Persistencia Del Poro D

13/8/2019 Persistencia del poro de transición de permeabilidad en mitocondrias humanas desprovistas de una ATP sintasa ensamblada | PNAS
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NUEVA INVESTIGACIÓN EN
Ciencias fisicas 
Ciencias Sociales 
Ciencias Biologicas 
Persistencia del poro de transición de

permeabilidad en mitocondrias humanas
desprovistas de una ATP sintasa ensamblada
Joe Carroll , Jiuya He , Shujing Ding , Ian M. Fearnley y John E. Walker
PNAS 25 de junio de 2019 116 (26) 12816-12821; publicado por primera vez el 18 de junio de 2019 https://doi-
org.pbidi.unam.mx:2443/10.1073/pnas.1904005116
Contribuido por John E. Walker, 9 de mayo de 2019 (enviado para su revisión el 7 de marzo de 2019; revisado por Michael R. Duchen y
David G. Nicholls)
Información y
Artículo Figuras y SI métricas  PDF
Significado
Las mitocondrias generan el combustible celular, adenosina trifosfato o ATP, para mantener una vida
compleja. La producción de ATP depende de la oxidación de compuestos ricos en energía para producir
una diferencia de potencial químico para los iones de hidrógeno (o fuerza motriz de protones, pmf), a
través de la membrana mitocondrial interna (IMM). La interrupción del IMM, la disipación del pmf y la
muerte celular se producen si la concentración total de calcio dentro de las mitocondrias se eleva lo
suficiente como para abrir un poro en el IMM. Se ha propuesto que el poro se encuentra en el sector de
https://www-pnas-org.pbidi.unam.mx:2443/content/116/26/12816 1/23
la membrana de la ATP sintasa. Aquí, mostramos que cinco proteínas de membrana asociadas con el
estator de la enzima no están involucradas en el poro, y que el poro persiste en ausencia del complejo
enzimático.
Resumen
La apertura del poro de transición de permeabilidad, un canal no específico en las membranas mitocondriales
internas, se desencadena por una concentración total elevada de iones de calcio en la matriz mitocondrial, lo
que conduce a la interrupción de la membrana interna y la muerte celular necrótica. La ciclosporina A inhibe
la apertura de los poros al unirse a la ciclofilina D, que interactúa con los poros. Se ha propuesto que el poro
está asociado con el complejo ATP sintasa. Anteriormente, confirmamos una observación anterior de que el
poro sobrevive en las células que carecen de las subunidades de membrana ATP6 y ATP8 de la ATP sintasa,
y en otras células que carecen de la enzima c 8anillo del rotor o, por separado, sus subunidades periféricas
del tallo by proteína conferral sensible a oligomicina. Aquí, investigamos si el poro está asociado con las
subunidades de membrana restantes de la enzima. La supresión individual de las subunidades e, f, gy el
proteolípido de 6.8 kDa interrumpe la dimerización del complejo, y la supresión de DAPIT (proteína asociada
a la diabetes en el tejido sensible a la insulina) posiblemente influye en la oligomerización de dímeros, pero la
eliminación de cada subunidad no tuvo ningún efecto sobre el poro Además, eliminamos juntos la membrana
de la enzima unida a c 8anillo y la subunidad δ del dominio catalítico. Las células resultantes ensamblan solo
un subcomplejo derivado del tallo periférico y las proteínas asociadas a la membrana. A pesar de la
disminución de los niveles de complejos respiratorios, estas células generan un potencial de membrana para
soportar la absorción de calcio en las mitocondrias, lo que conduce a la apertura de los poros y la retención
de sus propiedades características. Es muy poco probable que la ATP sintasa, dímero o monómero, o
cualquier componente, proporcione el poro de transición de permeabilidad.
mitocondrias humanas transición de permeabilidad ATP sintasa
Durante más de 40 años, se ha reconocido que las mitocondrias contienen el poro de transición de
permeabilidad (PTP), un canal inespecífico que se abre en respuesta a niveles elevados de iones Ca 2+
en la matriz mitocondrial ( 1 ). En consecuencia, las mitocondrias toman agua, sus crestas se hinchan y
sus membranas se rompen. Se han hecho observaciones similares en muchos vertebrados, desde
humanos hasta lampreas y también en plantas y levaduras ( 2 ). Además de los iones elevados de Ca
2+
, la apertura de PTP es promovida por fosfato, disminución de nucleótidos de adenina y especies
reactivas de oxígeno ( 3 ). Esta separación de las membranas mitocondriales interrumpe la síntesis de
ATP y la homeostasis de iones en el orgánulo y conduce a la muerte celular por necrosis (4 , 5 ).
