Guia Bioquimica

Manual de Prácticas de Bioquímica
NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

1. El alumno ingresará al laboratorio con bata, la cual debe de ser blanca y de manga larga.
Es indispensable portar la bata abotonada. Así mismo se recomienda llevar zapatos
cerrados y no sandalias.
2. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar,
etc.
3. Está terminantemente prohibido el uso de audífonos durante la práctica, salvo que estos
se requieran por deficiencia auditiva del estudiante
4. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos
de seguridad disponibles. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia
por si se diese el caso de una evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así
como conocer la localización exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos.
5. En ningún momento se permitirá la aplicación de cosméticos, fumar, comer ni beber en el
laboratorio, ya que hay la posibilidad de que ellos se contaminen con productos químicos.
6. Limpiar las mesas de trabajo antes y después de cada práctica.
7. Para evitar quemaduras, se deberán apagar mecheros, planchas calientes o ambos
cuando éstos no se utilicen. Así mismo, se deberán emplear gradillas o pinzas para
sostener o transportar tubos calientes.
8. Mantener las sustancias químicas inflamables alejadas del fuego, planchas calientes o
ambos.
9. No se deberá olfatear, probar reactivos o ambos o las soluciones. No se debe mirar nunca
la interior de un tubo de ensayo que se esté calentando, ni apuntar hacia alguna persona
porque el contenido podría proyectarse en cualquier momento. La misma precaución debe
tomarse cuando se mezclan reactivos o se agiten vigorosamente los tubos.
10. Utilizar pipetores o perilla de goma para la medición de los líquidos corrosivos, ácidos,
bases, sustancias volátiles, venenos entre otros. No aspirar con la boca.
11. Evitar agregar agua sobre ácidos para evitar quemaduras por proyección. Para diluir
cualquier ácido, se vierte el ácido sobre el agua y nunca agua sobre ácido. Emplear baño
de hielo o baño de agua fría para preparar soluciones diluidas de ácidos.
12. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar derrames.
13. Usar guantes desechables cuando se manipulen muestras biológicas. Considerar que
cualquier material biológico es potencialmente infeccioso aún cuando proceda de
personas aparentemente sanas.
14. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservación de
alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en
los laboratorios.
15. Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de salir del
laboratorio.
16. No se puede hacer ningún experimento no autorizado.
17. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.
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ACCIONES QUE SE DEBEN TOMAR EN CASO DE ACCIDENTE

1. En caso de que exista contacto de ácidos o bases con la piel, ojos o boca, se recomienda
enjuagar el área con abundante agua con el propósito de disminuir su acción por dilución.
2. En caso necesario llamar inmediatamente a los teléfonos de emergencia: Compañía de
Bomberos (119), Cruz Roja Arequipa (Telefax: 054-204343, Móvil: 95-9576843, RPM:
#842761).
3. En caso de ingestión de corrosivos NUNCA provocar vómito. Si existe ingestión de ácidos
hacer beber inmediatamente una solución de bicarbonato de sodio (2 cucharadas soperas
en 2 vasos con agua); en caso de ingestión de soluciones cáusticas (hidróxido de sodio o
de potasio) ingerir una cucharada de vinagre o 25 ml de jugo de limón en agua.
4. Al ingerir otras sustancias químicas hacer vomitar a la persona accidentada. Vigilar que
exista una ventilación adecuada y mantener las vías áreas permeables mientras se
traslada al hospital.
5. Si existe derramamiento de un ácido, neutralizar agregando bicarbonato de sodio y en
caso de bases agregar ácido acético (vinagre). NUNCA tratar de adicionar agua. Emplear
bata, guantes y gafas durante la limpieza.
RECOMENDACIONES PARA TENER EXITO EN LAS PRÁCTICAS
1. El alumno deberá leer la práctica completa y la discutirá con el profesor antes de la

realización de la misma.
2. Los útiles y objetos personales deberán ser colocados en la parte inferior de las mesas de
trabajo.
3. El material con el que se trabajará deberá estar perfectamente limpio antes y después de
la práctica.
4. Antes de preparar las mezclas de reacciones etiquetar adecuadamente cada uno de los
tubos de ensayo con marcador indeleble.
5. Por ningún motivo alterar el orden de adición de reactivos en la práctica.
6. Utiliza agua destilada en todos los experimentos en los que se solicite agregar agua.
7. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar contaminación o vaporización de los
mismos.
8. Utilizar sólo la cantidad requerida de reactivos para evitar el desperdicio de los mismos.
9. Evitar regresar excedentes de reactivo al frasco de donde se extrajo el mismo.
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PRACTICA 1
USO DE MATERIAL, EQUIPOS DE LABORATORIO Y PREPARACIÓN DE

SOLUCIONES
OBJETIVOS
1. Identificar los materiales y equipos comúnmente empleados en un laboratorio de
Bioquímica
2. Utilizar apropiadamente algunos de los equipos de laboratorio
3. Preparar soluciones porcentuales, molares y normales
4. Preparar soluciones valoradas
INTRODUCCIÓN
La aplicación de algunos de los conocimientos teóricos obtenidos en el salón de clase
se logran mediante prácticas de laboratorio en las que se requiery el manejo apropiado de
equipos de laboratorio como: espectrofotómetro, baño maría, agitador magnético, centrífuga,
pHmetro, pipetas (serológicas y automáticas), material de vidrio, etc. Así mismo el estudiante
debe emplear el vocabulario apropiado y conceptos comúnmente empleados en el laboratorio.
SOLUCIONES
Una solución es una mezcla homogénea formada por dos componentes: solvente y
soluto; el solvente disuelve al soluto y está en mayor proporción.
Las soluciones, físicamente se clasifican en:

a) Líquidas.- Sólido en líquido, líquido en líquido y gas en líquido.
b) Gaseosas.- Sólido en gas, líquido en gas y gas en gas.
c) Sólidas.- Sólido en sólido, líquido en sólido y gas en sólido.
Los factores que afectan la solubilidad son las propiedades del soluto y del solvente
como la polaridad y el carácter iónico.
Los factores que afectan la velocidad de disolución son: tamaño de partícula, cantidad
de soluto, agitación, temperatura.
La concentración de una sustancia es la cantidad de uno de los componentes de la

solución (casi siempre el soluto) disuelto en la unidad de solución. La medida de la
concentración puede hacerse empleando unidades químicas o unidades físicas.
SOLUCIONES NORMALES
Son las que contienen un equivalente gramo de sustancia por litro de solución.
Así, una solución normal de HCl, contiene un átomo gramo (1.008 g.) de hidrógeno, y
una solución normal de base contiene un gramo del radical hidroxilo (17.008 g.) por litro de
solución. Las soluciones valoradas se corresponden volumen a volumen; así, un mililitro de
solución normal de ácido neutraliza exactamente a 1 ml. de solución normal de base. La
normalidad de una solución es el número de equivalentes de soluto por litro de solución. Una
solución 1 N de un ácido contiene un equivalente de ese ácido por litro, o un mol de iones de
hidrógeno ionizables por litro de solución.
La normalidad de una solución se encuentra dividiendo el peso de la sustancia

contenida en un litro de solución entre el equivalente gramo de dicha sustancia.
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PESO EQUIVALENTE
Llamado también equivalente gramo (Eq), es la cantidad de elemento o compuesto que
se combina o equivale a 1.008 g. de hidrógeno o a 8.00 g. de oxígeno, así:
Ejm.
Peso fórmula gramo Peso equivalente gramo
H2SO4 98 g. 49 g.
HNO3 63 g. 63 g.
Ejm.
Peso fórmula gramo Peso equivalente gramo
KOH 56 g. 56 g.
Ca(OH)2 74 g. 37 g.
La milésima parte del peso equivalente gramo, es el miliequivalente y se expresa en

miligramos. Así, el miliequivalente de H2SO4 es: 49 / 1000 = 49 mg.; el milequivalente se
abrevia como mEq.
SOLUCIONES PORCENTUALES
Representa la proporción del soluto que se encuentra en una solución utilizando la base
100 expresada en gramos o en mililitros. Existen cuatro diferentes formas para referirse a la
concentración porcentual como se muestra a continuación:
1. Porcentaje en peso (%p/p): número de gramos de soluto en 100 g de solución
2. Porcentaje en volumen (%v/v): número de mililitros de soluto en 100 mililitros de solución
3. Porcentaje en peso-volumen (%p/v): número de gramos de soluto en 100 mililitros de
solución
4. Porcentaje en moles (%Moles): número de moles de soluto en 100 mililitros de solución
SOLUCIONES MOLARES
Número de moles en un litro de solución
Mol: se define como el peso molecular de una sustancia expresado en gramos. La masa
molecular o peso molecular (PM) de una sustancia es la suma de los pesos atómicos de cada
uno de los pesos atómicos de cada uno de sus componentes; por ejemplo el peso molecular
del ácido sulfúrico (H2SO4) es de 98 g/Mol.
SOLUCION ESTANDAR
Es una sustancia de composición química conocida, de alto grado de pureza, de gran
estabilidad química en el ambiente, que se puede pesar directamente para formar soluciones
utilizadas para la titulación exacta de soluciones cuya concentración normal es desconocida.
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Debe además, tener un peso equivalente gramo alto para que el error en la pesada sea lo mas
bajo posible. Ejm.: ácido oxálico (HOOC-COOH.2H2O, P.M. 126.0480), su peso equivalente
será 126.048/2 = 63.024 g. de ácido oxálico que disuelto al volumen de un litro corresponde a
la concentración de una solución 1 N. Otro ejemplo de patrón primario es el ftalato ácido de
potasio (biftalato de potasio: KHC8H4O4), P.M. 204.228 g. que disuelto en un volumen de 1000
ml en un matraz aforado (fiola), nos proporciona una solución 1N; el carbonato de sodio, etc.
SOLUCIONES DE PARTES POR MILLÓN

