Mutation Research 629 (2007) 122-132

Los efectos anti-mutágenos y antioxidantes de

pigmentos biliares en la prueba de Ames
Salmonella
*
AC Bulmer una,segundo,mi, , K. Ried re, JS Coombes una,
JT Blanchfield segundo, YO. Tothsegundo,do, K.-H. Wagnerre
una
Escuela de Estudios del Movimiento Humano, Universidad de Queensland, Brisbane 4072,
Australia
segundo
Facultad de Ciencias Molecular y Microbiana de la Universidad de Queensland, Brisbane
4072, Australia
do
Facultad de Farmacia, Universidad de Queensland, Brisbane 4072, Australia
re
Departamento de Ciencias de la Nutrición, Universidad de Viena, Viena 1090, Austria
mi
Biopharma Pty. Ltd., 2/67 Richland Avenue, Coopers Plains, Brisbane 4108, Australia
Recibió 31 julio de 2006; recibida en forma 22 de de enero de de 2007 revisado; aceptado el 25 de
de enero de de 2007
Disponible en línea el 11 de febrero de de 2007

Resumen
El objetivo de este estudio fue explorar la pro- potencial y efectos anti-mutagénicos de pigmentos biliares endógenos
bilirrubina no conjugada (BR), biliverdina (BV) y un sintético, conjugado soluble en agua, ditaurate bilirrubina (BRT) en la
prueba de Ames Salmonella. Los pigmentos biliares se ensayaron en un amplio intervalo de concentración (0,01-2 mol / placa)
en presencia de tres cepas bacterianas (TA98, TA100, TA102). Una variedad de mutágenos incluyendo benzo [a] pireno (B [a]
P), 2,4,7 trinitrofluorenona (TNFone), 2-aminofluoreno (2- AF), azida de sodio (NaN3) e hidroperóxido de butilo terciario (t-
BuOOH), se usaron para promover la formación de revertientes mutantes. Las pruebas se realizaron con (B [a] P, 2-AF, t-
BuOOH) y sin (TNFone, NaN3, t-BuOOH) activación metabólica incor- ing la adición de la preparación microsomal de hígado,
S9. Los pigmentos biliares solo no indujo mutagenicidad en cualquiera de las cepas ensayadas (p> 0,05). Se observaron efectos
Anti-mutagénicos de los pigmentos biliares en la presencia de todos los mutágenos excepción de NaN3 y los efectos anti-
mutágenos parecían independiente
≥ de la cepa ensayada. Para genotoxicidad
≥ TNFone inducida, el orden de la eficacia fue BR
BRT> BV. Sin embargo, el orden era BV BRT BR para 2-AF. ≥pruebas de antioxidante en la cepa TA102 pigmentos biliares
revelados podría inhibir de forma eficaz el efecto genotóxico de t-BuOOH estrés oxidativo inducido. El antioxidante aparente y
el comportamiento anti-mutagénico de pigmentos biliares sugiere aún más su presencia en los sistemas biológicos es de posible
importancia fisiológica. Se observaron efectos Anti-mutagénicos de los pigmentos biliares en la presencia de todos los
mutágenos excepción de NaN3 y los efectos anti-mutágenos parecían independiente de la cepa ensayada. Para genotoxicidad
TNFone inducida, el orden de la eficacia fue BR BRT> BV. Sin embargo, el orden era BV BRT BR para 2-AF. pruebas de
antioxidante en la cepa TA102 pigmentos biliares revelados podría inhibir de forma eficaz el efecto genotóxico de t-BuOOH
estrés oxidativo inducido. El antioxidante aparente y el comportamiento anti-mutagénico de pigmentos biliares sugiere aún más
su presencia en los sistemas biológicos es de posible importancia fisiológica. Se observaron efectos Anti-mutagénicos de los
pigmentos biliares en la presencia de todos los mutágenos excepción de NaN3 y los efectos anti-mutágenos parecían
independiente de la cepa ensayada. Para genotoxicidad TNFone inducida, el orden de la eficacia fue BR BRT> BV. Sin embargo,
el orden era BV BRT BR para 2-AF. pruebas de antioxidante en la cepa TA102 pigmentos biliares revelados podría inhibir de
forma eficaz el efecto genotóxico de t-BuOOH estrés oxidativo inducido. El antioxidante aparente y el comportamiento anti-
mutagénico de pigmentos biliares sugiere aún más su presencia en los sistemas biológicos es de posible importancia fisiológica.
pruebas de antioxidante en la cepa TA102 pigmentos biliares revelados podría inhibir de forma eficaz el efecto genotóxico de t-
BuOOH estrés oxidativo inducido. El antioxidante aparente y el comportamiento anti-mutagénico de pigmentos biliares sugiere
aún más su presencia en los sistemas biológicos es de posible importancia fisiológica. pruebas de antioxidante en la cepa TA102
pigmentos biliares revelados podría inhibir de forma eficaz el efecto genotóxico de t-BuOOH estrés oxidativo inducido. El
antioxidante aparente y el comportamiento anti-mutagénico de pigmentos biliares sugiere aún más su presencia en los sistemas
biológicos es de posible importancia fisiológica.
© 2007 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

palabras clave: Pigmento biliar; La bilirrubina; biliverdina; ditaurate bilirrubina; antioxidante; antimutangen; Prueba de Ames; Salmonela

