Manual de Procedimientos Técnicos Del Área de Bacteriología Final

Julio
2018
Manual de Procedimientos
Técnicos del área de
Bacteriología
AUTORES:
 Arizmendi Becerra Janette Marie
 Sánchez Piña Alejandra
Contenido
PRESENTACIÓN ......................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 2
OBJETIVOS ................................................................................................................. 2
OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 2
CONSIDERACIONES PARA SU PROTECCIÓN PERSONAL ...................................... 3
NORMAS DE BIOSEGURIDAD .................................................................................... 3
NORMAS GENERALES DE LA TOMA Y MANEJO DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS
BACTERIOLÓGICOS ................................................................................................... 4
RECEPCIÓN DE LA MUESTRA ................................................................................... 5
NORMAS DE BACTERIOLOGÍA .................................................................................. 5
UROCULTIVO .............................................................................................................. 6
PROPÓSITO: ............................................................................................................ 6
OBJETIVOS .............................................................................................................. 6
MUESTRA: ORINA. .................................................................................................. 7
TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE: ............................................................. 7
TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER: ................................................................ 7
TOMA DE UROCULTIVO EN NIÑOS PEQUEÑOS:.................................................. 7
SEDIMENTO URINARIO........................................................................................... 8
FORMA DE REPORTE ............................................................................................. 8
VALORES DE REFERENCIA ................................................................................... 8
FUENTES DE ERROR .............................................................................................. 8
MATERIALES ........................................................................................................... 9
PROCEDIMIENTO: ................................................................................................... 9
INCUBACIÓN............................................................................................................ 9
INTERPRETACIÓN:................................................................................................ 10
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y OTROS LÍQUIDOS DE DERRAME ..................... 12
LESIONES DE LA PIEL. ......................................................................................... 12
1. PUS. ............................................................................................................. 12
2. SECRECIONES. .......................................................................................... 12
3. SECRECIONES VAGINALES, URETRALES Y ORALES. ............................ 12
4. PUS Y MEDULA ........................................................................................... 12
5. ESPUTO Y LAVADO BRONQUIAL. ............................................................. 12
6. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y LÍQUIDOS DE DERRAME .................... 13
7. BIOPSIA ....................................................................................................... 13
8. SANGRE ...................................................................................................... 13
PROPÓSITO: .......................................................................................................... 13
GRAMNEGATIVOS................................................................................................. 13
GRAMPOSITIVOS: ................................................................................................. 13
OTROS MICROORGANISMOS IMPORTANTES: ................................................... 14
OBJETIVOS ............................................................................................................ 14
MUESTRA: ............................................................................................................. 14
PROCEDIMIENTO: ................................................................................................. 14
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: ................................................................. 15
INFORME: .............................................................................................................. 15
HEMOCULTIVO ......................................................................................................... 17
PROPÓSITO: .......................................................................................................... 17
OBJETIVOS ............................................................................................................ 17
MUESTRA: ............................................................................................................. 17
INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE UN HEMOCULTIVO: ................................ 17
PROCEDIMIENTO: ................................................................................................. 18
INFORME: .............................................................................................................. 19
CULTIVO DE GARGANTA. ........................................................................................ 22
SECRECIÓN FARINGEA. ....................................................................................... 22
EXPECTORACIÓN. ................................................................................................ 22
SECRECIÓN NASAL. ............................................................................................. 22
OBJETIVOS ............................................................................................................ 23
MUESTRA: ............................................................................................................. 23
PROCEDIMIENTO: ................................................................................................. 23
INTERPRETACIÓN................................................................................................. 24
SECRECIONES GENITALES ..................................................................................... 25
SECRECIÓN VAGINAL........................................................................................... 25
PROPÓSITO: .......................................................................................................... 25
OBJETIVOS ............................................................................................................ 25
LA TOMA DE LA MUESTRA ................................................................................... 25
HOMBRES: ......................................................................................................... 25
MUJERES: .......................................................................................................... 26
PROCEDIMIENTO: ................................................................................................. 26
GRAM.................................................................................................................. 26
CULTIVO ............................................................................................................. 26
CULTIVO DE CATÉTERES ........................................................................................ 28
PRINCIPIO .............................................................................................................. 28
VÍAS DE INFECCIÓN: ............................................................................................ 28
RECOGIDA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS .............................................. 28
ETIOLOGÍA ............................................................................................................. 28
PROCEDIMIENTOS................................................................................................ 28
RESULTADOS E INFORME MICROBIOLÓGICO ................................................... 29
SECRECIÓN URETRAL. ............................................................................................ 30
HECES ....................................................................................................................... 30
SECRECIÓN OCULAR. .............................................................................................. 30
SECRECIÓN OTICA................................................................................................... 30
BACILOSCOPIAS....................................................................................................... 31
PROPOSITO. .......................................................................................................... 31
OBJETIVOS ............................................................................................................ 31
MUESTRAS. ........................................................................................................... 31
PROCEDIMIENTO: ................................................................................................. 32
COLORACIÓN DE KINYOUN: ................................................................................ 32
COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN: ..................................................................... 32
INTERPRETACIÓN DE LA BACILOSCOPÍA: ......................................................... 33
CULTIVO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. ............................................. 33
DISCUSION......................................................................................................... 33
IDENTIFICACION DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. ............................ 33
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 34
Anexos ....................................................................................................................... 36
Anexo 1 ...................................................................................................................... 36
Coloraciones ........................................................................................................... 36
COLORACIÓN DE GRAM. .................................................................................. 36
TINCION DE ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE. .................................................. 36
(Ziehl- Neelsen). .................................................................................................. 36
COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO PARA MUESTRAS DE HECES. ......... 38
PROCEDIMIENTOS PARA FROTIS FIJADOS. ................................................... 38
Anexo 2. ..................................................................................................................... 39
Otras pruebas bacteriologicas ................................................................................. 39
PRUEBA DEL CORDÓN. .................................................................................... 39
PRUEBA DE LA COAGULASA. ........................................................................... 39
PRUEBA DE LA CATALASA. .............................................................................. 41
PRUEBA DE OXIDASA. ...................................................................................... 42
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................... 45
RESUMEN .................................................................................................................. 46
PRESENTACIÓN
Se ha elaborado el presente manual que contiene los procedimientos técnicos
que deben realizarse en el área de bacteriología del laboratorio clínico.
Este documento se ha desarrollado con la finalidad de contar con un instrumento
que contenga la secuencia de los pasos necesarios, que aseguren la correcta ejecución
de todos los procedimientos técnicos del área de bacteriología, y de esta manera
contribuir al ordenamiento y estandarización de los mismos.
Por lo anterior, se pone a disposición de todos los profesionales involucrados en
los procesos descritos, el presente documento denominado: “Manual de Procedimientos
Técnicos del área de Bacteriología”.
El contenido de esta publicación debe incorporarse en las actividades diarias que
se desarrollan dentro del área, a fin de garantizar la emisión de resultados confiables,
comparables y oportunos, que colaboren a mejorar la condición de salud de la población.
1
INTRODUCCIÓN
El área de bacteriología representa un apoyo primordial para el área médica, ya
que a través de los análisis realizados en ellos se pueden diagnosticar diferentes
patologías y establecer el tipo de tratamiento que se debe administrar al paciente. Es
por eso, que conscientes de la gran importancia y con la finalidad de alcanzar un trabajo
de calidad, es indispensable contar con un manual que presente de manera formal y
sistemática los procedimientos técnicos que se realizan en la práctica diaria de esta
área.
El siguiente manual se ha elaborado de forma sencilla y práctica para que su
contenido sea de fácil aplicación por el personal que desarrolla estas actividades diarias.
Contiene los procedimientos de rutina en el área de Bacteriología, con el fin de conocer
las vías bioquímicas y metabólicas que sirven de base en las identificaciones
bacterianas, a la vez se hace mención de las normas de bioseguridad útiles para
mantener la seguridad dentro del laboratorio y de quienes laboran en él, así como
indicaciones generales en toma, manejo y envío de muestras para los diferentes análisis
bacteriológicos. Además está elaborado de tal manera que sea aplicable al
funcionamiento actual de los diferentes procedimientos del área de Bacteriología.
Se espera que este manual sea una guía efectiva y útil para lograr la
estandarización de los procedimientos y calidad de los resultados obtenidos en los
Laboratorios Clínicos del Ministerio de Salud.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Conocer las técnicas, procedimientos y controles que se desarrollan en el área de

bacteriología dentro del Laboratorio Clínico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
o Brindar una herramienta que permita realizar los procedimientos técnicos del área
uniformemente, de manera que se eviten desviaciones en su desarrollo.
o Conocer las normas de bioseguridad que se realizan en bacteriología.
o Conocer el manejo y envío de muestras en el área de bacteriología.
o Conocer las diferentes técnicas bacteriológicas aplicables para la identificación de
cepas bacterianas.
o Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de las
actividades del área de bacteriología.
2
CONSIDERACIONES PARA SU PROTECCIÓN PERSONAL
o Todas las muestras de especímenes biológicos deben considerarse potencialmente

infecciosas.
o Vacunarse contra los principales agentes infecciosos.
o Procurar no producir "salpicaduras" con la muestra obtenida. Debe limpiarse y
desinfectarse cualquier superficie contaminada por algún espécimen biológico.
o Lavarse las manos correctamente, después de haber tenido contacto con cada
paciente y al concluir cualquier procedimiento.
o No deben ingerirse comidas, bebidas, goma de mascar o fumar durante los
diferentes procedimientos en el Laboratorio.
o Vigile que los elementos de trabajo estén en perfectas condiciones físicas. Algún
elemento en mal estado, podría causarle una herida.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
o Mantenga el lugar de trabajo en óptimas condiciones de higiene y aseo.

o Evite fumar, beber y comer cualquier alimento en el sitio de trabajo.
o No guarde alimentos, en las neveras ni en los equipos de refrigeración de sustancias
contaminantes o químicos.
o Maneje todo paciente como potencialmente infectado. Las normas universales
deben aplicarse con todos los pacientes, independientemente del diagnóstico, por
lo que se hace innecesaria la clasificación específica de sangre y otros líquidos
corporales.
o Lávese cuidadosamente las manos antes y después de cada procedimiento e
igualmente si se tiene contacto con material patógeno.
o Utilice en forma sistemática guantes plásticos o de látex en procedimientos que con
lleven manipulación de elementos biológicos y/o cuando maneje instrumental o
equipo contaminado en la atención de pacientes.
o Utilice un par de guantes por paciente.
o Absténgase de tocar con las manos enguantadas alguna parte del cuerpo y de
manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento.
o Emplee mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que puedan
generar salpicaduras góticas -aerosoles- de sangre u otros líquidos corporales.
o Use batas o cubiertas plásticas en aquellos procedimientos en que se esperen
salpicaduras, aerosoles o derrames importantes de sangre u otros líquidos
orgánicos.
o Evite deambular con los elementos de protección personal por fuera de su sitio de
trabajo.
o Mantenga sus elementos de protección personal en óptimas condiciones de aseo,
en un lugar seguro y de fácil acceso.
o Evite la atención directa de pacientes si usted presenta lesiones exudativas o
dermatitis serosas, hasta tanto éstas hayan desaparecido.
o Las mujeres embarazadas que trabajen en ambientes hospitalarios expuestas al
riesgo biológico VIH/SIDA y/o Hepatitis B, deberán ser muy estrictas en el
cumplimiento de las precauciones universales y cuando el caso lo amerite, se deben
reubicar en áreas de menor riesgo.
o Aplique en todo procedimiento asistencial las normas de asepsia necesarias.
3
o Utilice las técnicas correctas en la realización de todo procedimiento.
o No cambie elementos cortopunzantes de un recipiente a otro.
o Absténgase de doblar o partir manualmente las hojas de bisturí, cuchillas, agujas o
cualquier otro material cortopunzante.
o Evite reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas y hojas de bisturí.
o Realice desinfección y limpieza a las superficies, elementos, equipos de trabajo al
final de cada procedimiento y al finalizar la jornada.
o En caso de derrame o contaminación accidental de sangre u otros líquidos
corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro material absorbente;
luego vierta algún desinfectante sobre el mismo y sobre la superficie circundante,
dejando actuar durante 30 minutos; después limpie nuevamente la superficie con
desinfectante a la misma concentración y realice limpieza con agua y jabón. El
personal encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, mascarilla
y bata.
o En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro líquido
corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor, nunca con las manos.
o Los recipientes para transporte de muestras deben ser de material irrompible y cierre
hermético. Deben tener preferiblemente el tapón de rosca.
o Manipule, transporte y envíe las muestras disponiéndolas en recipientes seguros,
con tapa y debidamente rotuladas, empleando gradillas limpias para su transporte.
Las gradillas a su vez se transportarán en recipientes herméticos de plásticos o
acrílico que retengan fugas o derrames accidentales. Además deben ser fácilmente
lavables.
o En caso de contaminación externa accidental del recipiente, éste debe lavarse con
hipoclorito de sodio al 0.5% (5.000 ppm) y secarse.
o Restrinja el ingreso a las áreas de alto riesgo biológico al personal no autorizado, al
que no utilice los elementos de protección personal necesarios y a los niños.
o La ropa contaminada con sangre, líquidos corporales u otro material orgánico debe
ser enviada a la lavandería en bolsa plástica roja.
o Disponga el material patógeno en bolsas resistentes de color rojo que lo identifique
con símbolo de riesgo biológico.
o En caso de accidente de trabajo con material cortopunzante haga el reporte
inmediato de accidente de trabajo.
NORMAS GENERALES DE LA TOMA Y MANEJO DE MUESTRAS PARA

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICOS
o Los análisis clínicos se practicarán a los pacientes que sean referidos al laboratorio,
por el personal autorizado del Establecimiento.
o Todo examen deberá ser solicitado en el formulario proporcionado por el laboratorio,
completando los siguientes datos: Nombre del paciente, número de registro, edad,
sexo, servicio que lo refiere, sello del establecimiento, diagnóstico clínico, firma y
nombre de quien lo refiere y especificar si es de urgencia.
o Todo paciente con solicitud de exámenes de Laboratorio, deberá presentarse a éste

para que se le dé la orientación sobre la colección de la muestra, la hora y la fecha
en que se le recibirá. Estos datos deberán ser anotados en la hoja de solicitud del
examen y en el libro de citas del laboratorio.
4
o Toda solicitud de examen de Laboratorio, deberá revisarse confirmando los datos
requeridos y comparando los datos de identificación con la tarjeta del expediente del
paciente.
o El Laboratorio Clínico de cada establecimiento para efecto de control de exámenes
llevará un libro de entrada en el que anotará el número correlativo, fecha, nombre
del paciente y análisis a realizarse.
o Los tubos, láminas, cajas de petri y frascos utilizados para colectar las muestras,
deberán ser identificados inmediatamente después de tomadas o recibida la
muestra con el número correlativo de Laboratorio, nombre o iniciales del paciente.
o Previo al envío de muestras a otro laboratorio debe hacerse contacto con éste para
notificar del envió y saber quien recibirá la muestra.
o Toda muestra clínica que se envíe a otro laboratorio, debe ser transportada en
envases y condiciones que proporcionen la mayor seguridad para evitar roturas,
derramamientos de la misma o extravío.
o En el transporte de la muestra se consideran tres aspectos importantes:
 Protegerlas del calor excesivo.
 Protegerlas de la luz solar.
 Acondicionarlas en forma tal que no haya riesgo de derrame.
o Para el envió de la muestra es conveniente disponer de cajas de madera con
tabiques interiores; si no se dispone de ellas se puede usar una caja de cartón
grueso en la que se anotará la dirección del Laboratorio al cual se envía y se le
marcarán flechas verticales indicado la posición en que debe mantenerse. Cada
envío deberá ir acompañado de la lista con la identificación de cada muestra
contenida en la caja.
RECEPCIÓN DE LA MUESTRA
Comprobar que las muestras están bien identificadas y que correspondan a la lista
adjunta.
o Si hay derrame del material, desinfectar el exterior del envase con algodón o toallas
de papel impregnado en fenol al 5 % u otra solución bactericida. Si se comprueba
derrame masivo esterilizar el envase por autoclave o incineración
o Notificar al servicio remitente las deficiencias que hubieren en la calidad y cantidad
de las muestras o en la forma en que se hizo el envío.
NORMAS DE BACTERIOLOGÍA
Siempre que sea posible, la muestra para cultivos tiene que ser recolectada antes de la
administración de antibióticos.
5
UROCULTIVO
PROPÓSITO:
El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o Urocultivo se efectúa para
demostrar la presencia de un número significativo de bacterias.
En condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estéril, pero siempre se
contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razón, el criterio para interpretar
el crecimiento es cuantitativo.
De acuerdo con el llamado “Criterio de Kass” un número de bacterias mayor o igual a
100,000 UFC/ml (Unidades formadoras de colonias por mililitro de orina) se considera
infección verdadera, es decir es un recuento significativo. A diferencia de otros cultivos
bacteriológicos, las bacterias que causan la infección urinaria, se limitan a unos pocos
microorganismos de crecimiento rápido. Las principales bacterias que afectan el sistema
urinario son las Enterobacterias (bacilos Gramnegativos).
La Escherichia coli es sin duda la bacteria que con más frecuencia se aísla de
urocultivos positivos, luego tenemos:
 Klebsiella spp.
 Enterobacter spp.
 Proteus spp.
 Pseudomona aeruginosa (no es Enterobacteria).
De menor frecuencia tenemos los cocos grampositivos:

 Enterococcus spp.
 Staphylococcus aureus
 Streptococcus pyogenes y Streptococus spp. (raros).
 Staphylococcus epidermidis (puede ser por contaminación)
 Staphylococcus saprophyticos(puede ser por contaminación).
Las infecciones mixtas causadas por dos o más especies bacterianas son raras, por lo
que el crecimiento con varios tipos de colonias indican contaminación.
La demostración de piuria (presencia de leucocitos poliformonucleares en el sedimento
urinario) y la Bacteriuria (bacterias en orina), son ambas de gran importancia para
establecer el diagnóstico de infección urinaria.
OBJETIVOS
o Aprender a tomar una muestra limpia de orina y a dar indicaciones sobre dicho
procedimiento.
o Realizar examen directo con coloración de Gram de las muestras de orina
proporcionadas. Observar los resultados, los intérpretes y hacer el reporte
preliminar.
o Verificar el recuento de bacterias en las muestras por el método del asa calibrada,
sembrar en placas e interpretar los resultados.
o Identificar los posibles microorganismos patógenos. Interprete los resultados.
6
MUESTRA: ORINA.
La muestra para cultivo de orina puede ser por cateterismo, punción suprapúbica,
muestra limpia o de medio chorro. Esta última exige las siguientes condiciones:
a) Antes de tomar la muestra practicar un cuidadoso aseo de la zona genital con agua
y jabón.
b) Colectar la primera orina de la mañana o tener como mínimo 2 horas de retención
urinaria.
c) En un frasco estéril de boca ancha, tapón de rosca, transparente, recoger una
cantidad de 15 a 20 ml de orina medio chorro.
d) El tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su proceso, no debe exceder
de 2 horas; sino se puede procesar al recibirla, se puede refrigerar hasta por 12
horas.
TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE:

a) Desinfectar bien el glande del pene del paciente con una gasa estéril empapada con
jabón antiséptico no irritante. Remover el jabón con otra gasa estéril, empapada en
agua estéril.
b) Pedir al paciente que orine directamente en el inodoro.
c) Después de transcurrido unos 3 a 5 segundos, destapar rápidamente pero con
cuidado un frasco estéril de boca ancha tomar “al vuelo” a medio chorro una muestra
de orina de la parte central de la micción.
d) Se deja correr la primera porción de orina para que remueva las bacterias de la parte
anterior del meato urinario, que contaminaría el Urocultivo. Tapar rápidamente el
frasco.
e) Si no es posible inocular el Urocultivo antes de una hora de obtenida la muestra,
refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrigeración se mantiene en
buenas condiciones para ser inoculada, por un máximo de 48 horas.
TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER:

En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la muestra, ya
que sus genitales están expuestos, por lo tanto hay una abundante colonización de
bacterias. Proceder de la siguiente manera:
a) Solicitar a la paciente que se coloque sobre la tasa del inodoro con las piernas
abiertas. Con los dedos índices y medio de la mano derecha izquierda debe
separarse los labios genitales mayores.
b) Con una gasa empapada con jabón antiséptico no irritante, limpiar bien toda el área
y luego remover el jabón con otra gasa empapada con agua estéril.
a) Obtener la muestra de orina a medio chorro, que corra el chorro de orina unos
segundos y luego la tomar de la porción central de la micción. Tapar rápidamente.
b) Sembrar antes de una hora ó refrigerar la muestra.
TOMA DE UROCULTIVO EN NIÑOS PEQUEÑOS:

a) En niños varones desinfectar bien con jabón antiséptico no irritante, todo el pene y
el área genital.
b) En las niñas desinfectar bien los labios mayores y el área genital que los rodea.
Quitar bien el jabón con gasa y agua estéril, luego secar finalmente con una gasa
estéril seca.
7
c) Pegar una bolsita de plástico estéril y descartable, especial para tomar urocultivos
pediatricos. En niños tener la precaución de introducir todo el pene en el orificio del
llenado y en las niñas que el agujero de la bolsa quede pegado al centro por donde
saldrá la orina.
SEDIMENTO URINARIO
Para realizar la observación del sedimento urinario se toman entre 5 y 10 ml de orina en
un tubo cónico y se centrifuga a 2.000 rpm durante 10 minutos. Se vuelca el
sobrenadante de modo que quede aproximadamente 0,5 ml del sedimento. Se
resuspende por agitación en ese volumen de líquido y se observa entre porta y
cubreobjetos en microscopio con un aumento de 40X. Se deberá consignar la presencia
de leucocitos, hematíes, bacterias, cilindros (especialmente leucocitarios), tipo de
cristales y tipo de células. Se promediará el número por campo de leucocitos, hematíes
y células para informar el recuento respectivo.
FORMA DE REPORTE
CÉLULAS EPITELIALES, ESCAMOSAS Y REDONDAS: reportar escasas, moderadas
o abundantes.
GLÓBULOS ROJOS: Reportar el número estimado por campo.
LEUCOCITOS: Reportar el número estimado por campo.
CILINDROS: se pueden encontrar en la orina los siguientes cilindros: hialinos,
granulosos finos y gruesos, leucocitarios, hemáticos, grasos y céreos. Reportar el
número de cilindros observados por campo.
FILAMENTOS MUCOIDES: reportar escasos, moderados o abundantes.
CRISTALES: se pueden encontrar en la orina los siguientes cristales: oxalatos de calcio,
acido úrico, uratos amorfos, fosfatos amorfos, fosfatos triples, urato de amonio, leucina,
cistina y tirosina. Reportar en la forma siguiente: escasos, moderados o abundantes.
LEVADURAS: Reportar escasos, moderada y abundantes.
PARÁSITOS: Se pueden encontrar en orina Trichomonas vaginalis, Phitirus pubis,
huevos y quistes de parásitos por contaminación con heces.
BACTERIAS: Reportar la presencia de bacterias moderadas o abundantes, solamente
cuando se observen más de 10 leucocitos por campo.
VALORES DE REFERENCIA
CÉLULAS EPITELIALES, ESCAMOSAS: Escasas a moderadas.
CÉLULAS EPITELIALES REDONDAS: No deben observarse.
GLÓBULOS ROJOS: No deben observarse.
LEUCOCITOS: .0-5 por campo.
CILINDROS: No deben observarse.
FILAMENTOS MUCOIDES: No deben observarse.
CRISTALES: Podrían observarse oxalatos, uratos y fosfatos amorfos de escasa a
moderada cantidad.
LEVADURAS: No deben observarse.
PARÁSITOS: No deben observarse.
BACTERIAS: Escasas o no presentes
FUENTES DE ERROR
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o Usar portaobjetos y cubreobjetos sucios.
o Desecación del sedimento urinario.
o Tiempo transcurrido desde la toma de la muestra hasta la observación microscópica.
o Uso excesivo de luz.
o Centrifugación inadecuada.
El sedimento de orina, realizado con una muestra correctamente recolectada, es una

herramienta fundamental para la interpretación del urocultivo. Sin embargo, su
sensibilidad y especiﬁcidad depende de ciertos factores, como lo son el tipo de muestra,
el tiempo de retención, el sexo, la edad del paciente y la presencia de otras patologías.
Desde el punto de vista infectológico, se considera que un sedimento de orina no es

normal cuando una gota del centrifugado de 10 ml (10 min. a 2.000 rpm) contiene más
de 5 leucocitos por campo de 40X. La tabla 4 muestra los resultados de sendos estudios
realizados en pacientes adultos ambulatorios y pediátricos, donde se determinaron los
valores predictivos del sedimento de orina para la presunción de bacteriuria signiﬁcativa
(BS, más de 10 UFC/mL).
MATERIALES
 Placas de agar sangre.
 Placas de MacConkey
 Asa calibrada de 0.001ml
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar la orina en dos medios de cultivo según la técnica del Asa calibrada. Los
medios de cultivo a utilizar son:
a. Agar sangre. Crecen la mayoría de microorganismos
b. Agar MacConkey: Crecen solo bacilos Gramnegativos aerobios
(Enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.
2. Para sembrar usar un asa calibrada de platino (95% platino, 5% radio) que tome
0.001 mL. agitar el frasco de orina, abrir delante del mechero y flamear la boca del
mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fría en la orina, justamente por
debajo de la superficie.
3. Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de la caja
de petri pasando por el centro. Flamear o inocular en igual forma el medio de
MacConkey.
4. Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inoculo de orina, en ambas
cajas, haciendo estrías tupidas y perpendiculares a la estría dejada por el asa
calibrada.
INCUBACIÓN
Dado que la mayoría de los patógenos urinarios son facultativos. Las condiciones de
incubación favorables para su desarrollo y multiplicación son las siguientes:
a. Placas de agar sangre. En atmósfera enriquecida con CO2 en anaerobiosis
(envase con vela)
b. Placas de agar MacConkey. Se incuba en atmósfera ambiental aerobiosis.
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Ambos en incubación a 36°C
INTERPRETACIÓN:
1. Después de incubar ambas cajas durante 18-24 horas interpretar resultados de

ambas cajas simultáneamente y con buena luz.
2. Contar el número de colonias presentes y multiplicar por 1000; si se usó el asa
calibrada de 0.001 mL, multiplicar por 100 si se utilizó un asa calibrada de 0.01 mL.
3. Recuento mayores de 100,000 UFC/ml de orina, cepa pura: identificarlo con
bioquímica, hacer sensibilidad y reportarlo.
UFC/ML CRITERIO PARA REPORTAR
Negativo a las 24 horas de incubación a 36°C

0 –10,000
Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma de
10,000-50,000 muestra y correlación de leucocitos en sedimento
urinario.
Se aisló ___, _____, 000 UFC / mL(reportar el número
50,000-100,000 de UFC contado y especie bacteriana con su
sensibilidad antimicrobiana.
Se aisló ___, más de 100,000 UFC / mL infección
100,000 ó más
urinaria verdadera, hacer antibiograma y reportar.
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LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y OTROS LÍQUIDOS DE DERRAME
Este examen es uno de los de mayor urgencia dentro del Laboratorio Bacteriológico,
por lo cual debe examinarse sin demora ya que la enfermedad es de evolución rápida y
de alta mortalidad o de secuelas importantes. Es básico la identificación del agente
causal y su antibiograma. Se necesitan de 1 a 2 mL. de muestra en tubos de tapón de
roscas estériles, enviarlos al Laboratorio a temperatura ambiente: usualmente se toman
2 tubos uno para bacteriología y otro para química. Si no es posible, primero procesar
bacteriología y luego remitirlo para química, la muestra debe guardarse en la estufa a
35°C. hasta completar la rutina. Centrifugar la muestra y con el sedimento inocular los
medios de cultivo y hacer un frotis para Gram y una preparación con tinta china.
LESIONES DE LA PIEL.
Lavar con agua, jabón y desinfectar con alcohol o yodo. Primero remover las costras y
la piel que cubre las pústulas o vesículas, frotar firmemente con hisopo o bisturí dentro
de la lesión. Si la lesión es seca usar hisopo húmedo y colocarlo en caldo tioglicolato.
1. PUS.
En un absceso cerrado si el contenido es fluido extraer con jeringa, si el absceso es
abierto tomar con un hisopo o bisturí de las paredes internas y no del centro: hacer frotis
de inmediato y colocar los hisopos en medio de tioglicolato.
Si las lesiones son cerradas colectar en jeringa gruesa, previa asepsia con yodo. Si las
lesiones son abiertas, lavar primero con agua y jabón y colectar con bisturí el pus del
borde de las lesiones.
Colocarlo directamente en los medios de cultivo o en porta - objetos. Si el pus es
abundante colocarlo en un tubo estéril con tapón de rosca.
2. SECRECIONES.
Lavado bronquial, líquidos de derrame, LCR, médula ósea y biopsia. Serán colectadas
por el médico con estricta asepsia y colocadas en un tubo estéril con tapón de rosca u
otro recipiente estéril sin preservativo.
Las muestras deben ser procesadas de inmediato y si no es posible, guardarlas en

refrigeración no más de 24 horas.
3. SECRECIONES VAGINALES, URETRALES Y ORALES.

Colocar una gota de secreción en un porta objeto y cubrir con laminilla- examinar al
microscopio. Es recomendable hacer simultáneamente un frotis de la secreción y
colorearla por Gram.
4. PUS Y MEDULA
Hacer un frotis delgado en un portaobjeto y colorearlo por Giemsa.
5. ESPUTO Y LAVADO BRONQUIAL.

Seleccionar las porciones purulentas y hacer frotis y colorear por Giemsa al
mismo tiempo hacer una preparación con KOH al 10 ó 20%.
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6. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y LÍQUIDOS DE DERRAME
Centrifugar la muestra a 3000 rpm. Por 15 minutos. Del sedimento tomar 1 gota
pequeña y colocarla a la par de una gota de tinta china. Cubrir ambas gotas con una
laminilla para que se forme un gradiente de color negro.
Observar con el objetivo 10 x; si se ven círculos claros, contra fondo negro observar con
el 45x para apreciar la morfología. Además colocar una gota del sedimento en un porta
objeto y dejar secar. Colorear por Giemsa y observar con objetivo de inmersión, esto
para LCR. En caso de líquido pleural y ascítico se agrega 3 gotas de citrato de sodio al
10% por cada 10 ml. Y se conserva en refrigeración si la muestra no se procesará
inmediatamente.
7. BIOPSIA
Macerar el tejido con 1 mL. de solución salina en un mortero o con un homogenizador
estéril, preparar un frotis y colorear con Giemsa y hacer preparación al fresco.
8. SANGRE
Para la toma de muestra realizar aseo cuidadoso con jabón y agua después aplicar
tintura de yodo al 1% y luego limpiar con alcohol al 70%. Con jeringa colectar 5 a 10 mL.
y colocar en medio de cultivo líquido en volumen 10 veces mayor.
Colocar la sangre en un tubo de Wintrobe y centrifugar a 3000 rpm. Por 15 minutos.
Con pipeta Pasteur descartar el plasma y tomar 1 gota de la capa de leucocitos, preparar
un frotis en un porta objetos y colorearlos por Giemsa.
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de la tinción de Gram y el cultivo, la presencia de bacterias en
estas muestras que normalmente deben ser líquidos estériles ya que son tomadas por
el médico que las solicita en condiciones quirurgicas estériles, por eso, todo
microorganismo que se aisle es patógeno. Las bacterias de mayor importancia en el
líquido cefalorraquídeo son:
GRAMNEGATIVOS.
 Neisseria meningitidis (causa meningitis meningococica severa)
 Haemophilus influenzae (Meningitis en niños de 6 meses a 4 años de edad)
 Escherichia coli y otras Enterobacterias (en pacientes inmunodeficientes)
 Pseudomonas aeruginosa
GRAMPOSITIVOS:
 Streptococcus pneumoniae (muy importante)
 Staphyloccus aureus
 Streptococcus sp
 Streptococcus pyogenes.
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OTROS MICROORGANISMOS IMPORTANTES:
 Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum
 Cryptococcus neoformans, Candida albicans
OBJETIVOS
1. Realizar el examen directo del Líquido cefalorraquideo, interpretar y hacer su
reporte.
2. Identificar los medios de cultivo de utilidad para muestras de LCR y otros líquidos de
derrarme, inocularlos e incubarlos en condiciones adecuadas.
3. Identificar las bacterias aisladas y reportar sus resultados.
4. Aislar e identificar hongos causantes de meningitis.
5. Procesar otros líquidos de derrame.
MUESTRA:
Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:
 Líquido cefalorraquídeo
 Líquido ventricular
 Fluido abdominal (líquido peritoneal o ascítico)
 Líquido pleural
 Líquido pericardico
 Líquido sinovial
 Médula ósea.
Las muestras deben transportarse rápidamente al laboratorio y ser procesadas