Representa la proporción de las moléculas de un soluto presentes en un millón de
moléculas de una mezcla. Es utilizada en situaciones en las cuales un soluto se encuentra en
concentraciones extremadamente bajas. Por ejemplo la cantidad de Mercurio en suelo.
CENTRÍFUGA
La centrífuga es un método empleado para separar partículas en base a la velocidad
de sedimentación de cada una de ellas como resultado de la fuerza centrífuga a las que son
sometidas. El equipo empleado para realizar la centrifugación es la centrífuga (Fig. 1), la cual
está constituida de un motor eléctrico que lleva un dispositivo que gira alrededor de un eje
vertical, el rotor y cuyo resultado es el aumento de la atracción gravitacional en el fondo del
tubo que contiene la muestra. El resultado de toda centrifugación es la separación de 2 fases,
una fase insoluble denominada residuo, precipitado o “debris celular” y una fase líquida
llamada sobrenadante.
El uso adecuado de la centrífuga implica:

 Los tubos de la centrífuga deben colocarse por pares uno al frente del otro y deben tener
el mismo volumen o peso
 La velocidad y el tiempo de ser programado en el panel de la centrífuga
 Colocar el rotor adecuado al tipo de tubo a usar
 Antes de prender la centrífuga debe estar tapada
 Levantar la tapa cuando ésta esté totalmente detenida
Figura 1. Centrifuga refrigerada
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POTENCIÓMETRO O pHMETRO
Es un medidor de pH (Fig. 2), que permite determinar la concentración de iones
hidrógeno midiendo la fuerza electromotriz (f.e.m.) de una celda formada por un electrodo de
referencia, la solución problema, y un electrodo de vidrio sensible a hidrogeniones.
El uso del potenciómetro depende del modelo. Sin embargo en forma general debe
tener los siguientes cuidados:
 Los electrodos deben lavarse antes y después de utilizarse, y no se deben tocar con la
mano
 Antes de ser utilizado debe ser calibrado con soluciones de referencia (pH 4, pH 7º pH
10)
 Los electrodos o electrodo debe mantenerse en agua destilada cuando no estén en uso y
evitar que se sequen. Si esto ocurre, los electrodos deben ser sumergidos en agua
destilada y calibrarse varias veces antes de proceder hacer las mediciones.
Figura 2. pHMETRO
ESPECTROFOTÓMETRO
Aparato que sirve para medir la intensidad de luz absorbida por una solución, en un estrecho
intervalo de longitudes de onda del espectro UV/Visible.
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En general consta de: a) una fuente de luz (UV, visible, infrarrojo); b) un monocromador,
que mediante un prisma o red de difracción dispersa la luz en un espectro, y luego selecciona
una longitud de onda o un cierto intervalo de ese espectro y lo dirige hacia la sustancia
problema y; c) un sistema de detección que transforma la energía luminosa que recibe, en
energía eléctrica (Fig. 3, 4).
Figura 3. Diagrama de un espectrofotómetro
En resumen, la luz monocromática pasa por una cubeta que contiene la solución
problema y la luz transmitida es medida empleando una célula fotoeléctrica. La corriente
eléctrica producida por la luz transmitida es proporcional a su intensidad, y se lee la corriente
en un galvanómetro. Con estos aparatos es posible obtener un espectro de absorción,
determinando la absorbancia a diferentes longitudes de onda.
Figura 4. Espectrofotómetro
PIPETAS AUTOMÁTICAS
En bioquímica, la habilidad para medir de manera exacta y reproducible y transferir
volúmenes pequeños de líquidos son críticos para obtener resultados útiles. Para los
volúmenes menores de 1 ml, el método más común para medir líquidos requiere el uso de un
dispositivo conocido como micropipeta (Fig. 5).
Las pipetas que usa pueden no parecerse a las mostradas. Las micropipetas usadas en
este laboratorio vienen en tres diferentes presentaciones.
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 P1000 es útil para volúmenes de 200 hasta 1000 µL

 P200 es útil para volúmenes de 20 hasta 200 µL.
 P20 es útil para volúmenes de 0.5 hasta 20 µL.
Figura 5. Micropipetas
Asegúrese que está usando la micropipeta correcta para el volumen que necesita.
También, asegúrese que la micropipeta está realmente lista para el volumen que necesita
revisando la “ventana de volumen”, y, si es necesario, cambiando el volumen mediante el
“dispositivo” del control o mando del volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la
micropipeta no lee su mente; varias personas usarán las pipetas, no siempre se encontrará
como usted la necesita).
No Trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para

volúmenes menores del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta. Toda micropipeta
utiliza puntas desechables (no utilice la pipeta sin usar la punta apropiada, hacer esto
contaminará la micropipeta y la puede dañar). No utilizar la micropipeta con líquidos que
atacan el polipropileno. No utilizar líquidos que estén emitiendo vapores. La temperatura de los
líquidos debe estar entre 15 y 40 º C. Al poner la punta, asegúrese que la punta sea del tipo
correcto y que está correctamente ajustada. Generalmente para P1000 las puntas son azules,
para P200 son amarillas y para P20 pueden ser amarillas o blancas.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 1: PREPARACION Y TITULACION DE UNA SOLUCION DE NaOH 0.1 N

Para preparar una solución de NaOH, es necesario partir de una solución saturada
preparada con anticipación.
SOLUCION SATURADA DE NaOH.- Pesar 100 g. de NaOH, disolver en 100 ml. de agua
destilada libre de CO2; colocar este preparado en un frasco provisto de un tapón de jebe y
dejar en reposo por una semana para sedimentar los carbonatos. Decantar el líquido claro y
guardar en frasco parafinado y rotular con fecha. Esta solución es aproximadamente 19 N.
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SOLUCION PATRON DE ACIDO OXALICO 0.1 N.- Pesar con precisión 6.302 g. de ácido
oxálico desecado en estufa a 110ºC por 10 minutos y colocarlo en un matraz aforado (fiola) de
1000 ml; añadir agua destilada, agitando continuamente hasta una completa disolución del
ácido oxálico. Agregar agua hasta el aforo y homogenizar. Como la concentración es conocida
con precisión, se denomina solución estándar (= patrón) y servirá para estandarizar las
soluciones.
SOLUCION 0.1 N de NaOH.- Medir 0.6 ml. de solución saturada de NaOH y colocar en un
matraz aforado de 100 ml. Completar con agua destilada hasta la marca y homogenizar.
Proceder a la titulación de esta solución, pasando a un Erlenmeyer 10 ml de ácido oxálico 0.1
N, exactamente medidos. Agregar 3 gotas del indicador fenolftaleina al 1%. Lleve este
preparado debajo de una bureta que ha sido previamente llenada con la solución de NaOH
aproximadamente 0.1 N; se deja caer esta solución graduando la velocidad de caída y
agitando continuamente la solución patrón hasta la aparición de un color rosado estable.
Para hallar la normalidad de la solución, se puede aplicar la siguiente expresión:
V1 x N1 = V2 x N2
Donde:
V1 = Volumen conocido
N1 = Normalidad conocida
V2 y N2 = Uno de ellos se desconoce
Ejm. Supongamos que se ha gastado 9.5 ml de solución de NaOH aproximadamente 0.1 N,

tendremos:
10 x 0.1 = 9.5 x N2
N2 = 10 x 0.1 / 9.5
N2 = 0.105
La normalidad de la solución es 0.105 N, pero queremos que la solución sea

exactamente 0.1 N; para eso, debemos agregar una determinada cantidad de agua para
corregir la normalidad aplicando la siguiente regla:
ml de agua = A x B / C
Donde:
A = Volumen de la solución a corregir. Ej. 90.5 ml de NaOH 0.105N
B = Volumen patrón primario, menos solución a corregir gastada. Ej. 10 - 9.5 = 0.5
C = Volumen de la solución a corregir, gastado durante la titulación. Ej. 9.5 ml.
Se deduce que quedan 90.5 ml de NaOH aproximadamente 0.1 N, que se ha

necesitado 9.5 ml para neutralizar 10 ml de solución de ácido oxálico 0.1 N y que la diferencia
entre 10 ml y 9.5 ml es igual a 0.5 ml. Entonces tendremos:
ml de agua = 90.5 x 0.5 / 9.5

ml de agua = 4.34
Bastará con añadir 4.34 ml de agua destilada para obtener una solución exactamente
0.1 N de NaOH.
EXPERIMENTO 2: PREPARACION Y TITULACION DE UNA SOLUCION DE HCl 0.1N

