2.
Treinar técnicas fixadas e coradas de
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Campus Campo Mourão
Coordenação de Alimentos
Disciplina de Microbiologia
Profa. Márcia R. F. G. Perdoncini
AULA PRÁTICA n°
Preparações microscópicas a fresco, fixadas
simples e coloração de Gram.
Coloração simples
INTRODUÇÃO
Preparações microscópicas compreendem
técnicas de tratamento de espécimes
microbianos em lâminas a serem examinadas ao
microscópio. Células microbianas podem ser
examinadas vivas, a fresco, sobre lâminas, com
auxílio ou não de corantes, vitais, ou podem ser
fixadas pelo calor sobre a lâmina e coradas com
corantes químicos específicos.
A visualização microscópica a fresco é difícil
devido ao tamanho reduzido e ao índice de
refração dos microrganismos que se aproximam
ao da água, tornando-os praticamente incolores,
quando suspensos em um meio aquoso.
Apesar da dificuldade de visualização,
preparações microscópicas a fresco são úteis
para observar a viabilidade e algumas atividades
celulares, como motilidade e fissão binária, e
para observar o tamanho e a forma natural das
células microbianas.
Para diferenciar os microrganismos em grupos
específicos com o propósito de diagnosticar e de
estudar suas propriedades, utilizam-se corantes e
técnicas de coloração que constituem
ferramentas essenciais nas preparações
microscópicas. Um corante é, geralmente, um
sal, no qual um dos seus íons é um cromóforo.
Se o cromóforo é positivo, o corante é básico,
como é o caso do azul de metileno, do cristal
violeta ou da fucsina. Se o cromóforo é negativo,
o corante é ácido, como o ácido pícrico.
Corantes básicos, carregados positivamente, são
ideais para corar bactérias, porque os ácidos
nucléicos e alguns componentes da parede
celular apresentam carga negativa e são atraídos
por cromóforos catiônicos.
Nas técnicas de coloração simples, células
microbianas fixadas sobre uma lâmina são
coradas com um único corante.
OBJETIVOS
1. Preparar lâminas a fresco para
observação de algumas amostras de
leveduras;
preparação de bactérias para exame
microscópico;
3. Treinar manuseio adequado do
microscópio óptico composto;
4. Diferenciar bactérias de acordo com a
morfologia (forma e arranjo) de suas
células.
MATERIAIS E MÉTODOS
Corantes utilizados: cristal violeta e azul de
metileno. Solução salina estéril.
Técnica de coloração a fresco
- Flambar rapidamente uma lâmina de
microscopia limpa, nos dois lados, “cortando”,
lentamente, a chama do bico de Bunsen;
- Flambar a alça de repicagem ao rubro e, a
seguir, deixá-la esfriar, conservando-a, todavia,
perto da chama;
- Tomar o tubo com a suspensão de leveduras,
agitá-lo levemente com a mão esquerda e com o
dedo mínimo e anular da mão direita, remover o
tampão de algodão da boca do tubo;
- Flambar a boca do tubo de cultura;
- Introduzir a alça de repicagem, presa entre o
polegar e o indicador da mão direita, no interior
do tubo, até tocar a suspensão;
- Flambar novamente a boca do tubo de cultura;
- Tomar uma lâmina (anteriormente preparada)
com a mão e depositar em seu centro uma
gotícula da suspensão;
- Pingar uma gota de azul de metileno a pequena
distância da suspensão e, sobre a lâmina,
colocar uma lamínula;
- Observar ao microscópio na objetiva de 40x.
Técnica de coloração simples com material
sólido
- Colocar no centro da lâmina uma pequena gota
de solução fisiológica com a alça de repicagem;
- Transferir uma pequena alíquota da cultura
sólida para a lâmina, colocar sobre ela uma gota
de solução fisiológica e espalhar o material com
movimentos circulares (esfregaço);
- Em seguida, “cortar”, lentamente, a lâmina na
chama do bico de Bunsen, a fim de que o
material fique bem aderente à lâmina (fixação);
- Cobrir a lâmina com o esfregaço fixado com o
cristal violeta por 1 minuto e, em seguida, lavar
com água;
- Observar ao microscópio na objetiva de 100x.
OBS. Quando a cultura estiver em meio líquido,
não utilizar solução fisiológica para o esfregaço.
Para fazê-lo, utiliza-se a alíquota da cultura
diretamente na lâmina que deve ser cortada
sobre o bico de Bunsen até secar, repetindo-se a
operação cinco vezes.
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO
1. Descreva detalhadamente o processo de
esfregaço, a partir de uma cultura bacteriana
sólida.
2. Qual a diferença entre o esfregaço de cultura
sólida e o de cultura líquida?
3. Como se faz a fixação de um esfregaço
bacteriano? Qual é a finalidade da fixação?
4. Esquematize as preparações a fresco e as
preparações coradas simples observadas.
Coloração a fresco Coloração simples
se encontra uma camada de lipoproteínas, de
fosfolipídeos, de proteínas e de
lipopolissacarídios.
A coloração de Gram envolve a aplicação de
quatro reagentes: cristal violeta (CV) e lugol (iodo
metálico e iodeto de potássio) (I), que formam um
complexo insolúvel (CV-I); álcool-acetona, que
funciona como solvente de lipídios e desidratante
de proteínas, e fucsina ou safranina.
O tratamento com álcool-acetona extrai os
lipídios, resultando no aumento da
permeabilidade da parede celular das bactérias
Gram-negativas. Assim, o complexo cristal
violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado, e as
bactérias Gram-negativas são descoradas. A
parede celular das bactérias Gram-positivas, em
virtude de sua composição, torna-se desidratada
durante o tratamento com álcool. Além disso, a
permeabilidade é reduzida, e o complexo CV-I
não pode ser extraído. Finalmente, utiliza-se
fucsina ou safranina que funciona como corante
básico de contraste (contracorante). O tratamento
com fucsina ou safranina não altera a cor roxa
das Gram-positivas, ao passo que as Gram-
negativas, descoradas pelo álcool, tornam-se
avermelhadas.

