INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ACAPULCO

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

EQUIPO: 4 GRUPO: “B”

DISEÑO EXPERIMENTAL 8°: SALMONELLA.

ALUMNO: BENÍTEZ ROJAS LAURA ISABEL

N ° DE CONTROL: 15320526

PROFESOR: M.C. MIGUEL ÁNGEL DÍAZ ALDAY

FECHA DE ENTREGA: 28 OCTUBRE DE 2018

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CONTENIDO
INVESTIGACIÓN ............................................................................................... 3
FUNDAMENTO .............................................................................................. 4
Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y Servicios. “Método
para la determinación de Salmonella en alimentos”. .......................................... 4
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 5
HIPOTESIS ........................................................................................................ 5
PROCEDIMIENTO ............................................................................................. 6
METODOLOGIA: Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y
Servicios. “Método para la determinación de Salmonella en alimentos”. ........... 8
PRUEBAS BIOQUIMICAS ................................................................................. 9
I. Agar TSI:...................................................................................................... 9
II. Agar urea: .................................................................................................... 9
IV. Medio para Voges- Proskauer (VP): ....................................................... 11
V. Medio para reacción de indol:................................................................. 11
VI. Citrato Simmons ..................................................................................... 11
VII. Caldo manitol.......................................................................................... 11
VIII. Caldo malonato ...................................................................................... 12
MATERIALES:.................................................................................................. 12
CÁLCULOS ...................................................................................................... 12
BIBLIOGRAFÍA Y LINKOGRAFÍA .................................................................... 13

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INVESTIGACIÓN
El género Salmonella se incluye en la familia Enterobacteriaceae, integrada por
bacilos Gram negativos anaerobios facultativos. Poseen, por lo tanto, las
características generales de las enterobacterias: son fermentadores de la
glucosa, catalasa positiva, oxidasa negativa y suelen ser móviles; representa
una excepción Salmonella gallinarum, siempre inmóvil.
La nomenclatura de Salmonella es compleja. Se han usado diferentes sistemas
para referir a este género. Teniendo en cuenta que estas bacterias tienen una
muy importante homología general de su ADN, deberían ser caracterizadas
como dos únicas especies. Esta propuesta, formulada por Le Minor y Popoff en
la década de los ochenta, no ha sido completamente aceptada. No obstante, y
teniendo en cuenta la necesidad de uniformizar la comunicación entre los
distintos actores (médicos, veterinarios, químicos, etc.), la mayoría ha optado
por seguir una antigua propuesta de Kaufmann, con las más recientes
modificaciones (formuladas desde el Centro de Referencia colaborador de la
OMS, en el Instituto Pasteur); así, se divide el género en dos especies:
Salmonella enterica y Salmonella bongori, diferenciables entre sí por
características metabólicas tales como la hidrólisis del ONPG, el crecimiento en
presencia de KCN y otras.
Salmonella enterica se subdivide, a su vez, en seis subespecies: enterica (I),
salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houenae(IV), e indica (VI) que
corresponden a los antiguos subgéneros. Estas subespecies son diferenciables
bioquímicamente.
Como todas las enterobacterias, el género Salmonella tiene tres tipos de
antígenos: somático (O), flagelar (H) y de envoltura, para Salmonella (Vi). Los
antígenos somáticos son termoestables y su especificidad radica en el
componente polisacárido de la endotoxina, complejo proteína- lipopolisacárido.
Los antígenos O se clasifican en mayores y menores; los mayores son los que
definen un grupo antigénico. Así, el factor antigénico 0:4 caracteriza el antiguo
grupo B, hoy llamado O:4, mientras que los antígenos menores tienen menor
valor discriminativo. Por ejemplo, el antígeno O:12 lo presenta toda Salmonella
perteneciente a los grupos A, B y D. Pueden encontrarse otros antígenos
menores generados por modificaciones químicas o por conversiones fágicas.
Los antígenos capsulares o de envoltura sólo lo presentan algunos serotipos de
Salmonella (Typhi y Dublin). Los antígenos flagelares son proteicos y
termolábiles. Algunas serovariedades sólo producen un único tipo de antígeno
H, siendo, en consecuencia, monofásicos. Sin embargo, otros serotipos pueden
producir alternativamente dos tipos de antígenos H, por lo que se denominan
bifásicos.
Mediante el uso de reacciones antígeno anticuerpo se determina la fórmula
antigénica de una cepa y, a partir de dicha fórmula, se la clasifica en serovar o

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serotipo siguiendo el esquema propuesto originalmente por Kauffman y White

(que agrupa todas las serovariedades conocidas, mas de dos mil quinientos).

