SOLEMNE 2

PKU-TSH (Clase 6)

*Leer caso

FENILQUETONURIA

Pesquisa del recién nacido: Programa en chile desde 1992, en donde a todo niño se le toma una muestra
para la pesquisa de pku e hipotiroidismo congénito.
Las matronas son las encargadas de tomar la muestra.

Si el recién nacido no es de termino la muestra de pku-tsh se recolecta a los 7 días y luego se repite a los
15 días porque en el caso de los pku-tsh y niño prematuro puede salir un falso negativo.

 Error innato del metabolismo: Desordenes genéticos en donde el organismo no es capaz de

metabolizar todos los componentes de los alimentos. Los niños que tienen esta enfermedad
genética no son capaces de descomponer los alimentos y no utilizan ese metabolito para su
alimentación. Son causadas por mutaciones en las encimas involucradas en las vías metabolicas.
*Las proteínas se degradan en aminoácidos, estos aminoácidos tienen que seguir una via
matabolica para luego ser absorbidos y en estos casos donde hay un error innato del
metabolismo, algunos de ellos no es posible que sigan su via metabolica, ella se detiene y además
se acumulan productos que son dañinos para el organismo.
El diagnostico se realiza porque se presentan alteraciones clínicas importantes o porque se
detecta una cantidad anormal de aminoácidos en sangre u orina en el recién nacido.
Garrod (1902-1908) describió los errores innatos del metabolismo. Utilizando el concepto de que
un gen codifica para una enzima y si hay una alteración de ese gen no vamos a tener la presencia
de la enzima o no será funcional. Si ese gen no está funcional y si la enzima no está presente no se
tendrá el producto que se espera y el metabolito se va a acumular (ver diapo 4). El cuerpo es
capaz de compensar esto, pero parcialmente.

La fenilalanina se degrada a tirosina, pero si no esta la enzima fenilalanina hidroxilasa esta via
metabolica se interrumpe y se comienza a acumular acido fenilpiruvico. Este acido es muy
neurotóxico y es el responsable de la discapacidad intelectual que presentaría un niño con esta
mutacion y que no es tratado inmediatamente en el periodo de recién nacido. (ESTO PRODUCE LA
FENILQUETONURIA)
Existe un tratamiento nutricional que consiste en no introducir el aminoácido que no es capaz de
metabolizar el paciente.

HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO
Su frecuencia es de 1 por cada 3.500 nacimientos. Se produce un defecto enzimático, no se tienen
hormonas tiroideas funcionales y los efectos son de retardo del desarrollo psicomotor. El tratamiento es
un medicamento que es la levotiroxina (dosis de 10-15 ug/kg/día) que finalmente es el reemplazo de la
hormona tiroidea que está faltando. Se introduce inmediatamente en el periodo de recién nacido y ese
niño no tendrá ningún efecto clínico en adelante.

*Causas: agenesia total de la glándula tiroides. Hipoplasia, ectopia o defectos heredados de la síntesis de
hormona tiroídea.

Diagnostico de los errores innatos del metabolismo

 Examenes de sangre: Se miden los aminoácidos en un screening. Cuando el niño viene con
características (vomitos persistentes, compromiso de consciencia)
 Examenes de orina
 Examenes en liquido cefalorraquídeo
 Gotas de sangre en papel filtro
*El screening de sangre en el neonato se realiza en unas gotitas tomadas en papel filtro. Se punciona el
talón y se recogen las gotitas de sangre en un papel filtro.

En 20 años de programa se ha prevenido el retardo mental en 1200 niños.

*Incidencia de PKU 1:20.000 RN
Los niños con pku son referidos al INTA para ingresar al programa de seguimiento, iniciar las evaluaciones
medicas nutricionales y neurologicas y el ministerio entrega la leche correspondiente (sin fenilalanina).

Los niños que tienen confirmado el hipotiroidismo congénito deben ser controlados en los servicios de
endocrinología del hospital.