Se considera la valoración de ácido clorhídrico con NaOH 0.1, por lo siguiente:
a) Respecto al ácido clorhídrico: posee más ventajas frente a otros ácidos minerales.
b) Respecto al NaOH: Fue valorado frente a un patrón primario, lo cual garantiza mayor
precisión en los resultados.
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El HCl concentrado tiene las siguientes características: PM = 36.5, pureza 37%,

gravedad específica 1.19, lo que da a entender que 1 ml. de esta solución pesa 1.19 g.
Si 1.19 x 0.37 da 0.44 g. de HCl puro, el volumen necesario para obtener una solución
normal será: 36.5 / 0.44 = 83 (82.95 ml) de HCl, que serán disueltos hasta obtener un volumen
de 1000 ml.
Para preparar 100 ml de solución 0.1 N, se toma 0.83 ml de HCl y se disuelve hasta
obtener un volumen de 100 ml, en fiola.
Para la titulación se llenará una bureta con esta solución, mientras que en un beaker de
100 ml, se verterá 10 ml de solución de NaOH exactamente 0.1 N y 3 gotas de anaranjado de
metilo. Se deja caer la solución de NaOH 0.1 N (patrón), agitando constantemente hasta viraje
del indicador. Se anota el gasto y se calcula la normalidad con la expresión: V 1 x N1 = V2 x N2.
Si hay necesidad de corregir el volumen, se aplica la regla ya conocida.
Cuando se trata de elementos o sustancias monovalentes, las soluciones normales son

a la vez molares, porque tienen la misma concentración.
CUESTIONARIO:
1. Se dispone de una solución de NaOH 0.14 N, cuanto se debe medir de esta solución
para preparar 500 ml exactamente 0.10 N ?
2. Se quiere preparar 250 ml se solución de H2SO4 0.02 N a partir de una solución

concentrada, cuya densidad es 1.84 gr/ml y con 96% de pureza. Cuántos ml se debe
tomar de esta solución ?
3. Cuántos ml de una solución concentrada de HCl serán necesarios medir para preparar
500 ml de HCl 0,035 N ?
4. Cuántos ml de HCl 0.5 N se requieren para que reaccionen exactamente con 2 g. de

hidróxido de calcio ?
5. Calcular la normalidad de una solución de HCl, sabiendo que 50 ml de esta solución

necesitan 60 ml de NaOH 0.1 N para neutralizarse.
6. Cuántos moles de NaCl hay en 100 ml de solución 2 M ?
7. Cuál es la normalidad de una solución que se prepara disolviendo 58.5 g. de NaCl en 500
litros de agua ?
8. Qué volumen de HNO3 0.85 N se necesitará para neutralizar 36 ml de NaOH 0.86 N ?
9. Cuál es la molaridad de una solución que contiene 250 g. de CaCl 2 en 1500 ml de

solución?
10. Cuántos ml de una solución de H2SO4 0.05 M, serán necesarios para titular
completamente 250 ml de NaOH 0.075 N?.
10
PRACTICA 2
COLORIMETRIA Y FOTOMETRIA
Muchos experimentos en bioquímica dependen de la absorción de la luz
monocromática, de una solución, en la región visible y ultravioleta del espectro
electromagnético. Muchas moléculas de interés biológico absorben la luz en la longitud de
onda comprendida entre 200 - 800 nm ó 2000 - 8000 Å. Por ejm., purinas, pirimidinas y ácidos
aromáticos, así mismo los ácidos nucleicos y las proteínas. Otros ejm., son las hemoproteínas
(citocromos, hemoglobina y mioglobina) carotenoides y esteroides.
Muchos compuestos, sean o no coloreados, tienen la capacidad de absorber luz de una

determinada longitud de onda; pero en otras casos es necesario transformar la sustancia a un
derivado coloreado, usando un reactivo adecuado.
Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de la luz de una solución

pueden usarse como medida de su concentración.
La colorimetría es un procedimiento por el cual una solución coloreada de un material

de concentración desconocida se compara, mediante el color, con un estándar que contiene
una concentración conocida del mismo material. Hoy se usa poco ésta técnica. La mayor parte
de procedimientos analíticos usan el principio fotométrico, es decir, la medida de potencial
transmisor de luz de una solución coloreada, a una longitud de onda espectral específica.
Muchos aparatos llamados "colorímetros" son realmente fotómetros según la estricta
definición. Si la longitud de onda puede seleccionarse a lo largo de un intervalo continuo,
interponiendo un prisma o una red de dispersión, entre la fuente de luz y la muestra, el
instrumento se denomina "espectrofotómetro".
En fotometría o en espectrofotometría se compara la transmitancia de la luz a través de

una solución que contiene materiales absorbentes con la transmisión de la misma luz a través
de otra solución que solo contiene disolvente. Esta última se denomina solución de referencia
o reactivo blanco o simplemente blanco; debe ser idéntica a la primera excepto en que carece
de los materiales absorbentes de la luz que han de estudiarse. Ambas soluciones deben
medirse bajo idénticas condiciones de longitud de onda, intensidad de luz incidente y anchura
de cubeta (longitud de paso de luz).
1. ENERGIA RADIANTE
Las radiaciones electromagnéticas, conocidas corrientemente como luz, están
compuestas por paquetes de energía llamados fotones o cuantos. De acuerdo a la longitud de
onda, se conocen tres zonas: a) Ultravioleta (UV), comprende radiaciones de 100 a 300 nm de
longitud; b) Luz Visible (color), está constituida por radiaciones electromagnéticas de 390 a
770 nm de longitud de onda y c) El Infrarrojo, entre 2000 a 30000 nm.
Una onda de luz posee campos eléctricos y magnéticos oscilantes que están en fase,
pero son perpendiculares a la dirección de propagación. La longitud de onda, de la luz, se da
en cm y se relaciona con la velocidad de luz en el vacío, en cm/seg, y con la frecuencia, en
ciclos/seg:
Longitud de onda (), es la distancia entre los nudos de dos ondas de radiación
adyacente. Se mide en cm, nm, mm, mm, Å.
La velocidad (c), de propagación en el vacío es de 3 x 1010 cm/seg y algo menor al

atravesar sustancias transparentes.
La frecuencia (v), es el número de oscilaciones por segundo. Se expresa en ciclos/seg.
11
La luz interacciona con la materia principalmente a través del campo eléctrico oscilante.
Para fines de absorción debe tenerse en cuenta que la luz es un paquete de energía o fotón
hv, donde h es la constante de Planck, 6.627 x 10-27 ergios segundo, y v es la frecuencia. De
aquí se desprende que la energía de la luz es directamente proporcional a la frecuencia:
y según la ecuación anterior inversamente proporcional a la longitud de onda.
Hay absorción de luz cuando la energía del fotón, hv, corresponde a la diferencia entre
los niveles de energía de la molécula.
2. LEYES DE ABSORCION
En Química Biológica se emplea la fotometría principalmente para regular o controlar la
concentración de diversas especies en mezclas de reacción. La absorción de luz a una
longitud de onda dada, está relacionada con la concentración de especies absorbentes por
medio de dos leyes.
2.1. Ley de Lambert. Lambert estudió la cantidad de luz monocromática absorbida por un
cuerpo y enunció la ley que dice: "la fracción de luz absorbida es proporcional al espesor del
absorbente x, e independiente e la intensidad de luz", o en otros términos, "la proporción de
luz incidente, absorbida por el medio, es independiente de su intensidad y cada sucesiva capa
unidad de medio, absorbe una fracción igual de la luz que pasa a través de él". Por ejm., si la
luz incidente es 100% y cada capa unidad de espesor x, absorbe el 20% de la luz incidente, la
luz transmitida es el 80%. Para otras capas unidad de espesor x, la luz transmitida disminuirá
0 1 2 3
como sigue: 64%, 51.2%, etc. que es la secuencia (0.8) , (0.8) , (0.8) , (0.8) , etc. Lo que
conduce a la expresión matemática:
Donde:
I0 = Intensidad e la luz incidente
I = Intensidad de la luz transmitida
x = grosor de la capa en cm
α = coeficiente de absorción del medio
En forma logarítmica tenemos:
Al pasar al sistema logarítmico de base 10, el coeficiente de absorción c, se convierte

en coeficiente de extinción molar k
o sea
por tanto
Donde: log I0/I es la densidad óptica (D.O.) o absorbancia (A). A es directamente

proporcional a x.
2.2. Ley de Beer. Beer estudió la influencia de la concentración de la solución de una

sustancia coloreada sobre la transmisión de la luz monocromática y halló la misma relación
entre la transmisión y el espesor de la capa atravesada. Teniendo en cuenta que la luz se
absorbe solamente cuando un fotón choca con una molécula, la ley de Beer puede anunciarse
12
como sigue: "cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, la
cantidad de luz absorbida o la probabilidad de absorción es proporcional al número de
moléculas c, contenidas en el haz de luz".
donde: c = concentración en mol/l.
Cuando en la ley anterior, la transmitancia disminuye exponencialmente con el número

de moléculas absorbentes. Por ejm., en el caso anterior se hizo variar el espesor de la capa,
ahora si hacemos que el espesor de la capa sea constante, es decir que sea 1 cm y variamos
la concentración de la solución de la sustancia coloreada tenemos que: si consideramos la Io
como 100% y la absorbancia de cada una de las concentraciones c, es 50% de la luz
incidente, la luz transmitida es 50%. Para otras concentraciones c, la luz transmitida disminuirá
como sigue: 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13%, etc.
La ley de Beer es exacta sólo para luz monocromática y en muchos casos no se cumple
sobre todo a concentraciones altas.
2.3. Ley de Beer-Lambert. Es evidente que pueden combinarse las leyes de Beer y Lambert,
ya que tanto c como K incluyen un factor de concentración, de donde:
E = coeficiente de extinción molar

c = concentración en moles/litro
De aquí se deduce:
por consiguiente:
La ley combinada de Beer-Lambert nos dice que: "la fracción de luz incidente absorbida
por una disolución, a una determinada longitud de onda, está relacionada con el espesor de la
capa absorbente x, y con la concentración c, de la especie que absorbe". La Ley de Beer -
Lambert supone que la luz incidente es paralela y monocromática, y que las moléculas del
disolvente y del soluto están orientadas al azar.
2.4. Coeficiente de extincion molar. Por definición, el coeficiente de extinción molar E, es la

densidad óptica (log10 I0 / I) de una solución 1 M de la sustancia con un recorrido luminoso de
1mol/l
1 cm y generalmente se escribe E 1cm . La densidad óptica carece de dimensión, por lo que
E se expresa en términos de litros (concentración x longitud). E se expresa en unidades de
-1 -1 2
litros moles cm ; es decir, en cm / mmol y es numéricamente equivalente a la densidad
óptica de una solución milimolar de la sustancia con un recorrido luminoso de 1 cm. Con
1%
frecuencia se utiliza el término E 1cm , que es la extinción de una solución al 1% (1 g/100 ml)
cuando el camino recorrido por la luz es igual a 1 cm.
2.5. Coeficiente de extincion específica. En muchas ocasiones no se conoce el peso

