TIPOS DE TÉCNICAS

TÉCNICAS ORIENTATIVAS: Identificación preliminar de sangre

 Técnica de Bencidina o de Adler
El reactivo se obtiene a partir de la bencidina
Preparación: disolver la saturación de la bencidina en ácido acético glacial
Fundamento: hemoglobina descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, que al
reaccionar con la bencidina la oxidará formando un compuesto intensamente azul
Sensibilidad: 1, 300,000 a 500,000.
Resultado: positivo (sangre) requiere, como toda técnica de orientación, del empleo de
reacciones de confirmación ya que se pueden obtener falsas reacciones positivas con otras
sustancias que tengan actividad semejante a las peroxidasas o bien con otros materiales
oxidantes como las manzanas, espárragos, frijol, zarzamora, entre otros.
 Fenolftaleína o de Kastle-Mayer
Se basa en los indicadores químicos de la hemoglobina, sustancia de la sangre que
reacciona a la fenolftaleína, es básicamente una prueba colorimétrica. La fenolftaleína en
soluciones ácidas permanece incolora, pero en presencia de bases se torna rosa o violeta, se
utiliza el reactivo conocido con el nombre de Kastle-Meyer.
La prueba únicamente sirve para confirmar que la muestra obtenida es sangre, aunque no
podemos conocer su origen pues algunos vegetales (brócoli) y minerales (cobre), también
causan que la fenolftaleína reaccione.
Sensibilidad de 1: 1, 000,000 a 10, 000,000.
 Leuco malaquita verde
También se le llama reacción de MEDINGER. El reactivo se puede preparar de dos formas:
La primera consiste en mezclar 0,32 g de perborato de sodio con 0,1 g de leuco malaquita
verde.
Para que la reacción sea considerada como positiva se debe observar en menos de 10
segundos un color azul-verdoso. La sensibilidad del método es de 1/100000
Se basa, al igual que las anteriores en una reacción de oxidación y reducción. La estructura
química de esta sustancia recuerda a la de la fenolftaleína. El prefijo leuco se refiere a la
forma reducida incolora; la forma leuco puede ser preparada por reducción de la malaquita
verde.
 Reacciones quimioluminiscentes
La quimioluminiscencia es la obtención de luz a partir de una reacción química
(exotérmica, es decir, que desprende energía), y se produce cuando los electrones de las
capas más externas del átomo saltan a las más internas.
El luminol es un compuesto quimioluminiscente y consiste en provocar la producción de
luz por parte de las peroxidasas presentes en la muestra.
Esta prueba es muy útil cuando las manchas son difíciles de ver, cuando se encuentran en
superficies oscuras, en grietas o hendiduras o zonas que han sido lavadas. El luminol no
destruye la mancha y no interfiere en el caso de que se realicen después otras pruebas de
confirmación o serológicas. La sensibilidad es de 1/5000000 y es más efectivo con sangre
antigua que con sangre fresca. Se puede aumentar la efectividad rociando previamente la
mancha con ácido hidroclórico al 2% para descomponer la hemoglobina.
TÉCNICAS DE CONFIRMACIÓN
Las pruebas de Teichmann y Takayama detectan la hemoglobina, ambas dependen de una
reacción entre un reactivo y la hemoglobina, esto produce cristales de reacción, que puede
ser visto bajo un microscopio, una ventaja considerable de estas pruebas es que son más
eficaces con manchas viejas.
 Cristales de hemina o de Teichmann
El método es aplicable cuando la mancha de sangre se encuentra sobre metales oxidados o
cuando se ha sometido a altas temperaturas. Se admite desde entonces que, si se observa la
formación de los cristales, la mancha es, con toda seguridad, de sangre. Los cristales de
hemina que se forman son romboidales y de color café obscuro
 Cristales de Takayama o hemocromógeno
Solución para reconocer las manchas de sangre, compuesta de piridina, hidrato de sodio y
dextrosa, que en contacto con las manchas forma cristales de piridino-hemocromógeno
Los cristales pueden formarse tanto en medio ácido como alcalino; sin embargo, el reactivo
de Takayama es de naturaleza alcalina.
