Pontificia Universidad Católica de Chile

Facultad de Ciencias Biológicas

BIO 297C - Laboratorio de Bioquímica, Biología celular

Laboratorio N°1:
Espectrofotometría.

Integrantes: Paula Amado - Valentina Alarcón - Marcela Huenumilla

Fecha de Realización: 13 - Marzo - 2018
Fecha de entrega: 20 - Marzo - 2018
Introducción
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La técnica utilizada en el presente informe fue espectrofotometría. Mediante esta técnica es

posible obtener datos de absorbancia para una muestra dada, entendiendo la absorbancia
como una forma de medir la absorción de radiación (UV o visible) por parte de la molécula en
estudio (Harris, 2003).

La forma de cuantificar la absorbancia de la muestra experimentalmente es mediante un

espectrofotómetro, instrumento que consiste en una fuente constante de luz, monocromador,
muestra, fotodetector y computador (Boyer, 1986). En términos de los principios por los cuales
es posible la utilización de la técnica es preciso hablar de la radiación electromagnética. Este
tipo de radiación, que se desplaza a gran velocidad por el espacio, logra atravesar los tres
estados básicos de la materia provocando que ciertas frecuencias sean absorbidas por las
moléculas, de modo que la energía electromagnética es transferida a los átomos. Este
comportamiento de la luz de trasladarse por el espacio y además ser absorbida por las
moléculas se conoce como comportamiento dual de la luz, en que se puede encontrar como
onda y como partícula separada en cuantos denominados fotones (Rodriguez y Virgós, 1998).
Por la teoría cuántica, nombrada anteriormente, los fotones entregados para la excitación de
las moléculas deben ser exactamente iguales a la diferencia entre en estado basal y el
excitado para que dicha radiación sea absorbida (Skoog, Holler y Niemann, 2001).

Desde la Ley de Beer se enuncia que la absorción que una molécula efectúa es proporcional
a la concentración de la solución dada. Así también, se debe considerar la Ley de Lambert
en la que se enuncia la relación entre el camino recorrido por la molécula para absorber y la
absorción que esta misma logra efectuar (Walton y Reyes, 2005). Las moléculas dentro de la
cubeta en solución deben tener suficiente espacio para tener oportunidad de absorber luz sin
ser enmascaradas por otras moléculas en disolución. Además, implica que cada fotón que
atraviesa la cubeta puede ser absorbido de igual forma dando a conocer la presencia de una
luz monocromática.

La unión de ambas ecuaciones o principios permite dar explicación al fenómeno de

absorbancia y como usando la técnica de espectrofotometría se logra determinar la
concentración de una muestra problema dada.
Esta técnica e instrumento han sido escogidos debido al fácil uso de este último, rápida lectura
de los datos que se presentan de forma digital, es de análisis rápido, alta precisión (±2nm) y
se requiere baja preparación de la muestra problema para el estudio. Sin embargo, presenta
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desventajas como el alto precio del instrumento y la sensibilidad de las celdas que requiere
especial cuidado al introducir la muestra.

Existen métodos que presentan mayor sensibilidad para la detección de concentraciones

bajas, como lo es la fluorimetría, que se describe con aquellos compuestos que absorben
luz remitiéndola a una longitud de onda más elevada, esta es medida en ángulo recto al
haz de excitación contra un fondo oscuro y las mediciones de de absorbancia implican la
detección de pequeños cambios en la luz trasmitida.

Con toda la información precisada acerca de la técnica a utilizar, el objetivo del práctico
realizado es comprender los principios teóricos de la espectrometría y habituar el uso con las
micropipetas, evaluando la precisión y exactitud del material volumétrico presente en el
laboratorio.
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Materiales y Métodos
1) Materiales
- Espectrofotómetro Jenway 6300
- Micropipeta P1000
- Agua destilada
- Tubos Falcon
- Violeta de gencenia

2) Metodología
En la primera parte del práctico se usó el espectrofotómetro Jenway 6300, este se calibró
automáticamente y luego se llevó 0 absorbancia a 450nm de longitud de onda. Se insertó la
muestra blanco, que corresponde a 1mL de agua, en el portacubetas. Considerando que la
cubeta estuviera limpia y en la posición correcta, para que haz de luz incidiera.

