes, e Basidiomycetes. São fungos
filamentosos hialinos, septados, não-‐formadores de estruturas específicas e que, até então,
não eram patogénicos clássicos. Estes, por sua vez, são contaminantes habituais. Exibem hifas
hialinas, septadas à microscopia óptica.
A maioria destes fungos são saprófitas habituais do solo, parasitas de vegetais e
decompositores de materiais orgânicos. Em grande parte, estes fungos são oportunistas, com
limitado poder patogénico. A infecção é dependente do estado imunológico (leucémicos,
diabéticos, aidéticos, transplantados, etc.), das condições de trabalho e modo de vida de cada
indivíduo



1) Aspergillus

Macromorfologia da colónia: No início a superfície é branca e em seguida diversos tons de
verde, amarelo, laranja, marrom ou preto, dependendo da espécie. Textura aveludada a
algodonosa. Reverso usualmente branco, amarelo-‐ouro ou marrom.

Micromorfologia: Hifas septadas; conidióforos não ramificados e célula podal de base. O
conidióforo é alargado no topo, formando uma vesícula volumosa que é coberta por fiálides.
Das fiálides partem cadeias de conídios de formação basipétala. Apresenta então um
conidióforo a partir da célula pé e este termina numa vesícula globosa onde assentam
as fiálides ou métulas conforme a espécie é unisseriada ou bisseriada respetivamente, ou seja,
se é uni tem apenas uma camada de células (fiálides) e se é bisseriada tem uma camada de
células (métulas) logo após a vesícula. Depois é possível ver ligadas às fiálides, cadeias
de fialoconídeos e que dão o típico aspecto aspergilar e não são ramificados.
Dentro deste género temo 3 especies a considerar: A.fumigatus, niger e flavus

1.1) Aspergillus flavus
Macromorfologia da colónia possui textura pulverulenta,
micélio branco, com esporulação cuja a tonalidade varia de
verde oliva à amarelado. Dependendo do meio de cultura
pode ou não haver coloração no reverso da placa, sendo
radiado em qualquer condição de cultivo em meio sólido.
Colônia filamentosa granulosa (representado pelos
conidióforos), cor verde e reverso de incolor a castanho

Micromorfologia: pode apresenta hifas hialinas, estirpes e esporos rugosos, vesícula globulosa
ou piriforme, esporos globulosos de cor verde oliva, pode ser uniseriado, apresentando


métulas de onde originam se os esporos ou podem ser bisseriados, possuindo métulas e
fiálides. Os conidióforos originam se de uma estrutura chamada célula pé em que abre
diretamente na vesícula. As fiálides aparecem em todas as direções

1.2) Aspergillus fumigatus
Fiálides só ocupam 2/3 da parte terminal da vesícula.
Longo e filamentoso com conidióforos curtos de parede lisa,
incolores e ligeiramente verdes em que aparece dilatado. Conídios
verdes escuros, unicelulares e redondos. É uniseriado.
Colónia filamentosa finamente granulosa, cor cinza escuro e
reverso de incolor a castanho

1.3) Aspergillus niger
As fiálides tem disposição radial e um aspecto de sol típico
(coloração acastanhada). Já o conidióforo é como o flavus que abre
diretamente na vesícula, mas este já é longo ao contrário do flavus
que é curto.
Colónia filamentosa granulosa preta ou castanho escuro (lembra
borra de café) e reverso de incolor a castanho. É bisseriado.

A. flavus
A.niger
A. fumigatus



2) Penicillium

Macromorfologia da colónia: Superfície inicialmente branca, em seguida de coloração verde-‐
azulada, podendo apresentar bordos brancos. Diferentes espécies apresentam diferentes
colorações e texturas. Reverso comumente branco, vermelho ou marrom.

Micromorfologia: Apresentam hifas septadas com conidióforos ramificados (ou não) que
possuem estruturas secundárias conhecidas como métulas. As métulas suportam fiálides que
apoiam cadeias não ramificadas de conídios arredondados de formação basipétala. O
conidióforo pode ser, uni, bi, ou triverticilados.