molecular de algunos compuestos tales como proteínas y ácidos nucleicos presentes en una
mezcla y entonces se acostumbra expresar la concentración en g/l. En estos casos, se emplea
el coeficiente de extinción específico. Se le define como la densidad óptica de una solución al
13
10g/l
10% (10g/l) del compuesto cuando el recorrido de la luz es 1 cm, E 1cm .
2.6. Transmitancia (T). Es la capacidad de una solución para transmitir la luz. Se define como
la relación entre la intensidad de la luz que sale de la solución y la intensidad de luz entra a
ella.
Si la solución es absolutamente transparente I = 1, y su transmitancia será 1; este valor

es tanto menor de 1 cuanto mayor sea la luz absorbida por la solución. Se acostumbra,
también, expresar la transmitancia como porcentaje, es decir, porcentaje de luz transmitida:
Por tanto, los valores de T % van de 0 a 100%. Como la transmitancia va de 0 a 100%,

la expresión de Beer - Lambert será:
2.7. Absorbancia (A) o Densidad Óptica (D.O) o Extinción (E). Es la cantidad de luz
absorbida por una solución, equivalente al logaritmo negativo de la transmitancia y se mide en
unidades de 0 a 2 en la escala de absorción; 2 es el logaritmo de 100% de transmitancia. Este
es ó puede también calcularse restando a 2 el logaritmo del
porcentaje de transmitancia;
Si se construye una gráfica de A en función de c, se obtiene una recta, pues la

absorbancia es directamente proporcional a la concentración. La pendiente de la recta es Ex, y
el valor de la ordenada para c = 0 se considera cero.
Ejm. En un espectrofotómetro se ha ajustado al 100% la transmitancia de luz con agua

(blanco); la lectura de una solución de K2Cr2O7 en el mismo espectrofotómetro indica que T%
= 50 y la absorbancia es 0.301.
Solución: Hemos dicho que -log T ó -log I/I0 se denomina absorbancia. En este ejemplo:
Como:
tenemos:
reemplazando tenemos:
14
Ya que en la práctica, siempre se ajusta la transmitancia a 100% (cuyo log = 2), la

absorbancia se puede calcular a partir de:
2.8. Limitaciones de la Ley de Beer-Lambert. Aunque la ley de Lambert se cumple en todos

casos hasta hoy estudiados, la de Beer tiene algunas alteraciones. Algunas veces la relación
lineal entre la absorbancia y la concentración predicha por la ley de Beer, no se cumple. Los
tres tipos de desviaciones son: a) instrumentales, que pueden ser ópticos, mecánicas o
ambas, b) las relacionadas con las muestras y; c) experiencia del investigador.
2.8.1. Desviaciones Instrumentales. La ley de Beer solo se cumple para luz monocromática.
En la práctica nunca se obtiene luz totalmente monocromática. La monocromaticidad puede
variar cambiando el ancho de la rendija.
Para la región visible del espectro se usan los fotocolorímetros. Difieren de los
espectrofotómetros en que usan filtros para obtener luz monocromática en lugar de un prisma
o red y una rejilla. Los filtros dejan pasar una ancha banda de luz; por ejm., un filtro de 540 nm
deja pasar una luz que oscila entre 525 y 555 nm. Por el contrario las rendijas de los
espectrofotómetros ayudan a seleccionar mejor la longitud de onda a usarse, por lo cual se
puede suponer que con estos aparatos la ley de Beer tiene una menor desviación. También, la
ley de Beer se desvía con la luz no paralela.
2.8.2. Desviaciones Debidas a la Naturaleza de la Muestra. Se deben al cambio en la

concentración efectiva de la especie absorbente o la interferencia debida a los productos de
alguna reacción secundaria.
Muchas especies absorbentes contienen grupos ácidos o básicos. Puesto que los
conjugados del par ácido-base tienen una absorción diferente, si no se controla el pH habrá
desviaciones. De igual modo, si el equilibrio de la especie depende de la temperatura, habría
desviaciones si la temperatura sufre cambios. Si las moléculas del absorbente se absorben a
las paredes de la celda durante el curso de la observación, disminuyen la concentración
efectiva en la disolución y producen desviaciones aparentes de la ley de Beer, Los disolventes
también pueden cambiar las características de absorción. Las soluciones muy concentradas,
que originan un color muy intenso, también originaran desviaciones ya que la ley se cumple
solo hasta cierto límite máximo de concentración, característico para cada sustancia.
2.8.3. Desviaciones Debidas al Investigador. Principalmente se deben a una mala elección

de longitud de onda. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el máximo de
absorción de la solución. Esto permite también conseguir la sensibilidad óptima.
3. RANGOS ADECUADOS DE CONCENTRACION

Es muy difícil medir la concentración de las soluciones con exactitud por
espectrofotometría, ya que en algunos casos la intensidad de radiación transmitida I, es muy
pequeña, mientras en otras es muy alta. En la práctica, I debe de estar entre el 10% y el 90%
de Io (es decir, la absorbancia debe de estar entre 1.0 y 0.05), pero las medidas más seguras
se realizan cuando I » 50% de Io (es decir, absorbancia = 0.3). Estas condiciones pueden
conseguirse modificando la concentración del compuesto, el espesor de la célula o cambiando
la longitud de onda de la radiación (es decir, variando E). El primer procedimiento es el que se
realiza con más frecuencia.
4. CALCULO DE LA CONCENTRACION DE UNA MUESTRA PROBLEMA

Existen tres formas de cálculo.
4.1. Mediante el factor de calibracion (Fc). Resulta de dividir la concentración del estándar
entre la absorbancia del estándar:
15
el factor obtenido se multiplica por la lectura o absorbancia del o de los tubos que contienen la
solución problema, obteniéndose así la concentración de la muestra o muestras. Para
expresar la concentración en porcentaje, se toma en cuenta el volumen utilizado 100/V.
Según la Ley de Beer - Lambert tenemos que:
donde:
Ast = absorbancia del estándar o patrón
Am = absorbancia de la muestra problema
Cst = concentración del estándar o patrón
teniendo en cuenta que el espesor X es constante y que la tratarse de soluciones de la misma

sustancia el coeficiente de extinción K, será el mismo. Relacionando las dos expresiones
tenemos:
despejando:
Ya que tanto la lectura del problema como del patrón son equivalentes a la absorbancia,
se tiene:
Nótese que Cst / Ast es un constante y puede usarse como un factor sobre todo cuando
se va a determinar la concentración de una serie de muestras. Por tanto, la ecuación anterior
se puede reducir a :
donde: Fc = factor de calibración (Fc = Cst/Ast); esta expresión referida a porcentaje se

escribe:
v = volumen de la muestra utilizada para la determinación.
4.2. Mediante curvas de calibración. En este caso se utilizan varios patrones de

concentraciones progresivas y un blanco (el blanco contiene todos los componentes de la
muestra menos la sustancia a determinar). Luego se realiza la lectura (de absorbancia)
usando el filtro o la longitud de onda para la cual la sustancia tiene la máxima absorción. Se
registra el valor de absorbancia en una tabla.
Luego se construye una gráfica en un sistema de coordenadas, colocando las lecturas

correspondientes a los patrones en el eje de las "y" (eje de ordenadas) y las concentraciones
de los mismos en el eje de las "x" (eje de abscisas), con lo cual se obtiene una recta, que pasa
por cero si la sustancia obedece la ley de Beer-Lambert.
La muestra problema dará una lectura o absorbancia determinada que se busca en el

eje de las ordenadas de la gráfica anterior, luego por este punto se traza una perpendicular a
16
dicho eje hasta encontrar la curva (trazada con la lectura y concentración de los patrones). En
seguida, por este punto de intersección se traza una paralela al eje de ordenadas hasta tocar
el eje de abscisas (eje de concentración). Por lo tanto, la concentración de la muestra
problema está dada directamente por este punto del eje de abscisas.
En la curva de calibración puede observarse que hay una parte de la curva dentro de la
que se cumple perfectamente la ley de Beer-Lambert, es la parte recta que corresponde a una
función lineal. Sin embargo, puede también aplicarse a valores superiores por extrapolación
siempre que las desviaciones con respecto a la recta no sean muy grandes. Además el uso de
la gráfica elimina los errores que podrían aparecer como consecuencia del uso del cálculo de
proporcionalidad en una región donde no se cumple la ley de Beer-Lambert. Esto último
corrobora la norma general que preconiza el uso de soluciones patrón para las comparaciones
colorimétricas cuyas densidades ópticas sean lo más cercanas posible al valor del problema.
4.3. Mediante la ecuación A = Ecx. Ecuación obtenida de la combinación de las leyes de