1. Introducción
perteneciente a la clase 'porfirina' de moléculas [1]
(Higos. 1 y 2). Grandes cantidades de pigmentos
Los pigmentos biliares, la bilirrubina no conjugada
biliares se forman en los seres humanos en una base
(BR) y biliverdina (BV) son ácidos dicarboxílicos,
diaria y la excreción de pigmentos biliares en las heces
tetrapirrólicos
y la orina se estima en 300 mg por día[2]. La
bilirrubina y biliverdina son potentes antioxidantes, y
*
El primer autor en: Escuela de Estudios Humanos movimiento,
como un posible papel ical tales physiolog- para ellos
Blair Drive, Universidad de Queensland, Santa Lucía, Queensland ha postulado [3]. Específicamente, que se han
4072, Australia. Tel .: +617 33656767; Fax: 617 33656877. encontrado para proteger los lípidos [4-9] y teins pro-
Dirección de correo electrónico: abulmer@hms.uq.edu.au (AC [10-12] de la oxidación. Estudios adicionales también
Bulmer).

1383-5718 / $ - see front matter © 2007 Elsevier BV Todos los derechos

reservados. doi:10.1016 / j.mrgentox.2007.01.008
 AC Bulmer et al. / Mutation Research 629 (2007) 122-132 12

Fig. 1. Dos dimensiones, estructuras planas de la bilirrubina no conjugada (A), la bilirrubina ditaurate (B) y biliverdina no conjugado (C).

sugieren que los pigmentos biliares poseen propiedades

anti-complemento [13,14], anti-inflamatoria [15-17],
antivirulento [18,19],
anti-apoptótica [20] y anti-mutagénico [21-30]
apropiado- lazos, alimentando el debate que los
pigmentos biliares no son simplemente
subproductos de catabolismo del hemo, pero moléculas
fisiológicamente importantes.
La prueba de Ames Salmonella [31] ha sido un
modelo de prueba popular para el estudio de los
efectos anti-mutagénicos de la bilis

Fig. 2. tridimensional, minimizadas (mm2) estructuras de energía de la bilirrubina no conjugada (A), biliverdina no conjugado (B), 2,4,7
trinitrofluorenona
(C) y 2-aminofluoreno (D).
12 AC Bulmer et al. / Mutation Research 629 (2007) 122-132
pigmentos. Los resultados de estas investigaciones Todos los mutágenos y otros reactivos fueron de grado
muestran que BR posee la mayor actividad anti- reactivo analítico o mejor y
◦
mutagénica de los pigmentos biliares[23,26,28,29]. se almacena a -80 C si es necesario.
Por ejemplo, en la cepa TA100, la cantidad de BR y
BV requiera inhibir los efectos mutagénicos de benzo
[a] pireno (B [a] P) por 50% (ID50) igualado un
exceso de 75 y 100 veces molar de la respectiva
pigmentos [23]. Arimoto et al. [25] También
encontrado el ID50 de pigmentos biliares hacia B [a] P
en la cepa TA98 igualó un exceso molar de 63 veces
de BV comparación con el siete veces y el exceso de
BR.
Los efectos de los pigmentos biliares en la
mutagenicidad de 2-nitrofluoreno, 1-nitropyrene y 3-
nitrofluoranthene También se han estudiado [28] en la
cepa TA98 con BR inhibir de manera más eficiente la
respuesta genotóxica de todos los mutágenos, en
comparación con BV. propiedades anti-mutágenas
adicionales de BR se han observado en experimentos
usando 4-nitroquinolina 1-óxido (4NQO) y el humo
del cigarrillo condensado mutagénesis inducida[31] y
los resultados de De la flora et al. [26] sugieren que
mayor efecto anti-mutagénico de BR hacia 4NQO es
debido a su único tridimensional, ción conformacional
de hidrógeno unido [32] (ver Figura 2). Cuando se
resumen, estos resultados sugieren que los pigmentos
biliares, BR y BV, son capaces de perturbar los efectos
genotóxicos de un número de mutágenos en la prueba
de Ames Salmonella y por lo tanto son candidatos para
pruebas adicionales anti-mutagénico.
El objetivo del estudio para probar si los pigmentos
biliares podrían inhibir selectivamente los efectos
genotóxicos de los gens mutatis con conformaciones
tridimensionales específicas. combinaciones
Anteriormente no probados de pigmentos biliares y los
mutágenos 2,4,7 trinitrofluorenona (TNFone) y 2-
aminofluoreno (2-AF), que poseen planar y
estereoquímicas no planas (Figura 2), se utilizaron
para probar esta hipótesis. Además, el estudio probó si
los pigmentos biliares indujeron efectos anti-
mutágenos cuando incu- acanalados con el oxidante
hidroperóxido de butilo terciario (t-BuOOH), lo que
sugiere un mecanismo de multi-modal de acción. El
objetivo final fue establecer si la bilirrubina ditaurate
(BRT), un sintético previamente no probado, soluble
en agua, el conjugado bilirrubina, también poseía anti-
actividad mutagénica.