Debido a que la PTP humana se ha implicado en la neurodegeneración, la lesión por isquemia-
reperfusión, la distrofia muscular y el cáncer ( 6 ), el poro se ha estudiado ampliamente en varios tipos
de células y también en mitocondrias aisladas. En condiciones experimentales, la apertura de la PTP en
las células puede ser provocada por altas concentraciones de thapsigargin, un inhibidor de la Ca 2+ -
ATPasa en la retícula sarcoplásmica y endoplásmica, o por un efecto directo sobre las mitocondrias ( 7
). Otra forma es hacer que la membrana plasmática de las células cultivadas sea permeable, ya sea
con ionóforos como la ferutinina ( 8 ) o con el detergente suave digitonina ( 9 ), para proporcionar una
ruta para el Ca 2+ exógenoiones para entrar en las células. El uniportador de Ca 2+ , un componente de
la membrana mitocondrial interna, lleva los iones citoplasmáticos elevados de Ca 2+ a la matriz
mitocondrial, que puede acumular grandes cantidades de Ca 2+ en presencia de fosfato ( 10 , 11 ). Sin
embargo, cuando la concentración total de Ca 2+ en la matriz mitocondrial está suficientemente
elevada, el PTP se abre ( 12 ). La inhibición del uniportador de Ca 2+ con el complejo de rutenio amina
dinuclear con puente de oxígeno, Ru-360, o la interrupción genética del uniportador, reduce la entrada
de iones de Ca 2+ en el espacio de la matriz y el poro permanece cerrado ( 13) El PTP se define
experimentalmente por una serie de propiedades que incluyen las siguientes. Primero, la ciclosporina A
(CsA) inhibe la apertura de la PTP al unirse a la ciclofilina D, una prolil cis-trans isomerasa que se
encuentra en la matriz mitocondrial ( 14 ), que se considera que interactúa y modula la PTP en lugar de
ser un componente integral. En segundo lugar, la apertura de la PTP es inhibida por el ácido bongkrekic
y estimulada por el carboxiatractilato ( 15 ). En tercer lugar, el poro permite que pasen las moléculas
hidrofílicas hasta una masa molecular de 1.500 Da ( 16 ).
Se han propuesto varias proteínas como componentes del PTP y se han rechazado posteriormente ( 17
). Otra propuesta investigada aquí y anteriormente es que el PTP está asociado con el complejo
dimérico ATP sintasa en la membrana mitocondrial interna ( 18 ). Cada monómero constituyente es un
conjunto de 28 proteínas de 18 tipos diferentes organizadas en un dominio extrínseco de membrana,
donde tiene lugar la síntesis de ATP, y un dominio intrínseco de membrana, donde el giro del rotor de la
enzima se genera a partir de la fuerza motriz del protón ( Fig. 1 ) ( 19 ). Los dominios están unidos por
un tallo central (subunidades γ, δ y ε) y un tallo periférico (subunidades b, d, F 6y la proteína conferral
de sensibilidad a oligomicina u OSCP). El subcomplejo del tallo central y un anillo de ocho subunidades
c en el dominio de la membrana constituyen el rotor de la enzima. Una sugerencia es que el PTP está
asociado con este anillo c 8 ( 20 ⇓ - 22 ), y otro es que el OSCP proporciona el sitio de interacción de
ciclofilina D con el PTP ( 18 ). Sin embargo, ninguna sugerencia es sostenible. Las propiedades
características de la PTP persisten en una línea celular humana donde los tres genes que codifican la
subunidad c se han alterado, haciéndolos desprovistos de la subunidad c, y en otros, que carecen de
un tallo periférico en virtud de la interrupción del gen para el OSCP o la subunidad b ( 23 , 24)
Recientemente, investigamos la vía de ensamblaje del brazo de membrana de la ATP sintasa
eliminando las subunidades supernumerarias individuales e, f, g, DAPIT y el proteolípido 6.8-kDa
(6.8PL) y caracterizando los complejos vestigiales de ATPasa ( 25 ). Aquí, hemos aprovechado este
conocimiento para estudiar si la eliminación individual de estas subunidades supernumerarias, que
influyen en la formación de dímeros y su oligomerización, tiene algún efecto sobre el PTP, y en otros
experimentos para ver si las mitocondrias carecen de una ATP sintasa ensamblada. retener las
características de un PTP funcional.
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Figura 1.
Organización de subunidades en el complejo dimérico ATP sintasa en mitocondrias de mamíferos. Los dímeros forman
filas a lo largo de los bordes de las crestas. Las líneas negras representan los límites de la membrana interna entre la
matriz y el IMS (espacio intermembrana). El dominio catalítico F 1 (composición de subunidad α 3 β 3 γδε) que incluye el
tallo central está arriba; Se ha eliminado una subunidad α de cada monómero para exponer la subunidad γ (negra), que se
encuentra aproximadamente a lo largo del eje central del dominio esférico α 3 β 3 . Las subunidades γ, δ y ε están unidas
a la c 8anillo (marrón), y juntas estas subunidades constituyen el rotor. La rotación se genera por la translocación de
protones a través de la interfaz entre el anillo c 8 y ATP6 (azul). Los tallos periféricos están hechos de copias individuales
de las subunidades OSCP, b, d, y F 6. La subunidad b tiene dos hélices α transmembrana N-terminales. El dominio de
membrana también contiene subunidades ATP8 (rojo ladrillo), e (amarillo), f (verde), g (rojo), DAPIT (púrpura) y 6.8PL
(crema), cada una con una sola hélice transmembrana. La región C-terminal de ATP8, se extiende hacia el tallo periférico.
Las subunidades e, f, g, DAPIT y 6.8PL son "supernumerarias" sin funciones conocidas en la generación o hidrólisis de
ATP. En el complejo dimérico, las subunidades ATP6 y 6.8PL proporcionan la interfaz proteica entre los monómeros. Las
subunidades eyg crean un dominio separado que no está en contacto con ATP6 y 6.8PL. Por ejemplo, se ha eliminado un
par en la parte delantera de la estructura dimérica para mayor claridad. La interfaz de dímero y la disposición de
subunidades de membrana supernumerarios se basa en la estructura de dimérica F o de S. cerevisiae (33 )
Resultados
Efecto de la eliminación de subunidades supernumerarias.