inmediatamente no después de 30 minutos de recolectados. Rotular con el nombre del
paciente, número de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si el médico sospecha
que la muestra puede contener bacilos alcohol ácido resistentes debe hacerlo saber en
su solicitud al laboratorio.
PROCEDIMIENTO:
1. El médico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del cual
desee examen completo).
2. Uno de los tubos no se centrífuga, enviarlo para que se le haga el citoquímico
(recuento total de células) recuento diferencial (fórmula) y análisis químico. El otro
tubo sirve para análisis microbiológico.
3. Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad. (2500-3000 RPM). Decantar
asépticamente, tapar, agitar y procesar sólo el sedimento.
4. Sembrar una asada del sedimento en cada uno de estos medios:
a. Agar sangre de carnero al 5%
b. Agar chocolate
c. Agar Mac Conkey
d. Sabouraud (hongos)
e. Tioglicolato
f. Lowenstein-Jensen (solo si se investiga BAAR)
5. Diseminar por estrías en toda la superficie de los medios sólidos. Introducir el agar
sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedo con candela encendida.
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Incubar todos los medios a 36°C, excepto el sabouraud que se incuba a temperatura
ambiente, para el aislamiento de hongos patógenos especialmente (Cryptococcus
neoformans).
6. En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotis pequeños (de
aproximadamente un centímetro de diámetro) en el centro de la lámina.
7. Colorear un frotis con Gram y otro con Ziehl- Neelsen.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Observa los frotis de sedimento de LCR con el objetivo de inmersión. En vista que del
resultado de los frotis depende el tratamiento inmediato de pacientes con infección
grave de las meninges, su observación debe hacerse con todo cuidado. Observar las
siguientes morfologías:
1. Diplococos gram-negativos (rojos o rosados), arriñonados, dispuestos en parejas
como granos de café, idénticos a N. gonorrhoeae de pus uretral: morfología
compatible con N. meningitidis. Dar alerta al médico inmediatamente.
2. Cocobacilos gram-negativos (rojo pálido) pleomorficos, con escasas formas
bacilares: morfología compatible con H. Influenzae agente de meningitis en niños de
6 meses a 4 años.
3. Cocos gram-positivos (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en parejas o
cadenas cortas, la cápsula se insinúa como halo claro alrededor de las bacterias: En
LCR morfología compatible con Streptococcus pneumoníae.
4. Bacilos gram-negativos (rojos) de coloración sólida, no pleomorficos, bacilos
alargados: morfología compatible con Enterobacterias o Pseudomonas (E. Coli,
Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa).
5. Levaduras redondeadas. Algunas con gemaciones laterales, gram positivo se
insinúa cápsula, hacer “tinta china”, para demostrar la presencia de levadura
capsulada sugestiva de Cryptococcus neoformans.
6. En Zielh-Neelsen: bacilos alcohol-ácido resistente (rojos) cortos, algunos con
coloración dispareja en forma de gránulos: morfología compatible con
Mycobacterium tuberculosis.
INFORME:
 El primer informe, entregar el mismo día de la obtención del muestra: Frotis de
Gram: se observan morfología de bacterias, cantidad de leucocitos. Cultivo
pendiente.
 El segundo informe; entregar el día que termina la identificación:
 Cultivo: se aísla: Nombre de la bacteria, género, especie más antibiograma.
15
16
HEMOCULTIVO
PROPÓSITO:
El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se están
reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. Cuando las bacterias se
multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema retículo-endotelial para
removerlos de la sangre, ocurre la septicemia. Se diferencia de la bacteremia, que es la
presencia transitoria de bacterias en el torrente circulatorio. Usualmente causa
septicemia una sola especie bacteriana.
OBJETIVOS
1. Aprender la toma de sangre venosa en condiciones asépticas e inocularlas en los
medios de cultivo apropiados.
2. Reconocer en forma macroscópica los signos visibles de crecimiento bacteriano de
un hemocultivo positivo.
3. Conocer los medios de cultivo necesarios para la inoculación de muestras de sangre
en el laboratorio, así como también los procedimientos efectuados para la
identificación bacteriana.
4. Elaborar el reporte final en base a los microorganismos encontrados, si los hay.
MUESTRA:
Los síntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo son:
Aumento súbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales, escalofríos, postración
y presión baja. Además la recuperación de las bacterias de la sangre depende de los
siguientes factores.
1. Cantidad de sangre que se cultiva. En niños debe ser al menos 2.5 mL y en adultos
usualmente 5 mL.
2. La relación entre la sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10 es decir sangre
al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar coagulación.
3. La presencia de inhibidores bacterianos en el suero tales como anticuerpos,
complemento o antibióticos.
4. La característica de la bacteria de ser “fastidiosa” es decir que requiere de un medio
de cultivo enriquecido y complejo.
5. El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento con
antibióticos.
6. En algunos casos se justifica obtener varias muestras del paciente, en tiempo y sitios
diferentes, es decir “seriado”.
INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE UN HEMOCULTIVO:

1. Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapón de hule
perforable. Dejar la tapadera a un lado y con un algodón empapado en solución
de yodo al 3% y alcohol, limpiar bien el tapón perforable. Dejar secar mientras se
atiende al paciente.
2. Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y localizar con
precisión el sitio donde se va a puncionar.
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3. Lavar con agua y jabón el brazo del paciente, antes de aplicar desinfectante.
Limpiar el sitio correcto con un algodón empapado en tintura de yodo al 3%. Dejar
secar y luego limpiar el sitio de punción con un algodón empapado en alcohol, con
movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitio de punción.
4. Con aguja y jeringa estériles, puncionar la vena y obtener asépticamente 5 mL
o más de sangre.
5. Inyectar exactamente 5 mL de sangre en el frasco que contiene 45 mL de caldo o
10 mL en un frasco con 90 mL de caldo. En los hemocultivos pediátricos, inyectar
2.5 mL de sangre en 25 mL de caldo.
6. Agitar suavemente las botellas ya inoculadas e incubar a 36°C.
PROCEDIMIENTO:
1. Incubar los hemocultivos por siete días, excepto en casos especiales en los cuales
debe prolongarse la incubación, por ejemplo para el aislamiento de Brucella spp.
2. Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los
frascos contra la luz, para buscar algunos de los siguientes signos visibles que
indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el tipo de bacteria que
está creciendo:
Signos Visible Posible Bacteria
 Bacilos Gramnegativos aerobios

Turbidez  Staphylococcus spp.
 Bacteroides spp.
 Estreptococcus spp.
 Staphylococcus spp
Hemólisis  Listeria spp
 Clostridium spp.
 Bacillus spp.
Formación De Gas  Bacilos Gramnegativos aerobios
 Anaerobios
Colonias Visibles Como “Motas de  Staphylococcus spp.
Algodón”  Streptococcus
 Pseudomonas spp.
Formación De Película  Bacillus spp.
 Levaduras
Coloración Verdosa (Raro)

 Pseudomonas aeruginosa
3. En caso de observar cualquiera de estas características, agitar suavemente,

limpiar el tapón perforable con algodón y alcohol, puncionar con jeringa y aguja
estéril, y aspirar una pequeña cantidad de caldo. Inocular una gota y luego estriar
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con asa sobre una caja de agar sangre y una caja de agar chocolate; incubar
ambas en jarro con candela. Simultáneamente dejar secar dos gotas del caldo
sobre un porta objetos, colorear con Gram.
4. Observar cuidadosamente el frotis coloreado por Gram con objetivo de
inmersión, pues la observación de las bacterias es la base de su caracterización.
Además, algunas bacterias como Haemophilus influenzae, no producen signos
visibles en el caldo si se observan bacilos o cocobacilos gram-negativos, inocular
adicionalmente una caja de Agar Mac Conkey; incubar aeróbicamente. Esto es
especialmente importante para el aislamiento o identificación de Salmonella
typhi.
5. Si se observan cocos gram-positivos esféricos y con tendencia a agruparse en
racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el aislamiento e
identificación de Staphylococcus aureus. Si se observan diplococos o cadenas
cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar los discos de optoquina y
bacitracina sobre la segunda estría del agar sangre, para aclarar la identificación
presuntiva de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes.
6. Rutinariamente revisar los hemocultivos aparentemente negativos. Procederá
así: hacer asépticamente un frotis de Gram del caldo a las 48 horas y también al
séptimo día de incubación. La incubación prolongada puede producir una leve
turbidez de fibrina.
1. Con siete días de incubación a 36°C se recupera el 95% de las bacterias
clínicamente significativas. Si se observa en Mac Conkey el crecimiento de colonias
lactosa-negativo sospechosas de Salmonella typhi, aglutinar inmediatamente el
crecimiento en agar sangre con antisuero polivalente anti-salmonella, anti-
salmonella del grupo D y anti-antígeno Vi. Si hay aglutinación franca, reportar
inmediatamente la presencia de salmonella typhi.
2. Algunas bacterias importantes en hemocultivos positivos, son las siguientes:
 Salmonella typhi
 Escherichia coli
 Streptococcus pneumoniae
 Staphylococcus aureus
 Streptococcus pyogenes
 Haemophilus influenzae
3. Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos como contaminantes
provenientes de la microbiota de la piel son:
 Bacillus sp
 Corynebacterium sp.
INFORME:
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1. Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observan bacterias en
el Segundo control por coloración de Gram, a los siete días de incubación, NUNCA
ANTES. Reportar así: NEGATIVO A LOS SIETE DÍAS DE INCUBACIÓN A 36°C.
2. Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubación reporta

cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible, hasta especie, aunque la
identificación sea presuntiva. Reportar así: SE AISLÓ
____________________SUSCEPTIBILIDAD PENDIENTE.
3. En el caso del aislamiento e identificación de Streptococcus pneumoniae ó

Streptococcus pyogenes de hemocultivo, reportar así: SE AISLO
Streptococcus________________, se recomienda tratamiento con penicilina. Sí se
trata de S. pneumoniae, hacer la prueba de sensibilidad a la penicilina.
4. Después de interpretar los resultados de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana,

enviar otro reporte, así:
Se aisló:__________________________________
Susceptible a:______________________________
Intermedio a:_______________________________
Resistente a: _______________________________
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21
CULTIVO DE GARGANTA.
SECRECIÓN FARINGEA.
La muestra debe tomarse de amígdalas y faringe, colocar al enfermo en posición
cómoda y buscando la mejor iluminación, pedir al paciente que pronuncie la letra A,
baje la lengua suavemente con un bajalengua, frote el hisopo con firmeza pero con
suavidad en ambas caras de las amígdalas y luego en la pared posterior de la faringe
de manera que el hisopo quede impregnado de exudado faríngeo, evite tocar con el
hisopo lengua y úvula. Introducir el hisopo en 1mL. de medio de enriquecimiento, 0.5
mL de caldo de tripticasa soya, infusión cerebro corazón, o sembrar de inmediato en
agar sangre y Mac Conkey. Si hay pseudomembrana hacer un frotis y colorear por
Gram para investigar difteria.
EXPECTORACIÓN.
Toma de muestra: el paciente debe efectuar repetidos enjuagatorios previos con
solución de bicarbonato de sodio o con solución salina estéril.
Tomar la primera expectoración de la mañana (este esputo debe ser purulento no
saliva). El frasco debe ser de boca ancha, con tapón de rosca y estéril, debe taparse
bien e identificarse correctamente. Enviarlo al Laboratorio inmediatamente.
SECRECIÓN NASAL.
Introducir el hisopo con solución salina estéril profundamente en dirección paralela al
piso de la fosa nasal. Frotar suave y firmemente (1 minuto en cada fosa nasal). Colocar
el hisopo en 0.5 mL. de caldo de tripticasa soya o inocular de inmediato en agar sangre
y Mac Conkey.
Debido a la gran ocurrencia de procesos infecciosos en el área faríngea, el estudio

bacteriológico del exudado faríngeo es uno de los procedimientos que con mayor
frecuencia se realizan en el laboratorio clínico. La flora aislada incluye cocos y bacilos,
tanto Grampositivos como Gramnegativos además de encontrarse cierto número de
levaduras.
Para un estudio satisfactorio del exudado faríngeo es necesario tomar una adecuada
muestra de la región de amígdalas y faringe. El cultivo se efectúa para demostrar la
presencia de Sreptococcus pyogenes, Steptococcus agalactiae y otras especies del
género Streptococcus.
Otras bacterias que frecuentemente se pueden aislar en un cultivo de garganta son las
siguientes:
 Streptococcus pneumoniae
 Haemophilus influenzae
 Staphylococcus aureus
 Klebsiella pneumoniae
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Estos microorganismos solo se deben reportar si predominan sobre la microbiota
normal.
OBJETIVOS
1- Colectar muestras de exudado faríngeo en forma adecuada y cuando sea
conveniente la estudie por la técnica del examen directo con la coloración de Gram y
Azul de metileno.
2- Observar los microorganismos presentes en las preparaciones anteriores y
determinar cuales pudieran ser patógenos de la faringe. Escribir el reporte
correspondiente.
3- Inocular los medios de cultivo apropiados con las muestras colectadas de sus
compañeros.
4- identificar los posibles microorganismos patógenos aislados en los medios de cultivo
y realizar pruebas especiales para su identificación.
MUESTRA:
La muestra debe tomarse siempre antes de iniciar algún tratamiento con antibióticos.
Además si el paciente ya comió se recomienda dejar pasar unas dos horas para que se
vuelva a formar la secreción deglutida.
Localizar el fondo de la garganta y en las amígdalas (que se encuentran a los lados),
observar las siguientes lesiones:
 Inflamación (Enrojecimiento)
 Pus (secreción blanquecina o amarillenta)
 Úlceras blanquecinas.
Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado de no tocar la
lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos, labios y dientes al retirar el hisopo.
PROCEDIMIENTO:
1. Inocular inmediatamente una caja (placa) de agar sangre al 5%, hacer dos cortadas
en el agar durante la siembra. Las cortadas deben ser aproximadamente de 1 cm de
largo y el asa debe llegar al fondo de la caja.
El propósito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para alejarlos
del oxígeno atmosférico y así incrementar la hemólisis tipo beta.
2. Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcus pyogenes, sin
necesidad de hacer sub-cultivos proceder así: Con pinza flameada y fría, colocar en
la zona de más fuerte inoculación en el agar sangre de carnero (primera estría), un
disco de 30 mcg de neomicina. A unos 8 –10 mm de distancia, colocar un disco de
0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae
son resistentes al antibiótico neomicina, por lo que crecen en cultivos casi puro
alrededor de éste disco.
23
3. Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo una toalla
de papel húmeda, colocar la caja con el medio y luego introducir una candela corta
y encendida, cerrar el frasco. La candela se apagará sola.
4. Incubar por 18 a 24 horas a 36°C
INTERPRETACIÓN.
Para interpretar correctamente los crecimientos de los cultivos de exudados faríngeos,
tomar en cuenta lo siguiente:
Tipo de Hemólisis Apariencia del Halo

ALFA Verde (Incompleta)
BETA Claro, del color del medio (Completa )
REPORTE
Inhibición por Bacitracina Reportar
+ (Si produce halo) Se aisló Streptococcus pyogenes beta
hemolítico del grupo “A” de Lancefield
Streptococcus sp. beta hemolítico no del

grupo “A” de Lancefield
- (No inhibición)
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SECRECIONES GENITALES
SECRECIÓN VAGINAL.
Toma de muestra: colocar a la paciente en posición ginecológica, introducir el especulo,
tomar la muestra con dos hisopos del endocervix y vagina; se recomienda sea tomada
por el médico. El hisopo debe estar estéril e impregnado con solución salina fisiológica
al 0.85% estéril. Hacer de inmediato un frotis para coloración de Gram y hacer un
examen directo al fresco, colocando una gota de solución salina en un porta objetos y
suspender en ella la secreción vaginal; cubrir con el cubre objetos y buscar
Trichomonas vaginalis o levaduras. Si el examen al fresco no se puede hacer de
inmediato colocar el hisopo en 0.5 mL de solución salina, en refrigeración no más de 2
horas. En la coloración de Gram reportar Vaginosis bacteriana si hay predominio de
bacilos gram negativos.
PROPÓSITO:
Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos bacterianos que infectan los
órganos genitales femeninos y masculinos, tales como:
 Neisseria gonorrhoeae: Bacteria, causante de la gonorrea.