2. métodos

2.1. productos químicos

La bilirrubina no conjugada (BR) [635-65-4], bilirrubina

ditaurate disódico (BRT) [89771-93-7] y clorhidrato de
biliverdina (BV) [55482-27-4] se adquirieron de Frontier
Scientific (Logan, UT, EE.UU. ). El homogeneizado de
hígado S9 se obtuvo de MP Biomedicals (Illkirch, Francia).
 AC Bulmer et al. / Mutation Research 629 (2007) 122-132
2.2. Cepas bacterianas
TA98, TA100 y cepas typhimurium TA102 de
Salmonella se obtuvieron del Dr. Bruce N. Ames
(Universidad de Califor- nia, Berkley, EE.UU.). bacterias
◦
madre se almacenaron a 80 do hasta su uso.
2.3. mezcla S9
En los estudios que incorporan activación metabólica,
una mezcla S9 fresco siempre se hizo. La mezcla S9
consistía en 19,75 mlreH2O, 25 ml de tampón PBS, 0,5 ml
de MgCl2 (0,85 M), 0,5 ml
KCl (1,65 M) y 2 ml NADP (90,8 mM), 250! L de glucosa-6-
fosfato (1,08 M) y 2 ml de S9. La solución se sometió a
vórtice, se mantuvo en hielo y se utiliza en menos de 1 h.
2.4. ensayo de mutagenicidad
La dosis pigmento biliar máxima que podría ser
utilizado en el ensayo se calculó mediante la prueba (1) la
cantidad máxima de DMSO que podía añadirse sin causar
toxicidad y (2) la solubilidad máxima de pigmentos biliares
en una solución de modelo de pre-incubación (300 : 600
DMSO: PBS).
2.5. toxicidad DMSO
La prueba de Ames se realizó en ausencia de mutágenos
y los compuestos de prueba mientras que el volumen de
12
DMSO se incrementó de 0 a 500! L. Cada cepa se puso a
prueba, tanto en la pre- sencia y ausencia de la mezcla S9
(100? L / placa) de acuerdo con el procedimiento de ensayo
(véase la Sección2.7).Se observó el césped de fondo a través
de un microscopio (40) y anotó en una escala - de cuatro
puntos (4 = sin cambio desde el control; 0 = ausencia de
césped de fondo) por un investigador ciego. cambios visibles
en la puntuación de fondo de césped se produjeron en 350 l
(39%, v / v) o mayor en todas las condiciones. Por lo tanto,
se utilizaron 300 l de DMSO en todos los ensayos, lo que
equivale al 33% del volumen total de pre-incubación.
2.6. solubilidad pigmento biliar
Una solución acuosa modelo, similar a la utilizada en el
ensayo, se utilizó para aproximar la dosis máxima de
pigmento biliar que podrían ser disuelto. Todos los
pigmentos biliares se solubilizaron en DMSO, que se diluyó
de modo que 0,01-2 mol de pigmento biliar estaba contenida
en 300! L. Seis cien microlitros de PBS y luego se añadieron
a la solución, que se agitó con vórtex. Diez microlitros de
esta solución fue tomada y se diluyeron (1: 100)
× con DMSO.
a continuación, se centrifugó la solución original (33.000 g;
15 min) y 10! l del sobrenadante fue diluida (1: 100) con
DMSO. La absorbancia de las soluciones no centrifugados
diluida se Comparado con las soluciones de sobrenadante
diluido (br, BRT 450 nm; BV 375 nm; datos no mostrados).
Los experimentos de solubilidad se repitieron para confirmar
los resultados. La dosis máxima de BR, BRT
y BV que podría añadirse sin agregación aproximada 0,75,>
2 y ~1.85 mol, respectivamente.
×
2.7. Diseño experimental
Basado en los resultados del estudio piloto, se utilizaron
seis dosis de BRT y BV en la prueba de Ames (0,01, 0,05,
0,1, 0,5, 1
y 2 mol / placa) y cinco dosis de BR (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 y
0,75? mol / placa). El ensayo se realizó de acuerdo con
Maron y Ames[33] con 30 min de preincubación [34] y
siendo una variación del volumen de DMSO usado (véase la
Sección 2.5). El ensayo se realizó en un laboratorio con poca
luz y las soluciones de pigmentos biliares se protegió de la
luz usando contenedores de aluminio cubierto. Doscientos
microlitros de solución de pigmento biliar (DMSO), a
continuación 100 l de solución de mutágeno (DMSO), se
añadieron 500 l de PBS o mezcla S9 seguido de 100! L de
cultivo bacteriano durante la noche a tubos de ensayo. Los
tubos de ensayo se
◦
se incubaron durante 30 min a 37 do en un agitador rotatorio
y 2 ml de
agar fundido se añadió a cada tubo, el cual se agitó con
vórtex y se vertió sobre placas mínimas de glucosa. Las
◦ Software, Inc., Ver. 3.11). El efecto de la bilis pigmento con-
placas se bated incu- durante 48 horas a 37 do y la Su+
revertientes se contaron manualmente. La toxicidad se
evaluó mediante la observación× de la capa de fondo con un
microscopio (40). Tres placas se contaron para cada
concentración de cada condición y se repitió cada ensayo en