Tratamiento nutricional del PKU

TRATAMIENTO NUTRICIONAL: dieta restringida en fenilalanina (FA). Prohíbe alimentos de origen animal y
restringe frutas, verduras y cereales calculando el contenido de FA.

PROGRAMA EN CHILE: RN y niños hasta los 18 años se entrega un sustituto lácteo sin FA, que aporta las
proteínas, vitaminas y minerales suficientes para un crecimiento en rangos de normalidad. Este producto
es proporcionado por el Programa de Alimentación Complementaria (PNAC), del Ministerio de Salud.

*Este tratamiento debe ser permanente por lo que deben manejar su dieta.

PROHIBIDOS PERMITIDOS LIBRES CONTROLADOS

Carnes, pescados, mariscos,
huevos.
Leche y derivados.
Pan, pastelería, frutos secos.
Leguminosas.
Azúcar, aceite, margarina. Cereales, papas.
Vegetales, jugos de fruta en Verduras, frutas.
polvo.
Maicena
Alimentos proteicos, Colados infantiles.
condimentos.

DIAGNOSTICO DE EIM
Pruebas iniciales cualitativas
 Test COLORIMÉTRICO: El cloruro ferrico (pku) con la cantidad de fenilalanina que hay en la orina
cambiará de color. (orina más oscura)

Pruebas cuantitativas (HOY EN DIA SE USAN ESTAS)

 Permiten cuantificar los aminoácidos en un analizador de aminoácidos
 HPLC (cromatografía liquida de alto rendimiento)
Este equipo nos entrega los valores de aminoácidos que hay en orina o en sangre

En el país también existe el Espectrómetro de masa que analiza una gran cantidad de aminoácidos
y los cuantifica (se verá lo anormal, si cuantifica para fenilalanina o tsh). Gracias a este equipo a
partir del 2007 hay 27 patologías pesquisadas a través del papel filtro.

SINDROME PRADER WILLI

Características clínicas:
Talla baja, hipogonadismo, manos y pies pequeños, fascie característica y obesidad
Déficit intelectual, rabietas y TOC.

ETAPA I: Hipotonía neonatal central con dificultades para alimentarse y retraso del crecimiento.
*Despues de los 12 meses ya se inicia un proceso de hiperfagia y obesidad mórbida en estos niños, por lo
que es urgente hacer el diagnostico en la etapa I.
Se debe hacer una intervención nutricional temprana y además si es posible instalar hormona de
crecimiento.

El diagnostico molecular es por FISH o MLPA (amplificación de multiples sondas ligadas).

El síndrome de prader willi se caracteriza por delecion del cromosoma 15. La identificación de la delecion
de ese gen es lo que importa hacer de manera temprana. Para hacerlo de manera temprana es necesario
sospechar…
En un niño recién nacido con hipotonía, dificultad para alimentarse y de retraso del crecimiento se puede
sospechar y se pide que se haga el diagnostico que puede ser por FICH o por MLPA.

MLPA: Es una amplificación de multiples de sondas ligadas que produce las sondas para detectar errores
del ADN (deleciones o duplicaciones)

Pasos del MLPA

Cada sonda que se compra está compuesta por 2 oligonucleótidos. Si esta sonda encuentra su secuencia
con el ADN del paciente se va a ligar, luego un PCR lo amplifica.
Si la sonda no encuentra su secuencia va a quedar “flotando” y no se va a tener el producto de PCR o se va
a pegar parcialmente y se va a tener un producto mucho menor.
El software coffalyser entrega y grafica la alteración encontrada.
Tambien se usa MLPA en las neuropatías periféricas (Charcot Marie Tooth ó CMT1A) y en las neuropatías
hereditarias de paralisis por presión (HNPP), ambas se ven en etapas más adultas.