De acuerdo con la vía de ensamblaje del brazo de membrana de la ATP sintasa humana ( SI Apéndice , Fig.
S1 ), la eliminación individual de cualquiera de las subunidades supernumerarias e, f, gy 6.8PL evita que los
complejos vestigiales se dimericen ( 25) En contraste, los dímeros persisten en cierta medida cuando se
elimina DAPIT. La apertura de PTP en células que carecen de subunidades supernumerarias individuales se
evaluó mediante tres métodos independientes. Ellos fueron: primero, enfriamiento de calceína-cobalto y
agotamiento de la fluorescencia del éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) en respuesta al tratamiento
de células intactas con thapsigargin (TG) o el ionóforo ferutinina de calcio (FT); segundo, medición de la
capacidad de retención de calcio (CCR) por las mitocondrias en células permeabilizadas con digitonina; y
tercero, la inflamación de las mitocondrias en respuesta al Ca 2+ exógeno en células permeabilizadas
monitoreadas por absorbancia de luz ( 23 , 24) Según lo ensayado por estos métodos, la eliminación de cada
una de estas subunidades supernumerarias no evitó la apertura de la PTP o la inhibición de la apertura por
CsA ( Apéndice SI , Figs. S2-S5 ). Por lo tanto, la interrupción de los dímeros de la ATP sintasa por la
eliminación de cualquiera de las subunidades e, f, gy 6.8PL no influye en la función del PTP, ni tampoco la
eliminación de DAPIT, y las subunidades individuales no son parte del PTP .
Mitocondrias humanas desprovistas de sintasa ATP ensamblada.

La ATP sintasa de levadura se ensambla a partir de módulos preformados del dominio F 1 , el tallo periférico y
el anillo c 10 ( 26 , 27 ). El proceso de montaje de la enzima humana es similar, pero no idéntico ( 25 ), y el
conjunto de su F 1 dominio no se ha estudiado en detalle todavía. Sin embargo, el agotamiento de cualquiera
de los tres componentes del tallo central, las subunidades γ-, δ-, ε ( Fig. 1 ), afecta el ensamblaje de todo el
dominio, acompañado de una reducción en los niveles de tallo periférico y membrana subunidades ( 28 , 29),
y la acumulación de un subcomplejo no caracterizado que contiene la subunidad c. Las mutaciones sin
sentido homocigóticas en ATP5F1D , el único gen humano que codifica la subunidad δ, están asociadas con
el trastorno metabólico y están acompañadas por una reducción en el nivel de ATP sintasa y cambios en la
morfología de las crestas ( 30 ). Por lo tanto, interrumpimos ATP5F1D en las células HAP1-A12, que carecen
de la subunidad c ( 23 ). La eliminación de un solo par de bases en el exón II de este gen produjo un cambio
de marco, que cambió la subunidad δ madura después del residuo 88 y terminó la cadena después de otros
10 residuos no relacionados con la secuencia de la subunidad δ ( Apéndice SI , Figs S6 y S7) La línea celular
clonal resultante, conocida como HAP1-Δ (c + δ), carece de las subunidades c y δ ( Fig. 2 ) y crece
aproximadamente a la misma velocidad que las células HAP1-WT ( SI Apéndice , Fig. S8 A ), aunque las
células mutantes contienen un 40% más de moléculas de ADN mitocondrial que las células HAP1-WT (
Apéndice SI , Fig. S8 B ). Sin embargo, como con las células HAP1-A12 ( 23 ), las células HAP1-Δ (c + δ)
tienen una capacidad respiratoria reducida ( Apéndice SI , Fig. S8 C ), consistente con los niveles reducidos
de los complejos I, III y IV. , pero no el complejo II, en sus mitocondrias ( SI Apéndice , Fig. S9) Como se
esperaba, las células HAP1-Δ (c + δ) no contienen ATP sintasa intacta ( Fig. 2 y Apéndice SI , Fig. S10 ), y no
hubo evidencia de ningún complejo vestigial que contenga el dominio F 1 ; tales complejos vestigiales se han
observado previamente en células ρ 0 humanas y en células HAP1-A12, y en células HAP1 que carecen de la
capacidad de expresar individualmente las subunidades OSCP, b, e, f, gy 6.8PL ( 23 ⇓ - 25 ) Sin embargo,
hubo evidencia en las células HAP1-WT y HAP1-Δ (c + δ) de un subcomplejo no caracterizado que contiene
al menos la subunidad g (s1 en el Apéndice SI , Fig. S10) que puede estar relacionado con un conjunto
intermedio que contiene las subunidades b, e y g ( 31 ).
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Figura 2.