otro día. En cada prueba, tres 'control positivo' (mutágeno
solamente), seis 'control negativo' (sin mutágeno o pigmento
biliar) y tres 'ningún tratamiento' placas (sin DMSO
mutágeno, pigmento biliar o) fueron incluidos. Los efectos
moduladores de pigmentos biliares se investigaron en dos
paradigmas de prueba. En primer lugar, una serie de
experimentos que investigan los efectos mutagénicos de la
prueba sólo compuestos se completó (véase la Sección2.9).
En paralelas, experimentos que evaluaron los efectos pro-y
anti-mutagénicos de los compuestos de ensayo, en presencia
de gens mutatis conocidos, se llevaron a cabo (véase la
Sección 2.10).
2.8. Evaluación de la mutagenicidad
La evaluación de 'mutagénico', 'pro-mutagénico' y 'anti-
mutagénicos' compuestos se llevó a cabo de acuerdo con las
directrices publicadas por Mortelmans y Zeiger [35].
2.9. las pruebas mutagénicas
Un compuesto se clasificó como 'mutágeno' Si los
resultados SAT-isfied dos criterios (1) se observó un aumento
dependiente de la dosis en el número de revertientes y (2) el
número de revertientes era igual o mayor que dos veces de lo
negativo controlar [35].
2.10. / Prueba Pro anti-mutagénica
Las respuestas pro- y anti-mutagénicos relativas se calcu-
lada para cada compuesto, en cada condición, con relación a
la
control positivo [35], usando la siguiente ecuación.
más allá de 200%. Además, se requiere dependencia de la
dosis de acuerdo con Mortelmans y Zeiger[35]. Todos los
resultados se expresaron por mol / placa de manera que los
efectos moduladores de diferentes compuestos podrían ser
comparados.
Por lo que las tendencias en los resultados podrían ser
visualizados, algoritmos matical mathe- se ajustaron a los
datos. El algoritmo con el mejor ajuste para cada compuesto
en cada condición fue determinada por la observación de la
R2 co-eficiente y estos algoritmos se superponen en las
figuras resultados (ver Higos. 3-6). los 50% dosis de
inhibición (ID50) de los pigmentos biliares y el porcentaje de
inhibición a 0,5 mol / placa (I0.5) y en la mayor dosis
ensayada (Imax) eran matemáticamente interpolados o
extrapolados usando el programa de ordenador, Derivar (Ver.
6, Texas Instruments Inc .; ver Mesa 1).
2.11. análisis estadístico
Los datos se analizaron utilizando Sigmastat (Systat
centración en la formación de revertientes se ensayó usando
análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) o el análisis
de una vía de Kruskal-Wallis sobre rangos, si los datos no se
distribuyen normalmente. O bien el Holm-Sidak
(paramétrico) o de prueba (no paramétrico) de Dunn se
utilizaron para realizar la evaluación post hoc de las
diferencias entre los revertientes formadas a diferentes
concentraciones
± y los datos de control positivos y negativos.
Todos los datos se presentan como media error estándar. Un
valor de p <0.05 se consideró sig- sig-.
3. resultados
La bilirrubina no conjugada, ditaurate bilirrubina y
biliverdina no conjugado se ensayaron en tres cepas de
S. typhimurium (EJÉRCITO DE RESERVA 98, TA100,
TA102) para establecer si podían modular la
genotoxicidad espontáneo o inducido. El ensayo de los
pigmentos biliares solo reveló que no eran
mutagénicos y no causaron toxicidad en cualquiera de
las cepas de Salmonella (datos no mostrados; p> 0,05).
3.1. TA98
3.1.1. 2,4,7 trinitro fl mutagenicidad inducida por
uorenone
2,4,7 trinitrofluorenona (TNFone) inducida ciudad
genotoxi- se utilizó para probar los posibles efectos
anti-mutagénicos de pigmentos biliares BR, BRT y BV
en ausencia de activación metabólica. En esta
condición, todos los compuestos inhibieron la TNFone
inducida efecto genotóxico en una dosis
norteo- revertientes forman [compuesto de prueba] - no- revertientes formado [control
negativo] × 100 no- revertientes formado [control positivo] - no- revertientes forman
[control negativo]
Un compuesto fue clasificado 'anti-mutagénico' si la de manera dependiente (p <0,001; Fig. 3UNA). BRT y
respuesta mutagénica relativa cayó por debajo de 50%. Un BV redujo significativamente el número de sus
compuesto fue clasificado 'pro-mutagénico' si la respuesta reversiones en +
mutagénica relativa aumentó ≥0.5 mol / placa y BR en ≥0.05 mol / placa (p
<0,05).
Fig. 3. Los efectos moduladores de pigmentos biliares de genotoxicidad TNFone inducida en TA98 (A), TA100 (B) y TA102 (C) de Salmonella
typhimurium. Los datos presentados como media ± SE (n = 6).