 Garnerella vaginalis: Bacilo gramnegativo causante de la vaginosis.
 Treponema pallidum: Bacteria causante de la sífilis.
 Candida albicans: Hongo levaduriforme, causante de la vulvovaginitis.
 Trichomonas vaginalis: Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal.
OBJETIVOS
1. Realizar el examen directo de la secreción uretral utilizando la coloración de Gram.
2. Elaborar el reporte preliminar.
3. Cultivar la muestra en los medios de cultivo adecuados y seguir la marcha
bacteriológica correspondiente para la identificación del microorganismo causante
de la infección.
4. Realizar la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
5. Elaborar el reporte final.
LA TOMA DE LA MUESTRA
HOMBRES:
1. Tener listo: hisopos estériles, porta-objetos limpios, agar sangre y agar Thayer –
Martin.
2. Con el hisopo estéril tomar una gota de la secreción.
3. Preparar cuidadosamente un frotis delgado sobre el porta objetos, haciendo rodar el
palillo sobre la lámina, no frotar
4. Simultáneamente inocular los medios sólidos (agares)
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MUJERES:
1. En las mujeres la muestra la debe obtener el ginecólogo. Tener listo el mismo
material que en el caso de los hombres.
2. Hacer el mismo procedimiento.
PROCEDIMIENTO:
1. Colorear los frotis con coloración para Gram.
2. Con asas flameadas y frías, diseminar por estrías el inoculo sobre la superficie de
las placas.
3. Incubar el agar sangre y el de Thayer –Martín durante 24 a 48 horas a 36°C en
jarro húmedo con candela encendida.
GRAM: Buscar diplococos adosados en forma de granos de café y Gramnegativos

(rojos). Anotar si se encuentran intracelularmente, dentro de los leucocitos
polimorfonucleares o fuera de ellos (extracelular.)
CULTIVO: Después de 24 a 48 horas de incubación a 36°C en jarro con candela,

examinar el Thayer –Martín, ya que este contiene sustancias enriquecidas que
favorecen el crecimiento de Neisseria gonorreae. Efectuar la prueba de oxidasa para
verificar género.
La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo líquido al
cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnado con el reactivo.
Luego identificar la especie Neisseria gonorreae por medio de la prueba de oxidación
de tres azúcares (CTA): maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa).
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27
CULTIVO DE CATÉTERES
PRINCIPIO
El estudio bacteriológico de los catéteres, nos va a permitir en ocasiones conocer el

agente causal de una bacteriemia relacionada con el catéter y por otra parte, prevenir
que aparezca dicha bacteriemia. Para valorar su importancia, podemos decir que de
una u otra forma el 82% de las bacteriemias nosocomiales se relacionan con la
presencia de catéteres.
VÍAS DE INFECCIÓN:
a) Piel y catéter. En los catéteres periféricos y de corta duración.

b) Endoluminal. En las vías centrales tunelizadas.
RECOGIDA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS
a) Catéter: Una vez extraído el catéter, cortar 3 o 4 cm de la porción distal en

condiciones asépticas. Depositar en recipiente estéril sin conservante y transportar
de inmediato. Si ello no fuera posible conservar a 4ÂºC.
b) Método conservador: Se obtendrán las muestras mediante escobillón en la puerta
de entrada o inserción del catéter e interior de las conexiones.
ETIOLOGÍA
Los microorganismos más frecuentes causantes de la colonización e infección del

catéter son: S. epidermidis, S. aureus, Candidaspp, Enterobacterias y
Acinetobacterspp.
PROCEDIMIENTOS
a) Catéter:
1. Semicuantitativo. (Técnica de Maki). Se realiza mediante rodamiento en placa de
Agar sangre. Punto de corte en 15 UFC. Sus principales limitaciones son que no
detecta contaminación intraluminal, riesgos de contaminación y dificultad de
realización en catéteres curvos.
2. Cuantitativos. (Técnicas de Cleri, Brun-Buisson, Liñares). Detecta contaminación
extra e intraluminal. Punto de corte 103 UFC. Su principal limitación es su
laboriosidad.
b) Método conservador:
Permite el diagnóstico de las bacteriemias asociadas a catéter y su etiología sin
necesidad de retirar el mismo.
1. Puerta de entrada o inserción del catéter:
- Tinción de Gram
- Cultivo cualitativo en Agar sangre.
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2. Interior de las conexiones:
- Cultivo cualitativo en Agar sangre.
El conjunto de ambos estudios posee un elevado valor predictivo negativo.
RESULTADOS E INFORME MICROBIOLÓGICO
Se informarán las UFCs si procede. Cualquier microorganismo aislado se

informará con su antibiograma correspondiente.
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SECRECIÓN URETRAL.
Toma de muestra: efectuar presión suave sobre la uretra, eliminar la secreción luego
exprimir desde atrás con fuerza y recoger la secreción con dos hisopos estériles, 1 para
el frotis y el otro para el cultivo (Thayer Martín o Agar chocolate). Si la secreción es
escasa introducir en la uretra un hisopo fino y raspar la pared uretral con delicadeza.
Hacer de inmediato el frotis para coloración de Gram e inocular los medios de cultivo.
Si se va a transportar colocarlo en medio de transporte de Stuart , Amies o Cary Blair.
Si no se puede sembrar de inmediato hacer frotis y mantener el hisopo en un medio de
transporte.
HECES
La muestra debe tomarse en los tres primeros días de la enfermedad y antes de

comenzar el tratamiento antimicrobiano. En los lactantes lo indicado es el hisopado
rectal. Introducir el hisopo, ( previamente humedecido con solución salina estéril ), dos
o tres cms. en el ano imprimiéndole movimientos de rotación amplia, pero con suavidad
arrastrando mucosidad de la pared del recto. En el adulto la muestra puede obtenerse
del recipiente con heces o del hisopo rectal. Las mejores muestras son aquellas
diarreicas, con mucus, o con sangre, la muestra debe ser de 1 a 2 gramos si es sólida
y de 3 a 4 mL. si es diarreica.
Si el cultivo se hace dentro de las dos horas después de tomada la muestra, no se

requiere medio de transporte. Pasado ese período se recomienda usar el medio de
transporte Cary  Blair, o el caldo de Selenito o Tioglicolato.
SECRECIÓN OCULAR.
La muestra debe tomarse con cuidado y con la ayuda de otra persona para que
inmovilice la cabeza del paciente. Previa separación del párpado inferior con el pulgar
de la otra mano, tomar con un hisopo de la secreción conjuntival dirigida hacia el ángulo
interno del ojo, rotar el hisopo suavemente (tomar 2 hisopos uno para úlcera corneal)
sembrar en el medio de agar sangre, Mac Conkey, tioglicolato y también un tubo de
sabouraud. En este caso es recomendable que el oftalmólogo, con anestesia local tome
la muestra con careta. Siempre hacer examen directo.
SECRECIÓN OTICA.
Con dos hisopos colectar el pus del conducto auditivo externo. Hacer un frotis y teñirlo
con Gram e inocular en agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey.
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BACILOSCOPIAS
Este grupo de bacterias en forma de bacilos, se tiñen con dificultad por el alto contenido
de grasa en su pared celular. Para lograr teñirlas deben usarse coloraciones con fenol
y calor. Una vez teñidas con fucsina carbólica, no se decoloran con alcohol acidificado.
Por esta característica muy particular se les llama “BACILOS ALCOHOL-ÁCIDO
RESISTENTES”.
Las mycobacterias son aerobios estrictos, no móviles, no poseen cápsula no producen

esporas. Su crecimiento es sumamente lento, la mayoría de especies patógenas crecen
después de 2 a 6 semanas de incubación a 36°C en el medio de Lowenstein-Jensen.
Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se asocian con enfermedad , en
nuestro medio, sin lugar a duda, M. tuberculosis es la especie más importante
PROPOSITO.
Demostrar por medio de coloración y cultivos especiales la presencia de bacterias
pertenecientes al género Mycobacterium, especialmente Mycobacterium tuberculosis.
OBJETIVOS
1-Conocer las técnicas de laboratorio útiles para la identificación de M. tuberculosis.
2-Conocer las tinciones utilizadas para la identificación presuntiva de M. tuberculosis.
MUESTRAS.
1. Esputo: Es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para la
investigación de tuberculosis.
 El esputo debe colectarse temprano en la mañana, inmediatamente al despertar.
De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en días alternos.
 El primer esputo de la mañana es la más adecuada para el análisis, pues es
más concentrada y menos contaminada.
 Colectar la muestra antes de iniciar tratamiento.
 Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con agua
corriente, no debe de usar pasta dental o cualquier otro antiséptico.
 El paciente debe depositar la muestra en un recipiente estéril de boca ancha.
 El paciente que tiene dificultad para producir esputo puede usar estos métodos:
a) Nebulización de solución salina hipertónica (cloruro de sodio al 10%, sin
propilenglicol), es excelente para inducir la producción de esputo,
generalmente diluido.
b) Los hisopos faríngeos pueden ser usados en estos pacientes para extraer el
esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable para niños
pequeños a los cuales no se les pude pedir una muestra adecuada.
c) Broncoscopía: Puede ser usada para obtener las muestras directamente del
sitio infectado.
31
2. Lavado gástrico: Frecuentemente se solicita lavado gástrico para análisis de
micobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estómago, sirve para
demostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se ha tragado.
3. Orina: Se debe examinar un mínimo de tres muestras de la PRIMERA ORINA DE LA
MAÑANA colectar a “medio chorro” en un recipiente estéril de boca ancha.
4. Otro tipo de Muestra:
 Lavado bronquial
 Fragmentos de pulmón
 Hisopado faríngeo
 Líquido cefalorraquídeo
 Líquido pleural
 Líquido articular
 Pus
 Raspado endometrial (sangre menstrual)
 Médula ósea
 Líquido pericardico
 Trozos de tejido de biopsias.
PROCEDIMIENTO:
El diagnóstico de Micobacterias se basa en la observación de los bacilos alcohol-ácido
resistentes en la muestra y su cultivo IN VITRO. Los bacilos alcohol-ácido resistentes
deben teñirse con las coloraciones de Zielh-Neelsen o Kinyoun. Ambas técnicas dan
buen resultado.
COLORACIÓN DE KINYOUN:
Tiene la ventaja de que no necesita calentamiento. Proceder así:
1. Preparar el frotis de igual forma que para Zielh-Neelsen y fijarlo con calor.
2. Colocar la lámina en la gradilla de coloración y dejar que enfríe. Cubrir el frotis con
Fucsina de Kinyoun y dejar que se coloree por 4 minutos. No es necesario calentar.
3. Lavar con agua corriente
4. Decolorar el frotis con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante rojo.
5. Lavar con agua corriente.
6. Cubrir el frotis con azul de metileno por 1 ó 2 minutos.
7. Lavar con agua corriente.
8. Dejar secar y examinar con lente de inmersión.
COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN:

1-Cubrir el frotis previamente fijado con fucsina fenicada por 5 minutos y calentar hasta
la emisión de vapores. (No hervir).
2- Lavar con agua de chorro.
3- Decolorar con alcohol-ácido por 2 minutos.
4- Lavar con agua de chorro.
5- Cubrir el frotis con azúl de metileno por 1 minuto.
32
6- Lavar con agua de chorro y dejar secar.
INTERPRETACIÓN DE LA BACILOSCOPÍA:
Número de Bacilos Reporte

Alcohol-Ácido Resistente
0 No se observan bacilos Alcohol-Ácido Resistente
1 a 2 en todo el frotis Informar el número de BAAR encontrados y pedir
nueva muestra
3 a 9 en todo el frotis + ó escasos
10 ó más en todo el frotis ++ ó regular cantidad
1 ó más por campo +++ abundantes
CULTIVO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.
Antes de inocular los medios de cultivo para la identificación final de M. tuberculosis

deben realizarse una serie de procedimientos para tener éxito en los aislamientos.
Dentro de los procedimientos a realizar tenemos:
A) Descontaminación
B) Neutralización
C) Centrifugación
Luego de realizar estos procedimientos se procede a inocular los medios de cultivo

apropiados.
DISCUSION
1- Medios de cultivo utilizados en la identificación de Mycobacterias.
2- Tinciones utilizadas. Uso de cada colorante.
3- Reporte preliminar.
4- Baciloscopia. Ventajas, desventajas y utilidad clínica.
IDENTIFICACION DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.
Para que el Laboratorio pueda obtener resultados confiables, no solo es necesario que
ejecute las técnicas en forma correcta, sino que reciba una buena muestra que provenga
del sitio de la lesión a investigar y obtenida en cantidad suficiente.
La muestra de mayor rendimiento para la baciloscopía es la expectoración,
33
especialmente de la mañana, proveniente del árbol bronquial, se le pide al paciente que
inspire profundamente, que retenga un instante el aire en sus pulmones y que lo expulse
violentamente con un esfuerzo de tos hasta obtener no menos de tres esputos.
Para el diagnóstico se requiere dos muestras: la primera se tomará en el momento de

la consulta, la segunda será recogida al despertar la persona (matinal) previo aseo de
la boca.
Para control de tratamiento: dos baciloscopías al segundo, cuarto y sexto mes de

tratamiento.
Para control post tratamiento: se deben realizar baciloscopías a los 12 y 24 meses de

finalizado el tratamiento.
Al recibir la muestra se debe observar la cantidad y la calidad, tapar bien el recipiente y

marcarlos en el cuerpo del recipiente, no en la tapa.
BIBLIOGRAFÍA
 Gustavo A. Gini Q.B. “Manual de Procedimientos para la Identificación de las

bacterias con importancia clínica”, Segunda Edición, Guatemala 1995.
 Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social. Unidad de Laboratorio “Manual
Normativo, toma, manejo y envió de muestras para análisis de laboratorio”.
Páginas 1-11, San Salvador. El Salvador 1995.
 Miguel Francisco Torres. “Manual Práctico de Bacteriología Médica”. Segunda
Edición. Páginas 41-189, Guatemala 1999.
 Giuseppe Nicoletti, Vito Nicolosi “Diccionario de Bacteriología Humana” Centro
Documentación Científica Menarini Barcelona 1990.
 Hospital Nacional de Niños Benjamín Bloom. “Manual de Técnicas de
Microbiología” Pág. 1-44. San Salvador, El Salvador 1996.
 Koneman/ Allen/ Dowell/ Janda y otros. Texto y Atlas, Diagnostico
Microbiológico. 4ta Edición. Editorial Médica Panamericana.
34
35
Anexos
Anexo 1
Coloraciones
COLORACIÓN DE GRAM.
1. Hacer un frotis.
2. Fijar el frotis con calor y dejar enfriar.
3. Cubrir el frotis con cristal violeta por 1 minuto.
4. Lavar con agua de chorro, eliminar el exceso de agua
5. Cubrir el frotis con lugol para Gram por 1 minuto.
6. Lavar con agua de chorro.
7. Decolorar con alcohol acetona por 20-30 segundos.
8. Lavar con agua de chorro.
9. Cubrir con safranina el frotis por 30 segundos.
10. Lavar con agua de chorro. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo
100x.
INTERPRETACION
 Bacterias Gramnegativas: Color rojo o rosado.

 Bacterias Grampositivas: Color violeta oscuro.
TINCION DE ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE.

(Ziehl- Neelsen).
Esta es una tinción diferencial que permite distinguir entre algunas bacterias que por su
alto contenido de sustancias lipídicas o céreas se tiñen con dificultad por los
procedimientos usuales; sin embargo, una vez teñidas resisten el colorante aún cuando
se les lave con una mezcla de alcohol- ácido clorhídrico. Esta tinción es importante para
distinguir, entre otras las bacterias ácido resistentes causantes de la tuberculosis y la
36
lepra. (Mycobacterium sp). Existen varias técnicas para este tipo de tinción, sin embargo
nos referimos a la de Ziehl- Neelsen.
REACTIVOS:
CARBOLFUCSINA:
Fucsina básica...................................... 0.3 g
Etanol 95°C........................................... 10.0mL
Cristales de fenol fundidos por calor...... 5. 0mL
Agua destilada....................................... 95.0mL
Disuelva la fucsina básica en el alcohol y el fenol en el agua. Mezcle las dos soluciones
y deje en reposo por una semana antes de usar. Almacene en frascos ámbar a
temperatura ambiente.
ALCOHOL- ÁCIDO:
Etanol 95°C.............................................97.0mL
Ácido clorhídrico concentrado................ 3.0mL
Agregue el HCL al alcohol, homogenice y almacene en frascos a temperatura ambiente.
AZUL DE METILENO:
Azul de metileno.................................... 0.3 g
Agua destilada....................................... 100.0mL
Disuelva el azul de metileno en el agua mediante agitación. Almacene en frascos ámbar
a temperatura ambiente.
FILTRE LOS COLORANTES AL MENOS UNA VEZ AL MES.
PROCEDIMIENTO:
1. Prepare un frotis adecuado de la muestra a estudiar.
2. Cubra la lámina con CARBOLFUCSINA y caliente suavemente hasta que haya

emisión de vapor. NO DEJE QUE EL COLORANTE HIERVA NI SE SEQUE.
Agregue más carbolfucsina si es necesario. Mantenga la emisión de vapor durante
3-5 minutos.
3. Lave la preparación con agua del grifo.
4. Decolore con alcohol- ácido durante 2 minutos o hasta que queden sólo trazas de
color rosado.
5. Lave con agua del grifo
6. Aplique el colorante de contraste AZUL DE METILENO por un minuto.
37
7. Lave con agua del grifo.
8. Deje secar y observe con objetivo de inmersión.
RESULTADO:
Bacterias alcohol- ácido resistentes: rojas.

Bacterias alcohol- ácido sensibles: azules.
CONTROL DE CALIDAD:
Utilice una mezcla de bacterias que contengan bacilos alcohol ácido resistentes
(Mycobacterium sp.) y cocos alcohol- ácido sensibles (Staphylococcus sp.)
COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO PARA MUESTRAS DE HECES.
Es una coloración directa simple usada para diferenciar las características morfológicas
de microorganismos y glóbulos blancos en materia fecal. Utilizado para diferenciación
de glóbulos blancos en muestras de heces el procedimiento puede desarrollarse: Con
un montaje húmedo (directo al fresco) o con frotis de heces que contengan leucocitos
(el cual ha sido previamente fijado).
PROCEDIMIENTOS PARA FROTIS FIJADOS.