Ausencia de la subunidad δ y del ensamblaje de la ATP sintasa de las células clonales HAP1-Δ (c + δ). ( A ) Análisis por
transferencia Western de extractos de mitoplastos de células HAP1 de tipo salvaje (WT) y HAP1-Δ (c + δ) hechas con n -
dodecil-β- D -maltosido y fraccionadas por SDS / PAGE. Los anticuerpos estaban contra la subunidad δ, y la citrato
sintasa (CS) proporcionó un control de carga. Las posiciones de los marcadores de masa molecular (en kilodaltons) se
muestran a la derecha. ( B ) Análisis por SDS / PAGE de ATP sintasa inmunopurificada de mitoplastos derivados de
células HAP1-WT y HAP1-Δ (c + δ). Se aplicó material derivado de la misma cantidad de material de partida en ambos
carriles. El gel se tiñó con plata. Las posiciones de las subunidades se indican a la izquierda.
La ausencia de ATP sintasa intacta y complejos vestigiales que contienen el dominio catalítico F1 de las
células HAP1-Δ (c + δ) se confirmó por MS cuantitativa del material inmunocapturado de las células en
condiciones empleadas para la purificación de la ATP sintasa de las células HAP1-WT ( Fig. .3 A , Apéndice
SI , Fig. S11 y Conjuntos de datos S1 y S2 ). El material Δ (c + δ) no contenía rastros de algunas subunidades
de ATP sintasa y niveles muy bajos de otros en relación con las células HAP1-WT. Es de destacar que la
abundancia relativa de IF 1en el material inmunocapturado también había disminuido drásticamente, en
contraste con las observaciones en células HAP1 mutantes que carecen de subunidades supernumerarias
individuales (excepto DAPIT), subunidades de tallo periférico OSCP o b, y subunidad c ( 23 ⇓ - 25 ). En todas
estas células mutantes, donde permanecen diferentes complejos vestigiales de ATPasa ( Apéndice SI , Fig.
S1 ), cada uno con un dominio F 1 intacto , el nivel de IF 1 es elevado en relación con las células HAP1-WT,
presumiblemente para prevenir el F 1 dominio de hidrolizar ATP. Por lo tanto, la ausencia de IF 1 del material
inmunocapturado de las células HAP1-Δ (c + δ) es consistente con la ausencia de un F 1 ensambladodominio.
El análisis cuantitativo de MS de los mitoplastos confirmó la pérdida de las tres subunidades centrales del
tallo, γ, δ y ε, y las dos subunidades codificadas mitocondrialmente, ATP6 y ATP8 (y la subunidad c también
está ausente), pero niveles significativos (25-55% ) de todas las otras subunidades se midieron ( Fig. 3 B ,
Apéndice SI , Fig. S11 y Conjuntos de datos S3 y S4 ). Los niveles residuales de las subunidades se
detectaron también mediante el fraccionamiento de los mitoplastos por SDS / PAGE, seguido de la
transferencia Western con anticuerpos específicos de la subunidad ( SI Apéndice , Fig. S12), aunque a
niveles aparentemente más bajos que los medidos en el etiquetado de isótopos estables utilizando
aminoácidos en análisis de cultivo celular (SILAC). Los experimentos cuantitativos de EM también confirman
niveles reducidos de subunidades de los complejos I, III y IV ( Apéndice SI , Fig. S13 y Conjunto de datos S3
).
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Fig. 3.
Cuantificación relativa de subunidades de ATP sintasa en células HAP1-Δ (c + δ). Se muestran abundancias relativas de
subunidades y la proteína inhibidora IF 1 . ( A ) ATP inmunopurificada sintasa y complejos vestigiales. ( B ) Mitoplastos.
Los complejos se purificaron a partir de mitoplastos a partir de mezclas 1: 1 de células marcadas con SILAC
diferencialmente. Los complejos y mitoplastos se fraccionaron mediante SDS / PAGE, y las proteínas se tiñeron con
colorante azul Coomassie. Los digestos trípticos se analizaron por espectrometría de masas. Los histogramas son los
valores medios de ambas relaciones de abundancia relativa determinadas para proteínas encontradas en experimentos
complementarios de SILAC. Los datos para todas las proteínas identificadas se dan en el Apéndice SI , Fig. S11 y
Conjuntos de datos S1 – S4. Las barras de error muestran el rango de los dos valores. IF 1 -M1 es una forma madura
específica de IF 1 ( 23 ), y f-1 y f-2 son isoformas de la subunidad f (Swiss-Prot P56134). La abundancia relativa de la
subunidad c no se determinó.
Características de la PTP en células HAP1-Δ (c + δ).

La función de la PTP se comparó en células HAP1-WT y HAP1-Δ (c + δ) mediante los mismos tres ensayos
independientes descritos anteriormente.