Fig. 4. Los efectos moduladores de pigmentos biliares en 2-AF genotoxicidad inducida en TA98 (A), TA100 (B) y TA102 (C) de Salmonella
typhimurium. Los datos presentados como media ± SE (n = 6).

Fig. 5. Los efectos moduladores de pigmentos biliares en B [a] P
genotoxicidad inducida en TA98 de Salmonella typhimurium. Los
datos presentados como media ± SE (n = 6).
3.1.2. 2-amino fl uorene mutagenicidad inducida
genotoxicidad inducida por 2-aminofluoreno se
utilizó para probar los posibles efectos anti-
mutagénicos de los pigmentos biliares en presencia de
activación metabólica. Todos los pigmentos biliares
afectado mutagenicidad inducida por 2-AF (p
<0,001;Fig. 4UNA). BRT inhibió significativamente el
crecimiento tant reversión a 2 mol / placa, sin
embargo, el crecimiento aumentada en 0,01 mol /
placa (p <0,05). BV era anti-mutagénico en la dosis
más alta de 2 mol / placa (p <0,05) y redujo el número
de revertientes al valor trol con- negativa a esta dosis.
Adición de BR en la dosis más baja (0,01 mol / placa)
inesperadamente aumentado el número de revertientes
por encima del control positivo (p <0,05).
3.1.3. Benzo [α] pireno inducida mutagenicidad
Benzo [a] pireno genotoxicidad inducida se utilizó
para probar los posibles efectos anti-mutagénicos de
los pigmentos biliares en presencia de activación
metabólica. Todos los pigmentos biliares inhiben B [a]
P mutagenicidad de una manera dependiente de la
dosis (p <0,001;Fig. 5). BRT significativamente
crecimiento revertientes inhibido en todas las
concentraciones ensayadas
(≥0.001 mol / placa; p <0,05). BV redujo el nú-
ero de reversiones en 0.5 mol / placa, al igual que
en BR ≥
0,75 mol / placa (p <0,05).
3.2. TA100
3.2.1. 2,4,7 trinitro fl mutagenicidad inducida por
uorenone
Cuando TNFone causada mutación en la cepa
TA100, BR y BRT inhiben esta respuesta de una
manera dent depen- dosis (p <0,029 y 0,001,
respectivamente; Fig. 3B), sin embargo, BV no lo
hicieron (p = 0,521). BRT y BR signifi-
cativamente redujo el número de sus reversiones en ≥1 +
y
≥0.5 mol / placa, respectivamente (p <0,05).
3.2.2. mutagenicidad azida de sodio inducida
A las concentraciones ensayadas, ninguno de los
com- puestos estudiados modula los efectos
mutagénicos de NaN3 (BRT; p = 0,604, BV; p = 0,608,
BR; p = 0,386; datos no mostrados).
3.2.3. 2-amino fl uorene mutagenicidad inducida
BRT y BV exhibió un dependiente efecto
mutagénico dosis, anti- sobre la formación de
revertientes (p <0,001; Fig. 4SEGUNDO). Sin
embargo, BR no para evocar una respuesta similar (p =
0,083). BRT y BV inhibieron el crecimiento
revertientes en
≥1 mol / placa (p <0,05).
3.3. TA102
3.3.1. las pruebas anti-mutagénica
3.3.1.1. 2,4,7 trinitro fl mutagenicidad inducida por
uorenone. Todos los pigmentos biliares inhibieron la
TNFone indujo respuesta génica mutatis en la cepa
TA102 de una manera dependiente de la dosis (p
<0,001; Fig. 3DO). BRT, BV y BR reducen
el número de sus reversiones + en ≥0.05, y ≥1
≥0.5 mol / placa, respectivamente (p <0,05).
3.3.1.2. 2-amino fl uorene indujo mutagenicidad. BRT
y BV inhibió la respuesta mutagénica inducida por 2-
AF
Fig. 6. Los efectos moduladores de pigmentos biliares de genotoxicidad inducida por t-BuOOH en TA102 de Salmonella typhimurium en ausencia
(A) y presencia (B) de S9. Los datos presentados como media ± SE (n = 6).
tabla 1
Los efectos moduladores de pigmentos biliares de genotoxicidad en el TA98, TA100, TA102 de Salmonella typhimurium