El Charcot Marie Tooth es la más común, es una neuropatía desmielinizante, caracterizada por un
enlentecimiento en la conducción nerviosa. Se empieza a destruir la mielina y la fibra nerviosa queda
expuesta.
En el HNPP la característica clínica es que se produce paralisis o adormecimiento por presión de las
extremidades.
*La mutacion en estos casos esta en el cromosoma 16 (brazo corto). Puede ocurrir que haya una
duplicación como en el caso del charkomerytuh xD o una delecion como en el caso del HNPP, pero es el
mismo gen el mutado.
*El MLPA es la mejor opción para detectar estos sindromes, ya que en una misma prueba se puede saber
si hay delecion o duplicación.

TEST DE PATERNIDAD. CLASE 7

Caso: RN de sexo masculino de término adecuado para la edad gestacional, sin embargo antes del alta la
madre solicita realizar el test de paternidad puesto que no sabe exactamente quién es el padre. Se
presentan en el hospital dos hombres y posiblemente uno de ellos es el padre del RN, se requiere
determinar cuál es realmente el progenitor.

En que consiste el test de paternidad  Técnica de biología molecular que nos permite la identificación de
individuos basada en el análisis de regiones del ADN que presentan números variables de repetidos en
tandem (VNTR). Recordar que hay números variables o polimorfismos en la secuencia de ADN, que no
significan algún efecto fenotípico, ni una enfermedad ni trastorno, pero si tienen que ver con nuestra
variabilidad.

VNTR Permite reconocer un individuo de otro. Ej: Imagen del ppt

El padre tiene en un alelo 4 repetidos (representados por

una banda), si enviamos la muestra a PCR en un gel de
electroforesis va aparecer una banda y de acuerdo al
tamaño de la banda se ordena, mientras más chico es el
fragmento repetido va a migrar más abajo.

La madre tiene uno de 5 y uno de 3 (el de 3 quedaría más

abajo).
Por lo tanto los hijos de esta pareja deben heredar algunos
de esos alelos, si no seria hijo de ellos.

Cuando nosotros queremos saber cuál es el padre de alguno de esos niños, tiene que el compartir algunos
de los alelos del padre y algunos de la madre, porque recordemos que uno hereda un cromosoma de la
madre y uno del padre. Si el niño no tiene ninguno de los del padre lo podemos descartar, el tema es que
en esta variable repetidas se pueden repetir entre una persona y otra no existen tantas variables como
seres humanos, es por esto que los test de paternidad no solo involucran una variable si no que múltiples.

Entonces el DNA repetido en tándem corresponde al 10% del DNA satélite que existe en todos nosotros,
también de este 10% forman parte los micro satélites o los STR (pequeños repetidos en tándem), son
fracciones hipervariables que forman parte del 0,1% del genoma, y son las que sirven para hacer un test
de paternidad y para crear el fingerprint (las huellas dactilares son únicas en cada personas) entonces el
fingerprint debe reconocer estos marcadores únicos para cada persona. Entonces las secuencias
hipervariablesson únicas como las huellas dactilares. Ahora explica otro ejemplo del ppt sobre la posición
de los marcadores.

STR repeticiones de nucleótidos del mismo tamaño. Lo importante es que los STR tengan bajas tasas de
mutaciones, porque puede provocar es que existan más repetidos de lo normal en otras personas o que
tengamos las variables repetidas en otras células. Son pequeños y fáciles de amplificar por PCR y tienen
gran variabilidad en las personas.

Los estudios de paternidad comparan las huellas dactilares del niño con la madre y el posible padre:

 Para excluir paternidad se debe demostrar exclusión de al menos dos marcadores discordantes.
 Para asignar paternidad se expresa como una probabilidad de paternidad y esta debe alcanzar al
menos un 99,9% de la probabilidad de compartir el mismo alelo. Así de fuerte es la herramienta.
 Se deben considerar de 13 a 15 marcadores de STRs.

Cuando el padre y la madre comparten un mismo marcador no se puede asignar o descartar paternidad
porque es muy pobre la información.

 Estos son los marcadores de STR del perfil genético que están repartidos en
los diferentes cromosomas en lugares específicos y que tienen la condición de
ser muy variables y que nos van a identificar a una persona determinada.