En el primer ensayo, la apertura del poro se demostró mediante la extinción de calceína-cobalto y la pérdida
de fluorescencia TMRM tanto en células HAP1-WT como en HAP1-Δ (c + δ) intactas en presencia de
tapsigargina o ferutinina de ionóforo de calcio. Con ambos reactivos, la apertura del poro fue inhibida por CsA
( Fig. 4 ). En el segundo ensayo, se siguió la capacidad de las mitocondrias para retener calcio en las células
HAP1-WT y HAP1-Δ (c + δ), donde la membrana plasmática se había permeabilizado con digitonina. Las
respuestas de las células a pulsos sucesivos de Ca 2+ se monitorizaron en ausencia y en presencia de CsA (
Fig. 5) En promedio, la proporción del número de pulsos de calcio necesarios para inducir la apertura de la
PTP en presencia y ausencia de CsA fue muy similar, y también a los valores en HAP1-Δe, -Δf, -Δg, -ΔDAPIT,
y -Δ6.8PL células ( Fig. 5 C y SI Apéndice , Tabla S3 ). Tanto en las células HAP1-WT ( 24 ) como en las
células HAP1-Δ (c + δ), la inhibición del uniportador de calcio mitocondrial con Ru360 inmediatamente
después de una sola inyección de calcio evitó una mayor absorción de Ca 2+ por las mitocondrias ( Apéndice
SI , Fig. S14 ) . Además, no hubo diferencia en las células HAP1-WT y HAP1-Δ (c + δ) con respecto a los
efectos del ácido bongkrekico o el carboxiatractilato, en la apertura de la PTP en respuesta a los pulsos de Ca
exógeno2+ ( Apéndice SI , Fig. S15 ). Por lo tanto, en respuesta a pulsos de Ca2 + exógeno , no hubo
diferencia cualitativa en la apertura de poros en presencia y en ausencia de un complejo ATP sintasa
ensamblado. Sin embargo, la tasa de absorción de calcio fue más lenta en las células HAP1-Δ (c + δ) que en
las células HAP1-WT ( SI Apéndice , Fig. S16 ), a pesar de que la primera tenía niveles ligeramente elevados
de componentes del uniportador de calcio ( Conjunto de datos S3 ). Presumiblemente, la absorción más lenta
surge debido a los niveles reducidos de los complejos respiratorios I, III y IV en las células HAP1-Δ (c + δ) (
Apéndice SI , Figs. S9 y S13) Como era de esperar, primero, con la introducción de cada pulso de calcio, el
potencial de membrana disminuyó ( Apéndice SI , Fig. S17 ), y luego se recuperó a medida que el calcio se
acumulaba en las mitocondrias, pero más lentamente en las células mutantes que en las de tipo salvaje.
hasta que, tanto en células de tipo salvaje como mutantes, el PTP se abrió con la liberación de calcio
acumulado y el colapso completo del potencial de membrana. Una estimación independiente de la capacidad
respiratoria máxima basada en el consumo de oxígeno celular después del tratamiento con el ionóforo,
carbonil cianuro-4- (trifluorometoxi) -fenilhidrazona, proporciona confirmación adicional de que las células
HAP1-Δ (c + δ) retienen la capacidad de generar un flujo de protones suficiente para mantener la absorción
de Ca 2+ ( Apéndice SI , Tabla S4 ).
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Fig.4.
Influencia de FT o TG en la apertura de la PTP en células HAP1. Las células HAP1-WT y HAP1-Δ (c + δ) se tiñeron con
calceína y TMRM y luego se mantuvieron a 37 ° C durante 30 minutos en presencia de 25 μM FT, o durante 1 hora con 40
μM TG. Las muestras duplicadas se tiñeron de manera similar y se trataron con 5 μM de CsA y luego con FT o TG. Las
intensidades de fluorescencia de calceína y TMRM se midieron en un microscopio de fluorescencia de recuento de células
(ver Apéndice SI , Fig. S3 para un ejemplo). Las columnas gris y blanca corresponden a las relaciones de retención de
fluorescencia para calceína y TMRM, respectivamente, calculadas como se muestra en el Apéndice SI , Fig. S3 . Los
datos mostrados son los valores medios ± DE ( n = 4). Los datos que proporcionan la base para este resumen se
presentan enApéndice SI , Tablas S1 y S2 . En cada caso, las relaciones de retención de fluorescencia para el tratamiento
en ausencia o presencia de CsA son significativamente diferentes (prueba t , P <0.01).
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Fig.5.
El calcio indujo la apertura de la PTP en células HAP1 permeabilizadas. La capacidad de retención de calcio de las
mitocondrias se determinó en células permeabilizadas con digitonina (2 × 10 7 células por ml) en respuesta a pulsos de
CaCl 2 10 μM , en ausencia y presencia de CsA 1 μM. La absorción mitocondrial de Ca2 + extramitocondrial se controló
mediante la fluorescencia de calcio verde-5N administrada en unidades arbitrarias (au). El colapso de la señal de
fluorescencia corresponde a la apertura de la PTP. ( A ) células HAP1-WT. ( B ) células HAP1-Δ (c + δ). ( C )
Cuantificación de la PTP mostrada como la proporción del número de pulsos de calcio requeridos para inducir la PTP en
inhibición de CsA (CRC i) y muestras no tratadas (CRC o ) (± DE). Los datos experimentales para la cantidad de pulsos de
calcio requeridos para inducir el PTP se muestran en el Apéndice SI , la Tabla S3 , y las trazas representativas para las
células HAP1-Δe, -Δf, -Δg, -ΔDAPIT y -Δ6.8PL se dan en SI Apéndice , Fig. S5 .