Beer-Lambert (en la que x es un valor constante por ser los tubos uniformes, o por usarse una
sola cubeta para hacer la lectura). Para esto se calcula una E relativa mediante , para
los patrones, (los valores hallados deben ser iguales si la sustancia cumple la ley de Beer).
El coeficiente de extinción debe mantenerse constante para un intervalo de

concentraciones de patrones y problemas. Una vez obtenido un valor E, la concentración de la
muestra se determina mediante la ecuación que sigue:
5. ESPECTROS DE ABSORCION. Se llama espectro de absorción a la gráfica que

representa la absorbancia en función de la longitud de onda. Muchos compuestos
contienen espectros característicos de absorción en la región visible y ultravioleta, lo cual
hace posible la identificación de dichos materiales en una mezcla.
Figura 1.
Espectros de
Absorción del
naftaleno,
antraceno y
tetraceno
6. VALORACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS. El curso de una reacción química o la

posición de un equilibrio pueden determinarse en forma rápida con un espectrofotómetro si
puede medirse la absorción de uno de los componentes. Como ejemplo tenemos las
curvas de valoración de los indicadores:
17
donde las formas protonizadas o no protonizadas (o ambas) son coloreadas. Los máximos de
absorción para las dos formas suelen estar separados, por lo que se puede medir la
concentración de cualquiera de las formas. Si se disuelven cantidades iguales del indicador en
tampones de diverso pH y se mide la absorbancia en uno de los máximos de absorción, se
puede calcular el pK. La determinación espectrofotométrica del pK es el mejor método. El pK
se debe determinar a diversas concentraciones para comprobar las desviaciones de la ley de
Beer.
7. ESPECTROFOTOMETRIA Y ENZIMAS. Por las grandes ventajas de comodidad,

sensibilidad, amplio espectro espectral y una selección fina de longitud de onda, el
espectrofotómetro se utiliza en enzimología, principalmente, en tres tipos diferentes de
determinaciones: a) se puede determinar la concentración de un compuesto midiendo la
densidad óptica a una longitud de onda bajo condiciones en que no ocurran cambios y
suponiendo que el coeficiente de extinción del compuesto es conocido; b) se puede seguir
el curso de una reacción en un sistema completo de ensayo, midiendo la velocidad de
formación o desaparición de un compuesto absorbente de luz. Para este tipo de medidas
se dispone de espectrofotómetros que representan gráficamente la densidad óptica frente a
tiempo; c) un tercer tipo de medida interesante para la identificación de compuestos
requiere la determinación de la densidad óptica en función de la longitud de onda. También
este caso se dispone de instrumentos que trazan la curva automáticamente.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. ESPECTROS DE ABSORCION Y LONGITUD DE MAXIMA

ABSORBANCIA DE ALGUNAS MOLÉCULAS.
OBJETIVO:
2+
 Realizar la curva espectral del rojo de fenol, complejo Cu -proteína, y SBA
2+
 Determinar la longitud de onda de máxima absorbancia del rojo de fenol, complejo Cu -
proteína, y SBA
FUNDAMENTO
Si se mantiene constante el espesor (x) y la concentración (c), la absorbancia (A)
dependerá de la longitud de onda (λ); esto permite hallar la curva espectral, así como la
longitud de onda de máxima absorción de las diferentes moléculas.
Puesto que los compuestos coloreados presentan espectros de absorción

característicos, la selección cuidadosa de las longitudes de onda de máxima absorción
permitirá analizar los componentes de las sustancias.
MATERIAL
Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas
-4
Solución de rojo de fenol 1 x 10 M
Reactivo de biuret
Solución de albúmina de suero bovino 1 mg/ml
METODO DE TRABAJO
Calibrar el espectrofotómetro a cero utilizando agua destilada como blanco. Luego,
18
determinar la extinción de cada solución, usando todo el rango espectral del equipo.
Medir en un tubo de ensayo 1 ml de rojo de fenol adicionarle una gota de NaOH y

mezclar.
Medir en un tubo de ensayo 1 ml de SBA
Medir en un tubo de ensayo 0.8 ml de proteína, adicionar 2 ml de agua destilada, 1 ml

de NaOH 6% y 0.2 ml del reactivo de Biuret. Mezclar.
Anote las absorbancias para cada longitud de onda y para cada solución, teniendo
especial cuidado de anotar la longitud de onda de máxima absorbancia
DATOS EXPERIMENTALES
 Rojo de fenol Biuret-Proteína SBA
RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUCIÓN, BIBLIOGRAFÍA

Para obtener los espectros de absorción y la longitud de máxima absorbancia, utilice
papel milimetrado y grafique los valores de absorbancia de cada solución (corregidos para la
19
absorción del disolvente, si se usó otro en vez de agua) en las ordenadas en función de la
longitud de onda que se coloca en las abscisas. Luego unir los puntos con un trazo suave.
Anotar en la gráfica, la longitud de onda de máxima absorbancia para cada solución. Luego
consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las que arriba y la bibliografía
consultada.
EXPERIMENTO N° 2. DEMOSTRACION DE LA LEY DE BEER Y CONSTRUCCION DE

CURVAS DE CALIBRACION
OBJETIVOS
Poner en evidencia la ley de Beer-Lambert haciendo uso de concentraciones
progresivas del rojo de fenol.
FUNDAMENTO
Si se mantiene constante la longitud de onda de máxima absorción, la absorbancia
dependerá de la concentración
MATERIALES
Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas
-4
Rojo de fenol 1x10 M
Buffer borato 0.1 M, pH 9.8
Solución estándar de SBA 2mg/ml
Hidróxido de sodio 6%
Agua destilada
METODO DE TRABAJO
a) Curva de calibración para el rojo de fenol. Prepare un sistema de tubos como se indica a
continuación y lea a 540 nm:
TUBO N° Bl 1 2 3 4 5 6
Buffer borato 0.1 M, pH 9.8 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
-4
Rojo de fenol 1 x 10 M -- 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Agua destilada 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 --
Concentración
Tubo
de Rojo de Ab Fc
N°
Fenol (M)
Bl
1
2
3
4
5
6
b) Curva Estándar para proteínas. Micrométodo de biuret (Brewer y col 1974). Prepare un
sistema de tubos como se indica a continuación e incube por 15 minutos a 37 °C.
Transcurrido este tiempo se lee a 330 nm frente a un blanco apropiado.
20
TUBO N° 1 2 3 4 5 Blanco
Proteína (ml) 0.10 0.30 0.50 1.0 2.0 0.0
Agua destilada (ml) 1.9 1.7 1.5 1.0 0.0 2.0
NaOH 6% (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Reactivo de Biuret (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
[Proteína]
Tubo N Ab Fc
mg/ml
Bl -
1 0.2
2 0.6
3 1.0
4 2.0
5 4.0
RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA

Para obtener las curvas de calibración, utilice papel milimetrado y grafique los valores
de absorbancia en las ordenadas y la concentración del colorante en las abscisas. Debe tener
en cuenta que el tamaño de los ejes en el plano deben ser del mismo tamaño, independiente
de la escala, para obtener una línea recta de aproximadamente 45°. Determinar el factor de
calibración promedio. Luego consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las que
arriba y la bibliografía consultada.
EXPERIMENTO N° 3. DETERMINACION FOTOMETRICA DEL pK DEL ROJO DE FENOL.
FUNDAMENTO:
El rojo de fenol es un ácido débil y la variedad donadora de protones se disocia en
solución, dando un protón y una variedad aceptora de protones:
Amarillo Rojo
Según la ecuación de Henderson-Hasselbalch, tenemos;
Sea igual a la suma de las variedades aceptora y donadora de

protones del ácido, o sea, la cantidad total de ácido existente. Por tanto, .
Reemplazando estos valores en la ecuación se tiene:
Esta es una ecuación de una recta, de tipo y = ax + b, donde b = pK; a = 1; y = pH; x =

- -
log [A ] / [T] - [A ]. Por tanto, si se construye una gráfica con el pH en las ordenadas y los
- -
valores de la expresión log [A ] / [T] - [A ] en las abscisas, tendremos una recta cuya
intersección con el eje vertical representa el pKa. Puede suponerse que en un medio ácido el
-
rojo de fenol no está ionizado, en solución alcalina está totalmente ionizada [A ], y en solución
21
tampón de pH 7.8 (ó 7.6) las dos formas se hallan en igual concentración.
Se ha encontrado que la variedad aceptora de protones presenta un máximo e

absorción cerca de 550 nm. Para esta longitud de onda, la variedad donadora absorbe muy
poca luz, por tanto, podemos aceptar que la absorción total a 550 nm corresponde casi
totalmente a la variedad aceptora. A 550 nm, la absorción de la luz por el rojo de fenol sigue
la ley de Beer-Lambert, o sea: donde se incluye la constante
correspondiente al trayecto luminoso.
Por tanto, si se construye una gráfica poniendo en las ordenadas una serie de valores
-
de absorbancia a 550 nm, para distintas concentraciones conocidas de A , y en las abscisas
los valores de concentración, se obtiene una recta. A partir de esta curva de calibración es
-
posible, midiendo la absorbancia, determinar A en una solución de concentración
-
desconocida, o medir la proporción entre A y AH, en una solución donde se conoce la
-
concentración total del indicador. Si se mide la concentración de A para algunos valores
conocidos de pH, en una solución cuya concentración total del colorante se conoce, se obtiene
una curva que permite deducir el pK del indicador.
MATERIALES
Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas
-4
Rojo de fenol 1x10 M
Buffer fosfato 0.1 M
Agua destilada
METODO DE TRABAJO
El pK del rojo de fenol es aproximadamente 7.8. Prepare el siguiente sistema de tubos:
TUBO N° Bl 1 2 3 4 5 6
Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.2 4.0 4.0 -- -- -- -- --
Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.6 -- -- 4.0 -- -- -- --
Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.8 -- -- -- 4.0 -- -- --
Buffer fosfato 0.1 M, pH 8.0 -- -- -- -- 4.0 -- --
Buffer fosfato 0.1 M, pH 8.4 -- -- -- -- -- 4.0 --
Buffer fosfato 0.1 M, pH 8.8 -- -- -- -- -- -- 4.0
-4
Rojo de fenol 1 x 10 M -- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
- -
[A ] - - - log [A ] /
Tubo Ab [T] - [A ] [A ] / [T] - [A ] - pH
Moles [T] - [A ]
Bl
1
2
3
4
5
6
RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUCIÓN, BIBLIOGRAFÍA