Este es el perfil genético, es el análisis que se usa que

es por electroforesis de capilaridad con un aparato que entrega
el pick exacto y el tamaño exacto que tiene el fragmento
de ADN de la persona. Es muy importante saber el tamaño
exacto por eso el análisis se hace con un secuenciador, y es muy
preciso para saber el tamaño del alelo. Es un PRC múltiple
que amplifica todos los STR de una vez y están marcados con
fluorescente, por lo que nos entregara el tamaño y pick al
mismo tiempo. Hoy en día se utilizan 16 marcadores de STR.

Dato freack de la profe: Existe la posibilidad de hacer test de paternidad prenatal con un examen de
sangre materno, este estudio considera la sangre materna y el posible padre (ver foto ppt) en el ejemplo
del ppt en el análisis de los resultados el supuesto padre cae en una zona de exclusión de paternidad por
tanto los marcadores de la muestra de la madre eran discordantes con los del supuesto padre.
Recordemos que en la sangre materna hay células fetales circulantes, entonces las células fetales deben
ser de alguna manera concordante con las del padre. Este método prenatal necesita muchos mas
marcadores.

Otras Aplicaciones de FINGERPRINTIN

 Estudios de paternidad, maternidad y otros parentescos  Caso de los detenidos desaparecidos y

el robo de niños en la dictadura, se determinó parentesco con abuelas.
 Análisis de quimerismo post trasplante de médula ósea  Lo que interesa es conocer si el
receptor agarro la medula del donante.
 Criminalística  Casos de violaciones por estudio de fluidos.
 Investigación Forense  Comparar ADN dejado en la escena del crimen con el ADN de los
sospechosos.

PRC permite amplificar muestras obtenidas en hueso o pelo cuando estas son pocas.

Los nuevos analizadores permiten analizar además de los STR, el ADN mitocondrial y los cambios o
polimorfismos en un solo nucleótido, en el cromosoma X e Y y el ADN mitrocondrial. Porque el
mitocondrial, porque recordemos que este ADN solo se hereda de los ovocitos. Cuando se trata de padres
que no están pero si la abuela nos sirve analizar el ADN mitocondrial y así tener toda la línea materna.

SOUTHERN BLOT

Se utilizaba antes del fingerprinting para realizar test de paternidad, es una técnica compleja y larga que
solo se limita al estudio de ciertas patologías. El método se describió en el 1975 y consiste en:

Tenemos el ADN del paciente que queremos estudiar y hacemos una digestión con enzimas de restricción
que cortan en ciertos segmentos genómicos, y como sabemos dónde va a cortar es que sabemos que
segmentos nos va a aportar y dependiendo de lo que queremos estudiar, vamos a elegir que la enzima de
restricción a utilizar, luego viene la electroforesis (¿Qué es la electroforesis? : Tenemos fragmentos de ADN
cargados negativamente y si lo ponemos en el gel de agarosa, el gel tiene unos hoyitos y en estos
ponemos el ADN y al tener una carga negativa, por lo que aplicar un catión y un anión y aplicamos
corriente el ADN va a migrar al polo positivo y en esa migración se separa por tamaño de fragmento).

Los fragmentos creados por la enzima de restricción los más pequeños van a llegar abajo y los más
grandes llegaran arriba. Si ponemos un marcador de peso molecular y conocemos el tamaño de cada
fragmento, sabemos que hay marcadores con 23 pares de bases y que todos los que lleguen al mismo
nivel que ese también tienen 23 pares de bases. Por lo tanto cuando nosotros el ADN de nuestro paciente
y lo hacemos correr en el gel de agarosa los fragmentos que vemos si los comparamos con una regla de
tres, tenemos que el fragmento de 23 pares de bases migro desde el origen hacia 1 cm y tenemos uno que
migro dos centímetros, podemos saber cuántos pares de base tiene el que migro 2 cm.