El tercer ensayo se basa en monitorear el cambio en la absorbancia de las mitocondrias en las células HAP1
permeabilizadas que acompañan la apertura de la PTP y la inflamación mitocondrial, inducida por una sola
adición de calcio e inhibida por CsA ( Apéndice SI , Fig. S18 ). Como en las células HAP1-Δb y -ΔOSCP ( 24
), en las células que carecen de las subunidades individuales e, f, g, DAPIT y 6.8PL, y también en las células
HAP1-Δ (c + δ), los cambios inducidos por Ca 2+ en sus mitocondrias monitoreadas por absorción de luz
fueron generalmente más lentas y menos extensas que en las células HAP1-WT ( Apéndice SI , Figs. S4 y
S18 ). El Ca 2+-la inflamación inducida de las mitocondrias en las células HAP1-WT y HAP1-Δ (c + δ) se llevó
a cabo también en presencia de PEGs 200, 600, 1000, 1500, 2000 y 4000 a concentraciones que generan
una presión osmótica equivalente. Tanto en las células de tipo salvaje como en las mutantes, el PTP permitió
que pasaran los PEG 200 y 600, y en ambos casos, se excluyeron los PEGS 1500, 2000 y 4000 ( Apéndice
SI , Fig. S19 ), y el PEG 1000 estuvo cerca del límite límite para la permeabilidad de los poros en ambos tipos
de células. Por lo tanto, los poros en las células mutantes y de tipo salvaje tienen tamaños similares,
probablemente los mismos.
Discusión
El PTP humano se caracteriza por su capacidad de abrirse en respuesta a la elevación de la concentración
total de Ca 2+ en la matriz mitocondrial, y por la inhibición de la apertura por CsA, mediada por la unión del
fármaco a la ciclofilina D, y la interacción de ciclofilina D con el PTP. En trabajos anteriores, la eliminación de
ninguna de las subunidades de membrana b o c tuvo un impacto significativo en la apertura del poro en
respuesta a la elevación de la matriz de Ca 2+ en tres ensayos independientes y en cada caso la apertura del
poro permaneció sensible a la acción de CsA ( 23 , 24 ). Del mismo modo, la ausencia de ADN mitocondrial
de ρ 0Las células -143B y, por lo tanto, de su capacidad para sintetizar las subunidades de membrana ATP6 y
ATP8, no tuvieron efecto en la apertura de los poros ni en el efecto inhibidor de CsA ( 23 ). Observaciones
similares se han hecho antes con otra línea celular ρ 0 -143B ( 32 ).
Aquí, se ha demostrado que hubo una falta similar de impacto en la apertura de la PTP en respuesta a la
matriz elevada Ca 2+ por los mismos tres ensayos independientes empleados previamente cuando las
subunidades de membrana restantes e, f, g, 6.8PL, y la proteína asociada a la diabetes en el tejido sensible a
la insulina (DAPIT) de la ATP sintasa se eliminaron individualmente de las células HAP1 por disrupción
génica. Hasta el momento, no existe una estructura detallada de la interfaz entre los monómeros en el
complejo dimérico ATP sintasa de mamífero, pero la ATP sintasa en S. cerevisiae tiene la misma composición
de subunidad que el complejo mamífero, las subunidades de levadura j y k, respectivamente, son ortólogos
de mamíferos 6.8PL y DAPIT ( 25 ). En una estructura del dominio de membrana dimérico de la ATP sintasa
deS. cerevisiae ( 33 ), la interfaz entre monómeros está formada por interacciones entre las subunidades
ATP6 y entre las subunidades j en cada monómero, y ninguna otra subunidad parece estar directamente
involucrada en la formación de la interfaz del dímero, aunque las estructuras de algunas subunidades de
membrana están incompletos ( 33 ). Hemos demostrado anteriormente que la eliminación de cualquiera de
las subunidades OSCP, b, c, e, f, gy 6.8PL individualmente, y de ATP6 y ATP8 juntas, detiene el ensamblaje
del complejo y se acumulan varios complejos ATPase vestigiales parcialmente ensamblados. que todos
carecen de la interfaz del dímero formando proteínas, ATP6 y 6.8PL ( 25) Del mismo modo, la eliminación de
DAPIT probablemente interrumpe la oligomerización de dímeros en las largas filas a lo largo de los bordes de
las crestas. Por lo tanto, la propuesta de que la forma dimérica de la ATP sintasa proporcione el PTP ( 18 ) es
extremadamente improbable.
En un experimento más drástico, los genes para las subunidades c y δ se interrumpieron en la línea celular
clonal, HAP1-Δ (c + δ). Sus mitocondrias carecen no solo del anillo c, ATP6 y ATP8 y las subunidades
asociadas, DAPIT y 6.8PL, sino que tampoco hay un dominio F 1 ensamblado y una subunidad OSCP
asociada, y aún conservan un PTP, que se abre característicamente en respuesta a La elevación de la
concentración de Ca 2+ de la matriz y la apertura, como de costumbre, es inhibida por CsA. El único vestigio
restante de la ATP sintasa en las células HAP1-Δ (c + δ) puede ser un subcomplejo caracterizado de forma
incompleta por las subunidades b, e y g, y posiblemente otras subunidades, y la participación de cada una de
estas subunidades en el PTP tiene sido eliminado en el pasado y en el presente ( 24) En las células HAP1-Δ
(c + δ), los niveles de los complejos respiratorios I, III y IV y el consumo de oxígeno se reducen notablemente
en relación con las células HAP1-WT. También se ha observado una reducción similar en los complejos
respiratorios y el consumo de oxígeno en las células HAP1-Δc, -Δb y -ΔOSCP ( 23 , 24 ), lo que hace que se
cuestione la capacidad de generar un potencial de membrana para impulsar la absorción de Ca 2+. ( 34 ), a
pesar de la clara evidencia experimental de que pudieron hacerlo ( 23 , 24 ). Por lo tanto, para eliminar
cualquier posible duda residual sobre la capacidad de las mitocondrias de las células HAP1-Δ (c + δ) para
mantener un potencial de membrana y acumular pulsos de Ca 2+ exógeno, se demostró aquí explícitamente
que, como se esperaba, absorben Ca 2+ más lentamente que las mitocondrias en las células HAP1-WT, pero el
potencial de membrana se recupera y acumulan Ca 2+ hasta el punto donde se abre el PTP y la membrana
colapsos potenciales ( Apéndice SI , Figs. S16 y S17 ). Además, un cálculo simple proporciona confirmación
adicional de que estas mitocondrias generan un flujo de protones suficiente para mantener la absorción de Ca
2+
( Apéndice SI , Tabla S4 ).