En papel milimetrado se construye una curva del pH en las ordenadas en función del
22
- -
valor correspondiente de log [A ] / [T] - [A ] en las abscisas. Se traza una línea recta por los
puntos experimentales, y se extrapola esta recta hasta el eje vertical. El punto de intersección
de la recta con el eje de pH representa el pK del indicador. Obsérvese que al extrapolar hasta
- -
el eje vertical, queda implícito que a este nivel de esta intersección, log [A ] / [T] - [A ] vale cero.
- -
Por tanto, [A ] / [T] - [A ] debe ser igual a 1 en este punto. Ya se sabe que pH = pK cuando las
variaciones donadora y aceptora de protones de un ácido débil tienen la misma concentración
en la solución. Luego consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las que arriba y la
bibliografía consultada.
CUESTIONARIO
1. Un compuesto presenta un máximo de absorción a 660 nm. Para una concentración 0.75
µM se obtuvo una absorbancia de 0.4. Sabiendo que el límite de sensibilidad del método
utilizado es de 0.1 µM a 3 µM, calcule la concentración de este mismo compuesto
correspondiente a una absorbancia de 0.85.
-5
2. Una disolución de ATP 10 M tiene una transmitancia de 0.702 (70.2%) a 260 nm en una
cubeta de 1 cm de espesor. Calcular a) la transmitancia de la disolución en una cubeta de
-5
3 cm, b) la absorbancia y la transmitancia de una disolución de ATP de 5 x 10 M en una
cubeta de 1 cm.
3. Un filtro óptico permite solamente el paso de la luz roja lejana, con una longitud de onda
media de 6500 Å. Calcular a) la longitud de onda en nm y en cm, b) el número de ondas
-1
en cm , y c) la frecuencia.
4. El coeficiente de absorción específico de un complejo de glucógeno-iodo a 150 nm es

0,20. Calcular la concentración de glucógeno en una disolución del complejo yodado que
tiene una absorción de 0.38 en una cubeta de 3 cm de espesor.
5. Un enzima puro que contiene molibdemo tiene un coeficiente de absorción específico de

1.5 en una cubeta de 1 cm de espesor. Una disolución concentrada de la proteína se vio
que contenía 10,56 mg de Mo/ml. La misma disolución diluida 1:50 tenía un valor de
absorbancia a 280 nm igual a 0.375. Calcular el peso molecular mínimo de la enzima. El
peso atómico del Mo es 95.94.
+
6. Una disolución que contiene NAD y NADH tiene una densidad óptica, en una cubeta de 1
cm de espesor de 0.311 a 340 nm y de 1.2 a 260 nm. Calcular las concentraciones de las
+
formas oxidada y reducida del coenzima en la disolución. Ambos (NAD y NADH)
absorben a 260 nm, pero a 340 nm solo absorbe el NADH. Los coeficientes de extinción
se dan en la siguiente tabla:
COMPUESTO 260 nm 340 nm
NAD 18000 ~0
NADH 15000 6220
23
PRACTICA N° 3
pH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
INTRODUCCION
Los procesos celulares son sensibles a los cambios de pH y se realizan en un medio
cuyo pH está controlado. Por ello, el estudio de los mismos y su reproducción "ïn vitro"
requiere el uso de medios que regulen el pH.
Debido a que el agua constituye más del 50% de la mayoría de los tejidos tanto de
plantas como de animales, las reacciones bioquímicas se verifican en medio acuoso, y la
mayor parte en un medio que se mantiene cercano a la neutralidad. Por lo tanto, es
fundamental conocer a fondo las propiedades de los ácidos y las bases de un sistema
amortiguador.
Puesto que el agua no solo es el componente celular más abundante, sino que tiene
además carácter de compuesto indispensable para la vida, es conveniente hacer notar que
esta sustancia presenta muchas propiedades excepcionales que la facultan para desarrollar su
tarea de solvente de la vida. De estas propiedades, las que permiten explicar el rol biológico
del agua, son las siguientes: punto de ebullición, calor de vaporización y punto de fusión más
alto que los correspondientes a otras sustancias relacionadas (H 2S, etanol, metanol, HF, etc.)
y además, capacidad calórica y calor de fusión elevados.
1. LEY DE ACCION DE MASAS Y EQUILIBRIO QUIMICO

En 1864 GULDBERG y WAAGE establecieron una relación entre la velocidad de una
reacción química y las concentraciones moleculares de las sustancias reactantes, llamada ley
de acción de masas, que dice: "La velocidad de una reacción química en un tiempo dado, es
proporcional a la concentración molecular (moléculas / unidad de volumen) de las sustancias
reactantes presentes en ese tiempo".
Considerando la reacción química reversible siguiente:
donde para la reacción de ida, los reactantes son A y B y los productos que se originan son C
y D. La velocidad para esta reacción será proporcional a las concentraciones moleculares de A
yB
Introduciendo una constante de proporcionalidad (k1) que mida la afinidad química

propia de la reacción, la ecuación anterior puede escribirse:
Para la reacción de vuelta, en forma análoga, se tendrá:
donde k2 es la constante de proporcionalidad que mide la afinidad química de la reacción de

derecha a izquierda.
Cuando la reacción alcanza el equilibrio, las concentraciones de las cuatro sustancias

ya no se modifican, lo que quiere decir que la velocidad de la reacción de ida, se hace igual a
la velocidad de la reacción de vuelta.
24
Por tanto,
lo que también puede escribirse así:
donde K es otra constante, que expresa la relación k 1 /k2 y que se conoce como constante de
equilibrio, que expresa matemáticamente la relación entre las concentraciones de las
sustancias reactantes en el estado de equilibrio. Cuando la constante de equilibrio se aplica a
reacciones de ionización recibe el nombre de constante de ionización.
Aplicación de la ecuación de equilibrio.- El valor numérico de K es específico y

característico para reacción, sea cuales fueren las concentraciones relativas, siempre que la
temperatura se mantenga constante. Cuando K es alta, las concentraciones de C y D son altas
en el equilibrio en relación a las concentraciones de A y B, indicando que la afinidad entre A y
B es grande y que la reacción hacia la derecha predominará. Por otro lado, un valor pequeño
de K, indica un predomino de la reacción hacia la izquierda y una afinidad grande entre C y D.
2. ACIDOS Y BASES
2.1. DEFINICIONES.- Por costumbre se define a un ácido como aquella sustancia que en
+
solución aporta hidrogeniones (H ) al medio y base aquella que al disolverse da iones oxidrilos
-
(OH ).
El concepto moderno de ácidos y bases de BRÖNSTED, LOWRY y otros, define un

ácido como un donador de protones y una base como un aceptor de protones. Por lo tanto,
cada ácido tiene una base conjugada.
El concepto de BRÖNSTED es idéntico al concepto clásico en lo que se refiere a los

+
ácidos, puesto que un protón es lo mismo que un hidrogenión H (es decir un átomo de
hidrógeno sin su electrón orbitario) pero es muy diferente en lo que se refiere a las bases.
De acuerdo con esta teoría, un ácido se disocia en un protón y una base. Esta última
puede regenerar al ácido al reaccionar con un protón. Un ácido y su base se llaman
conjugados.
ALCALI.- El término álcali se reserva para aquellos compuestos que al disociarse generan
iones hidroxilo:
Se comprende fácilmente que las bases clásicas, como el KOH, NaOH, etc. no pueden
ser consideradas como tales según la teoría de BRÖNSTED puesto que no aceptan protones;
+ - -
sin embargo funcionan como bases porque al disociarse en K y OH , el grupo oxidrilo OH ,
+
que es la verdadera base, acepta un protón H para formar H2O. Es decir, el ion OH- es base
pero la molécula de KOH no lo es.
ANFOLITOS.- Son especies iónicas que pueden actuar como ácidos y como bases; por
ejemplo el agua y los aminoácidos (Tabla N° 1). Se dice también que son anfóteros.
Aún cuando es cómodo escribir el equilibrio ácido-base en la forma indicada arriba, el

protón no existe como tal sino que está solvatado. Por ejm. en medio acuoso el hidrogenión
25
+
existe como hidronio (H3O ).
TABLA N° 1. EJEMPLOS DE ACIDOS Y BASES BRÖNSTED

ACIDO BASE CONJUGADA
+ -
HCl H + Cl
+ -
CH3COOH H + CH3COO
+ + +
NH4 H + NH3
+ -
H2CO3 H + HCO3
+ —
HCO3 H + CO3
+ -
H2O H + OH
+ +
H3O H + H2O
2.2. FUERZA DE ACIDOS Y BASES.- Se deben distinguir dos términos: concentración que es
la cantidad de ácido o base disuelto en un determinado volumen de agua (mol / litro) y fuerza
de un ácido o una base es la medida de la efectividad con que un compuesto se comporta
como ácido o como base.
2.2.1. Fuerza de un ácido.- La fuerza de un ácido esta dada por su capacidad para ceder
protones. Por ejemplo, los ácidos clorhídrico y nítrico se disocian casi completamente en
solución acuosa y por l o tanto serán ácidos fuertes. Por el contrario, los ácidos acético y
fórmico, que están solo ligeramente disociados en solución, serán ácidos débiles. De otro lado,
se considera que un ácido es fuerte cuando tiene una constante de equilibrio superior a 10-2
(Ka mayor que 10-2). O en otras palabras, puesto que pKa = - log Ka, es evidente que cuanto
menor es el valor de pKa de un ácido, más fuerte es el mismo (Ka = constante de disociación
de un ácido).
Acidos fuertes:
Acidos débiles:
2.2.2. Fuerza de una base.- La fuerza de una base está dada por la magnitud en que se
disocia en solución acuosa para dar lugar a iones hidroxilo o por la capacidad para aceptar
protones. Por ejemplo, el NaOH y el KOH que están completamente ionizados en solución
-
acuosa (de manera que la concentración de OH es la misma que la de la base), son bases
fuertes y tienen alta afinidad por los protones. Por el contrario, la anilina que esta sólo
ligeramente disociada en solución, será una base débil; tiene escasa afinidad por los protones
-
(Ejm. el Cl del HCl):
-12
Se considera bases fuertes aquellas que tienen una constante de equilibrio superior a 10
-12
(Kb mayor de 10 ).
La capacidad del solvente de combinarse con el hidrogenión afecta la capacidad de

disociación de un ácido o una base y así, un mismo compuesto puede actuar como un ácido
débil en un solvente y como ácido fuerte en otro.
26
Es importante, también, señalar que la fuerza de un ácido depende de qué tan fuerte es
su base conjugada, así como de la constante dieléctrica del medio. En un ácido fuerte, como
-
el HCl, su base conjugada (base débil, Cl ) tiene escasa afinidad por los protones, prefiriendo
estos combinarse con el solvente y determinar un alto grado de disociación del ácido.
En el caso de los ácidos débiles sus bases conjugadas (base fuerte) tienen gran
afinidad por los protones, prefiriendo estos seguir combinándose con el solvente y determinan
un escaso grado de disociación del ácido.
3. CONCENTRACION DE IONES HIDROGENO Y pH