Luego para determinar el espectro de absorción del Violeta de Gencenia en una

concentración 1:5, se midió la absorbancia de 1mL a 450nm y 400nm de longitud de onda.
Se determinó la absorbancia en espectrofotómetro, luego se realizó un primera serie de
medidas en un rango de longitudes de ondas desde 420nm a 700nm, cada 20 nanómetros
como se observa en la tabla 1. Posteriormente se determinó un valor de absorbancia máxima
a una longitud de onda determinada, lo que constituye la segunda serie de medidas en el
rango de 550nm a 615nm, cada 5 nanometros (Ver tabla 2). La tercera serie de medidas se
realiza con la absorbancia máxima considera en la segunda serie de medidas, el rango de
longitud de onda que abarcan se realizó cada 1 nanómetros, desde 583nm a 597nm
obteniendo los datos tabulados en la Tabla 3.

En la segunda parte del práctico se realizó cuatro diluciones en la proporción de ½, ¼, ⅛ y

1/16, aparte de una solución de Violeta de Gencenia 1:5, mediante una micropipeta 1000. En
la disolución ½ , se dispuso de 2mL de dicha solución concentrada y se traspasaron a un
tubo falcon, agregando 2 mL de agua destilada, para las siguientes se extrajo 2mL de la
solución anterior y agregando 2 mL agua destilada, generando diluciones seriadas.
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Resultados
Con el fin de establecer el espectro de absorción para el colorante y mediante el uso del
espectrofotómetro se obtuvieron datos de absorbancia para el Violeta de Genciana a distintos
valores de longitud de onda, los datos obtenidos se muestran en las Tablas 1, 2 y 3.

Tabla 1. Mediciones de absorbancia de 20 en Tabla 2. Mediciones de absorbancia de 5

en 20 nm. en 5 nm.
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Tabla 3. Mediciones de absorbancia de 1 en 1nm.

Longitud de onda del máximo de absorción: 590nm

Los valores obtenidos de absorbancia en cada longitud de onda fueron graficados según
Absorbancia vs Longitud de onda, el espectro de absorción obtenido se muestra en el
Gráfico 1.

Para obtener el coeficiente de extinción molar del violeta de genciana mediante una curva
de calibración se prepararon cuatro diluciones seriadas en las razones 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16
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considerando un volumen final de 4 mL para cada solución según:

Volumen final: 4mL → 2 mL solución + 2 mL agua destilada

Las concentraciones molares de cada una de las diluciones seriadas fueron calculadas
mediante la ecuación 1 posterior a haber determinado la concentración molar de la muestra
original.
Ecuación n°1 C1 ∙ V1 = C2 ∙ V2

Determinación de la concentración molar de la solución

⋅Peso molecular cristal violeta = 407,9 gr/mol
⋅Solución entregada= 0,5 mg/100mL
0,5𝑚𝑔 0,005 𝑔𝑟
⋅ 100 𝑚𝐿=
1𝐿
0,005𝑔𝑟 407,9 𝑔𝑟
= ⇒ 1,225𝑥10−5 mol
𝑋 𝑚𝑜𝑙 1 𝑚𝑜𝑙

Luego, para graficar la curva de calibración correspondiente, se midió la absorbancia de

cada una de las diluciones por duplicado mediante el uso de espectrofotómetro y con una
longitud de onda de 590 nm. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 4.

Tabla 4. Datos de absorbancia obtenidos para cada concentración molar.