23 pares de bases  1cm

X pares de bases  2cm
La migración tiene que ver con el tamaño del fragmento que nosotros generamos.
Desde el gel de agarosa no podemos analizar los fragmentos, por lo que el ADN que está en el gel se
transfiere a un soporte solido a una membrana que es un papel filtro en el que podemos identificar y
analizar el ADN. Este fue el aporte de SOUTHERN, el de poder transferir el ADN por capilaridad desde el
gel a una membrana de nitrocelulosa y por lo tanto tener en la membrana la misma información del gel, y
vamos a saber hasta donde llegaron los fragmentos y el perfil del paciente. El perfil se logra con muchos
marcadores de STR.

El southernblot se utiliza para identificar 1 o 2 fragmentos en pacientes con alteraciones genómicas

determinadas.

Después de que los fragmentos llegan a la membrana de nitrocelulosa lo que viene es reconocer a través
de una sonda marcada lo que queremos saber ya sea una alteración, y con la sonda marcada hibridamos
en la membrana el ADN del paciente. Recordemos que la hibridación es por complementariedad de bases
se une la sonda marcada con el ADN complementario del paciente y ambos deben estar de una sola
hebra.

 En el Síndrome de X frágil, en donde lo que ocurre es una amplificación cercana al gen FMR1 que
es el gen que queremos estudiar, la amplificación nos lleva a inhibir la expresión de ese gen y que
este no produzca la proteína necesaria para el desarrollo normal. La amplificación es la mutación y
se reconoce por southernblot. Es mucho más frecuente que las mujeres sean portadoras sin tener
efectos fenotípicos (el riesgo es de 50% de descendencia con la afección).

Autoradiografía: Aquí la sonda marcada impacta en una placa de autoradiografia, aquí la marca no es
fluorescente si no que quimioluminicente o con fosforo radioactivo. En estas placas se ven los resultados
del southernblot.

Características del SOUTHERN BLOT

VENTAJAS
 Establece el diagnóstico por análisis directo del gen, no por amplificación de un fragmento (PCR)
 Permite establecer todos los tipos de mutación: Mutación Completa en hombres y mujeres
Premutación Mosaico Premutación/Mut. Completa.
 Permite entregar asesoramiento genético de certeza a la familia.
DESVENTAJAS
 Es un procedimiento largo ( 2-3 semanas) y costoso
 Requiere mucho entrenamiento del operador

Cuando se enfrenta a una mujer con una alteración ligada al X, lo más importante es saber que ella
entendió las posibilidades de recurrencia de presentar la alteración y luego plantear no sugerir las
alternativas como Dg prenatal.

Inmunoensayos (Clase 8)
*Leer caso 6 y 7
Son todas las técnicas de laboratorio llamadas inmunoquimicas que usan la unión antígeno-antocuerpo
para detectar una serie de patologías, virus, bacterias, células tumorales.
El anticuerpo formado por 1 cadena pesada y 2 cadenas livianas tiene una región constante y una región
variable que es la que se une específicamente al antígeno. El anticuerpo tiene alta especificidad con su
antígeno.
Dependiendo del objetivo del ensayo se puede cuantificar la cantidad de anticuerpos que el individuo
produce o cuantificar la cantidad de antígeno que hay en una muestra.

Hay dos tipos de anticuerpos:

1. Monoclonales: Aquellos que son específicos para un antígeno, no tienen afinidad con otro
2. Policlonales: Mezcla de inmunoglobulinas que pueden reconocer varios antígenos, menos
específicos.
*Los anticuerpos se compran para los inmunoensayos.

Método directo: Usa solo un anticuerpo (Ab primario) unido a un reportero, Sensibilidad baja.
*El anticuerpo debe estar unido a un reportero porque con el se puede ver la unión antígeno-anticuerpo
(por ejemplo la fluorescencia o tinción la permite el reportero).

Método indirecto: Usa dos anticuerpos, uno especifico para el anticuerpo y el otro contra este mismo,
Sensibilidad mayor, permite amplificación de señal.