3.1. DEFINICION DE pH.- La concentración de iones hidrógeno da el grado de acidez de una
solución, de allí que la forma más racional de expresar la acidez de una solución sea en
función de la concentración de hidrogeniones expresada en normalidad, es decir, en
equivalentes gramo de hidrogeniones/litro. Por ejm., una solución con 1 g. de
hidrogeniones/litro, tendrá una acidez 1 N. Sin embargo, en los líquidos biológicos las
concentraciones de hidrogeniones son muy bajas y su manejo es fastidioso y expuesto a
errores y difíciles de memorizar; así la concentración de hidrogeniones en el plasma es de
0.0000000389 N. Si omitimos un solo cero, la concentración de hidrogeniones se alterará 10
veces.
Por estas consideraciones, Sörensen en 1909 introdujo el término pH (potencial de

hidrogeniones) como una forma adecuada de expresar la concentración de hidrogeniones,
utilizando solo el exponente con signo positivo. Así, una solución con una concentración
0.0000001 de hidrogeniones, en vez de escribir esa cifra, Sörensen propuso escribirla como
-7
10 y utilizar solo el exponente con signo positivo, es decir 7 como la medida de iones
hidrógeno.
El pH se define entonces, como el logaritmo negativo de la actividad de hidrogeniones,

pero en la práctica se le denomina concentración de hidrogeniones, ya que la concentración y
la actividad son prácticamente las mismas, excepto en soluciones fuertemente ácidas.
Ejm. La concentración de hidrogeniones del plasma es 0.0000000398 N. Esta cantidad puede

-10
escribirse, también, de esta otra forma 398 x 10 . Por lo tanto el pH del plasma será:
3.2. DISOCIACION DEL AGUA

3.2.1. Derivación de Kw.- El agua purísima prácticamente no es conductora, pero en realidad
tiene una pequeñísima conductividad, reveladas por las medidas de conductividad. Esta débil
+ -
conductividad indica que el agua debe estar ligeramente disociada en iones H y OH .
+
Sin embargo, puesto que el H (el protón) está hidratado, podemos escribir más
correctamente como:
+ +
(el H3O se conoce como ion "hidronio"). El propio H3O se halla hidratado mediante el
27
+
establecimiento de más enlaces de hidrógeno formando el ion H 3O4 .
La pequeña disociación del agua se debe a que el átomo de hidrógeno tiene una masa
pequeña, y a que su único electrón se halla fuertemente retenido por el átomo de oxígeno. Por
esto el átomo de hidrógeno difícilmente puede disociarse del átomo de oxígeno al que se halla
unido covalentemente en una molécula de agua y "saltar" al oxígeno de la molécula de agua
adyacente a la cual se halla unido por enlace de hidrógeno. En esta reacción se producen dos
+ -
iones el ion hidronio (H3O ) y el ion hidroxilo (OH ).
-7 +
En un litro de agua pura, a 25 °C, existen solo 1 x 10 mol de iones de H3O y una
-
cantidad igual de iones OH , según muestran las medidas de conductividad eléctrica. El agua
destilada común contiene impurezas que la hacen mucho más conductora. Una buena agua
destilada, recientemente obtenida por destilación con contacto del aire, puede tener una
-6
conductividad específica de 0.7 x 10 l/ohm cm (esto es 20 veces mayor que el valor mínimo
-6
hallado 0.038 x 10 l/ohm cm).
La constante de equilibrio para la disociación del agua está dada por:
Como un litro de agua pura contiene 55.5. moles de agua (1000/18 = 55.5) esto es,
número de gramos de agua en un litro dividido por el peso molecular gramo) y solo 0.0000001
-7
mol (= 1 x 10 a 25 °C) se halla disociado, es natural que podrían variar enormemente los
+ -
valore de [H ] y [OH ] sin que la [H2O] se altere perceptiblemente. Por ejm., si la concentración
de estos iones aumentara en 1'000,000 de veces, los moles de agua no disociados por litro
descendería de 55.5 55.4. De manera que sin incurrir en error apreciable, se admite que la
concentración de las moléculas (H2O) es constante y su actividad es 1. Según esto, la
constante de equilibrio para el agua puede escribirse:
y el término [55.5][K] puede sustituirse por una constante "global" Kw llamada producto iónico
del agua, entonces:
En el agua pura puesto que al disociarse el agua

produce iguales cantidades de ambos iones (neutra) como será también
-14
, de donde se deduce que para el agua pura a 25 °C el producto iónico es 10 .
-14 -7 -7 + -
Puesto que 10 = 10 x 10 , se comprende que al aumentar la [H ] la [OH ] debe
+ -3
disminuir y viceversa. Por ejm., si al agua pura añadimos HCl hasta aumentar la [H ] a 10 , la
- -11
[OH ] disminuirá a 10 , así:
Para evitar dificultades en el uso de números decimales, aplicando los logaritmos

negativos correspondientes, tenemos:
28
donde se observa que el producto de la igualdad se convierte en una suma y así, al tomar el
logaritmo negativo:
y para el ejemplo:
+
En conclusión, la suma de los logaritmos negativos de las concentraciones de iones H
-
y OH en una solución acuosa es una constante de valor 14 a 25 °C. Así el pH del agua pura a
25 °C es 7 (neutra).
3.2.2. Temperatura y Kw.- El pH neutro no es 7 a cualquier temperatura, puesto que Kw

cambia con la temperatura y otros factores. Por ejm., el cambio de temperatura de 37 °C a 40
+ -
°C, causa un incremento de 8% en iones H y en iones OH . Esto indica que cualquier
elevación o descenso de la temperatura puede producir un cambio biológico profundo en los
+
organismos vivos sensibles a la [H ] (Tabla N° 2).
TABLA N° 2. PRODUCTO IONICO DEL AGUA Y pH DE NEUTRALIDAD A DIFERENTES

TEMPERATURAS
°C Kw pH de neutralidad
-14 -14.94
0 0.12 x 10 = 10 7.97
-14 -14.00
25 1.03 x 10 = 10 7.00
-14 -13.60
37 2.51 x 10 = 10 6.80
-14 -13.53
40 2.95 x 10 = 10 6.77
-14 -12.77
75 16.90 x 10 = 10 6.39
-14 -12.32
100 48.00 x 10 = 10 6.16
4. MEDICION DEL pH
El pH puede determinarse por mediciones catalíticas, espectrofotométricas, de la
tensión superficial y de la conductividad. Pero estos procedimientos no se usan. En cambio
describiremos los métodos colorimétricos y electrométricos.
La determinación del pH es uno de los procedimientos analíticos más importantes y

utilizados en bioquímica, ya que el pH determina muchas características de la estructura y la
actividad de las macromoléculas biológicas y, por tanto, de la conducta de las células y de los
organismos.
4.1. METODOS COLORIMETRICOS.- Si se desea tener una medida aproximada del pH de

una solución se puede usar los llamados indicadores.
4.1.1. Teoría de los Indicadores.- Los indicadores son base o ácidos débiles cuyo color
depende del pH de la solución. Este otro.
Si se considera el indicador como un ácido, como sucede con los compuestos nitrados,
+
fenolftaleína, etc., al disociarse en una solución acuosa, desprenderá iones H :
y según la ley de acción de masas:
29
Si usamos la ecuación de Henderson-Hasselbalch, como para cualquier ácido débil:
Cada indicador tiene su constante de disociación Kin y su (-logKin)pKin. Cuando el pH de