Absorbancia
Concentración Molar (M) 1era medición 2da medición

7,656𝑥10−6M - 0.009

1,531𝑥10−6M 0.039 0.045

3,063𝑥10−6M 0.092 0.090

6,13𝑥10−6M 0.160 0.163

Para integrar ambas mediciones de absorbancia para cada uno de las diluciones seriadas
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se calcularon los promedios indicados en la tabla 5, valores utilizados para elaborar la curva
de calibración. En el procedimiento experimental no se realizó la medición n° 1 de la dilución
1:2 por error en el desarrollo de la metodología por lo que el valor utilizado para la curva de
calibración corresponde a la única absorbancia obtenida.

Tabla 5. Datos de absorbancia obtenidos por el cálculo del promedio entre ambas
mediciones realizadas en el procedimiento experimental en cada una de las diluciones

Concentración de la Dilución Promedio Absorbancia (nm)

7,656𝑥10−6M -

1,531𝑥10−6M 0,042

3,063𝑥10−6M 0,091

6,13𝑥10−6M 0,1615

Finalmente, con el fin de determinar la concentración de la muestra problema,

correspondiente a violeta de genciana, se midió su absorbancia a una longitud de onda de
590 nm, datos entregados en la Tabla 6.

Tabla 6. Datos de absorbancia de medición por duplicado a 590nm

Longitud de onda (nm) Absorbancia

590 0,072 0,075

Promedio absorbancias: 0,0725

Mediante una extrapolación lineal de la gráfica absorbancia vs concentración es posible
conocer la concentración de la muestra problema, para eso se utiliza la ecuación de la recta,
sabiendo que:
Ecuación de la recta ⇒ y = 27764x + 0,003
Con y = absorbancia
x= concentración
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0,0725 = 27724 ∙concentración + 0,003

0,069
Concentración =
27764

−6
Concentración de la muestra problema: 2,485x10 M

El valor teórico de la muestra problema corresponde a una dilución de la solución original 0,5
mg/100mL en una relación 1:5, lo que equivale a una concentración molar de:

✳utilizando ecuación 1
−5
1,225x10 M ∙ 1mL = C2 ∙ 5mL
−6
Concentración: 2,45x10 M

Se calculó el error relativo de la concentración mediante:

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜

Ecuación 2. x 100
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜

Error relativo: 1,43%

Discusión
Cuando ondas del espectro electromagnético, cuyas longitudes de onda varían a lo largo de
este, son capaces de excitar a las partículas presentes en la materia quiere decir que los
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electrones son movilizados desde un estado basal a uno de mayor energía gracias a la
interacción de las moléculas con los fotones del haz de luz, estos últimos, otorgarán la energía
necesaria para compensar la diferencia energética entre ambos estados de los
electrones(Boyer, 200). Al confeccionar el espectro de absorción del violeta de genciana es
posible observar cómo a distintas longitudes de ondas se obtienen distintos valores de
absorbancia, debido a que los fotones, al poseer distintas energías interactúan de manera
desigual con las partículas presentes en la muestra. Esto se explica con la relación que existe
entre la cantidad de energía de los cuantos pertenecientes a un haz de luz con su longitud
de onda dada por la ecuación de Planck:

E=hv (Buefe, 2004)

En ella se establece que la energía (E) es proporcional a la constante de planck (h) y a la

frecuencia (v) a partir de esto se encuentra la relación con la longitud de onda la cual es
definida por
Lambda= c/v (Boyer, 2000)

Donde c corresponderá a la velocidad de la luz. Así es posible establecer que a una mayor
longitud de onda existirá una menor frecuencia y por tanto una menor cantidad energía.
En el gráfico 1 se observa como la absorbancia aumenta desde los 460nm hasta los 590nm
debido a que a partir de esa longitud de onda con su respectiva energía, la interacción de los
fotones con las partículas del violeta de genciana varía acercándose al punto de absorbancia
máxima en donde la energía de los fotones iguala a la diferencia energética entre el estado
de excitación y el estado basal de los electrones. La mantención y disminución de
absorbancia observada en el intervalo 586-588nm puede ser explicada por errores del
operador en un mal manejo de la cubeta que contiene la muestra al dejar marcas que impidan
una medición correcta, o del espectofotómetro, con un mal cierre o un mal encaje de la cubeta
dentro de este.

