AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ASOCIADOS AL CICLO DEL NITROGENO

INTRODUCCION
Entre los microorganismos fijadores de nitrógeno encontramos una amplia diversidad de procariotes que están
especializados en realizar esta función biológica, la segunda más importante sobre el planeta tierra.
Para que una bacteria sea capaz de realizar fijación de nitrógeno, debe poseer la información genética para sintetizar la
nitrigenasa, enzima que permite la ruptura del triple enlace entre los dos átomos de nitrógenos hasta reducirlos en
amonio. Entre los mecanismos que utilizan estas bacterias están los de entablar una relación simbiótica y una fijación
libre de nitrógeno.
Rhizobium es una bacteria que tiene la propiedad de realizar una asociación mutualistasimbiótica con plantas
leguminosas, en la cual dos organismos se benefician mutuamente. Rhizobium al estar relacionado con las células
vegetales de raíz, lleva a cabo la transformación de nitrógeno atmosférico en forma asimilable para la planta, gracias a la
acción de la nitrogenasa.
Azotobacter sp producen Giberelinas (GAS) que es el principal responsable de la elongación del tallo, así como la
producción de numerosas enzimas útiles en la germinación. Fuera de eso son fijadores libres de nitrógeno para el suelo.

OBJETIVO
Objetivo general
Aislar y seleccionar microorganismos utilizados como biofertilizantes a partir de muestras de suelo.

Objetivos especificos
- Recuperar Rhizobium sp a partir de nódulos de plantas de leguminosas en agar manitol levadura.
- Aislar y seleccionar bacterias del género Azotobacter sp mediante la técnica gránulos de suelo sobre agar Ashby.

REACTIVO Y MEDIOS DE CULTIVO

 Nódulos de leguminosas
 Cuchillas finas
 Pinzas de disección
 Lamina portaobjetos estéril
 Tubo con solución de alcohol etílico al 70%
 Tubo con solución de hipoclorito al 0,5%
 Tubo con agua destilada estéril
 Agar manitol levadura 2 cajas por grupo.
 Agar Ashby 2 por grupo
 Hisopos de algodón mango de madera
 Trozos de servilleta estériles (para retirar exceso de agua al final de la desinfección)

Agar Ahsby: Manitol 2 g/L, Sulfato de magnesio heptahidratados0,2 g/l, Fosfato de potasio di básico 0,2g/l, Cloruro de
calcio 0,2 g/l, carbonato de calcio 0,2g/l, Sulfato de hierro trazas, Agar agar 16g /L.

Agar Manitol Levadura ( AML): Manitol 5g/L, Cloruro de sodio 0,5g/L, Extracto de levadura 0,5g/L, Sulfato de magnesio
0,2g/L, Fosfato dibasico de potasio 0,5g/L, agar agar 17g/L. Rojo congo 0,1% de una solución 1:500.

EQUIPOS
 Microscopio
 Incubadora

MICROORGANISMOS A EVALUAR: Microorganismos aislados de nódulos de leguminosas y gránulos de suelo

METODOLOGIA

Aislamiento de Rhizobium sp.

 Tome la raíz de la planta, observe la apariencia y la localización de los nódulos
 Seleccione varios nódulos jóvenes y lávelos con agua corriente para eliminar la mayor cantidad de partículas de
suelo adheridas a las raíces.
 Con ayuda de las pinzas y la cuchilla , corte los nódulos y llévelos a un tubo con hipoclorito al 0,5% agite durante
2 minutos
 Sáquelos del alcohol y páselos por la solución de alcohol etílico al 70%, agite durante 5 minutos.
 Repita la misma acción pero con agua destilada estéril.
 Coloque los nódulos sobre una lámina portaobjetos y macérelos cerca del mechero hasta obtener un material
líquido.
 Con ayuda de un asa redonda tome una muestra y realice un frotis en otra lámina portaobjetos para coloración
de Gram.
 Observe la presencia de células alargadas y en forma de Y
 Paralelamente tome dos cajas de agar Manitol realice una siembra por aislamiento de la preparación anterior.
Incube 28°C durante 48h.
 Una vez transcurrido el tiempo de incubación realice una coloración de Gram y describa a nivel macro y
microscópico las colonias.
 Las colonias de Rhizobium sp en este medio se observan convexas, transparentes. Su aspecto es de gotas de
agua.

Aislamiento de Azotobacter sp.

 Tome la muestra de suelo y con ayuda de unas pinzas tome granulos de suelo y colóquelos sobre las cajas de
agar Ashby.

Técnica de los gránulos de suelo

 Cierre las cajas y llévelas a incubar a 28°C durante 8 días. Evidencie la presencia de exopolisacáridos.

RESULTADOS

Técnica de gránulos de suelos

Gránulos sembrados Gránulos positivos Características microscópicas

Porcentaje de recuperación

Realice una coloración de Gram a las colonias características de Azotobacter sp y de Rhizobium sp.

TALLER ANEXO
¿ Azotobacter sp como realiza la fijación biológica de nitrógeno?
¿Cómo ocurre la interacción simbiótica entre la planta y Rhizobium sp?.
¿Por qué el medio Manitol y Ashby no tienen fuente de nitrógeno?
Explique que son las Auxinas, Giberelinas y el Acido Indol Acético. Y explique para que sirve cada una.