El VIH afecta a las células del sistema inmune, estas células presentan el receptor CD4.
En el caso de mujeres embarazadas con VIH o mujeres que están amamantando la OMS recomienda la
terapia Antiretroviral (ART) para evitar la transmisión vertical.

En la detección de VIH se puede ver:

 Anticuerpos que el organismo produce contra el virus del VIH
 Antigeno
 Acidos nucleicos (ADN del virus)
No hay índice de virus inmediatamente de3spues de la infección. Existe el periodo de ventana en donde el
virus se esta replicando pero aun no hay anticuerpos (que el cuerpo genera), por lo que es importante en
que momento fue la infección para saber que test ocupar en la detección. Habrá altos niveles de ARN y del
antígeno P24. Las primeras inmunoglobulinas que aparecen son la M y luego la G.

Test de Elisa primera generación: Permite hacer el diagnostico solo después de 3 meses de infección,
necesita tener niveles altos de anticuerpo.

Test de Elisa de segunda y tercera generación: 2ª Generación: Detecta la presencia de anticuerpos (anti
VIH) en suero del paciente adulto a los 33-35 días tras la infección. 3ª Generación: Se detectan anticuerpos
de clase IgG e IgM, se acorta el período ventana a 22 días.

Test de Elisa de cuarta generación: Permite hacer el diagnostico entre los 13-15 días de la infección. Es la
más usada, además detecta el antígeno P24 en el suero del paciente… El P24 es el antígeno que aparece al
segundo día post infección.

Para el Elisa se usan placas que tienen pocillos y estos pocillos están recubiertos con el antígeno del VIH…
*Se van a eliminar los anticuerpos que no se han unido al antígeno. Los que se unen aparece el color.

Todo Elisa positivo debe ser confirmado por otro método, este método de confirmación es el Western
Blot. Este método busca detectar los anticuerpos anti VIH que existan en el suero del paciente.
Se usa una muestra de células positivas para VIH; las proteínas del virus se separarán en un gel por
electroforesis, luego se transfieren a un papel de nitrocelulosa.

 Estas proteínas son expuestas al suero del paciente, si es + los anticuerpos específicos se unirán a
las proteínas presentes y luego la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario
anti-humano unido a una enzima-señal.
 La aparición de bandas indica la presencia de proteínas contra las cuales el suero del paciente
contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.
*En el caso de un RN se puede obtener un falso positivo, ya que el RN recibe de manera pasiva los
anticuerpos de la madre, es por esto que se debe evaluar el ADN del RN.
*La lactancia queda suspendida hasta que la madre quede libre del virus (khe)

AHORA SE ESTUDIA EL CASO 7 (CÁNCER DE MAMA)

Inmunofluorescencia: Se usa un anticuerpo especifico monoclonal para determinar lo que se busca. Se
aplica un segundo anticuerpo unido a un fluoroforo (esto es el reportero) que al ser analizado por una luz
ultravioleta este se activa y puede ser visualizado en un microscopio de fluorescencia.
*En esta técnica el anticuerpo debe ser especifico para ese antígeno y asi se esta seguro que lo que se esta
reconociendo es la presencia del antígeno.

Fluorocromo: Son colorantes que emiten una luz de acuerdo a la longitud de onda que se les transmita.

La inmuno detección de proteínas o marcadores tumorales in situ, se refiere a la inmuno histoquímica y a