3) Fusarium

Macromorfologia da colónia: Inicialmente branca, logo desenvolvem coloração rosa ou violeta.
F. solani é o único que se torna verde-‐azulado ou marrom azulado onde se aglomeram células
conidiogénicas. Reverso geralmente claro ou colorido de acordo com cada espécie



Micromorfologia: Hifas septadas. Há dois tipos de formação de conídios. Macroconídios em
forma de canoa (foice, meia-‐lua) multisseptados; e microconídios, pequenos e ovais, podendo
apresentar um septo. Conidiogénese enteroblastica fíalidica. Fiálides em forma de garrafa.
Apresenta micro e macroconídios em forma de banana. Tem cor característica vermelha, mas
macroconídios aparecem corados de azul (quando se usa o azul lactofenol)

4) Geotrichum

Macromorfologia da colónia: Colónias jovens são brancas, húmidas, semelhantes a de fungos
leveduriformes. Logo surge a filamentação na periferia e algumas espécies desenvolvem
micélio aéreo branco algodonoso.

Micromorfologia: Hifa septada verdadeira que segmenta em artroconídios cilíndricos que
variam em comprimento. Alguns podem se tornar arredondados. A formação consecutiva de
artroconídios (não alternando com células vazias) serve para diferenciá-‐lo do Coccidioides
immitis. Tem conidiogénese do tipo taloártrico e que é holoártrica gerando-‐se artroconídeos,
que provêm da fragmentação de uma zona terminal das hifas

C) Dermatófitos

Pertencem ao grupo dos dermatófitos os fungos classificados em três gêneros:
Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton. São filamentosos, hialinos, septados, algumas
vezes artroconidiados, queratinofílicos (capazes de digerir e obter nutrientes da queratina,
uma proteína insolúvel que é o principal componente da pele, cabelos, unhas e penas),
passíveis de colonizar e causar lesões clínicas em pelos e/ou extrato córneo de homens e
animais.
Podem ser divididos em três grandes grupos, em relação ao seu habitat, sendo classificados
como geofílicos, zoofílicos e antropofílicos.



1) Microsporum

Macromorfologia da colónia:
-‐ M. canis (Zoofílico): Coloração amarela, superfície penujenta radiada. Reverso
amarelocanário ao marrom.
-‐ M. gypseum (Geofílico): Coloração marrom clara (canelada), superfície granulosa. Reverso
geralmente castanho.

Micromorfologia: Hifas septadas e são observados poucos microconídios. Macroconídios são
espiculados em formato de naveta (ou fuso), e eles que diferenciam entre as duas principias
espécies. Macroconídio de parede celular espessa e contendo geralmente mais de seis
compartimentos celulares caracterizam M. canis. Macroconídio de parede celular fina e
contendo geralmente menos de seis compartimentos celulares caracterizam M. gypseum.

D) Demáceos

São fungos que apresentam coloração escura (quando comparados aos fungos hialinos)
devido à pigmentação (coloração castanha escura) devido à presença da melanina na parede
celular, e apresentam características comuns como serem filamentosos, e possuírem hifas
septadas. São também considerados contaminantes e patogénicos oportunistas.
A cromomicose é uma infecção micótica crônica, de evolução lenta, que acomete a pele e o
tecido celular subcutâneo do homem e dos animais. A maioria das lesões é causada por fungos
da família Dematiaceae, que vivem no solo ou vegetais em decomposição. Normalmente, as
lesões localizam-‐se nos membros inferiores, principalmente nos pés e pernas. Os membros
superiores são afetados em menor proporção, e outros locais, como tronco, pescoço, face,
nádegas, são raramente afetados. Vale salientar o acometimento maior sobre indivíduos do
sexo masculino.



1) Alternaria

Macromorfologia da colónia: Início de coloração branca a cinza de aspecto lanoso, com o
tempo torna-‐se de verde escura a preta ou marrom de bordas claras. Reverso preto.

Micromorfologia: Hifas septadas e escuras. Conidióforos são septados e com tamanhos
diferentes e às vezes possuem aparência em “zigue-‐zague”. Os conídios são largos, marrons, e
apresentam septos transversais e longitudinais, catenulados (formação em cadeia) de
formação acropétala. Eles são usualmente mais redondos próximos ao conidióforo e mais
finos no ápice.

2) Cladosporium

Macromorfologia da colónia: Superfície com coloração marrom-‐esverdeada ou preta de

aspecto aveludado, tornando-‐se levemente elevada e pregueada. Reverso preto.

Micromorfologia: Hifas septadas e escuras, conidióforos ramificados, variando em tamanho e
usualmente produzindo duas ou mais cadeias de conídios. Os conídios são de formato circular
a oval gerando cadeias ramificadas de formação acropétala. As células disjuntoras são
levemente largas e às vezes septadas. Tem conidiogénese holoblástica acropta.



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