Tensión Mutageno (Mol / placa) S9 Compuesto CARNÉ DE IDENTIDAD50 (! Mol) yo0.5 (%) yomáx (%)
-11
Su+ TA98 2,4,7 TNFone (3,17 10 ) BRT 0,146 68
88 × - 152 6 ±
BV 0,056 68 76
BR 0,150 85 93
-9
B [a] P (8,00×10 ) + BRT 0,576 47 71 79 ± 14
BV 0,284 67 98
BR 0,658 24 68
-8
2-AF (1,10 ×
10 ) + BRT 1,799 7 55 543 ± 44
BV 1.142 12 94
BR 43.29una - -
-9
TA100 2,4,7 TNFone (3,17 ×
10 ) - BRT 1,666 22 56 653 ± 35
BV 557una 13 20
BR 0,505 50 62
-7
NaN3 (1,54 ×
10 ) - BRT - - - 1725 ± 112
BV - - -
BR - - -
-8
2-AF (1,10 ×
10 ) + BRT 1,086 22 75 590 ± 10
BV 0,860 32 100
BR 1,082una - -
-8
TA102 2,4,7 TNFone (3,17 ×
10 ) - BRT 1.083 31 70 1838 ± 58
BV 2.604una 18 36
BR 0,522 47 80
-6
2-AF (1,10×10 ) + BRT - 27 33 2302 ± 90
BV 0,594 42 100
BR - - -
-6
t-BuOOH (1,00 ×
10 ) - BRT 2,756una 11 30 975 ± 40
BV 1,000 25 78
BR 0,557 41 88
-6
t-BuOOH (1,00 ×
10 ) + BRT - - - 2384 ± 206
BV 0,946 35 59
BR 1.036una 12 25

ID50, la dosis de compuesto requerida para una inhibición del 50%; I0.5, porcentaje de inhibición a 0,5 mol / placa; Imax, porcentaje de
inhibición a la dosis±máxima ensayada; Su+, El número medio error estándar de histidina colonias revertientes positivos en las placas de control
positivos de dos experimentos; BRT, ditaurate bilirrubina; BV, biliverdina; BR, la bilirrubina no conjugada.
una
Resultado se extrapoló más allá del intervalo de concentración ensayado.
<0,001;Fig. 6A), sin embargo, BRT no lo hizo (p =
0,319). BV redujo el número de sus+ revertientes
de una manera dependiente de la dosis (p <0,001; Fig. en ≥1 mol / placa y BR en 0,75 mol / placa (p <0,05).
4DO). Cómo- nunca, este efecto no se presente para
BR (p = 0,708). BRT y BV redujo el número de sus
reversiones en ≥1 + y
≥0.5 mol / placa, respectivamente (p
<0,05).

3.3.2. prueba antioxidante

3.3.2.1. t-BuOOH indujo efectos pro-oxidantes. t-
BuOOH genotoxicidad inducida probó los posibles
efectos antioxidantes de los pigmentos biliares.
Cuando la activación metabólica estaba ausente, BR y
BV inhibieron la respuesta mutagénica t-BuOOH
inducida de una manera dent depen- dosis (p
 ≥

En presencia de activación metabólica, los efectos 3.4. Resumen de modulación mutagénico

de los pigmentos biliares parecían similares. BR y BV
inhib- itado la respuesta mutagénica t-BuOOH
inducida de una manera dependiente de la dosis (p
<0,001;Fig. 6B), sin embargo, no hubo ningún efecto
para BRT (p = 0,958). BV y BR signifi- reducen
icantly el número de sus revertientes + en 0,5 y 0,75
mol / placa, respectivamente (p <0,05).
Una tabla que resume la capacidad de los mentos
bilis porcino para modular genotoxicidad en las
bacterias TA98, TA100 y TA102 se presenta antes
(Mesa 1). Las dosis que inhibían mutagenicidad a 50%
de la positiva