FUNDAMENTO
La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un
esquema general que consiste de 4 pasos básicos:
Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un
medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella
dañadas, logrando de esta manera una condición fisiológica estable.
Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte
dos condiciones, por un lado, debe incrementar las poblaciones de Salmonella
y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra.
Selección en medios sólidos, este punto se deriva directamente del anterior y
se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros géneros
diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual característico
de colonias sospechosas.
Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los
cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y Servicios. “Método

para la determinación de Salmonella en alimentos”.

La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un

esquema general que consiste de 5 pasos básicos:

2.1 Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un

medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella
dañadas a una condición fisiológica estable.

2.2 Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las

poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.

2.3 Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que
restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el
reconocimiento visual de colonias sospechosas.

2.4 Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los

cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

2.5 Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación

específica de un cultivo.

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La calidad microbiológica de los alimentos es fundamental porque influye en su
conservación y vida de anaquel y, sobre todo, porque los microorganismos
presentes en ellos, pueden ser causantes de enfermedades transmitidas por
alimentos ó ETA’s.
La detección en el laboratorio de los microorganismos patógenos puede ser
muy complicada, muy lenta y/o muy costosa para determinaciones rutinarias.
Además, es concluyente cuando se encuentra un microorganismo patógeno,
pero puede haber casos en que no se detecte por razones circunstanciales
como el clima o la cantidad de individuos infectados que están contaminando, a
pesar de que el manejo del alimento implique el riesgo de que el patógeno
aparezca en cualquier momento. En todo caso, la investigación de
microorganismos patógenos en alimentos no facilita un enfoque preventivo.
Por esas razones, las normas en materia de alimentos, generalmente
establecen la calidad microbiológica en términos de microorganismos
indicadores. Éstos son organismos (o grupos) que advierten oportunamente de
un manejo inadecuado o contaminación que incrementan el riesgo de
presencia de microorganismos patógenos en alimentos. Además de que su
detección en el laboratorio es más sencilla, rápida y/o económica, los
microorganismos indicadores permiten un enfoque de prevención de riesgos,
puesto que advierten manejo inadecuado y/o contaminación.
La selección de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de los
riesgos implicados y de lo que se requiera saber para liberar, controlar o
mejorar el alimento, manteniendo el enfoque preventivo.

HIPOTESIS
Se espera que el alimento no se encuentre contaminado debido a que suele
estar en contacto directo con el público en general, y el microorganismo
presenta gran patogenicidad representando un riesgo para la población.

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OBJETIVO GENERAL

El presente procedimiento tiene como objetivo describir la metodología llevada

a cabo por el Laboratorio de Microbiología para realizar la detección,
aislamiento e identificación de Salmonella spp. en muestras de alimentos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Investigar la presencia de Salmonella en alimentos de consumo

humano.
Realizar un recuento de Salmonella.
Conocer el método de análisis y el uso de los medios de cultivo.

PROCEDIMIENTO
I. Como en este caso la muestra a estudiar han sido huevos crudos de
gallina se toman diez de estos y se los reparte equitativamente en dos
frascos grandes estériles (al introducirlos se los rompe). Luego se le
agrega 225 mL de caldo lactosado (enriquecimiento no selectivo).

II. Los frascos se los envía a estufa a 30 ºC por 24 h.

III. Pasado el tiempo, se preparan los tubos conteniendo 10 mL de los

medios de enriquecimiento selectivo (dos con caldo selenito y dos con
caldo tetrationato).

IV. Se inocula 1 mL de la muestra anterior a cada uno de los tubos y luego

se los separa, un par de tubos (C. selenito y C. tetrationato) van a
incubación a 37 ºC y el otro par de tubos van a 42 ºC y ambos por 24 h.