El máximo de absorbancia se encontró en los 590nm, longitud de onda utilizada para

confeccionar la curva de calibración a partir de las diluciones en serie, se escoge este valor
debido a que la curva es relativamente aplanada en las proximidades del máximo de manera
que apenas varía la absorbancia (Harris, 2007) lo que da cierto rango en longitudes de onda
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cuyas absorbancias son lo suficientemente similares para evitar grandes errores de cálculos
y porque la sensibilidad del análisis es máxima en el máximo de absorbancia (Harris, 2007)
lo cual significa que es en este punto donde se encuentra la máxima respuesta de las
partículas de la muestra para una concentración dada de la misma.

Lo que otorga la curva de calibración es la posibilidad de establecer una relación lineal entre
la concentración y la absorbancia lo que permite extrapolarla linealmente y así determinar
concentraciones de muestras problemas mediante el análisis de la ecuación de la recta. En
esta última (y=mx+b) sabiendo que y corresponderá a la absorbancia, x a la concentración y
b a 0 (idealmente debido que a concentración 0 la absorbancia es 0) es posible determinar
que si y=mx, la pendiente corresponde al coeficiente de extinción molar (estableciendo 1 la
trayectoria óptica) ya que según la ley de Lambert-Beer la Absorbancia(A o y) es proporcional
a la concentración(c o x), trayectoria óptica(1) y coeficiente de extinción molar (e o m). Por lo
tanto la pendiente m=27764 corresponde al valor del coeficiente de extinción molar.

Las curva de calibración presentada en el gráfico 2, si bien no presenta grandes desviaciones,

no muestra una relación completamente lineal, esto puede ser explicado por errores tanto en
el manejo de la muestra al momento del desarrollo experimental que alteraron la correcta
medición de la absorbancia, como en alteraciones en la concentración de la muestra debido
a errores en el proceso de dilución seriada, esto es altamente probable debido a que al
trabajar con concentraciones tan bajas cualquier error, por mínimo que fuera puede generar
resultados que se alejen de lo esperado, lo que explica también el hecho de que n en la
ecuación de la recta no fuera exactamente 0. Además, algunos de los errores más comunes
de la espectrofotometría, es que ciertas leyes que la rigen como la ley de Lambert-Beer, ya
sea por las altas concentraciones o un cambio de absorción del cromóforo, la amplitud de
banda del monocromador es demasiada ancha por lo que longitudes de onda diferentes de
las absorbidas por el cromóforo se transmiten a la muestra.
Siguiendo la lógica que explica el uso de la absorbancia máxima para elaborar la curva de
calibración, se midió a 590nm la muestra problema cuya concentración teórica corresponde
a 1:5, es decir una parte de la muestra original diluida en cuatro partes de agua destilada que
−6
en concentración molar equivale a 2,45x10 M. El resultado obtenido por la extrapolación
de la curva de calibración, reemplazando datos en la ecuación de la recta obtenida
−6
(y=27764x+0,003) corresponde a 2,485x10 M, a partir de esto se puede establecer un
error relativo que indica una desviación del resultado experimental del esperado (teórico). El
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error relativo indica que si bien existieron errores dentro del desarrollo experimental, los
cuales se observaron gráficamente en el espectro de absorción y la curva de calibración, el
desarrollo del análisis de las mediciones se realizó de manera correcta.
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Conclusión