control (ID50), el porcentaje de respuesta anti- mediante la interacción con estos mutágenos,
mutagénico a la dosis común más alta (0,5 mol / placa; posiblemente a través de apilamiento g-, enlaces de
I0.5) y en la dosis respectiva más alta ensayada (Imax) hidrógeno o interacciones hidrófobas[23,38-40].
se pre tantes para ayudar al lector en la identificación Sorprendentemente, BR indujo un efecto pro-
de la anti- relativa efectos mutagénicos de los mutagénico en la presencia de bacterias 2-AF y TA98
pigmentos biliares. (Fig. 4UNA). Aunque un efecto pro-mutagénico
sinérgica de BR y 2-AF es posible, es poco probable, ya
4. Discusión que un efecto similar no se observó en el TA100 o cepa
TA102 (Fig. 4segundo y DO). Por lo tanto, es posible
Los pigmentos biliares poseen actividad que el hallazgo es el resultado de
antioxidante [2] pero datos completos sobre su
potencial anti-mutagénica es deficiente. La prueba de
Ames Salmonella fue elegido con el fin de probar los
efectos de los pigmentos biliares en la presencia de
compuestos genotóxicos que poseen diferentes
conformaciones tridimensionales (Figura 2). Además,
hemos probado si pigmentos biliares poseían efectos
antioxidantes y si las propiedades físico-químicas de
diferentes compuestos de bilirrubina (no conjugada
frente a conjugado) afectado los resultados.
pigmentos biliares, BR y BV, se sabe que inhiben
los efectos mutagénicos de B [a] P [25]. Nuestros
resultados apoyan esta observación y muestran que la
VB fue más eficaz que la BR. El ID50 de ditaurate
bilirrubina igualó 0,58 mol ser similar a la de BR (0,66
mol) lo que sugiere la conjugación de BR no afectó a
su potencial anti-mutagénico.
los anti-mutagénico efectos de la bilis pigmentos
e n TNFone y 2-AF inducido mutación compartido una
común tendencia en todas las cepas. El orden de
eficacia (ID50) siguió la tendencia
≥ general BR BRT>
BV para≥TNFone y BV BRT BR para 2-AF (Tpoder 1;
Higos. 3 y 4). Ese esta tendencia fue consistente en
todas las cepas, en ausencia de activación metabólica,
sugiere que pigmentos biliares vea afectada la
capacidad de TNFone para interrumpir la estructura
del ADN. En cuanto a los resultados de 2-AF, cabe
señalar que el 2-AF se metaboliza al compuesto
mutagénico, 2-acetilaminofluoreno (2-AAF), por la
fracción S9 microsomal [36,37]. Por lo tanto, es
posible que los efectos anti-mutagénicos de pigmentos
biliares, en la presencia de 2-AF, se podrían atribuir a
la inactivación de las enzimas citosólicas en la mezcla
S9, además de / inactivación de los mutágenos de
unión. La afinidad conocida de porfirinas para
compuestos aromáticos planos sugieren que los
pigmentos biliares podrían prevenir genotoxicidad
la variabilidad en el ensayo y no un verdadero efecto
dosis-respuesta.
Para que el mecanismo de multi-modal de acción
de los pigmentos biliares podría ser probados fueron
probados en la cepa TA102, que es susceptible a la
mutación inducida por el estrés oxidativo [41,42]. La
mutación se indujo usando t-BuOOH, lo que
provoca daños en el ADN in vitro [43-45] a través
de la generación de especies reactivas de oxígeno
(ROS), incluyendo radicales alcoxilo [44,46]. Los
pigmentos biliares inhiben reacciones en cadena de
radicales peroxilo en los lípidos a través de un
mecanismo de donación de hidrógeno [47]. Es
posible que los pigmentos biliares también son
eficientes alcoxilo como captadores de radicales
alcoxilo y radicales peroxilo comparten estructuras
similares, proporcionando un mecanismo mediante
el cual los pigmentos biliares podrían interferir con
t-BuOOH daño del ADN inducido [48]. Nuestros
resultados muestran que la BR y BV fueron capaces
de aten- mutación inducida luar t-BuOOH. En
ausencia de metabolismo S9, el ID50 de BR fue de
aproximadamente la mitad del de la biliverdina
(0,556, 1 mol, respectivamente;Fig. 6UNA; Mesa 1).
Como se discutió por Stocker [2], esta observación
podría explicarse por la capacidad de la bilirrubina
para neutralizar dos radicales a través de la donación
inicial átomo de hidrógeno, formando un radical
bilirrubina, que se une a la formación de otro radical
un complejo no radical [3,47]. Sin embargo, la
biliverdina sólo puede aceptar un electrón con la
formación de una resonancia estabilizada complejo
radical biliverdina [3]. La inhibición dependiente de la
dosis de mutagenicidad fue similar cuando t-BuOOH
se incubó en presencia de S9 (tabla 1). La falta de un
efecto para ditaurate bilirrubina (Fig. 6A y B), en
presencia de t-BuOOH, es conside- sorprendente Ering
su potencial antioxidante [9,49]. Que el BRT no puede
difundirse a través de las membranas lipídicas igual
que su hermano no conjugada [50], podría explicar su
incapacidad para prevenir mutatis
ciones en este caso.
Nosotros han demostrado que BR y BV son capaces
de pre- ventilación estrés oxidativo mutación inducida
de manera más eficiente que muchos otros
antioxidantes. En presencia de t- BuOOH, ácido
cafeico y a-tocoferol parecen tener poco[51], Si alguna
[52], potencial anti-mutagénico. ácido bic Ascor- sólo
es eficaz
≈ cuando en un gran exceso (ID50 68? mol /
placa)[52]. Sin embargo, la quercetina inhibe
eficientemente t-BuOOH mutagénesis inducida (ID50
≈0,44 mol) [52] de manera similar a la BR y BV (ID50 =
0,56,
1,00 mol / placa, respectivamente). Estos datos
sugieren que los pigmentos biliares endógenos son
potentes barrido de radicales anti-mutágenos.
Aunque los datos presentados aquí no se pueden
aplicar in vivo, que apoyan otros anti-mutagénico y
anti-cancerígenos hallazgos incluidos los efectos
apoptóticos de la BR en líneas celulares de cáncer de
colon [53], y la correlación negativa entre las
concentraciones circulantes Br y la mortalidad por
cáncer [54]. efectos Curiosamente, el anti-mutagénicos
 AC Bulmer et al. / Mutation Research 629 (2007) 122-132 131