OBJETIVOS
1. Aprender a técnica de coloração de Gram;
2. Aprender os fundamentos da coloração de
Técnicas de coloração de Gram Gram;
3. Comparar a estrutura da parede celular
das bactérias Gram-positivas e Gram-
INTRODUÇÃO negativas.
Corantes são substâncias que possuem a
propriedade de transmitir sua cor a outros corpos.
As colorações em microbiologia são de vital
importância, pois funcionam como opção na MATERIAIS E MÉTODOS
identificação presuntiva dos diversos agentes
patogênicos.
Preparações coradas são comumente usadas no
exame microscópio de bactérias e de fungos em
microbiologia, em que esfregaços de material são
submetidos à ação de um ou mais corantes após
a fixação.
A maioria das bactérias é corada pelo método de
Gram, que permite observar sua morfologia e
fornece informações a respeito do
comportamento do material celular diante de
corantes básicos (corantes de Gram). Essa
técnica separa as bactérias em dois grupos:
Gram-positivas e Gram-negativas.
A coloração é chamada de Gram devido ao Dr.
Christian Gram, que descreveu pela primeira vez
esse processo de coloração em 1884, ao fazer
uma referência à composição da parede celular.
As bactérias Gram-positivas possuem uma
espessa camada de peptidioglicano e de ácido
teicóico; enquanto as Gram-negativas possuem
uma fina camada de peptidioglicano sobre a qual
 A. Materiais
- Cultura de bactérias Gram-positivas
(Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus);
- Cultura de bactérias Gram-negativas Figura 1:
(Escherichia coli, Pseudomonas, Salmonella);
- Tubos com salina estéril.
- Cristal violeta (corante);
- Lugol (mordente);
- Álcool-acetona (descorante);
- Fucsina ou safranina (corante).

B. Método
- Fazer um esfregaço bem homogêneo, fixar pelo
calor e esperar esfriar (conforme roteiro de aula
prática parte 1);
- Cobrir com cristal violeta, e deixar agir por 1
minuto;
- Lavar rapidamente com água;
- Cobrir com solução de lugol durante 2 minutos; Figura 2
- Lavar em água corrente;
- Lavar a lâmina com álcool-acetona até que não
se desprenda mais corante da preparação
(aproximadamente 15 segundos);
- Lavar rapidamente a lâmina com água;
- Corar com fucsina durante 30 segundos;
- Lavar a lâmina com água e, em seguida, deixar
secar ao ar ou entre papel de filtro;
- Observar ao microscópio, focalizando com a
objetiva de imersão (100x).

EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO
(continuação da parte 1)
Referências
5. Descreva a técnica de coloração de Gram. OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologia-
6. Explique por que as bactérias Gram-negativas roteiros de aulas práticas. São Paulo: Tecmedd,
apresentam coloração diferente das bactérias 2008.
Gram-positivas.
7. Preencha o quadro a seguir: NOTA:
Qualquer processo de coloração segue basicamente três
Microrganismo Forma Arranjo Cor Gram passos:

1. Preparo do esfregaço: O esfregaço é a

8. Qual tipo de bactéria (gram negativa ou gram
positiva) está representada na figura 1 e 2?
colocação dos microrganismos na lâmina de
vidro para serem submetidos à coloração.
Deve ser oval e delgado.
2. Fixação do esfregaço: serve para fixar os
microrganismos do esfregaço na lâmina de vidro,
para que posteriormente não sejam removidos
durante o processo de coloração.
• Este procedimento faz com que o protoplasma
das células dos microrganismos se coagule,
aderindo- os desta forma na lâmina.
• A forma mais utilizada de fixação de esfregaço, é
passá-lo pela chama umas três vezes. Há também
outros processos utilizando produtos químicos.
3. Coloração propriamente dita: são os
procedimentos de cada técnica de coloração.