- Para concluir el estudio de los fenómenos que fundamentan la espectrofotometría,

podemos decir que la Ley de Lambert- Beer cumple varias condiciones, por lo que se
puede asumir la que ley no se cumple producto de las desviaciones que sufre a bajas
o altas concentraciones.
- El realizar un curva de calibrado nos permite calcular la concentración de la disolución
de colorante que diluimos. Pero, además poder determinar la de la muestra problema.
- Al construir una curva de espectro de absorción, se enfatiza el punto de máxima
absorbancia a una longitud de onda determinada, para comprender de qué manera
se construye el espectro.
- Las micropipetas son un instrumento que mide varios tipos de volumen por lo que
tienen una medición poco exacta.
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Bibliografía
- Boyer, R. (1986). Modern experimental biochemistry. :Pearson Education India. pp
152
- Buefe, F. (2004). Ciencias Físicas. (pp. 240) España: Editorial Reverté.
- Harris, D. (2007). Fundamentos de espectrofotometría. En Análisis químico
cuantitativo. (6ta ed., pp. 427-428, 240). Barcelona, España: Editorial Reverté.
- Rodríguez, J., Virgós, J. (1998). Teoría electromagnética de la luz. En Fundamentos
de óptica ondulatoria. (1era ed., pp. 21). España: Universidad de Oviedo.
- Skoog, D., Holler, F., Niemann, T. (2001). Introducción a los métodos
espectrométricos. En Principios de Análisis instrumental. (5ta ed., pp. 141-145).
Madrid, España: McGraw-Hill.
- Walton, H., Reyes, J. (2005). Absorcion de radiacion. En Análisis químico e
instrumental moderno. (1ra ed., pp. 146). España: Editorial Reverté.

Anexo: Cuestionario
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1) A bajas y altas concentraciones de un cromóforo se observan desviaciones a la Ley

de Lambert-Beer. Explíquelas.

Una causa importante de la desviación de linealidad corresponde a la pérdida de

monocromaticidad que es conocida como luz parásita dentro del detector. Entonces esta luz
parásita que no es absorbida aporta error en la medición de absorbancia.
Una desviación frecuente corresponde a la producida por cambios redox, esto es, la
molécula en estudio genera un equilibrio que puede, incluso, generar una dimerización que
sea observable a una mayor longitud de onda comparada con su estado monomérico.
Ocurre también que a altas concentraciones el soluto se convierte prácticamente en
solvente debido a la proximidad de ambas fases. Con esta interacción se produce un
cambio en sus propiedades, tales como la absorbancia y por ende la medición cambia y
sesgada por las nuevas propiedades de la molécula.
Las soluciones de baja concentración con aproximadamente 0,01𝑀 están perce más
propensas a desviaciones de la Ley puesto que pequeño cambios en distintos parámetros
(intensidad de fuente de luz, por ejemplo) causan cambios significativos en la medición de
absorbancia.

2) Explique por qué una sustancia que absorbe luz en el rango visible presenta a la
vista el color complementario de la longitud de onda que absorbe. ¿Ocurre esto en el
rango UV? ¿Por qué?

Si, porque la porción de radiación de UV-visible absorbida implica una porción no absorbida
por la muestra y qué es transmitida a través de ella. Dicha porción no absorbida o reflejada
puede ser captada por el ojo humano y entonces distinguir el color complementario.

3) Averigüe la estructura molecular de los colorantes que empleó en este práctico e

identifique el cromóforo.

Para la estructura mostrada en la Figura 1 se observa el cromóforo ubicado en sus tres

anillos aromáticos que se conjugan para poder darle la propiedad de absorción de luz UV-
visible.
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Figura 1. Estructura molecular de Violeta de gencenia.

4) Indique cuáles son los cromóforos de proteínas y DNA en el rango UV.

En el rango UV, la proteínas poseen algunos aminoácidos capaces de comportarse como

cromóforo. Entre ellos se cuentan: Fenilalanina (Phe), Tirosina (Tyr) y Triptófano (Trp). Esto
se debe a que todos corresponden a aminoácidos aromáticos que poseen composición de
enlaces conjugados permitiendo la absorción de luz y siendo la base de los cromóforos.

5) Haga una lista de biomoléculas que absorben a una longitud de onda similar al DNA.
Indique claramente qué tienen en común.

La principal característica en común es que naturalmente las moléculas presentan un

cromóforo en su grupos funcionales. Las biomoléculas corresponde a:
- FMN
- FMNH
- NAD
- NADH
- Nucleótidos