UNIVERSIDAD NORBERT WIENER

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

QUÍMICA ANALÍTICA E INSTRUMENTAL

S-15
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Mg. Gerardo De Lama Carrillo

2019 - I
 INDICE
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Fase estacionaria, fase móvil.
Tipos de columnas y detectores.
Tipos de trabajo en HPLC: fase normal, fase reversa
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

 Y Cromatografía de líquidos de alta eficacia

 Fase móvil, líquido a alta presión

 Fase estacionaria sólido en columnas de un diámetro de 3 a 10 micras.

 Analito: líquido.

 Utiliza instrumentación especializada.

INSTRUMENTACIÓN
 INSTRUMENTACIÓN

RESERVORIO DE LA FASE MOVIL

 El RESERVORIO ES EL RECIPIENTE QUE CONTIENE LA FASE MÓVIL.

 PUEDE EMPLEARSE COMO RESERVORIO DE FASE MÓVIL, CUALQUIER FRASCO DE

LABORATORIO DE BUENA CALIDAD (DE VIDRIO, O POLÍMERO RESISTENTE), CON UNA TAPA
ADECUADA PARA PREVENIR EL INGRESO DE PARTÍCULAS AMBIENTALES AL SISTEMA.

 LA CAPACIDAD DEL FRASCO DEPENDE, LÓGICAMENTE, DEL CONSUMO ESPERADO.

 INSTRUMENTACIÓN

BOMBA
 LAS BOMBAS DE HPLC IMPULSAN LA FASE MÓVIL PROVENIENTE DEL RESERVORIO DE
SOLVENTE HACIA EL INYECTOR Y DESDE ALLÍ HACIA LA COLUMNA.

 SU CAUDAL DE TRABAJO PUEDE SER MUY VARIABLE, SEGÚN LA ESCALA DE TRABAJO

ESCOGIDA

CARACTERISTICAS DE LAS BOMBAS

• CAUDAL.- LOS EQUIPOS CONVENCIONALES TRABAJAN CON CAUDALES DE 0.1 Y 10 mL/mL Y CON
PRESIONES HASTA 6200 psi.

• RUIDO.- SE REFIERE A LAS PULSACIONES QUE PRESENTA LAS BOMBAS DE TIPO RECIPROCANTE.
(MENOR DE 0.5 %).

• DERIVA.- ES UN CAMBIO CONTINUO EN LA ENTREGA DE SOLVENTE QUE SE PRODUCE EN

IINTERVALOS DE TIEMPOS MUY LARGO. ESTO ES UNA CONSECUENCIA DE LA PRECISIÓN Y
EXACTITUD DEL FLUJO DEL SOLVENTE.

• SISTEMAS DE CORTE.- PARA CUANDO LA PRESIÓN SUPERE LOS VALORES LÍMITES DE PRESIÓN
TANTO SUPERIOR COMO INFERIOR PREESTABLECIDOS.
 INSTRUMENTACIÓN

INYECTORES
 ES EL DISPOSITIVO QUE PERMITE INTRODUCIR LA MUESTRA EN SOLUCIÓN, SIN
INTERRUMPIR EL CAUDAL DESOLVENTE A TRAVÉS DEL SISTEMA.

 CARACTERISTICAS :
o DEBE SER FÁCIL DE OPERAR.

o DEBE SER INERTE AL ATAQUE

QUÍMICO Y SOPORTAR ALTAS
PRESIONES.

o DEBE SER PRECISO EN CUANTO A

LA CANTIDAD INTRODUCIDA EN EL
SISTEMA.

o NO DEBE PROVOCAR DILUCIONES

IMPORTANTES DE LA SOLUCIÓN
INYECTADA.
 INSTRUMENTACIÓN

Columnas HPLC

 Dimensión -Longitud (L) y diámetro interno (dc)

 Características del empaquetamiento
• Tipo - sílica o polímero
• Tamaño de la partícula (dp)
• Tamaño de poro(dpore)
• Grupo enlazado (determina el modo cromatográfico)
 Materiales Preferidos en la construcción del cuerpo de la columna: Acero
Inoxidable, PEEK, Vidrio rayado
 INSTRUMENTACIÓN

