Herramientas moleculares II:

Utilidad y aplicación en el laboratorio bioquímico

MÓDULO 1
(PARTE I)
Fundamentos de genética
aplicables al diagnóstico clínico de
enfermedades hereditarias

Dr. Germán R. Perez

Técnicas moleculares en el diagnóstico clínico
1- Estudio y detección de patógenos
Técnicas moleculares en el diagnóstico clínico
2- Estudio diagnósticos de enfermedades hereditarias
Hitos en el desarrollo de la genética humana
Hitos en el desarrollo de la genética humana

Junio 2000 Febrero 2001

Proyecto Genoma Humano: conclusiones
- El genoma humano contiene 3.200 millones de bases (A, G, T, C).
- El 5% contiene del genoma contiene unos 21.000 genes que codifican
unas 90.000 proteínas.
genes identificados: 22.000 – 26.588
genes supuestos: 31.780 – 38.
- El 25% del genoma humano está casi desierto, existiendo largos
espacios libres entre un gen y otro.
- El 35% del genoma contiene secuencias repetidas.
- El 95% del genoma no tiene función conocida.
- Los genes están repartidos entre los 23 pares de cromosomas. Los
cromosomas más densos (con más genes codificadores de proteínas)
son el 17, 19 y el 22. Los cromosomas X, Y, 4, 18 y 13 son los más
áridos.
- Cada persona comparte un 99,99% del mismo código genético con el
resto de los seres humanos.
Los distintos tipos de mutaciones que se encuentran en un gen pueden ser:
- mutaciones simples (deleciones, inserciones o substituciones que afectan a un nucleótido
o a unas pocas bases)
- reordenamientos grandes (deleciones parciales o reordenamientos que dan lugar a
duplicaciones o deleciones del gen).
Los seres humanos compartimos el 99.9% de la secuenciación de nuestro ADN.
El origen de nuestra diversidad genética se encuentra en el 0.1% de la secuencia genómica.

Polimorfismo de un único nucleótido (SNP)

 una variación de una base por otra en un lugar específico del
genoma y, por definición, se encuentra en más de un 1 % de la
población
- Forman hasta el 90% de todas las variaciones genómicas humanas.
- Aparecen ~ cada 300 bases, a lo largo del genoma humano.

Cada una de las formas de un gen o marcador

como un SNP se denomina alelo y estos diferentes
alelos producen variaciones en las características
hereditarias.
Polimorfismos de único nucleótido (SNP)

 marcadores genéticos en el desarrollo de diversas enfermedades complejas y en la respuesta a

determinados
 SNPs y Diversidad

 las variaciones en el genoma pueden ocurrir con diferentes frecuencias en diferentes poblaciones,
especialmente cuando las poblaciones están suficientemente separadas como para intercambiar
 Proyecto Internacional Hap Map
Se inició en octubre del 2002 y colaboran entidades
investigadoras de Reino Unido, Nigeria, China, Japón,
Canadá y Estados Unidos .

Desarrollar un mapa de haplotipos del genoma humano, para poder catalogar las regiones de
similitudes y diferencias genéticas entre individuos y entender mejor la relación entre el genoma y la
salud humana

Haplotipo: conjunto de variaciones del ADN (polimorfismos) que tienden a ser heredados juntos.
Se puede referir a una combinación de alelos o para un conjunto de polimorfismos de nucleótido
sencillo (SNPs) que se encuentran en un mismo cromosoma.

HapMap: catálogo de variaciones genéticas comunes

(polimorfismos) presentes en la especie humana

Fase I (2005): 1.000.000 SNPs.

Fase II (2007): 3.100.000 SNPs.
Fase III (2009): 4.700.000 SNPs y se aumentó el número de poblaciones.
 Proyecto 1000 Genomas

Comenzó en el año 2008.

Creación de un mapa lo más completo posible de las
variaciones genéticas humanas.

Caracterizar e identificar dichas variaciones permitirá un mejor entendimiento de la contribución

genética en las diferentes enfermedades que afectan al ser humano.

- 100 millones de variantes

- 3.5 millones de SNPs

- 1000 SNPs diferentes entre 2 personas

- Cada individuo 60 variantes que no
tienen los padres.
- 20 variantes están completamente
inactivadas (ambos alelos).
GWAS: Genome-Wide Association Study

Para cada SNPs, se analiza si su frecuencia alélica varía de forma

significativa entre el grupo control y el grupo de casos, cuando se
da esta situación, se determina que la SNP está probablemente
relacionada con la enfermedad

Wellcome Trust Case Control Consortium (WTCCC)  2.000 muestras de pacientes británicos con una de las siete
enfermedades multifactoriales más fueron comparadas con 3.000 controles sanos, y en cada uno de los individuos se
genotiparon 500.000 SNPs, encontrando asociación significativa con varias regiones del genoma.