En caso positivo se observarán cristales romboidales con forma de helechos, pinceles o
espinas de color rosado
TÉCNICAS DE ORIGEN
 Inmunocromatografía
La inmunocromatografía se basa en la migración de una muestra a través de una membrana
de nitrocelulosa. La muestra es añadida en la zona del conjugado, el cual está formado por
un anticuerpo específico contra uno de los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de
detección. Si la muestra contiene el antígeno problema, éste se unirá al conjugado
formando un complejo inmune y migrará a través de la membrana de nitrocelulosa. Si no,
migrarán el conjugado y la muestra sin unirse.
La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro epítopo
del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unión del
antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará en este caso como rosa o
azul (muestras positivas). En el caso contrario las muestras son negativas.
La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de
detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al
conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un control
de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y
negativas.
 Reacción de las precipitinas
La técnica de elección para determinar si una mancha de sangre es de origen humano, es la
Reacción de las precipitinas descubierta en 1900 por Uhlenhuth.
Las moléculas del anticuerpo (inmunoglobulina) reaccionan con el antígeno (proteína
soluble) para formar un precipitado fácilmente visible bajo condiciones de luz apropiadas y
a las concentraciones equivalentes de antígeno y anticuerpo.
Esta reacción antígeno-anticuerpo está influida por varias fuerzas, interactuando entre los
factores reaccionantes como son: las fuerzas de Van der Walls, puentes de hidrógeno,
interacciones de dipolos, atracción entre los antígenos no polares y la superficie del
anticuerpo, y la atracción electrostática.
La reacción misma tiene lugar en varias etapas. Inicialmente se forma un complejo antígeno
anticuerpo soluble; conforme la reacción prosigue, ese complejo empieza a unirse y forma
una tupida red compuesta de moléculas de anticuerpo bivalente y moléculas de antígeno
polivalente. Esta formación crece rápidamente formando partículas del tamaño suficiente
como para ser insolubles y formar un precipitado visible.
Debe tenerse en mente que para que la reacción se lleve a cabo se requiere que la
concentración del antígeno y del anticuerpo sean equivalentes; un exceso de alguno de los
dos producirá un resultado negativo.
Inmunoelectroforesis
Es un examen de laboratorio que mide las proteínas llamadas inmunoglobulinas en la
sangre. Las inmunoglobulinas son proteínas que funcionan como anticuerpos, que
combaten la infección. Existen muchos tipos de inmunoglobulinas que combaten diferentes
tipos de infecciones.
Esta técnica inmunoquímica se basa en las reacciones que se efectúan entre un antígeno que
emigra anódicamente y un anticuerpo que emigra hacia el cátodo 20 durante una
electroforesis. Sobre una placa de agarosa, se hacen horadaciones en pares; el antígeno
(seroalbúminas y alfa y beta globulinas) se coloca en una de ellas y el anticuerpo (gamma
globulinas) en la otra; una vez terminada la electroforesis aparecen bandas visibles de
precipitación entre las perforaciones pares de los materiales proteínicos específicos.
La inmunoelectroforesis es una técnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la
mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antígeno que se desea detectar se hace
reaccionar con un anticuerpo específico colocado en un pocillo lateral. Por difusión llegan a
encontrarse los antígenos y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma
de líneas de precipitación que pueden ser estudiadas por comparación con un sistema
estándar.
La técnica electroforética, tiene la ventaja de acelerar la difusión sobre el gel y por lo tanto
disminuye el tiempo de reacción además de ser más sensible que las otras técnicas, pero
requiere de un equipo más costoso.
DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO EN SANGRE SECA
Al determinar el grupo sanguíneo en sangre seca es necesario tener en cuenta que las
células que alguna vez estuvieron presentes en la sangre, ya no lo están, es por eso que es
necesario contar con una técnica capaz de reaccionar con el sistema ABO de la sangre seca
Los ensayos antígenos-anticuerpo son la base para la formación de métodos empleados en
la detección de antígenos en el estroma de glóbulos rojos de la mancha seca de sangre. Una
técnica fácil que consiste en poner en evidencia la presencia de antígenos mediante
aglutinación con antisueros específicos en manchas de sangre seca en estas muestras las
células se encuentran rotas, sin embargo, los antígenos del sistema ABO no se
desnaturalizan tan rápidamente por lo que sobreviven y conservan la capacidad de
combinación de anticuerpos específicos, la formación de estos an-ac es la base de todos los
métodos empleados en la detección.