1. Hacer un frotis a partir de una muestra de heces dejar sacar al aire.
2. Fijar con metanol al 95% por 1-2 minutos dejar secar.
3. Cubrir la preparación con azul de metileno por 30-60 segundos.
4. Lavar con agua. Dejar secar. Observar microscopio con objetivo 100x.
INTERPRETACIÓN.
En este caso se usa para diferenciar leucocitos fecales en enfermedades invasivas.
Predominio de Neutrófilos: se asume que existe un proceso infeccioso de origen

bacteriano.
Predominio de Linfocitos: se asume que el proceso infeccioso es de origen viral.
Elevado número de Eosinófilos: Se sospecha la presencia de parásitos o una
enfermedad crónica.
REPORTE.
 Contar 100 células y reportar: porcentaje de linfocitos y porcentaje de PMN.
 Si están escasas las células reportar: solo el número de células encontradas sin
reportar porcentaje. Ejemplo: 25 PMN, 2 Linfocitos.
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 Si no se observan células, reportar: 0% de linfocitos, 0% de PMN.
Anexo 2.
Otras pruebas bacteriologicas
PRUEBA DEL CORDÓN.
En una lámina colocar unas gotas de desoxicolato de sodio al 0.5% y suspender las
colonias bacterianas sospechosas. La mezcla se vuelve sumamente viscosa si es una
bacteria del género Vibrio. Esta viscosidad se puede visualizar mejor si se sumerge
dentro de la mezcla un asa. Al retirar el asa de la preparación se forma un cordón o hilo
de mucosidad entre el asa y la mezcla.
PRUEBA DE LA COAGULASA.
La coagulasa es una enzima que tiene la capacidad de convertir el fibrinógeno que está
presente en el plasma humano o animal, en fibrina, lo cual se evidencia en el laboratorio
por la formación de un coágulo visible.
Esta prueba se usa para diferenciar Staphylococcus aureus que siempre produce esta
enzima, de otras especies de Staphylococcus que no la producen.
La coagulasa está presente en las bacterias en dos formas: a) libre y b) unida a la pared
de la bacteria. La coagulasa unidad a la pared se evidencia haciendo la prueba en
lámina, y la coagulasa libre se determina haciendo la prueba en tubo. La prueba en
lámina es presuntiva y a todos los cultivos que den la prueba débil o negativa se les
debe hacer la prueba en tubo, porque algunas cepas de S. aureus sólo producen la
coagulasa libre.
MEDIOS Y REACTIVOS.
1. Plasma de conejo o plasma humano obtenido de sangre fresca estéril, no nitratada.
2. Cloruro de calcio al 5%: Pese 5.0 gramos de Cloruro de calcio, deposite en un
balón aforado de 100 mL y lleve con agua destilada hasta la marca de aforo.
3. Medio de cultivo: Cualquier medio sólido, libre de sal (NaCl) debe usarse para que
crezca el microorganismo a probar.
PRUEBA EN LÁMINA.
1. Ponga una gota de solución salina estéril en un portaobjeto limpio.
2. Tome una asada del cultivo a probar. Debe tener 18 horas y haber crecido en un
medio libre de sal. Haga con el asa una emulsión homogénea en la gota de
solución salina.
3. Agregue una gota de plasma a la suspensión de bacterias y mezcle.
4. Observe si hay formación inmediata o no de un precipitado granular de coágulos
blancos.
39
PRUEBA EN TUBO.
1. Agregue asépticamente 0.5 mL de plasma a un tubo estéril 12 x 75 mm.
2. Añada 0.5 mL de cultivo crecido en caldo infusión de cerebro y corazón o una
asada de un cultivo crecido en un medio sólido.
3. Incube el tubo en un baño María a 35°C.
LECTURA E INTERPRETACIÓN
1. PRUEBA EN LAMINA:
PRUEBA POSITIVA: Formación de un precipitado granular dentro de un período de
tiempo de 5 segundos a 1 minuto. Después de 1 minuto si aparece precipitado, monte
la prueba en tubo.
PRUEBA NEGATIVA: Suspensión homogénea.

Confirme el resultado con la prueba en tubo.
2. PRUEBA EN TUBO:
Observe cada 30 minutos y si a las 4 horas está
negativa, deje 24 horas en el baño María.
PRUEBA POSITIVA: Cualquier indicio de

coágulo.
PRUEBA NEGATIVA: Suspensión permanece homogénea.
CONTROL DE CALIDAD:
a. Control de esterilidad del plasma: 24 horas a 35°C.
b. Control de coagulación: Agregue una gota de solución de Cloruro de calcio al 5% a
0.5 mL de plasma. El plasma debe coagular en un periodo de 1 minuto.
c. Control positivo: S. aureus.
d. Control negativo: S. epidermidis.
PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:
1. Si se usa plasma citrato, agregue 5 unidades de heparina/ mL para eliminar falsos

positivos en la prueba de la coagulasa, ya que microorganismos que utilizan citrato
causan coagulación del plasma al consumirlo.
2. Si el cultivo a probar tiene más de 24 horas o es escaso se puede obtener una

prueba de coagulasa débil.
40
3. Si una colonia no se suspende en la solución salina en la prueba en lámina, el
resultado es imposible de interpretar.
4. No se deben emplear inóculos provenientes de medios con alta concentración de

sal, ya que el cultivo autoaglutina en solución salina.
5. Cuando realice la prueba en tubo no agite el tubo para observar la formación de

coágulo. Un falso negativo puede ocurrir debido a un rompimiento del coágulo
inicial que no se formará de nuevo.
6. Es muy importante observar el tubo cada 30 minutos, ya que existen cepas de S.

aureus que producen grandes cantidades de fibrinolisina, por lo que el coágulo se
puede lisar antes de 4 horas e interpretar erróneamente el resultado como negativo.
7. Algunas cepas producen poca coagulasa, por lo que la formación del coágulo se
evidencia hasta las 24 horas de incubación.
PRUEBA DE LA CATALASA.
La catalasa, es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y

anaerobias facultativas.
El peróxido de hidrógeno es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de

los carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo. La catalasa convierte
el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción:
CATALASA
H202 2H2O+O
Esta prueba es de vital importancia en la diferenciación de Streptococcus (catalasa

negativa) y de los Staphylococcus (catalasa positiva).
REACTIVO
Peróxido de hidrógeno al 3%: Se prepara con peróxido de hidrógeno y agua destilada.
Este es un reactivo muy inestable que cuando se expone a la luz se descompone
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fácilmente. Debe almacenarse en refrigeración y en botella color ámbar. Además justo
cuando se va a usar debe revisarse que dé bien con los controles de calidad.
PRUEBA EN LÁMINA.
a) Con una aguja bacteriológica o un aplicador estéril, pique el centro de una colonia
bien aislada y transfiera el inóculo a un portaobjeto limpio.
b) Añada 1 o 2 gotas de peróxido al 3%.
c) Observe si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el
reactivo.
d) Descarte la lámina en un recipiente con desinfectante.
MÉTODO EN PLATO O TUBO CON AGAR.

a) Añada unas gotas del peróxido de hidrogeno al 15% directamente sobre la superficie
donde hay crecimiento.
b) Observe si se forman o no burbujas de inmediato.
CONTROL DE CALIDAD.
a) Control positivo: Staphylococcus sp.
b) Control negativo: Streptococcus sp.
PRECAUCIONES.
1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de platino ya
que puede dar un resultado falso positivo. El alambre de nihcrome no interfiere.
2. La prueba debe realizarse a cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos pueden
perder su actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.
3. El peróxido de hidrógeno es extremadamente cáustico por lo que se debe evitar que
toque la piel ya que puede causar quemaduras dolorosas. En caso que ocurran,
inunde de inmediato el área afectada con alcohol al 70% para neutralizar la acción.
NO DEBE USAR AGUA.
PRUEBA DE OXIDASA.
La enzima Oxidasa, conocida también como CITOCROMO O OXIDASA O INDOFENOL

OXIDASA. Se encuentra presente en una gran variedad de seres vivientes entre los que
incluyen bacterias hasta animales superiores. Su función es la de promover la oxidación
del citocromo “c” a expensas del oxígeno molecular.
En bacteriología se puede determinar su presencia al hacer reaccionar una población

bacteriana con su sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- p- fenilendiamina y el
resultado observado es la aparición de color que va del rosado al púrpura.
Las siguientes reacciones ilustran lo anteriormente expuesto:
42
2 citocromos “c” reducidos + 2H* + ½ O2 CITOCROMO.c2 citocromo “c” oxidativos +
H2O
OXIDASA.
2 citocromos “c” reducidos + REACTIVO COMPUESTO COLOREADO

OXIDACIÓN
Esta prueba es sumamente importante en la identificación de bacterias Gram negativas

y en la diferenciación de cocos Gram positivos de importancia clínica: Micrococcus
(prueba positiva) y Staphylococcus (prueba negativa excepto S. Sciuri).
REACTIVOS.
 PARA GRAM NEGATIVOS.
REACTIVO DE KOVAC
Tetrametil P- fenilendiamina dihidrocloruro....................... 0.1 g

Agua destilada................................................................... 10 mL.
Agregue agua al tetrametil – p- fenilendiamina y disuélvalo. Si es necesario caliente

lentamente para lograr la disolución completa.
Este reactivo debe ser incoloro o mostrar un tono rosado sumamente leve. Si presenta
otro aspecto, descártelo; es poco estable y se oxida rápidamente, de tal forma que debe
prepararse justo antes de usarlo.
De los reactivos empleados para detectar OXIDASA, este es el MÁS SENSIBLE.
REACTIVO DE GORDON Y McLEOD:
Dimetil – p- fenilendiamina monohidrocloruro...................0.1 g

Agua destilada...................................................................10 mL
Agregue el agua al dimetil –p- fenilendiamina y disuélvalo. Si es necesario, caliente

lentamente para lograr la disolución completa.
Este reactivo debe presentar un tono lila muy tenue. Si presenta otro aspecto,
descártelo. Es más estable que el reactivo de Kovac pero MENOS SENSIBLE. Debe
prepararse justo antes de usarlo.
 PARA COCOS GRAM POSITIVOS.
REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER:
Tetrametil – p- fenilendiamina dihidrocloruro...................0.6g

Dimetilsulfóxido.................................................................10 mL.
Agregue el dimetilsulfóxido al tetramil- p- fenilendiamina y disuélvalo. Este reactivo
43
presenta un tono lila suave, es muy sensible.
Almacénelo en botellas color ámbar. Si el reactivo presenta otro color, DESCARTELO.
PROCEDIMIENTO
 PARA GRAM NEGATIVOS
TIRAS DE PAPEL
A partir de un cultivo de 18-24 horas, tome un inóculo denso con asa de platino o palillo
de madera estériles y deposítelo sobre una tirilla de papel filtro impregnada con el
reactivo para oxidasa
PRUEBA DIRECTA EN PLACA.
Inunde las colonias en estudio en la placa con el reactivo para oxidasa.
 PARA COCOS GRAM POSITIVOS.

A partir de un agar incubado a 36°C por 18-24 horas en atmósfera aerobia tome una
asada del cultivo y espárzala en una tira de papel filtro. Agregue 1 gota del reactivo de
Faller y Schleifer.
LECTURA E INTERPRETACIÓN:
a) REACTIVO DE KOVAC: Se debe hacer la lectura en un período de hasta 10

segundos.
b) REACTIVO DE GORDON Y McLEOD: Se debe de leer en un período de hasta 30
minutos.
c) REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER: Se debe leer en un período de hasta 2
minutos.
PRUEBA POSITIVA: Aparición de color púrpura en el tiempo estipulado

PRUEBA NEGATIVA: No aparición de color púrpura en el período señalado.
CONTROL DE CALIDAD:
a) Control positivo para:

Gram negativos: Aeromonas hydrophila.
Pseudomonas aeruginosa.
Gram positivos: Micrococcus sp.

b) Control negativo para: Gram negativos: Escherichia coli
Gram positivos: Staphylococcus aureus.
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PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:
1. La cristalería empleada para preparar y almacenar los reactivos para oxidasa debe
ser lavada escrupulosamente para eliminar restos de materia orgánica, ya que ésta
contribuye a oxidar el reactivo.
2. No realice la prueba de oxidasa a colonias bacterianas crecidas en medios que

contengan glucosa, ya que su fermentación inhibe la actividad de la enzima y
ocasiona falsos negativos.
3. La prueba debe realizarse únicamente a colonias provenientes de medios no

selectivos y no diferenciales.
4. Para la prueba no debe utilizarse el asa corriente (NIHCROME) dado que ésta, por
las trazas de hierro que deja, puede inducir la oxidación del reactivo y dar falsos
positivos.
5. La reacción debe observarse ÚNICAMENTE en la colonia y no alrededor de ésta.
6. El dimetil- p- fenilendiamina es menos sensible y las colonias viscosas (mucosas)

pueden aparecer como oxidasa negativas por la poca penetración del reactivo.
BIBLIOGRAFIA
o Microbiologia Médica Jawetz, Brooks, Geo 1997, Manual Moderno, Mexico 15ª
Edición.
o Tecnología y Métodos de Lab. Clínico, González de Butriago, José, 1990
Editorial Salvat, México 1ª Edición.
o Microbiología e Inmunologia, Levison Warren, Manual Moderno, México 2ª
Edición, 1998.
45
o Microbiología Médica de Divo, Carmona Osvaldo, Editorial McGraw Hill,
Caracas 5ta. Edición 1997.
o Microbiología. Brock Thomas, Prentice Hill, México, 4ta Edición 1987.
o Microbiología Zinsser, Jolik, Walfgang K, Editorial Medica Panamericana,
Buenos Aires, 20ª Edición 1997.
o Diagnóstico y Tratamiento para el Laboratorio, Henry- John Bernard, Masson
S.A., España 9ª edición, 1993.
o Microbiología y Parasitología, Romero Cabello Raúl y otros, Medica
Panamericana, México, 2ª edición, 1993.
o Laboratorio Clínico. Microbiología, Delgado Iribarren, Alberto, Mc Graw Hill,
Madrid, 1ª edición, 1994.
o Prevención de enfermedades Nosocomiales OMS, 2003, Ginebra, 2ª
edición.
o NAR/aa
RESUMEN
46
RESUMEN
DOCUMENTO CIENTÍFICO
INTRODUCCIÓN
La actividad que desarrolla el laboratorio de microbiología está orientada esencialmente al diagnóstico
microbiológico de las enfermedades infecciosas. Una parte importante de esa actividad consiste en el
aislamiento, la identificación y la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos de los microorganismos
causales de estas enfermedades. Otra parte importante de la actividad de un laboratorio de microbiología
consiste en la detección de anticuerpos, antígenos y ácidos nucleicos en diversas muestras (sangre, líquidos
estériles, orina, etc.), técnicas que resultan muy útiles en el diagnóstico precoz de determinadas enfermedades
infecciosas. La gran diversidad de muestras clínicas y de métodos diagnósticos aplicables, son dos aspectos
que diferencian el laboratorio de microbiología de otros laboratorios clínicos.
Este documento pretende exponer de forma resumida los aspectos referentes a la recogida, transporte y
procesamiento de las muestras que son relevantes para que la actividad del laboratorio de microbiología se
desarrolle de manera eficaz y eficiente. Los aspectos relacionados con las pruebas rápidas de detección de
anticuerpos, antígenos y ácidos nucleicos no se describen en el presente procedimiento y serán desarrollados
en otros posteriores.
CONSIDERACIONES CLÍNICAS
El primer paso del diagnóstico microbiológico comienza con la obtención de la muestra clínica
adecuada. Para ello es preciso conocer los posibles agentes etiológicos de las enfermedades infecciosas
y los mecanismos patogénicos de los mismos. La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso
que se pretende diagnosticar, teniendo siempre en cuenta que en determinadas infecciones, muestras no
relacionadas directamente con la focalidad clínica pueden tener también un buen rendimiento
microbiológico. El síndrome clínico y los posibles agentes etiológicos implicados condicionan no sólo el
tipo de muestra a enviar sino también su procedimiento de obtención y el transporte al laboratorio. En la
tabla 1 se resumen los distintos tipos de muestras adecuadas en función de las infecciones más
comunes. Igualmente, la información clínica es la que permite al laboratorio aplicar las técnicas
diagnósticas disponibles de manera más eficiente. Por ello es fundamental que el microbiólogo esté en
estrecha comunicación con los clínicos y que participe activamente en el proceso diagnóstico del paciente.
A su vez, el laboratorio de microbiología debe poner a disposición de los clínicos toda la información
necesaria sobre las posibilidades diagnósticas que el laboratorio ofrece.
RECOGIDA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