Sólo detectan variantes genéticas comunes (el alelo de menor frecuencia está presente en, al menos,
el 5% de la población), por lo que su efecto sobre la enfermedad es pequeño (el riesgo de los
individuos que lo portan aumenta poco en relación al riesgo general)
 Microsatélites (SSR / STR)
- Secuencias de ADN en las que un fragmento (2 – 6 pb) se
repite de manera consecutiva.
- La variación en el número de repeticiones, y no la
secuencia repetida, crea diferentes alelos.
- Se encuentran en zonas no codificantes del ADN
- Poseen una alta tasa de mutación
- Utilizados como marcadores moleculares en una gran
variedad de aplicaciones en el campo de la genética, como
pueden ser parentescos y estudios de poblaciones.

Desemparejamiento por deslizamiento de cadenas

 Mutaciones vs Polimorfismos
Variación genética  presencia de cambios genéticos heredables a nivel celular que además son
transmitidos a la siguiente generación si afectan a la línea germinal (pero no son transmitidos si
solamente afectan a células somáticas).

Cuando un locus se presenta, al menos, en dos formas alélicas y la frecuencia alélica del
alelo más raro es mayor o igual del 1%, se dice que ese locus se llama locus polimórfico, y
esa variación se denomina polimorfismo.
Las mutaciones pueden considerarse patológicas o anormales, y con una frecuencia
alélica en la población menor al 1%.
 Generación de Variación Genómica
1- Recombinación entre cromosomas homólogos
2- Mutación
- En cada división celular se incorporan 6x109 nucleótidos
- Se producen 1017 divisiones celulares durante la vida media de un individuo
- Se requiere copiar sin errores 6x1026 nucleótidos
- ADN polimerasa  1 error cada 10.000 nucleótidos incorporados (sin corrección)
1 error cada 10.000.000 nucleótidos incorporados (con corrección)
- Para un genoma diploide de 6x109nucleótidos
 600 mutaciones por cada división celular en cada célula del organismo

Sistemas celulares de reparación del ADN  repara la mayoría de las mutaciones

introducidas en el genoma, contribuyendo a mantener una fidelidad alta.
LAS TASAS DE DIVISIÓN CELULAR SON DISTINTAS EN LA LÍNEA GERMINAL
QUE EN LOS DIFERENTES TEJIDOS.
1,0x10-9 substituciones por nucleótido por división en células somáticas
1,3x10-8 substituciones por nucleótido por generación en la línea germinal

EQUILIBRIO ENTRE MUTACIÓN-REPARACIÓN-SELECCIÓN

 Mecanismos de reparación del ADN en humanos
1- Reparación de desemparejamientos entre nucleótidos normales
sistema MMR  hMLH1, hMSH2, hMSH3, hMSH6, hPMS1, hMLH3 y hPMS2

90% de los pacientes con Cáncer Colorrectal no-polipósico hereditario o Síndrome de Lynch
tienen mutaciones en uno de los genes del sistema MMR
Mecanismos de reparación del ADN en humanos
2- Reparación de nucleótidos dañados
4 mecanismos  reversión directa, BER (Base Excision Repair), NER (Nucleotide Excision
Repair) o por polimerasas capaces de pasar por encima de la lesión

Mutaciones en genes que codifican

otras proteínas asociadas con NER
dan lugar a varias enfermedades:
- Xeroderma pigmentosum,
- Tricotiodistrofia

Aumento del riesgo de aparición de

melanoma
Mecanismos de reparación del ADN en humanos
3- Reparación de roturas de la doble hebra del ADN.
Roturas bicatenarias del ADN (DSB)  recombinación homóloga en meiosis y mitosis, y
para la reordenación V(D)J de genes de las inmunoglobulinas y receptores de células T.
2 vías de reparación en diferentes fases del ciclo celular:
- Fusión no homóloga de extremos (NHEJ): G1/S (antes de la replicación del ADN)
- Recombinación homóloga (HR): S/G2,

Proteína RAD51 interacciona con:

- BRCA2 de forma directa
- BRCA1 de forma indirecta
Estudio de las enfermedades genéticas
El diagnóstico de enfermedades genéticas se realiza mediante
- la identificación clínica de los síntomas y signos que caracterizan cada síndrome
- los datos aportados por el laboratorio
HETEROGENEIDAD GENÉTICA vs HETEROGENEIDAD ALÉLICA
Heterogeneidad genética:
Varios genes pueden ser los responsables de una única enfermedad.
Heterogeneidad alélica
Aunque se conozca el gen implicado, las mutaciones responsables del cuadro clínico
pueden estar distribuidas por todo el gen, siendo necesario analizar toda la región
codificante.
DIAGNÓSTICO DIRECTO vs DIAGNÓSTICO INDIRECTO
Diagnóstico directo:
Análisis de un individuo para ver si es portador de la mutación concreta que causa la
enfermedad en esa familia
Diagnóstico indirecto
Análisis de marcadores genéticos en la familia para ver si el consultando ha heredado el
cromosoma que lleva la mutación
FIN DE LA PARTE 1 – MÓDULO I