Columnas HPLC

Tipo de Columna i.d. Capacidad de Velocidad

(mm) la muestra de Fluljo
(mg) (mL/min)
Semipreparativa 8-20 10-50 5-30

Analítica Estándar 4.6 1 1

Narrowbore 2.0 0.2 0.2

Microbore 1.0 0.05 0.05

 INSTRUMENTACIÓN

Columnas HPLC
 INSTRUMENTACIÓN

Columnas HPLC
Tipos de Soporte
• Silica (o alumina)
– Es el soporte predominante de LC con un excelente rendimiento.
– Los grupos silanol (Si-OH, siempre presentes en las superficies de sílica)
se encuentran típicamente enlazados con grupos silanos para modificar la
superficie.
– Sus límites de pH se encuentran entre 2.5 - 8
• Soportes de materiales poliméricos (poliestireno, poliéteres, polimetacrilatos)
– Se han introducido rápidamente con una alta eficiencia
– Muy utilizada en bioseparaciones
– Amplio ámbito de pH (1-14), buena reproducibilidad y ausencia de grupos
silanol.
 INSTRUMENTACIÓN
Columnas HPLC
Guía para la selección de una fase enlazada
• C18
– Fase enlazada más utilizada, retiene muy bien y es muy estable
– Las columnas C18 de diferentes vendedores tienen diferentes características de
selectividad.
• C8
– Se prefiere para fases móviles con bajo contenido de fase orgánica
• C4
– Se utiliza con frecuencia para separaciones de proteínas (C18 se prefiere para péptidos)
• CN
– Tanto para NP o RP; Utilizada para algunas aplicaciones específicas (ejm.
antidepresantes)
• Fenil
– Para separaciones en RP de compuestos medianamente polares y básicos, selectividad
única para aromáticos
• Amino
– Se utiliza para reemplazar la silica en separaciones por NP, análisis de azúcares.
 INSTRUMENTACIÓN
DETECTORES

EL DETECTOR ES LA PARTE DEL EQUIPO CROMATOGRÁFICO QUE PERMITE “VER” Y

UBICAR EN TIEMPO Y ESPACIO LA POSICIÓN DE CADA COMPONENTE DE UNA MUESTRA
A LA SALIDA DE LA COLUMNA CROMATOGRÁFICA

CARACTERISTICAS :

• TENER UN AMPLIO RANGO DINÁMICO DE RESPUESTA.

• POSEER UNA RESPUESTA LINEAL.

• NO CONTRIBUIR AL ENSANCHAMIENTO DE BANDA EXTRACOLUMNAR.

• RESPONDER A TODOS LOS SOLUTOS.

• TENER LA SENSIBILIDAD APROPIADA.

• POSEER UNA BUENA RELACION SEÑAL/RUIDO.

• NO DESTRUIR LA MUESTRA.

• TENER UNA CONSTANTE DE TIEMPO BAJA.

 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES

Detector UV/Vis
• Un detector UV/Vis consiste típicamente de:
– Una fuente de deuterio (190 - 600 nm)
– Un monocromador que incluye una rejilla de difracción movible controlado
por un motor paso a paso, para seleccionar cierta longitud de onda atravez
de una abertura (slit ) de salida hacia una celda de flujo ( de 8 a 12 uL)
– Dos fotodiodos miden las intensidades de los haces de luz de muestra y
referencia
• El principio del detector de absorvancia es la Ley de Beer
Absorvancia = absorvitibidad molar x paso de luz x concentración
A = e b c = - Log I / I0 ,, I0 = Intensidad de luz inicial
• Es el detector más común usado en HPLC – detección en el orden de ng
– Son importantes el ruido(noise)/deriva (drift) para la sensibilidad.
 INSTRUMENTACIÓN
DETECTORES