Toda la información diagnóstica que puede generar el laboratorio de microbiología depende en gran
medida de la muestra enviada. Esta no sólo tiene que ser la adecuada, sino que además debe cumplir
unos requisitos que aseguren su idoneidad y en consecuencia la calidad de nuestro trabajo. La
idoneidad de las muestras enviadas depende del cumplimiento de una serie de medidas o reglas
referentes a: procedimiento de obtención, cantidad enviada y transporte rápido y adecuado al
laboratorio. Todas las normas y recomendaciones sobre estos aspectos se encuentran detalladas en el
documento técnico. Las consecuencias de una muestra mal tomada y/o mal enviada pueden suponer un
fracaso en el aislamiento del agente etiológico o el aislamiento de posibles microorganismos
contaminantes que pueden generar tratamientos innecesarios o inadecuados. Para asegurar la
idoneidad de las muestras que recibe, el laboratorio de microbiología debe elaborar un manual claro y
conciso de las normas de recogida y transporte de las mismas. Dicho manual debe distribuirse en
controles de enfermería, consultas y demás dependencias hospitalarias y ambulatorias en las que se
asista a los pacientes.
TOMA DE MUESTRAS
La explicación detallada de la toma de cada muestra para el diagnóstico microbiológico se puede
encontrar en la sección anterior. En estos se detalla la preparación previa del paciente, la muestra de
elección, las alternativas aceptables, su cantidad, los recipientes adecuados y la conservación de la
muestra así como su estabilidad.
RECEPCIÓN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Una vez que la muestra se recibe en el laboratorio de microbiología, el manejo de la misma incluye:
1. Recepciónde la muestra: consiste básicamente en determinar si la muestra cumple o no los requisitos

de calidad necesarios para ser procesada. Estos requisitos incluyen: la correcta identificación de la
muestra, la valoración sobre si existe una cantidad adecuada para el estudio solicitado y la
comprobación de las condiciones adecuadas de transporte y conservación. Cada laboratorio debe
elaborar y distribuir los criterios de aceptación y rechazo de las muestras.
Tabla 1.- Muestras clínicas recomendadas para el diagnóstico microbiológico de las
infecciones más comunes
Tipo de infección Muestra Comentarios

Bacteriemia
Hemocultivos
Infecciones cardiovasculares y
asociadas a dispositivos
intravasculares (IV)
Endocarditis Hemocultivos/Válvula/Verru
Infección del gas Catéter IV, piel
catéter pericatéter, conexión del
catéter
Pericarditis Líquido pericárdico
Sistema nervioso central
Meningitis LCR
Abscesos Aspirados de abscesos
cerebrales
Tracto respiratorio
Faringoamigdalitis Exudado faríngeo No válidos los exudados nasales
Sinusitis Aspirado sinusal
Otitis media Timpanocentesis
Otitis Exudado oído
externa externo
Neumonía Esputo, muestras obtenidas
por fibrobroncoscopia,
punción transtorácica
aspirativa, punción
Empiema y abscesos transtraqueal,
pulmonares broncoaspirado Líquido
pleural, aspirados de
abscesos
Nasofarínge Diagnóstico tosferina/Infecc.
o Nasal víricas Detección de S. aureus
Infecciones oculares
Conjuntivits Exudado
Queratitis conjuntival/raspado
Endoftalmitis Raspado corneal
Líquido intraocular
Infecciones gastrointestinales
Diarrea Heces/biopsia intestinal/ Aspirado duodenal
Infecciones intraabdominales
Peritonitis Líquido peritoneal
Abscesos Aspirados de
intraperitoneales y abscesos
abscesos viscerales
Colecistitis Líquido biliar
Tracto urinario
Infección urinaria Orina (micción media, sonda)
Orina obtenida mediante Diagnóstico de bacteriuria
punción suprapúbica por anaerobios y de ITU
en niños
Tracto genital
Úlceras Raspado de la
genitales úlcera Aspirado del
Nódulos nódulo Exudado
Detección de S.agalactiae
genitales uretral Exudado
(también exudado rectal)
Uretritis vaginal Exudado
Acompañada de orina pre y
Vulvovaginitis endocervical
post masaje prostático
Cervicitis Secreción
Prostatitis prostática
Piel y tejidos blandos

Impétigo, foliculitis, erisipela, Preferiblemente aspirados
celulitis, úlceras, infecciones tomados con jeringa y
gangrenosas, abscesos biopsias de tejido. Son menos
cutáneos, heridas y quemaduras recomendables las muestras
tomadas con torundas
Hueso y articulaciones
Artritis Líquido sinovial
Osteomielitis Biopsia ósea o exudado
LCR: Líquido cefalorraquídeo

2. Procesamiento: consiste en la preparación de las muestras, la realización de tinciones y la inoculación en
los medios de cultivo para su posterior incubación. En este proceso es preciso considerar: a) el tipo de
muestra enviada, b) el diagnóstico clínico del paciente y c) la petición solicitada.
El tipo de muestra enviada determina si requiere o no pretratamiento (centrifugación,
homogeneización) previo a la inoculación de los medios de cultivo.
La información clínica del paciente es fundamental para la selección de los medios de cultivo a
inocular y su posterior incubación.
De modo general, en función del tipo de muestra, el laboratorio utiliza unos medios de cultivo
primarios que permiten el aislamiento de la mayoría de los agentes etiológicos más frecuentes de los
distintos procesos infecciosos. Sin embargo, en ocasiones el síndrome clínico puede estar causado por
microorganismos poco frecuentes cuyo aislamiento requiere el uso de medios de cultivo específicos y/o
selectivos no habituales. La sospecha de la participación de alguno de estos microorganismos poco
habituales, debe comunicarse al laboratorio. Igualmente, el laboratorio debe dar a conocer a los clínicos
de su institución qué microorganismos investiga rutinariamente y cuáles debe especificar en la petición
(cartera de servicios o catálogo de pruebas).
DOCUMENTO TÉCNICO
PROPÓSITO Y ALCANCE
El propósito de este procedimiento es establecer las directrices para asegurar la calidad de la fase
preanalítica en lo que afecta tanto a la recogida como al transporte de las muestras hasta la llegada al
laboratorio de microbiología previo al procesamiento. Asimismo, este procedimiento establece las
directrices del procesamiento inicial de la muestra de una manera general, una vez recibida en el
laboratorio.
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de hospitales, centros de salud o cualquier laboratorio
que realice determinaciones de microbiología clínica.
FUNDAMENTO
Todo el trabajo de un laboratorio de microbiología se convierte en inútil si las muestras clínicas que se
reciben para el diagnóstico no son de calidad, es decir, no están correctamente recogidas y transportadas al
laboratorio en las condiciones adecuadas para la determinación que se solicita. El laboratorio de
microbiología debe proporcionar esta información a los servicios solicitantes para que tanto la recogida
como el transporte y la conservación se hagan de manera apropiada.
MUESTRAS
En la tabla 2 se puede consultar con más detalle la muestra de elección para cada determinación
microbiológica, recipientes, transporte y conservación de cada muestra. Como reglas generales cabe
indicar las siguientes:
1. Antes de recoger la muestra, considerar el riesgo/beneficio de la recogida de la muestra para el
paciente.
2. La muestra debe transportarse en envases adecuados con cierres a prueba de fugas (ver tablas 3 y 4).
La recogida de la muestra deberá realizarse en condiciones de máxima asepsia, evitando
contaminaciones ambientales del personal y del propio enfermo a la muestra y viceversa.
3. La muestra debe etiquetarse con el nombre del paciente, el servicio solicitante, el tipo de muestra y la
fecha de recogida. En determinados casos será importante precisar la hora de recogida.
4. Se recomienda que cada muestra se introduzca en una bolsa de plástico que a su vez se introducirá en
otra donde se incluya el volante. Así se evita que los posibles derrames de la muestra invaliden el
volante de petición.
5. Se debe recoger una cantidad de muestra adecuada a la petición (ver tabla 5). En ocasiones una
escasa cantidad de muestra puede ser la causa de falsos negativos.
6. El material destinado a cultivo no debe estar en contacto con sustancias desinfectantes o anestésicas,
siempre que sea posible.
7. La muestra se debe recoger, siempre que sea posible, antes de iniciar cualquier terapia
antimicrobiana.
8. Se debe evitar, siempre que sea posible, el contacto de la muestra con microbiota normal del
paciente, con el objeto de asegurar que la muestra refleje lo mejor posible el lugar de la infección.
9. El envío al laboratorio de microbiología debe ser lo más rápido posible con objeto de asegurar la
supervivencia de microorganismos de difícil crecimiento y de evitar el sobrecrecimiento de la
microbiota normal, acortar el tiempo de contacto con anestésicos locales o con otras sustancias con
acción antimicrobiana utilizadas en la recogida de la muestra.
Tabla 2.- Transporte y conservación de muestras para diagnóstico microbiológico
Muestra Determinación Envases TRANSPORTE CONSERVACIÓN
Tiempo y temperatura Tiempo y temperatura
Abscesos/heridas Bacterias Envase para anaerobios (pref.) o jeringa sin aguja (pref.) ≤2 h, TA ≤24 h, TA
quemaduras/mordeduras Una para Gram, otra para cultivo (Amies/Stuart)
Hongos Estéril (pref.)/Torunda
≤2 h, TA ≤24 h, TA
Una torunda para tinción, otra para cultivo (Amies/Stuart)
Virus Torunda seca1 Transferir a TV, +24 h, -60/-80ºC
≤24 h, 2-8°C
Biopsias Bacterias/Hongos Estéril ≤15 min, TA ≤24 h, TA
Virus Estéril Transferir a TV, +24 h, -60/-80ºC
≤24 h, 2-8°C
Catéter/material Bacterias/Hongos Estéril ≤15 min, TA ≤24 h, 2-8°C
protésico
Catéter urinario No es aceptable
Catéter drenaje No se recomienda Enviar líquido drenaje/abscesos/aspirados
Genital Bacterias/Hongos Estéril ≤2 h, TA ≤24 h, TA
(Secreción prostática)
Genital (cervical/ Chlamydia trachomatis Medio transporte clamidia (cultivo) Inoculación inmediata
uretral/rectal
Torunda seca (fluorescencia)
Genital (cervical/rectal/
Bacterias (gonococo) Inoculación directa sobre medios de cultivo
uretral) Torunda con medio transporte ≤2 h, TA ≤24 h, TA
Genital (líq. amniótico) Bacterias/Hongos Transporte de anaerobios ≤15 min, TA ≤24 h, TA
1
Genital (úlcera) Virus To unda seca Transferir a TV, +24 h, -60/-80ºC
≤24 h, 2-8°C
(cualquier localización)
Genital (semen) No se recomienda
Genital (úlcera) Treponema pallidum Campo oscuro Inmediata visualización
(cualquier localización)
Genital (Uretral) Mycoplasma hominis Torunda de dacrón Inocular a medio transporte ≤8 h, TA
Ureaplasma urealyticum de mycoplasmas
≤36 h, 2-8°C
Genital (vaginal) Bacterias/Hongos Torunda con medio transporte (cultivo) ≤2 h, TA ≤24 h, TA
Torunda seca para Gram
Heces Bacterias Estéril con Cary Blair ≤2 h, TA ≤24 h, 2-8°C
Tiempo y temperatura
Tiempo y temperatura
Clostridium difficile Estéril ≤1 h, TA
48 h, 2-8°C para cultivo
1-24 h, 2-8°C 72 h, 2-8°C (citotoxina)
>24 h, -20°C +72 h, -60/-80°C (citotoxina)
Parásitos Transporte con SAF, FOR + PVA, MIF + PVA Indefinido, TA Indefinido, TA
Rotavirus Estéril 2-8°C
Heces/Rectal Virus Torunda seca1 Transferir a TV, +24 h, ºC
≤24 h, 2-8°C
Jugo gástrico Bacterias/Hongos Estéril ≤2 h, 2-8°C ≤24 h, 2-8°C
Micobacterias Estéril ≤15 min, TA o neutralizar ≤24 h, 2-8°C
en la 1ª hora de la recogida
Hongos Inoculación directa sobre medios de cultivo ≤24 h, TA
Lesiones fúngicas
(piel, pelo, uñas)
Líquidos Bacterias Estéril/botellas de hemocultivos ≤15 min, TA ≤24 h, TA
estériles transporte para anaerobios
Hongos Estéril ≤15 min, TA ≤24 h, 2-8°C
Virus Estéril ≤15 min, 2-8°C ≤72 h, 2-8°C
Serología Estéril ≤15 min, TA ≤24 h, 2-8°C
Parásitos Estéril ≤15 min, TA ≤24 h, TA
Médula ósea Bacterias/Hongos Estéril/botellas de hemocultivos ≤24 h, TA ≤24 h, TA
Parásitos (Leishmania) Estéril ≤2 h, TA ≤2 h, TA
≤24 h, 2-8°C
Ocular (Conjuntival) Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte ≤2 h, TA ≤24 h, TA
Ocular (Raspado corneal Bacterias/Hongos Inoculación directa en medios de cultivo ≤15 min, TA ≤24 h, TA
1
Ocular Virus Torunda seca Transferir a TV, +24 h, -60/-80ºC
≤24 h, 2-8°C
Oído externo Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte ≤2 h, TA ≤24 h, 2-8°C
Oído interno Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte ≤2 h, TA ≤24 h, TA
Transporte para anaerobios
Tubo estéril
Tabla 2.- Continuación

Orina Bacterias/Hongos Estéril ≤2 h, TA (sin conservante) ≤24 h, 2-8°C

Tubos con conservante (ác. bórico-formiato sódico) ≤24 h, 2-8°C (con conservante)
Virus Estéril ≤24 h, 2-8°C
M. hominis/ Estéril Inocular en medio transporte ≤8 h, TA
U. urealyticum de micoplasma ≤36 h, 2-8°C
Leptospira Estéril ≤1 h, TA
Parásitos Estéril ≤2 h, TA ≤24 h, 2-8°C
Antígeno Legionella Estéril ≤2 h, TA ≤24 h, TA
≤24, 2-8°C
+14 d, -20°C
Antígeno de neumococo Estéril ≤2 h, TA ≤24 h, TA
≤24, 2-8°C
+14 d, -20°C
Orina suprapúbica Bacterias Transporte para anaerobios ≤2 h, TA ≤24 h, 2-8°C
Rectal Bacterias Torunda con medio de transporte ≤2 h, TA ≤24 h, TA
Sangre Hemocultivo Botellas de hemocultivos ≤2 h, TA ≤24 h, TA
Serología Suero ≤24 h, 2-8°C +24h, -20°C
Plasma (no válido si hay que inactivar) +24h, -60/-80°C
(evitar
descongelación)
Virus Plasma ≤2 h, TA
(con EDTA para técnicas moleculares)
Carga vírica VIH Plasma (nunca heparina) ≤2 h, TA ≤72 h, -20-°C
+72h, -60/-80°C
Cultivo Leishmania Sangre no coagulada (con heparina pref.) ≤15 min, TA
Parásitos Sangre no coagulada (con EDTA) ≤15 min, TA

Tracto respiratorio Bacterias Transporte para anaerobios/Estéril ≤15 min, TA ≤24 h, TA

superior (sinusal) Hongos Estéril
Tracto respiratorio Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte ≤2 h, TA ≤24 h, TA
superior (faríngeo)
Tracto respiratorio
superior (faríngeo) Antígeno S. pyogenes Torunda seca (Dacrón/algodón) ≤2 h, TA ≤72 h, 2-8°C
Virus Torunda seca1 Transferir a TV, +24 h, -60/-80ºC
≤24 h, 2-8°C
Tracto respiratorio Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte ≤2 h, TA ≤24 h, TA
superior (nasal)
Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte ≤2 h, TA ≤24 h, TA

1
Virus Torunda seca Transferir a TV, +24 h, -60/-80ºC
≤24 h, 2-8°C
Tracto respiratorio Bordetella pertussis Torunda seca de alginato Inmediato/2-8°C
superior (nasofaríngeo)
Tracto respiratorio Bacterias/Hongos Estéril ≤2 h, TA ≤24 h, 2-8°C
Inferior2/esputo
≤24 h, 2-8°C
1Para virus: Se aceptan torundas de algodón, dacrón o rayón con bastón de aluminio o plástico. No aceptar torundas de alginato o con bastón de madera. 2Muestras del tracto respiratorio
inferior: aspirado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado por telescopado, aspirado traqueal, punción transtorácica aspirativa con aguja ultrafina.
Abreviaturas: TA: temperatura ambiente, TV: medio de transporte de virus; SAF: acetato sódico-formalina, FOR: 10% formalina, MIF: mertiolato-ioduro-formalina; pref.: preferentemente.
Tabla 3.- Sistemas de transporte para la investigación de microorganismos aerobios
Sistema de transporte Comentarios
Torundas con medio de transporte Torundas en tubos de plástico con medio de transporte
que mantiene un pH favorable y previene la desecación de
la muestra.
Torundas de alginato cálcico Útiles para la investigación de Chlamydia spp. y