de BR se observaron a concentraciones que varían de

placa
~ 3 a 250? M, que abarca las concentraciones BR Lista de abreviaciones
plasma encontrados en personas sanas~(12? M) [55], 2-AAF 2-acetilaminofluoreno
las personas con Síndrome de Gilbert
~ (40 M) [56] y El
síndrome de Crigler-Najjar ~ (80-280 M) [57,58].
También, Se observaron los efectos anti-mutagénicos
de BRT a concentraciones que se aproximan
~ a la placa
de 3-690? M refle- ing el rango inferior de las
concentraciones totales de BR en la bilis humana [59].
Las limitaciones del uso de la prueba de Ames
Salmonella son bien conocidos e incluyen
imprecisiones en recuento de las colonias revertientes,
especialmente cuando están en exceso de 2000. Estas
imprecisiones se superaron con el entrenamiento y
fueron eludidas cuando los efectos anti-mutagénicos
de pigmentos biliares redujeron la revertientes cuenta
colonial.
En conclusión, este informe ha demostrado amplio
rango de efectos anti-mutagénicos de pigmentos
biliares a numerosos mutágenos en TA98, TA100 y
TA102 cepas de S. typhimurium y representa la
investi- gación más completo de su tipo hasta la fecha.
Curiosamente, los efectos anti-mutagénicos de
pigmentos biliares estaban relacionados con sus
formaciones con- 3D. , Teja de cumbrera 3D
conformación de la bilirrubina[32] (Figura 2A), más
eficazmente inhibida TNFone (Figura 2DO) y BV
inhibe más eficazmente 2-AF (Figura 2B y D). En este
informe se ha presentado nuevos hallazgos de efectos
anti-mutagénicas de bilirrubina de ditaurate, lo que
podría mejorar nuestra comprensión de los efectos
fisiológicos de diglucurónido bilirrubina en el cuerpo
humano.
Lo más importante, este es el primer estudio para
informar de que los pigmentos biliares endógenos
pueden prevenir el estrés oxidativo genotoxicidad
inducida, lo que sugiere que poseen múltiples modos
de acción anti-mutagénico. La investigación adicional
Las investigaciones sobre los mecanismos de acción
anti-mutagénica se sugieren, y sin duda es necesario,
para explorar el potencial terapéutico de estos com-
puestos de origen natural.

Expresiones de gratitud

Andrew Bulmer, es una Beca Centenario 2001

(Commonwealth de Australia Gobierno), Graduate
Award Travel Research School (Universidad de
Queens- tierra) y el Premio Travel Research
(BioPharma Pty. Ltd.) destinatario. La investigación
fue financiada (Dr. Karl-Heinz Wagner) con una beca
de investigación de la Universidad de Austria,
otorgado por la Universidad de Viena.

Apéndice Apéndice A.
130 AC Bulmer et al. / Mutation Research 629 (2007) 122-132
2-AF 2-aminofluoreno [3] R. Stocker, Y. Yamamoto, AF McDonagh, AN Glazer, BN
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