Detector de Fluorescencia
• Un compuesto fluorescente absorve un fotón (ej., p - p * transición electrónica)
y emite un foton a otra longitud de onda más larga.
• Fluorecencia is 100-1000 veces más sensible que un detector de absorvancia
(pg de detección).
• Ambiental
PAHs: fluorescencia natural, se requiere un detector de longitud de onda
programable
Carbamatos: derivatizacion post columna (OPA)
• Biopharmaceutical, Clinical
Aminas, amino ácidos: OPA, FMOC, Dansyl catecolaminas
Prostaglandinas, ácidos grasos: N-ADM
• Farmacéutica: muchos compuestos tienen fluorescencia natural y otros son
“etiquetados”
• Alimentos y vitaminas
– Vitaminas A, D, E
– Compuestos “etiquetados”, drogas y residuos de pesticidas.
 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES

DETECTOR DE INDICE DE REFRACCION

• MIDE LA DIFERENCIA DE INDICE DE REFRACCIÓN ENTRE EL SOLVENTE PURO Y EL
SOLVENTE QUE CONTIENE LA MUESTRA .
• El IR es universal, pero tienen una baja sensibilidad (0.01 -0.1 mg) en comparación a un
detector de absorvancia.
• La detección IR es mayormente usada para componentes que tienen baja actividad
cromosférica tal como azúcares, trigliceridos, ácidos orgánicos, y polímeros.
• Require una bomba isocrática libre de pulsaciones, solventes desgasificados y horno
para la columna.
 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES

DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS

 INSTRUMENTACIÓN

DETECTORES

DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS

• Este tipo de detectores permiten hacer barridos a distintas longitudes de onda

de cada uno de los componentes separados. De esta manera, se generan una
colección de cromatogramas a diferentes longitudes de onda de cada pico.

• Mediante los arreglos de diodos se puede determinar la mejor longitud de onda

a la que debe monitorearse el compuesto de interés.
 INSTRUMENTACIÓN
DETECTORES
DETECTOR DE
ARREGLO DE DIODOS
 INSTRUMENTACIÓN
CARACTERISTICAS DE LOS DETECTORES CROMATOGRAFICOS
 FORMAS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA

FASE NORMAL O LÍQUIDO-SÓLIDO (NP, LSC)

SEPARACIÓN BASADA EN ADSORCIÓN / DESORCIÓN DEL ANALITO EN UNA
SUPERFICIE POLAR (SÍLICA)

FASE REVERSA (RPC)

LA SEPARACIÓN DE LOS ANALITOS ESTÁ BASADA EN EL COEFICIENTE DE
PARTICIÓN ENTRE LA FASE MÓVIL Y LA FASE ESTACIONARIA QUÍMICAMENTE
ENLAZADA
 FORMAS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA

FASE NORMAL O LÍQUIDO-

SÓLIDO

• UTILIZA FASES ESTACIONARIAS

COMO SÍLICA, ALUMINA, AMINO-,
CIANO O GRUPOS FENILO
QUÍMICAMENTE ENLAZADOS

• FASE MÓVIL NO-POLAR COMO

HEXANO, CH2CL2 CON PROPANOL

• LOS ANALITOS POLARES PRESENTAN

TIEMPOS DE RETENCIÓN LARGOS

• EXCELENTE TÉCNICA PARA

ANALITOS NO-POLARES, ISÓMEROS,
SEPARACIONES DE GRUPOS Y
PROCEDIMIENTOS DE LIMPIEZA DE
MUESTRAS
 FORMAS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA

FASE REVERSA
• SEPARACIÓN BASADA EN LA PARTICIÓN
DE UN ANALITO DENTRO DE UNA FASE
ESTACIONARIA HIDROFÓBICA
QUÍMICAMENTE ENLAZADA SOBRE UN
SOPORTE DE SÍLICA (EJM, C18, C8)
• USA UNA FASE MÓVIL POLAR COMO POR
EJEMPLO UN MEZCLA METANOL /
ACETONITRILO. LOS ANALITOS POLARES
ELUYEN PRIMERO MIENTRAS LOS NO-
POLARES SON MÁS RETENIDOS POR LA
FASE ESTACIONARIA
• MODO CROMATOGRÁFICO MÁS
AMPLIAMENTE UTILIZADO (>60% DE LAS
APLICACIONES)
• PARA ANALITOS POLARES (SOLUBLES EN
AGUA), MEDIANAMENTE POLARES Y
ALGUNOS CUANTOS NO-POLARES
 APLICACIONES

SISTEMAS DE GRADIENTES
¡Muchas gracias!