Bortedetella spp. Pueden ser tóxicas para N.gonorrhoeae,
U. urealyticum y virus útiles para la toma de muestra de
conexiones de catéteres intravasculares.
Torundas de dacrón Útiles para la investigación de virus

Torundas de algodón Pueden inhibir a Chlamydia spp. Cuando la torunda es de
madera, puede inactivar a virus del grupo Herpes e
interferir con las pruebas de identificación de Ureaplasma.
Torundas para exudados nasofaríngeos Torundas flexibles que emplean alambre en lugar de
varilla de madera
Tubos estériles de boca ancha Útiles para el transporte de orinas, esputos,
broncoaspirados, lavados broncoalveolares, heces,
biopsias.
Tubos estériles Líquidos estériles, catéter telescopado, aspirados de

abscesos y heridas
Tubos estériles con medio de transporte o Tubo estéril con medio de transporte (Cary Blair) para
conservante enteropatógenos en heces.
Tubo con fijador (alcohol polivinílico) para parásitos en
heces.
Tubo con conservante (ácido bórico–formiato de sodio)
para orinas. Mantiene la población bacteriana durante 48h
a temperatura ambiente sin necesidad de refrigeración.
Placas de Petri estériles Útiles para pelos, escamas cutáneas y uñas
Tabla 4.- Sistemas de transporte para la investigación de microorganismos anaerobios
Sistema de transporte Comentarios
Torundas con sistemas de transporte

específicos para anaerobios
Viales y tubos con atmósfera anaerobia Contienen un medio de transporte semisólido con un
agente reductor y un indicador. Cualquier coloración azul
de dicho medio indica exposición al aire.
Bolsas de anaerobiosis La muestra se introduce en el interior de una bolsa

impermeable en cuyo interior se introduce un catalizador y
un generador de hidrógeno y CO2.
Jeringa para la obtención de aspirados Cuando no se dispone de ninguno de los sistemas
anteriores o bien la cantidad de muestra es mínima, puede
utilizarse la misma jeringa con la que se ha obtenido. Para
ello hay que eliminar el aire y taponar la aguja con un
tapón de goma.
Tabla 5.- Consideraciones sobre la toma de las muestras
1. Consideraciones sobre la toma de las muestras del sistema nervioso central
Volumen mínimo Comentarios

Cultivo
recomendado (ml)
Bacterias 1 Enviar el tubo más turbio

Hongos 2 Descartar Cryptococcus spp.
Micobacterias 2
Anaerobios 2 Abscesos y biopsias
Parásitos 2 Abscesos o biopsias. Naegleria spp. y
Acantamoeba spp. también en LCR.
Virus 1-2
2.- Consideraciones sobre los líquidos estériles
Cultivo Volumen (ml) Comentarios

Bacterias 1-5 Especificar sospecha de artritis gonocócica
Hongos > 10
Micobacterias > 10
Anaerobios 1-5 Usar un medio de transporte con anaerobiosis
3.- Consideraciones sobre las muestras del tracto respiratorio

Bacterias No aplicable Especificar sospecha de Legionella
Hongos 3-5 Esputos, broncoscopias, aspirados y biopsias
pulmonares
Pneumocystis jiroveci 2 Esputo inducido, lavado broncoalveolar o biopsia
pulmonar
Micobacterias 5-10 Esputo, broncoscopia, aspirados y biopsias pulmonares
Anaerobios 1 Aspirado sinusal, timpanocentesis, aspirados y biopsias
pulmonares
Parásitos 3-5 Amebas, huevos de helmintos, larvas de Echinococcus,
Ascaris y Strongyloides spp.
4. Consideraciones sobre las muestras oculares
Cultivo Comentarios
Bacterias Inocular los medios directamente

Hongos Inocular los medios directamente
Micobacterias No usar torundas
Anaerobios Líquido intraocular
Parásitos Descartar Acantamoeba spp.
Chlamydia No usar torundas de algodón
Virus No usar torundas de alginato cálcico
5. Consideraciones sobre las muestras gastrointestinales
Cultivo Comentarios
Bacterias Heces
Biopsia gástrica: Helicobacter pylori
Torunda rectal: Patógenos entéricos (especialmente Shigella spp.) y
Neisseria gonorrhoeae.
Hongos Jugo gástrico, biopsia gástrica, biopsia esofágica
Micobacterias Jugo gástrico, biopsia gástrica, heces
Parásitos Jugo duodenal (Giardia spp y Strongyloides stercoralis)
Biopsia rectal: Entamoeba histolytica
Biopsias intestino delgado: Giardia spp. Cryptosporidium y
Microsporidium spp.
Virus Biopsia esofágica (CMV y Herpes) y biopsia rectal (Herpes).
6.- Consideraciones sobre las muestras de orina
Bacterias 0,5-1 No válidas orinas de 24 horas

Hongos > 20 No válidas orinas de 24 horas
Micobacterias > 20 No válidas orinas de 24 horas
Anaerobios 1 Sólo en orinas suprapúbicas
Parásitos Orina de 24 Schistosoma haematobium, Trichomonas
horas vaginalis, Onchocerca volvulus
Virus 10-50 No válidas orinas de 24 horas. Adenovirus y CMV
7.- Consideraciones sobre las muestras del tracto genital y enfermedades de transmisión sexual.
Cultivo Muestra recomendada
Neisseria gonorrhoeae Cervical, uretral, anal

Bacterias Cervical, vaginal, secreción prostática
Trichomonas vaginalis Vaginal, secreción prostática
Hongos Anal, vaginal, cervical
Anaerobios Abscesos
Virus Herpes Úlceras genitales
Chlamydia trachomatis Uretral, vulva, cervical
Treponema pallidum Úlceras genitales
Ureaplasma urealyticum Uretra, secreción prostática
Linfogranuloma venéreo Rectal, cervical, uretral, úlceras genitales
Haemophilus ducreyi Úlceras y nódulos genitales
8.- Consideraciones sobre las muestras de piel y tejidos blandos
Cultivo Comentarios
Bacterias Usar aspirados con jeringas o biopsias de tejido preferiblemente
Hongos Dermatofitos, levaduras, filamentosos y hongos dimórficos
Micobacterias Mycobacterium marinum, Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium chelonae
Anaerobios Poco comunes en infecciones superficiales, investigar sobre todo en mordeduras y
traumas
Virus Virus herpes simplex y varicella zoster
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO DE LAS MUESTRAS/TOMA DE DECISIONES
El laboratorio de microbiología debe determinar, una vez recibida la muestra en el laboratorio, si ésta cumple
con los requisitos para ser procesada. Estos requisitos incluyen entre otros, una correcta identificación, tipo
de muestra adecuada para la petición, y condiciones adecuadas de transporte y conservación. Es necesario
que cada laboratorio establezca y difunda a los servicios peticionarios sus propios requisitos de la aceptación
de una muestra para estudio microbiológico.
El laboratorio de microbiología debe disponer también de un sistema de registro de estas incidencias en el

que figure la muestra implicada, la persona que realiza la recepción de la muestra, el tipo de incidencia, la
persona con la que se contacta del servicio solicitante y la resolución de la incidencia (si la muestra no se
procesa, si finalmente se decide su procesamiento y en qué condiciones, etc.).
Las incidencias más frecuentes en la llegada de una muestra al laboratorio de microbiología y las acciones a
realizar (toma de decisiones) ante cada caso son las siguientes:
- Muestra deficientemente identificada: no se aceptará una muestra sin identificar, mal identificada o en
la que no coincidan la identificación del volante de petición con la de la muestra. En cualquier caso se
contactará con el servicio peticionario haciéndole conocer la necesidad de que procedan a la correcta
identificación de la muestra. Si se puede recoger otra muestra, se solicitará nuevamente. Dependiendo
de la importancia de la muestra, se puede optar a su procesamiento antes de la correcta identificación
con el objeto de que no se deteriore la misma.
- Muestras derramadas: no se aceptarán muestras claramente derramadas y se solicitará una nueva
muestra. Se procederá como en el caso anterior solicitando una nueva muestra. En el caso de no ser
posible la recogida de una nueva muestra, desinfectar externamente el envase o trasvasar la muestra a un
contenedor estéril. En este caso, se indicará en el informe que la muestra estaba derramada y que los
resultados deben ser interpretados con la debida precaución.
- Transporte/conservación inadecuados: si no se cumplen los requisitos de la tabla 2, se solicitará nueva
muestra. En el caso de muestras que no se puedan volver a recoger (por ejemplo: muestras quirúrgicas)
se puede optar por procesarlas informando por escrito al servicio solicitante de la incidencia en la
recogida/transporte de la muestra y alertando de que los resultados obtenidos deben ser interpretados con
la precaución correspondiente. En el caso de que el transporte deficiente invalide totalmente el estudio
microbiológico (por ejemplo, muestras en formol), no se aceptarán estas muestras y se informará al servicio
solicitante de la inadecuación de la muestra.
MANTENIMIENTO DE MUESTRAS TRAS EL PROCESAMIENTO

Es recomendable mantener las muestras conservadas (dependiendo de la muestra/petición: a temperatura
ambiente, en estufa de 35-37°C, en nevera de 2-8°C, o congeladas a -20°C ó a –70°C) un tiempo tras su
procesamiento. El tiempo de conservación debe ser aquel que garantice que un problema en el
procesamiento o en la interpretación de los cultivos pueda ser solucionado recuperando la muestra para un
nuevo procesamiento. El tiempo mínimo oscila entre 1-3 días. Se recomienda guardar tanto las muestras
procesadas como las rechazadas (no procesadas).
TRANSPORTE DE MUESTRAS POR SUPERFICIE Y POR VÍA AÉREA

Cada vez es más frecuente la realización de procedimientos microbiológicos en lugares distantes al de
la toma de muestra. Aunque es obvio que las muestras biológicas, sean infecciosas o no, deben estar
correctamente empaquetadas y etiquetadas para su transporte y envío, se ha hecho necesario el
desarrollo de legislaciones o guías específicas, tanto a nivel nacional como internacional, debido al
aumento del transporte de muestras fuera de los recintos hospitalarios y entre los distintos centros
sanitarios. El objetivo de este desarrollo es el reducir al mínimo posible el riesgo de accidentes.
Transporte internacional aéreo. Las regulaciones internacionales para el transporte de material
infeccioso están basadas en las Recomendaciones del Comité de Expertos de las Naciones
Unidas para el Transporte de Artículos Peligrosos. Estas recomendaciones están incluidas en las
regulaciones de la Unión Postal Universal (UPU), La Organización Internacional de Aviación
(OIAC) y la Asociación Internacional de Transporte Aéreo (IATA), todas ellas asesoradas por la
OMS.
Actualmente, las muestras se clasifican en sustancias infecciosas (clasificadas dentro de uno de los
cuatro grupos de riesgo definidos por la OMS) y en muestras para diagnóstico.
La modificación en enero de 2003 de la clasificación de una muestra como muestra para diagnóstico
permite que las que cumplan este criterio puedan ser clasificadas como ONU 3373 y embaladas según
las instrucciones de embalaje 650 del manual de la IATA, con las siguientes excepciones:
- Patógenos del grupo 4 de riesgo.

- Agentes identificados y patógenos nuevos o emergentes.
- Cultivos o “stocks” en grandes concentraciones.
Sistema básico de embalaje (ver figura 1). Se compone de:
Recipiente primario estanco, a prueba de filtraciones, etiquetado, que contiene la muestra. El recipiente
debe envolverse en material absorbente.
Recipiente secundario estanco, a prueba de filtraciones, que encierra y protege el recipiente primario. Se
pueden colocar varios recipientes primarios envueltos en un recipiente secundario. Se debe usar
suficiente material absorbente para proteger a todos los recipientes primarios y evitar choques entre ellos.
Recipiente externo de envío. El recipiente secundario se coloca en un paquete de envío que protege al
recipiente secundario y su contenido de los elementos externos, tales como daño físico y agua, mientras
se encuentra en tránsito.
Los formularios con datos, cartas y otras informaciones de identificación de la muestra deben colocarse
pegados con cinta adhesiva en el exterior del recipiente secundario.
Para el transporte de sustancias infecciosas se debe utilizar el sistema de embalaje básico con
requerimientos específicos de etiquetado y documentación.
En los vuelos internacionales está estrictamente prohibido que los pasajeros transporten sustancias
infecciosas con ellos o en su equipaje de mano. Igualmente está prohibida la utilización del correo
diplomático para el transporte de este tipo de material.
La Guía para el transporte de sustancias infecciosas y especímenes diagnósticos, publicada por la OMS
en 1997, permite un conocimiento detallado de los requerimientos específicos para las diferentes
situaciones que se pueden plantear ante el envío de material biológico, algunos de los cuales se plantean
a continuación:
1. Cantidad de sustancias infecciosas que pueden enviarse en un paquete.

2. Tipos de etiquetas de riesgo para sustancias infecciosas y para microorganismos genéticamente
modificados.
3. Tipos de etiquetas de riesgo para microorganismos no infecciosos.
4. Etiquetas para envío con dióxido de carbono (hielo seco).
5. Información que debe figurar en la etiqueta.
6. Normas para envío con refrigerantes (dióxido de carbono y nitrógeno líquido).

7. Ejemplos de formato de los documentos de envío (los originales pueden obtenerse de la compañía
transportadora).
Transporte nacional y local por superficie. Otras posibilidades de transporte de

material biológico incluyen el traslado de muestras dentro de un hospital o centro, de un centro de
salud a un hospital, de un laboratorio a otro, de un hospital a otro dentro de la misma ciudad o a
otra ciudad. Estos servicios de entrega deben ser gestionados por el propio hospital, por el servicio
de salud o por cualquier organización de transportes o agencia que haya sido autorizada.
Los principios en los que se basa un transporte seguro son los mismos que se aplican para el transporte
internacional y la finalidad es que la muestra no tenga ninguna posibilidad de salir del embalaje en las
circunstancias normales de transporte.
Para el embalaje y transporte de material biológico en estas situaciones (transporte local por superficie)
se recomienda un embalaje tipo, como el envase homologado de la figura 1 y se deben tener en cuenta
las siguientes indicaciones:
1. Los recipientes de las muestras deben ser herméticos y a prueba de fugas de líquidos.
2. Si el recipiente es un tubo, debe estar cerrado herméticamente, con tapa de rosca y colocado en una
gradilla, de tal forma que mantenga su posición vertical.
3. Los recipientes con muestras y gradillas deben colocarse en una caja resistente de metal o plástico y
a prueba de fugas de líquido, que contenga una cubierta segura y que cierre perfectamente.
4. La caja donde se transportan los materiales deberá ser asegurada firmemente en el vehículo de
transporte.
5. Cada caja de transporte deberá estar etiquetada de forma adecuada y de acuerdo a su contenido.
6. Los formularios con los datos de identificación de los especímenes deben acompañar a cada caja de
transporte.
7. El vehículo de transporte deberá ir provisto de material absorbente, desinfectantes, un contenedor
para desechos a prueba de fugas líquidas y guantes resistentes de uso múltiple.
El transporte de material biológico requiere una buena colaboración entre el remitente, la compañía de
transporte y el destinatario, y cada uno debe asumir sus responsabilidades para garantizar que el
producto llega a su destino oportunamente y en buenas condiciones.
Figura 1.- Sistema básico de embalaje
MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS.