la inmunocitoquímica. La histoquímica se refiere a cuando reconocemos el antígeno en un corte de tejido
y la citoquimica es cuando reconocemos el antígeno en células (descamativas, exudados, etc.). Ambos
usan anticuerpos específicos unidos a una molécula reportera que puede ser cromogenica (tinción
producida por la fosfatasa alcalina que puede ser vista en un microscopio corriente) o fluorescente que va
a requerir de un microscopio de fluorescencia. En anatomía patológica se utilizan marcadores
cromogénicos que pasan a ser marcadores reporteros que van a decir que ahí está el anticuerpo que
estamos estudiando (también se utiliza en producción de fármacos, investigación biomédica).
La mayoría de los tumores al mirar la célula tumoral teñida no da toda la información de que tumor se
trata cual es la proyección y el comportamiento del tumor, también necesitamos los marcadores para
saber que anticuerpos están produciendo los tumores y estos nos permiten decir el pronóstico y la
situación en la que está.
Igual que en los otros se aplica un segundo reportero, en este caso unido al segundo anticuerpo, y este
reportero es una fosfatasa alcalina o una peroxidasa que se tiñe y aparece en el tejido el precipitado
coloreado al mirarlo al microscopio indicándonos la ubicación de donde se está produciendo el anticuerpo
que estamos buscando
En el cáncer de mama es muy importante reconocer ER2+ ya que hay una gran producción de este, aquí es
muy importante el uso del panel histoquímico porque nos va a entregar la información del estadio, el
pronóstico, si va a dar o no metástasis y la clasificación del sub tipo del Ca Mama.

Sub tipos de cáncer de mamas:

 Luminal A Tiene receptores de estrógenos (+) y estos se visualizan por una reacción antígeno
anticuerpo con inmuno histoquímica, receptores de porgesterona (+) y ER2- ósea con ausencia
del oncogén.
 Triple (-)  Cuando están negativos los tres marcadores de inmuno histoquímica.
 Luminal B  Cuando además de ser positivo para estrógeno y progesterona es positiva para el
oncogén ER2.
 ER2 Solamente positivo para ER2

La clasificación del cáncer de mama nos sirve para saber cuándo hay un luminal A o B que representan el
45% de los Ca Ma y tienden a darse postmenopausia y son de mejor pronóstico, a diferencia del cáncer
donde hay una sobre expresión del ER2.
En los canceres de mal pronóstico se plantea un tratamiento específico coadyuvante, es decir un
tratamiento donde se utiliza un anticuerpo monoclonal anti ER2. Lo importante de este tratamiento es
que ayuda al cuerpo a luchar contra el ER2, hay mejores resultados y mayor tiempo de sobrevida.
Los marcadores histoquímicas no solo van a permitir clasificar el tipo de cáncer sino que también elegir el
tratamiento adecuado para ese tumor en específico.
La inmunofluoresencia directa utiliza anticuerpos monoclonales conjugados con fluorxeina (creo que eso
dice) y se usa mucho en los kit para detección de virus respiratorio, es decir tenemos una placa con los
virus respiratorios más frecuentes y ponemos en contacto la placa con la sangre del paciente, entonces si
hay anticuerpos antivirales quiere decir que el paciente tiene el virus. Si el anticuerpo está unido a la
fluorxeinay lo miramos a un microscopio de fluorescencia y hay fluorxeina positiva el paciente tiene
anticuerpos contra determinados virus.
Hibridación in situ:
Esta hibridación que consiste en alinear una molécula de ADN conocida (una sonda) que sabemos la
secuencia que tiene e hibridarla con el ADN complementaria en este caso sería con el ADN del paciente.
En que consiste la hibridación in situ, tenemos la secuencia del oncogén marcada con un cromógeno y la
hibridamos en las células del paciente, si hay hibridación ósea si encuentra secuencias complementarias
quiere decir que está presente. La sonda está unida a un reportero.
Si el reportero es fluorocromo hablamos de FISH y si es cromógeno es HIBRIDACION IN SITU y no
fluorescente.
Por ejemplo en el Cáncer de mama tenemos células y usando una sonda con ER2 marcado con
fluorocromo y después vemos dos marcas ósea niveles normales de ER2 y en la otra tenemos abundante
fluorescencia por lo tanto abundante oncogén ER2. Entonces además del diagnóstico por
inmunohistoquimica que podemos hacer, también se puede utilizar FISH para ver la presencia de ER2.

Las ventajas de la inmuno fluorescencia es que se puede aplicar a células vivas (exudadas, raspado, etc) y
células fijadas. La Hibridación in situ solo se puede hacer a células fijadas.
El marcaje es muy específico y se observa un marcado contraste incluso cuando hay un escaso antígeno,
es muy sensible a la detección del antígeno.
Permite análisis temporales, 3D y cuantificable por microscopia con focal

La desventaja es que se necesita un microscopio con focal o fluorescente.