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V.
Pasado el tiempo de incubación, se siembran de cada uno de los tubos
en placas con agar S-S. Éstas se incubarán a 37 ºC por 24 h.

VI. Luego, se realizarán a las colonias características, las pruebas

bioquímicas necesarias para su identificación.

Muestra

225 mL caldo lactosado + 25 mL muestra

Enriquecimiento no
selectivo

30 ºC x 24 h.
1 mL 1 mL Enriquecimiento
selectivo

Caldo Caldo Caldo Caldo

Selenito Tetrationato Selenito Tetrationato

Incubar por 24 h.
37 ºC 42 ºC

Luego se siembran
en agar SS

Se incuba a 37 ºC
por 24 h

Pruebas bioquímicas

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METODOLOGIA: Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y

Servicios. “Método para la determinación de Salmonella en alimentos”.

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PRUEBAS BIOQUIMICAS
I. Agar TSI:
Con una aguja de inoculación hacer una punción en el fondo y estriar
el pico de flauta. Incubar a 37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3 h.
Interpretación:
Fondo:
✓ amarillo: glucosa positiva
✓ rojo o sin cambio: glucosa negativa
✓ negro: formación de H2S
✓ burbujas o ruptura de agar: formación de gas a partir de la
glucosa
Pico de flauta:
✓ amarillo: lactosa y/o sucrosa positivo
✓ rojo o sin cambio: lactosa y sucrosa negativo.
✓ Las cepas típicas de Salmonella dan reacción alcalina (color
rojo) en el pico de flauta y ácida (color amarillo) en el fondo,
con formación de gas y (en aproximadamente en el 90% de
los casos) formación de H2S (ennegrecimiento del agar).
En presencia de una Salmonella lactosa positiva el pico de flauta del TSI es
de color amarillo. Por esto la confirmación preliminar de Salmonella no debe
basarse solamente en los resultados del TSI.
II. Agar urea:
Con un aguja de inoculación estriar el pico de flauta.Incubar a 37ºC ± 1ºC
durante 24 h ± 3 h y examinar en intervalos.
Reacción positiva: por hidrólisis de la urea se libera amonio que vira el
color del indicador rojo de fenol a rosa y luego a color cereza. La reacción
generalmente parece después de 2 h a 4 h.

III. LIA
Fundamento: Es un medio para detectar enzimas que descarboxilan o
desaminan la lisina en bacilos gramnegativos. Adicionalmente detecta enzimas
que producen sulfuro de hidrógeno y gas proveniente de la glucosa.
No existen Enterobacterias que posean las dos enzimas (descarboxilasa y
desaminasa de la lisina) por lo que sólo se tiene que observar, o una de ambas
reacciones o la ausencia de ambas.

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Lectura e interpretación:
Kalium- Kalium K/K: Se observa tubo color violeta, descarboxilación de la
lisina con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es
abundante y (g) si es poca. Se interpreta Lisina Positiva.
Rojo-Acido R/A: Se observa tubo color rojo superficie y amarillo fondo,
desaminación de la lisina, con producción o no de gas, la cual se representa
con (G) si es abundante y (g) si es poca. Se interpreta Lisina desaminasa.
Kalium-Kalium K/K+: Se observa tubo color violeta superficie y negro fondo,
descarboxilación de lisina, con producción de H2S la cual se representa por
(+), con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante
y (g) si es poca.
Kalium-Acido K/A: Se observa tubo color violeta en la superficie y amarillo
en el fondo, el color amarillo se debe a la fermentación de glucosa. Puede
haber o no producción de gas. Se interpreta Lisina negativa. Quiere decir que
no descarboxilo ni desamino la lisina.

Nota: Es importante diferenciar las diferentes reacciones del tubo de LIA,

conocer cuando el microorganismo es lisina positiva, lisina negativa y lisina
desaminasa. Las cuáles serán de mucha utilidad junto con la fermentación de
lactosa en el plato de MacConkey para realizar montaje del resto de bioquímica
de identificación.

IV. SIM
El medio SIM es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad,
producción de indol y de sulfuro de hidrógeno por los microorganismos. Es útil
para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

V. RM:

Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener

estables productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa.
Lectura e interpretación:
El RM es positivo si se observa un anillo de color rojo en la superficie del medio
al agregar 2gts de reactivo rojo de metilo.