Los medios de cultivo y reactivos recomendados para el procesamiento de muestras se detallan en la
tabla 6. Las condiciones de almacenamiento (temperatura, humedad, etc.) de los reactivos y medios de
cultivo utilizados deben ser establecidas, controladas y revisadas (ver más detalles en el apartado 6).
Se deben realizar, con periodicidad (semanal, mensual, trimestral, etc.) establecida por el propio laboratorio,
una revisión de los materiales almacenados (cantidad, caducidades, estado general) con el fin de comprobar
el estado de los mismos, verificando su correcta ubicación en los espacios identificados y definidos para
ellos en el almacén y su aptitud para el uso.
APARATOS Y MATERIAL
Los equipos habituales necesarios en el procesamiento de una muestra para estudio microbiológico son:
• Estufas
• Congeladores
• Neveras
• Centrífugas
De manera periódica (preferiblemente a diario) debe controlarse la temperatura (y humedad/presión de CO2

si fuera necesario) de cada estufa/nevera/congelador al inicio de la jornada de trabajo con un termómetro
situado permanentemente en el centro de cada equipo. El termómetro debe permitir la medida de la
temperatura máxima y mínima alcanzadas. Se anotará en la hoja de registro de temperatura de cada y en el
caso de temperaturas mínima o máxima fuera del rango de aceptación, anotar la incidencia y realizar las
acciones frente a esa variación. Estas acciones, por un lado, deben asegurar los resultados derivados de los
cultivos y por otro corregir esa desviación.
De una manera genérica se sugieren los siguientes intervalos de aceptación:

• estufas de 35-37°C se acepta una mínima superior o igual a 34°C y máxima inferior o igual a 37,5°C
• estufas de 42°C se aceptan variaciones entre 40-43°C
• estufas de 30°C se aceptan variaciones entre 28-32ºC Para las neveras el intervalo de tolerancia que se
acepta es generalmente de 2º-8°C, aunque puede variar en función de los reactivos que contengan.
Todos los termómetros utilizados en la medida de temperaturas de los aparatos se han de verificar
mediante un termómetro de referencia calibrado. Se introducirá el termómetro utilizado para la medición de
la temperatura y el termómetro calibrado en el equipo correspondiente (nevera, congelador o estufa) durante
un mínimo de 15 minutos. Se aceptarán aquellos termómetros cuyos desvíos no sobrepasen los límites
establecidos para cada uso concreto. La periodicidad de la verificación de los termómetros con el
termómetro calibrado debe ser establecida por el propio laboratorio.
Existen sistemas automáticos para el control de la temperatura, humedad, presión de CO2, etc., que
controlan de una manera permanente (en intervalos de 15-20 minutos) los anteriores parámetros con gran
fiabilidad y que utilizan sondas de referencia verificadas por organismos certificados. Estos sistemas alertan
de los desvíos que se producen de una manera más rápida que el control manual, controlan todos los
equipos del laboratorio y generan los informes de estos parámetros.
PROCESAMIENTO
RECEPCIÓN DE LA MUESTRA
Cada laboratorio de microbiología debe disponer de unas normas de recepción y aceptación de
muestras para diagnóstico microbiológico. En el acto de la aceptación de muestras por el laboratorio se
deben comprobar los siguientes aspectos:
- La trazabilidad, es decir, la correspondencia de la muestra con el volante de petición (con el paciente).
En la petición se debe incluir:
- Nombre completo del paciente, número de historia o de la seguridad social o DNI
- Servicio solicitante, nombre del médico solicitante
- Tipo de muestra (descripción completa y método de obtención)
- Hora y/o fecha de recogida
- Enfermedad de base y motivo de la petición
- El correcto transporte de la muestra para la petición solicitada
- La petición correcta de determinaciones microbiológicas
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
El laboratorio someterá a la muestra a un procesamiento en función de sus protocolos de trabajo y de la
información que aporta el servicio solicitante sobre la muestra y el paciente. Así el procesamiento
dependerá de varios factores:
• Petición del servicio solicitante
• Tipo de muestra/técnica de obtención
• Diagnóstico del paciente/enfermedad de base
• Motivo de petición
• Cualquier otra información aportada en el volante de la petición
De una manera general podemos considerar estos tipos de procesamiento de las muestras para
microbiología de la siguiente forma:
6.2.1.- Pretratamiento de la muestra

6.1.1.1 Centrifugación
6.1.1.1.1 Centrifugar todos los líquidos en volumen superior a 1ml a 2.500 rpm durante 15 minutos
6.1.1.1.2 Centrifugar sangre a 3.500 rpm durante 3-5 minutos para detección de antígenos y/o
anticuerpos
6.1.1.1.3 Otras técnicas de concentración específicas: precipitación en etanol, ultracentrifugación
selectiva, etc.
6.1.1.2 Homogeneización
6.1.1.2.1 Mediante hoja de bisturí
6.1.1.2.1.1 Traspasar la muestra a una placa de Petri estéril. Con ayuda de una hoja de bisturí
desmenuzar el tejido hasta obtener una consistencia homogénea.
6.1.1.2.1.2 Traspasar la muestra homogenizada a un contenedor estéril con ayuda de una pipeta
Pasteur.
6.2.1.3. Mediante mortero
6.2.1.3.1. Traspasar la muestra al interior de un mortero estéril y añadir 1-2 ml de caldo de cultivo
6.2.1.3.2. Con ayuda de la mano del mortero triturar la muestra mediante movimientos rotatorios
6.2.1.3.3. Traspasar la muestra utilizando una pipeta Pasteur estéril a un contendor estéril
6.2.1.4. Mediante Stomacher
6.2.1.4.1. Colocar la muestra en el interior de una bolsa de Stomacher y añadir 1-2 ml de caldo de
cultivo
6.2.1.4.2. Colocar la bolsa en el interior del Stomacher, dejando unos centímetros de la bolsa
sobresalir sobre la tapa del Stomacher.
6.2.1.4.3. Cerrar la tapa y conectar el Stomacher durante 1 a 5 minutos.
6.2.1.4.4. Desconectar el Stomacher, extraer la bolsa y traspasar su contenido a un contenedor
estéril.
Las muestras que se procesen para hongos no se homogenizan sino que se deben cortar en pequeños
trozos con la ayuda del bisturí y se inoculan directamente sobre los medios de hongos con objeto de
evitar que determinados hongos no septados sean inviables.
Tabla 6.- Recomendaciones de medios de cultivo y tinción de Gram para muestras microbiológicas
seleccionadas
Muestras/Microorganismo Gram AS ACH MCK Tio/BHI Otros
Biopsias X X X X X Medios anaerobios1
Biopsias (intestinal, colon, C.difficile
rectal)
Enteropatógenos
Biopsias gástricas X Helicobacter pylori
Catéter vascular X
Conexiones/Piel pericatéter X
Genitales
Rectal X S. agalactiae
Uretral X X Thayer Martin
Cervical X X Thayer Martin
Secreción X X X X
prostática Vaginal S. agalactiae
X
Heces Caldo Selenito, SS o similar
Campylobacter selectivo
Sangre ampicilina
Heridas profundas, mordeduras, X X X X X Medios
anaerobios1
quemaduras, úlceras, abscesos
Heridas superficiales X X X X X
Jugo gástrico X X X X Medios
anaerobios1 Líquidos estériles
L. ascítico, peritoneal, X X X X X Medios anaerobios1
pericárdico, sinovial
L. pleural X X X X X BCYE
Medios anaerobios1
Líquido cefalorraquídeo X X X X
Ocular
Exudado conjuntival X X
L. intraocular X X X X X Medios anaerobios1
Oído externo X X X
Timpanocentesis X X X X X
Orina (micción, sondaje) X X Agar Cled
Orina suprapúbica X X X X Medios anaerobios1
Tracto respiratorio inferior
Broncoaspirado X X X X BCYE
Cepillado bronquial con X X X X BCYE
telescopado Medios anaerobios1
Lavado broncoalveolar X X X X BCYE
Esputo X X X X
Tracto respiratorio superior
Aspirado sinusal X X X X X Medios anaerobios1
Faríngeo X Alternativa CNA
Nasal X Agar Manitol sal
Clostridium difficile CCFA
E.coli O157H7 Sorbitol-MCK
Bordetella pertussis Bordet Gengou
IFD si no cultivo
Helicobacter pylori X Agar Helicobacter
Thayer Martin
Agar Brucella
Legionella BYCE
Neisseria gonorrhoeae X Thayer Martin
Streptococcus agalactiae X Todd-Hewitt
Agar Granada
Vibrio TCBS
Yersinia CIN
1: medios anaerobios: agar sangre para anaerobios (Brucella agar), agar
feniletanol para anaerobios. agar sangre lacada-vancomicina-kanamicina
(ASKVL), agar Bacteroides bilis esculina (BBE)
Abreviaturas: AS: Agar sangre; ACH: Agar chocolate; MCK: Agar MacConkey; Tio/BHI:
Caldo tioglicolato ó infusión cerebro-corazón de buey; BCYE: agar enriquecido para
cultivo de Legionella; CNA: agar sangre colistina-ácido nalidíxico; CCFA: agar
cicloserina-cefoxitina-fructosa-yema de huevo; TCBS: agar tiosulfato-citrato-sales
biliares-sacarosa; CIN: agar cefsulodina-irgasán-novobiocina
6.2.2.- Preparación de extensiones
6.2.2.1 Mediante impronta: Piezas de tejido
6.2.2.1.1 Colocar el tejido en una placa de Petri y cortar una porción con la ayuda de una hoja de
bisturí
6.2.2.1.2 Con unas pinzas, tomar la pieza cortada y realizar impresiones por la superficie del corte
sobre un portaobjetos
6.2.2.2 Extensiones finas: material muy purulento
6.2.2.2.1 Tomar una porción de la muestra y colocarla sobre un portaobjetos
6.2.2.2.2 Colocar otro portaobjetos sobre la muestra y presionar los dos portaobjetos
6.2.2.2.3 Desplazar el portaobjetos superior sobre el que contiene la muestra hasta separarlos}
6.2.2.2.4 Repetir este último paso hasta conseguir una extensión fina
6.2.2.3 Líquidos
6.2.2.3.1 Depositar una gota de líquido sobre un portaobjetos y dejar secar
6.2.2.3.2 Citocentrifugar unas gotas de líquido 5-10 min. a velocidad media
6.2.2.4 Muestras en torunda}

6.2.2.4.1 Colocar la torunda sobre un portaobjetos}
6.2.2.4.2 Añadir sobre la torunda una pequeña cantidad de caldo de cultivo
6.2.2.4.3 Realizar movimientos rotatorios, exprimiendo la torunda sobre el portaobjetos
6.2.3.-Inoculación de la muestra en los medios de cultivo: selección de los medios: (ver tabla
6)
6.2.3.1. Piezas no triturables
6.2.3.1. Si la pieza es pequeña, introducirla en un caldo de cultivo e incubar 24 horas tras lo cual se
harán subcultivos a los medios necesarios.
6.2.3.2. Si la muestra es grande, añadir al contenedor en el que se recibe 10-20 ml de caldo de
enriquecimiento e incubar inmediatamente.
6.2.3.3. Tras 24 horas realizar subcultivos a los medios necesarios.
6.2.3.2. Muestras recibidas en jeringas o tubos estériles

6.2.3.2.1. Inocular 2 ó 3 gotas de la muestra en uno de los cuadrantes de la placa de Petri
6.2.3.2.2. Realizar estriamientos de la muestra mediante un asa estéril por todos los cuadrantes de la
placa
6.2.3.2.3. Inocular unas gotas de la muestra en un caldo de cultivo
6.2.3.3. Muestras recibidas en torundas

6.2.3.3.1. Hacer rotar la torunda varias veces en uno de los cuadrantes de la placa
6.2.3.3.2. Con un asa estéril realizar estrías desde la zona de la descarga por el resto de los
cuadrantes de las placas.
6.2.3.3.3. Introducir la torunda en un caldo de cultivo y exprimirla bien mediante movimientos
rotatorios sobre las pares del tubo. Cortar la parte superior y mantener en incubación una
porción de la misma en el interior del tubo con caldo de cultivo.
6.2.3.4. Técnica de Maki para cultivo de catéteres intravasculares

6.2.3.4.1. Con la ayuda de una asa o de unas pinzas estériles extraer el catéter de su envase.
6.2.3.4.2. Si mide más de 2-4 cm, cortarlo con un bisturí hasta esa longitud.
6.2.3.4.3. Depositarlo en una placa de agar sangre y rodar desde un extremo al otro de la placa 3-4
veces
6.2.3.5. Cultivossemicuantitativos (conexión catéteres/piel pericatéter)
6.2.3.5.1. Extender la muestra con la torunda seca por toda la placa de agar sangre como si de un
cultivo cuantitativo de orina se tratara
6.2.3.6. Cultivos cuantitativos (orina, broncoaspirados, secreciones traqueales, lavados

broncoalveolares)
6.2.3.6.1. En el caso de muestras respiratorias fluídas, agitar en vórtex durante unos segundos. Si
no se consigue una buena homogeneización, añadir suero salino y agitar en vórtex de
nuevo. Indicar en los medios de cultivo la dilución aproximada realizada con el suero
salino. En el caso de la orina pasar directamente al siguiente paso.
6.2.3.6.2. Esterilizar un asa calibrada de volumen adecuado (por ejemplo de 0,0025 mL) con el
incinerador o mediante llama.
6.2.3.6.3. Enfriar el asa e inocular la muestra con la ayuda del asa en los medios adecuados,
realizando un cultivo cuantitativo por toda la superficie de la placa.
6.2.4. Incubación
6.2.4.3. Temperatura
6.2.4.3.1. La mayoría de los cultivos bacterianos se incuban a 35-37ºC
6.2.4.3.2. El aislamiento de Campylobacter spp. de heces requiere una temperatura de incubación
de 42ºC
6.2.4.3.3. La mayoría de los cultivos para hongos se incuban a 30°C
6.2.4.4. Atmósferas de incubación

6.2.4.4.1. Aerobiosis
6.2.4.4.2. Atmósfera enriquecida con 5-7% de CO2
6.2.4.4.3. Atmósfera microaerofílica para el aislamiento de Campylobacter: 5% de O2, 10% CO2 y
85% de N2.
6.2.4.4.4. Atmósfera de anaerobiosis
Cada laboratorio debe realizar una vigilancia de la calidad de los medios de cultivo que utiliza, tanto de
los preparados en el propio laboratorio (apariencia, crecimiento/inhibición, esterilidad) como de los que
se adquieran comercialmente.
El laboratorio debe solicitar al proveedor de medios de cultivo los certificados de los controles de calidad
donde deben estar incluídas las características físicas y químicas que definen al medio de cultivo. Esos
certificados deben conservarse en el laboratorio. Asimismo, se deberán realizar controles de calidad a
los medios adquiridos comercialmente. El propio laboratorio debe elegir tanto la periodicidad como la
selección de los medios a los que realizar el control de calidad en función del tipo de medios que utilice,
la variedad y los datos históricos de la conformidad de los controles realizados por el laboratorio con las
características que el proveedor facilite: un medio estable y que no haya ocasionado problemas de
crecimiento según registros previos se debe controlar menos que uno que sea menos estable y haya
ocasionado problemas en su uso. El laboratorio debe generar registros de este control de medios
adquiridos de proveedores y conservar estos registros para poder evaluar los medios y reconsiderar
permanentemente el control de calidad de los mismos
OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Las incidencias surgidas en la recogida de la muestra para estudio microbiológico se deben informar lo
antes posible al servicio solicitante con el objeto de que la resolución sea inmediata. Cuando la información
sea telefónica, los interlocutores deben quedar identificados, y esta información debe seguirse siempre de
un informe escrito a la mayor brevedad posible.
RESPONSABILIDADES
El proceso de recogida de la muestra es responsabilidad del servicio solicitante o del laboratorio de
microbiología si se realiza en él la toma de la muestra.
La información sobre las normas de recogida, transporte y conservación y su distribución a los servicios
solicitantes es responsabilidad del laboratorio de microbiología.
El procesamiento de la muestra es responsabilidad del laboratorio de microbiología.
ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO
Todo el personal del laboratorio de microbiología deberá conocer las normas generales de seguridad. El
laboratorio de microbiología debe establecer las normas de seguridad en un Manual de Seguridad y
distribuirlo a todo el personal que trabaje en el laboratorio.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Todas las limitaciones del proceso de recogida, transporte, conservación y procesamiento de muestras
han sido expuestas a lo largo del documento. Estas limitaciones deben quedar registradas con el objeto
de que puedan ser medidas periódicamente y de poder disponer de datos de su evolución
correspondientes. Cada laboratorio de microbiología debe establecer indicadores de los procesos de
recogida, transporte, conservación y procesamiento de muestras con el objeto de llevar a cabo las
correspondientes acciones cuando estos indicadores estén fuera del rango de los límites establecidos.
BIBLIOGRAFÍA
• Enmiendas propuestas por Portugal y España a los anexos A y B del Acuerdo Europeo sobre
Transporte Internacional de Mercancías Peligrosas por carretera (ADR), hecho en Ginebra el 30 de
septiembre de 1957. Suplemento del BOE nº 70 de 22 de marzo de 2002. Fascículo primero, pp.
178-184.
• Fleming, D.O. D.L. Hunt. 2000. Biological safety: principles and practices. 3 rd ed. American Society
for Microbiology. Washington, D.C.
• Isenberg, H. 1992. Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for Microbiology.
Washington, D.C.
• ISO 9001:2000. Sistema de gestión de la calidad. Requisitos.
• ISO 9001:2000. Sistema de gestión de la calidad. Fundamentos y vocabulario.
• ISO 9004:2000. Sistema de gestión de la calidad. Directrices para la mejora del desempeño.
• Mandell, G., J. Bennett, and R. Dolin. 2000. Principles and practice of infectious diseases, 5 th ed.
Churchill Livingston, New York.
• Miller, J.L. 1996. A guide to specimen management in clinical microbiology. American Society for
Microbiology. Washington, D.C.
• Murray, P.R. 1998. Pocket guide to clinical microbiology. 2 nd ed. American Society for Microbiology.
Washington, D.C.
• Murray, P.R., E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken. 1999. Manual of Clinical
Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology. Washington, D.C.
• Orden de 4 de diciembre de 2001 por la que se actualizan las instrucciones técnicas para el
transporte sin riesgos de mercancías peligrosas por vía aérea. Suplemento del BOE nº 299. de 14
de diciembre de 2001. Fascículo primero. pp.

Manual de Procedimientos Técnicos Del Área de Bacteriología Final

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Manual de Procedimientos Técnicos Del Área de Bacteriología Final

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5. Lave con agua del grifo