CITOMETRIA DE FLUJO
Este método permite el recuento caracterización y separación de distintas poblaciones celulares usando
un anticuerpo unido a un colorante fluorescente para marcar de manera específica cada célula.
Ejemplo: Si tenemos las células de la sangre, los linfocitos son una gran cantidad y son todos distintos,
pero si podemos marcar cada uno de ellos con un anticuerpo específicos, luego el citometro de flujo
puede separarlos, medirlos y cuantificar que cantidad de cierto linfocito hay en esa muestra.
Analiza simultáneamente múltiples parámetros físicos y químicos que caracterizan a las células, porque si
el anticuerpo reconoce la membrana va a analizar la membrana o si reconoce otra estructura de la célula
va a reconocer y analizar esas estructuras. Las células son analizadas individualmente ya que en el flujo
pasa célula por célula y a traves de un rayo láser puede ir detectando los fluoroforos con que fueron
marcadas cada una de las células y de esta manera las designa a distintos pasillos y así cuantificar y
analizar las distintas características por células.
Una de las aplicaciones de la citometria de flujo es la marcación inmunofenotipica en que se emplean
anticuerpos monoclonales y policlonales combinados de 3 a 6 fluorescencias distintas y los antígenos
celulares que aparecen en las membranas en el citoplasma o en ambos, nos permite caracterizar las
poblaciones según esas estructuras.
Entonces el citometro de flujo analiza las células en suspensión alineadas una a una y estimuladas por el
láser y lo que hace interesante el citometro es capturar las distintas dispersiones luminosas que el
fluoroforo unido al anticuerpo en la membrana de la célula está emitiendo y es por esto que nos permite
caracterizar las distintas poblaciones celulares.
Luego son recogidos los datos por un computador que entrega la información en base a gráficos que
reflejan las distintas fluorescencias y la separación de las poblaciones celulares. Ver ppt.
Existen dos tipos de dispersión el frontal y lateral que pueden medir estructuras como el tamaño celular y
estructuras internas de granularidad y de esta manera uniendo el tamaño y la granularidad las puede
separar y decir cuántos granulositios hay, cuantos monocitos hay y cuantos linfocitos encontró.
Al medir la fluorescenciaemitida, por ejemplo si marcamos la estructura interna y la molecular nos entrega
esa información de estructura mucho más internas y finas de lo que está compuesta nuestra muestra.
Cuando hay leucemia y necesitamos saber la evolución del paciente luego de tratamientos, tenemos la
enfermedad mínima decidual y es importante saber si hay pequeñas fracciones de la célula que estamos
buscando en la muestra, esto es muy importante para continuar con los tratamientos o aplicar nuevos
protocolos.

Aplicaciones clínicas:
Infecciones por VIH  Recuentos bajos de CD4
Tumores sólidos  Cantidad de ADN, en qué fase se encuentran
Monitorización de tratamientos.
Inmunofenotipificacion de linfocitos
El sexado de espermatozoides por citometria de flujo usando el mismo sistema pero con marcadores
distintos nos va a separar aquellas células que tienen el cromosoma X y el cromosoma Y.
También se usa para favorecer la fertilización in vitro.

A modo de resumen recordar que dependiendo de la muestra que tengamos es el inmunoensayo que
vamos a utilizar:

Células vivas inmuno fluorescencia y citometro de flujo

Células fijadas  Cualquier metodo menos citometro de flujo
Células tumorales Inmuno histoquímica, inmunocitoquimica, hibridación in situ o el FISH
Virus y bacterias inmunofluorescencia y citometro de flujo
Presencia de oncogénHibridación in situ fluorescente.

La especificidad va a depender de cuan eficiente fue el marcaje.

También considerar el uso de microscopio fluorescencia o microscopio normal.