Similar a las células HAP1-Δb y HAP1-ΔOSCP ( 24 ), las células que carecen de las subunidades individuales
e, f, g, DAPIT y 6.8PL, y también las células HAP1-Δ (c + δ), los cambios inducidos por Ca 2+ en sus
mitocondrias monitoreadas por absorción de luz fueron más lentas y menos extensas que en las células
HAP1-WT ( SI Apéndice , Figs. S4 y S18 ). Este comportamiento se ha utilizado para inferir que la eliminación
de las subunidades individuales by OSCP tiene un impacto en el tamaño de la PTP ( 34 ). Sin embargo, es
bien sabido que el ensamblaje aberrante de la ATP sintasa humana tiene efectos de largo alcance, tanto en la
formación de redes mitocondriales como en la ultraestructura de las propias mitocondrias ( 30 , 35 ⇓ ⇓⇓ ⇓ ⇓ -
41 ). Del mismo modo, la eliminación de cualquiera de las subunidades e o g de la ATP sintasa en S.
cerevisiae evita que el complejo se dimerice con un profundo impacto en la morfología de las mitocondrias (
42 , 43 ). Pierden sus cristales característicos, y las vistas en sección transversal de las membranas internas
consisten en estructuras circulares concéntricas, comparadas en apariencia a la sección transversal de una
cebolla. Por lo tanto, la dimerización de la ATP sintasa y la oligomerización de los dímeros en largas filas son
determinantes importantes en la formación de las crestas ( 44 , 45) y los cambios (mutaciones; deleciones de
subunidades) que interrumpen el ensamblaje del complejo ATP sintasa, como los descritos aquí, afectarán la
estructura y las propiedades de absorción o dispersión de la luz de las mitocondrias. Hasta ahora, el impacto
de la eliminación de las distintas subunidades de la ATP sintasa en la estructura de las redes de mitocondrias
en las células HAP1 no se ha estudiado mediante análisis microscópico detallado, pero es probable que las
estructuras de las redes mitocondriales y de sus crestas , y las propiedades de absorción de luz y dispersión
de las mitocondrias se habrán visto profundamente afectadas. Además, la inducción de la PTP podría ser
más lenta en las mitocondrias mutantes donde surgen diferencias metabólicas porque la ATP sintasa es
defectuosa, lo que lleva a un cambio en el NAD (P) H / NAD (P) +y relaciones ADP / ATP y un entorno menos
favorable para la inducción de PTP ( 46 , 47 ). Los cambios en la estructura de las mitocondrias y las crestas
y en su metabolismo proporcionan una explicación más plausible de los impactos observados en la aparente
desaceleración de la apertura de la PTP según lo analizado por la absorbancia de la luz. También se ha
interpretado que un cambio similar de absorción de luz más lento en las mitocondrias de levadura que
carecen de las subunidades eyg demuestra una participación de estas subunidades en la formación de la
PTP ( 48) La matriz de las mitocondrias (o al menos en algunas de las mitocondrias) de las células de
levadura que carecen de las subunidades eyg, todavía tenía una apariencia densa (es decir, no hinchada) en
micrografías electrónicas en tinción negativa en condiciones que se esperaría que se abrieran el PTP ( 48 ).
Sin embargo, la apertura del PTP es un efecto de todo o nada; el poro está cerrado o abierto, y las
mitocondrias son densas o inflamadas ( 16 ), y una tasa de apertura más lenta probablemente produce una
población mixta de estados densos e inflamados.