La técnica que se utiliza hoy en día para la determinación del grupo sanguíneo en sangre
seca es la de absorción-elusión que ha demostrado ser carácter científico y confiable en
comparación con otras técnicas.
 Absorción-elusión
Esta técnica como su nombre lo indica cuenta con dos procesos, la mancha problema y el
anticuerpo homologo, después de efectuar esto, el excedente de anticuerpo se elimina por
medio de un lavado con solución salina fría. En donde la absorción es completa y el
excedente anticuerpo se elimina por medio de solución salina. Luego el complejo antígeno
se disocia a 56°c y el anticuerpo eluido se conecta con los eritrocitos antígenos. A lo que da
como resultado la aglutinación que es la presencia de un testigo antígeno de la misma
especificidad.
Esta técnica puede ser muy útil para la identificación del grupo ABO y Rh aun que se
requiere de mayores muestras igual empleada junto con la técnica absorción- inhibición
para la determinación del grupo en sangre, saliva y orina ,se puede usar en el sistema MN ,
finalmente la aglutinación indica la presencia de antígeno de la misma especificación , para
ser más concreto lo primero de estos es la absorción en el que la mancha de sangre seca se
pone en contacto con su antígeno correspondiente, una vez absorbido se eliminan los
excesos con solución salina y se procede a calentarse, se agregan glóbulos rojos y se
centrífuga, si se aglutina se dice que el antígeno utilizado es el mismo que está presente en
la mancha de sangre seca.
Técnica de biología molecular.
Los seres humanos están individualizados genéticamente a lo que hoy día se le conoce
como ADN. Esto pasa a través de los padres. Hoy se le puede llamar cómo una huella
digital del ADN. Todas las células que conforma el ser humano son gracias a la
fertilización, ya que esta produce una célula llamado cigoto gracias a la unión del ovulo y
espermatozoide, que en este está constituido en su núcleo 23 pares de cromosomas
homólogos, 22 cromosomas autónomas y un par de cromosomas sexuales. Obteniendo el
material genético de 46 cromosomas en el núcleo celular y del ADN.
Un cromosoma está constituido por una molécula de ADN de ácido desoxirribonucleico
con 100, 000 genes en promedio. Y el ADN está formado por cadenas de hélices que
contiene adenina, citosina, guanina y timina; la cual están unidas por un puente de
hidrógeno. El ADN tiene fragmentos de cromosomas que se codifican con proteínas
convirtiéndose así en genes en donde interviene en las funciones y estructuras de las células
de los seres humanos.
Una de las técnicas utilizadas para la identificación de una persona es por medio del
material genético, que es transmitido de los dos padres al hijo a través de sus células
sexuales, y el ADN mitocondrial, el cual solo es transmitido al hijo por la madre. Primero
se extrae el material genético del soporte dónde se encuentre, se procede a cualificar y a
cuantificar a través de electroforesis horizontal, la cual puede ser a través de un gel de
agarosa o por la espectroscopía de luz ultravioleta, se lleva a cabo la reacción en cadena de
la polimerasa, luego es sometido a cierto grado de temperatura para asegurar la unión de las
cadenas de ADN, por último se elabora un gel de agarosa y se determinará el genotipo de
cada muestra
Los marcadores genéticos se emplean de acuerdo a su naturaleza polimórfica
Los genes son fragmentos de ADN de los cromosomas que codifican a las proteínas las
cuales intervienen inteligentemente en las funciones y estructuras, del conjunto de células
de ser humano aproximadamente entre 50 y 100 diferente y se localizan en el locus-de los
cromosomas en formas variables llamadas alelos, que difieren en l secuencia de nucleótidos
del ADN.
Para el gen x puede existir en la población variantes en sus alelos, y cada individuo puede
tener solo dos de estos alelos (x1, x2, x3, x4). Si un individuo posee dos copias idénticas de
un alelo es homocigoto, en ese locus y si los tienen diferente es hereditario, la
identificación, se basa en la caracterización de variables polimórficas del material del
individuo.
Para el medio forense el utilizar los alelos para identificación es una de las técnicas más
certeras que existen siguiendo una metodología específica cuya finalidad es la exclusión de
algún alelo por lo que es importante conocer la distribución de estos.