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VI. Medio para Voges- Proskauer (VP):

Resuspender un ansada de la colonia sospechosa en un tubo estéril con 3
ml de caldo VP, Incubar a 37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3 h después de la
incubación agregar 2 gotas de la solución de creatina, 3 gotas de la solución
alcohólica de 1-naftol y 2 gotas de la solución de KOH; agitar después del
agregado de cada reactivo.
VII. Medio para reacción de indol:
Resuspender una ansada de la colonia sospechosa en un tubo estéril con 5
ml de caldo triptona – triptofano. Incubar a 37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3 h.
Después de la incubación agregar 1 ml de reactivo de Kovacs.
✓ Reacción positiva: formación de un anillo rojo
✓ Reacción negativa: formación de un anillo amarillo – marrón.

VIII. Citrato Simmons

El agar citrato es utilizado para evaluar la habilidad de un microorganismo
de utilizar el citrato como fuente de energía. Este medio contiene citrato
como única fuente de carbono y sales amonio inorgánico como única fuente
de nitrógeno. El crecimiento indica la utilización de citrato, un metabolito
intermedio en el ciclo de Krebs. Cuando la bacteria metaboliza el citrato, las
sales de amonio se desdoblan en amoníaco, el cual aumenta la alcalinidad.
El cambio del pH en el medio, produce un cambio del indicador azul de
bromotimol de verde hacia azul (en un pH mayor a 7,6). Este medio es
recomendado como parte de la diferenciación de especies de
Enterobacteriaceae.

IX. Caldo manitol

Agar Manitol salado o siglas en inglés MSA (Mannitol salt agar) es un medio
de cultivo que se utiliza normalmente en microbiología. Permite el
crecimiento de bacterias Gram-positivas mientras inhibe el crecimiento de
Gram-negativas. Este medio es importante en el laboratorio clínico debido a
que es capaz de distinguir los microorganismos patogénicos en un corto
periodo de tiempo. Contiene una alta concentración (~7.5%-10%) de sal
(NaCl), haciéndolo selectivo para Staphylococcus (y 'Micrococcaceae)
debido su alta concentración de NaCl es inhibitorio para la mayoría de las
bacterias Gram negativas. Además, contiene manitol otro inhibidor de
bacterias Gram negativas y un indicador de pH indicador de fermentación;
rojo de fenol.

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X. Caldo malonato

Fundamento: Evalúa la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato

como única fuente de carbono y la desaminación de la fenilalanina, en forma
combinada. Las Enterobacterias no tienen la capacidad enzimática de realizar
las dos reacciones simultáneamente, por lo que, o se observa la utilización del
malonato o la desaminación de la lisina. Lectura e interpretación: Un viraje de
color verde al azul, da una reacción positiva, de lo contrario es negativa.

MATERIALES:

Muestra de alimentos
Medio de enriquecimiento no selectivo (caldo lactosado)
Medio de enriquecimiento selectivo (caldo selenito y caldo
tetrationato)
Agar S-S.
Placas Petri
Tubos de dilución
Frascos
Pipetas
Mechero Bunsen
Gradillas

CÁLCULOS
Reportar presencia o ausencia de Salmonella spp. o la especie identificada en
25.0 g o mL de alimento, o en la cantidad de muestra inicialmente pesada
(mayor a 25.0 g o mL).

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BIBLIOGRAFÍA Y LINKOGRAFÍA
Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y Servicios. “Método
para la determinación de Salmonella en alimentos”.

Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products.

American Public Health Association. Copyright, Washington,

D. C. D’Aoust J., Maurer J. & Bailey J.S. (2001). Salmonella Species. In: Food
Microbiology. Fundamentals and Frontiers. Doyle M., Beuchat L.R. & Montville
T.J. (Eds.) 2d. ed. ASM Press USA: 141-157.

Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9 th

ed. Arlington, VA: AOAC.

Andrews W.H., Flowers R.S., Silliker J., & Bailey S. (2001) “Salmonella”. In:
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed.
Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington: 357-380.

International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005)

“Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed.

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