Otro sello distintivo del PTP que se ha caracterizado consistentemente es su capacidad para permitir el paso
de PEG de peso molecular creciente hasta un máximo específico, y para evitar el paso de polímeros de PEG
más grandes ( 16 , 49 , 50 ). Aquí, se ha demostrado que en las células HAP1-WT y HAP1-Δ (c + δ) el poro
permite que pasen polímeros PEG hasta PEG 1000 y excluye polímeros más grandes. Por lo tanto, el
diámetro del poro y sus otros rasgos característicos son los mismos en las células HAP1-Δ (c + δ) y en las
células HAP1-WT. Estos datos proporcionan una estimación aproximada del diámetro de poro de
aproximadamente 2 nm, y esta estimación es similar a los valores de diámetro de poro estimados por los
mismos métodos y métodos relacionados en varios tipos de células ( Apéndice SI , Tabla S5) Un intento
reciente de volver a invocar el anillo c 8 de la ATP sintasa para proporcionar el PTP ( 51 ) no tiene en cuenta
que el diámetro estimado del PTP sea de aproximadamente 20 Å o más ( Apéndice SI , Tabla S5 ), mientras
que el espacio central no proteico en el anillo c 8 tiene 4 Å de diámetro en su punto más estrecho en el centro
de la bicapa lipídica, ensanchándose a 12 Å en la superficie de la membrana ( 23 ). Tampoco se consideran
los aspectos químicos y físicos del poro central del anillo c 8 ; tiene una superficie casi completamente
hidrófoba, está llena de lípidos y está bloqueada en el lado de la matriz del anillo por el tallo central de la ATP
sintasa. No hay evidencia de que el c 8el anillo existe por sí solo en las membranas mitocondriales de tipo
salvaje o que el anillo c 8 y el dominio catalítico F 1 se pueden disociar de la sintasa ATP intacta en la
membrana mitocondrial interna. Estas propiedades físicas, químicas y biológicas son incompatibles con la
propuesta de que el anillo c 8 proporciona el canal acuoso del PTP que permite que pasen las moléculas de
Ca 2+ , agua y PEG hasta PEG 1000 ( 23 , 52 ).
En conclusión, los experimentos presentados aquí, combinados con otros publicados anteriormente ( 23 , 24
), ahora proporcionan evidencia abrumadora de que la propuesta de que el PTP está asociado con la ATP
sintasa no es sostenible.
Materiales y métodos
La derivación y caracterización de las líneas celulares humanas HAP1-Δe, -Δf, -Δg, -Δ6.8PL y -ΔDAPIT
donde, respectivamente, los genes para las subunidades e, f, g, 6.8PL y DAPIT de ATP sintasa se
interrumpieron , han sido descritos ( 25 ). Las células HAP1-Δ (c + δ) se generaron mediante la edición del
gen CRISPR-Cas9 ( 53 ) en células HAP1-A12 de ATP5F1D , el gen que codifica la subunidad δ de la ATP
sintasa. Las tasas de crecimiento y consumo de oxígeno de las células se midieron como antes ( 23 , 24 ). El
estado oligomérico de la ATP sintasa se examinó mediante BN-PAGE ( 54) La ATP sintasa y otros complejos
respiratorios se transfirieron a membranas y se detectaron mediante transferencia Western. La ATP sintasa y
sus subcomplejos fueron inmuno capturados de mitoplastos ( 23 ) y analizados por SDS / PAGE. Las
proteínas se sometieron a SILAC y se cuantificaron por espectrometría de masas ( 23 , 55 ). La apertura de la
PTP se analizó mediante enfriamiento con cloruro de calceína-cobalto y mediciones del potencial de
membrana mitocondrial con TMRM, como antes ( 23 ), con los inductores de PTP thapsigargin y ferutinina ( 7
, 8 ). El ensayo mitocondrial de CCR se realizó como se describió anteriormente ( 23).), excepto que los
niveles de calcio se midieron con 0.2 o 0.25 μM de calcio verde-5N. La apertura inducida por calcio de la PTP
y la inflamación mitocondrial se monitorizaron en células permeabilizadas con digitonina como se describió
anteriormente ( 24 ), con 2 x 10 7 células por ml e inyecciones individuales de CaCl 2 100 o 150 μM . La
solución de ensayo de CRC se usó con células HAP1-Δ (c + δ) para experimentos de hinchamiento
mitocondrial. El límite de exclusión de tamaño del PTP se determinó realizando el ensayo de hinchamiento
mitocondrial en presencia de polietilenglicoles de diferentes pesos moleculares ( 49 , 50 ). Para detalles
adicionales, vea el Apéndice SI .
Expresiones de gratitud
Agradecemos a MG Montgomery [Unidad de Biología Mitocondrial del Consejo de Investigación Médica
(MRC)] por producir la Fig. 1 y el Apéndice SI , Fig. S1 . Este trabajo fue apoyado por MRC UK Grants MR /
M009858 / 1 y MC_UU_00015 / 8 (a JEW).
Notas al pie
↵ 1 J.C. y JH contribuyeron igualmente a este trabajo.
↵ 2 A quién puede dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: walker@mrc-mbu.cam.ac.uk .
Contribuciones de los autores: investigación diseñada por JEW y proyecto supervisado; JC, JH, SD y el
FMI realizaron investigaciones; JC, JH, FMI y JEW analizaron datos; y JEW escribió el documento.
Revisores: MRD, University College London; y DGN, Buck Center for Research on Aging.
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Este artículo contiene información de respaldo en línea en

www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1904005116/-/DCSupplemental .
Publicado bajo la licencia PNAS .
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13/8/2019 Persistencia del poro de transición de permeabilidad en mitocondrias humanas desprovistas de una ATP sintasa ensamblada | PNAS

Persistencia del poro de transición de

mitocondrias humanas transición de permeabilidad ATP sintasa

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Mitocondrias humanas desprovistas de sintasa ATP ensamblada.

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Características de la PTP en células HAP1-Δ (c + δ).

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↵ 1 J.C. y JH contribuyeron igualmente a este trabajo.

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Persistence of the mitochondrial permeability transition PO-032 Displacement of hexokinase 2 from

Permeability transition in human mitochondria persists in Mitochondrial MyopathiesGenetic Mechanisms

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