-
la solución es igual al pKin del indicador, la relación [I ]/[HI] es igual a 1, por lo tanto existen en
igual medida los dos colores.
Las dos formas del indicador tienen colores diferentes y como parecerá claro al
observar la última ecuación, el color de la solución dependerá del pK in y del pH. El mayor
cambio de color se obtiene alrededor del pKin y este es el intervalo de pH donde el indicador
es más útil. Por ejm., si un solución tiene un pH aproximado de 6, entonces el púrpura de
bromocresol, que tiene un pKin de 6, es el mejor indicador para el caso. Pero debido a que el
cambio de color ocurre en un rango amplio de pH, los indicadores tan solo dan una medida
aproximada del pH. Otra desventaja de los indicadores se debe a que son afectados por
agentes oxidantes, agentes reductores, concentraciones de sal y de proteína. Además, al
usarlos, se debe agregar solo pequeñas cantidades a la solución que se examina, o de lo
contrario, el equilibrio ácido-base de la muestra puede desplazarse y el pH cambiar.
El uso más importante de los indicadores es la determinación del punto final de una
titulación.
En las titulaciones, se selecciona un indicador que cambie de color en el punto de

equivalencia, el cual, depende de la titulación que se efectúa. Por ejm., cuando se titula ácido
acético con NaOH el ácido es transformado totalmente en sal alrededor de pH 9; por l tanto
debe usarse fenolftaleína como indicador. En la misma forma, el rojo de metilo se usa cuando
se titula amoniaco con HCl, puesto que el punto final de titulación es pH 5.
En la Tabla N° 3 se consignan los indicadores más usados, sus valores de pK in y los

límites de pH entre los que se produce el cambio de color. Los límites de viraje de un indicador
determinan la llamada zona útil o zona de viraje, que corresponde a dos colores diferentes que
evidencian el predominio de la forma ácida o alcalina del colorante para un determinado pH.
Como ya se menciona, la zona de viraje varía según los colorares, puesto que la constante de
disociación pKin varía según su naturaleza. Comparando el color obtenido con la solución
desconocida con el color "estándar" correspondiente, se tiene el pH de la solución
desconocida.
En la práctica, se cuenta con series de colorantes para la determinación del pH, como la
propuesta por Clark y Lubs que permite el estudio de sustancias cuyo pH estén comprendidos
entre 1 y 10; los colorantes de la serie de Clark y Lubs son derivados de la Sulfonaftaleína y
son amarillos del lado ácido, y rojos o azules del lado alcalino. Los colorantes de la serie de
Michaelis son monocromáticos, es decir, va del incoloro al coloreado, o viceversa, y
comprenden colorantes nitrados o fenolftaleína.
+
El pH aproximado de una solución cuya concentración de iones H es totalmente
desconocida, se puede determinar con el llamado indicador universal o de Bogen, que es una
mezcla de varios colorantes, los cuales, a medida que el pH aumenta en la solución de
estudio, van apareciendo los colores como del espectro. Así; pH 2, rojo; pH 4, anaranjado; pH
6, amarillo; pH 8, verde; pH 10, azul; pH 12, violeta. Una vez establecido el pH aproximado de
la solución, se recurre al colorante de la serie de Clark o de Michaelis cuyo viraje se produce
en esa zona y de esta manera se puede precisar más exactamente el pH de la solución.
La determinación del pH utilizando soluciones buffer, consiste en comparar el color que
30
toma el indicador el la solución cuyo pH se quiere conocer, y el color que toma este mismo
indicador agregado a soluciones buffer, como por ejm., del tipo de McIlvaine, de pH conocido.
El pH de las soluciones buffer se determina exactamente mediante el método electrométrico.
Papeles impregnados con determinados indicadores toman las coloraciones

correspondientes cuando se mojan en la solución cuyo pH se quiere conocer. El tono
adquirido por el papel depende del pH de la solución y se puede comparar con los colores
estándar que llevan los tubos portapapeles. Los papeles a utilizar deben variar dentro del pH
de la solución. Así, por ejm., el papel impregnado con rojo de fenol cuya zona de viraje está
entre 6.8 y 8.4 permite determinar el pH de una solución comprendido dentro de estos valores.
4.1.2. Errores del Método Colorimétrico.- La adición de un colorante a una solución puede
modificar el pH de esta, dada la naturaleza ácida o básica del indicador y por la presencia de
sales o proteínas que modifican su viraje.
En las soluciones coloreadas o turbias, la coloración que da el indicador no es la misma

que en una solución clara e incolora; por ello, en tales casos se usan comparadores; es decir,
cajas especiales donde se disponen los tubos que contiene la solución de pH desconocido,
una solución coloreada estándar y el agua. La turbiedad o el color del medio que se ensaya se
superponen en los tres campos de visión, y por sustitución de los tubos de colores estándar se
llega a un tono que coincide con el tubo central y que establece su pH.
El método colorimétrico no es rigurosamente exacto, y su precisión es de 0.1 pH, que

puede llegar a 0.03 pH si se procede con técnicas cuidadosas.
TABLA N° 3. INDICADORES DE pH
INDICADOR PKin LIMITES DE CAMBIO DE COLOR

pH Acida Alcalina
Violeta de metilo 0.8 0.1 - 1.5 Amarillo Azul
Rojo cresol ácido 1.0 0.2 - 1.8 Rojo Amarillo
Púrpura de metacresol 1.5 0.5 - 2.5 Rojo Amarillo
Azul de timol 2.0 1.2 - 2.8 Rojo Amarillo
Tropeolina 2.2 1.3 - 3.0 Rojo Amarillo
Violeta de metilo 2.4 1.5 - 3.2 Azul Violado
Amarillo de metilo 3.5 2.9 - 4.0 Rojo Amarillo
Azul de bromofenol 3.8 3.0 - 4.6 Amarillo Azul
Anaranjado de metilo 3.4 3.1 - 4.4 Rojo Amarillo
Rojo congo 4.1 3.0 - 5.2 Azul Rojo
Verde de bromocresol 4.7 3.8 - 5.4 Amarillo Azul
Azul de bromocresol 5.0 4.2 - 5.8 Amarillo Azul
Rojo de metilo 5.2 4.2 - 6.2 Rojo Amarillo
Tornasol 6.4 4.5 - 8.3 Rojo Azul
Rojo de clorofenol 5.9 5.1 - 6.7 Amarillo Rojo
Púrpura de bromocresol 6.0 5.2 - 6.8 Amarillo Azul
Azul de bromotimol 6.8 6.1 - 7.7 Amarillo Azul
Rojo de fenol 7.6 6.8 - 8.4 Amarillo Rojo
Rojo de cresol 8.0 7.2 - 8.8 Amarillo Rojo
Púrpura de metacresol 8.2 7.4 - 9.0 Amarillo Violeta
Azul de timol 8.8 8.0 - 9.6 Amarillo Azul
Fenolftaleína 9.1 8.2 - 10.0 Incoloro Rojo
Amarillo de alizarina 11.3 10.4- 12.2 Amarillo Rojo
Sulfo naranja 11.8 11.0 - 12.6 Amarillo Naranja
Carmín de índigo 12.8 11.6 - 14.0 Azul Amarillo
31
TABLA N° 4. COMPOSICION DE LOS INDICADORES UNIVERSALES I Y II
INDICADOR CANTIDAD (g)

I II
Azul de timol 1.0 -

Azul de bromotimol 0.8 0.4
Dimetilaminoazobenceno 0.6 -
Rojo de metilo 0.4 0.2
Fenolftaleína 0.2 0.8
Alcohol etílico 1000.0 1000.0
TABLA N° 5. COLORACION DE LOS INDICADORES UNIVERSALES I Y II
INDICADOR I INDICADOR II
pH COLOR pH COLOR
1 rojo 4 rojo
4 naranja 5 naranja
6 amarillo 6 amarillo
8 verde 7 verde
10 azul 8.5 azul
10.0 violeta
4.2. METODO POTENCIOMETRICO.- Es el método más conveniente y confiable para medir

el pH. Requiere de un instrumento llamado potenciometro o pHmetro, que permite determinar
la concentración de iones hidrógeno midiendo la fuerza electromotriz (f.e.m.) de una celda
formada por un electrodo de referencia, la solución problema, y un electrodo de vidrio sensible
a hidrogeniones (Fig. 1).
Fig.1. Sistema de electrodos

para medición de pH
32
Un pHmetro de lectura directa, consta de dos electrodos:

a) El electrodo de referencia externa, el más usado es el electrodo de calomel; en este, la
solución acuosa que está en contacto con mercurio metálico y cloruro de mercurio sólido se
halla saturada con cloruro de potasio.
b) El electrodo de referencia interna, es el de vidrio, específicamente de membrana de vidrio.
Consta de un bulbo de vidrio especial de paredes muy finas sensibles a la actividad del ion
hidrógeno, que se halla soldado a un tubo de vidrio ordinario. En el interior del bulbo se halla
un alambre de plata recubierto de cloruro de plata, sumergido en una solución de HCl 0.1 M.
El tubo de vidrio se halla lleno de una resina que sirve para el contacto eléctrico con el circuito
externo.
La membrana de vidrio consta de dos capas de vidrio concéntricas hidratadas: externa e

interna que encierran una capa de vidrio seca.
4.2.1. Electrodo de Vidrio.- Este electrodo en combinación con el de calomel, al ser

introducido en la solución problema proporciona una celda galvánica útil para las mediciones
prácticas de pH; el esquema de una celda es el siguiente:
Cada línea vertical indica un límite de fases a través del cual se desarrolla una fuerza
electromotriz total constituida por 5 partes a la que se suma un potencial de asimetría. Los
diferentes potenciales son los siguientes:
1. El potencial del electrodo Ag - AgCl
2. El potencial entre la solución de HCl en el interior del electrodo de vidrio y la pared interna
de la membrana.
3. El potencial entre la pared externa de la membrana de vidrio y la solución de pH
desconocido.
4. El potencial de contacto líquido entre la solución de pH desconocido y el electrodo de
calomel saturado.
5. El potencial del electrodo de calomel saturado y el potencial de asimetría.
Los potenciales 1, 2 y 5 son invariable, debido a que la composición de la solución en el

interior del electrodo de vidrio se mantiene constante y la f.e.m. del electrodo de calomel tiene
un valor fijo.
El desplazamiento de la f.e.m. total observado en la celda galvánica, cuando se

introduce una solución de pH desconocido se debe a las variaciones de los potenciales 3,4 y
asimétrico.
El potencial del electrodo de vidrio (Ev) en relación con el electrodo de referencia

externa (Eref), se relaciona con el pH en la siguiente ecuación:
33
La respuesta del electrodo de vidrio debe calibrarse frente a soluciones amortiguadoras

de pH conocido, como las de la Tabla N° 6.
TABLA N° 6. SOLUCIONES DE pH CONOCIDO PARA LA CALIBRACION DE UN

MEDIDOR DE pH
SAL
pH A 25 °C pH A 37 °C
1. Tartrato monobásico de potasio saturado 3.56 -

2. Ftalato monobásico de potasio 0.05 M 4.01 4.02
3. Fosfato de potasio monobásico 0.025 M
Fosfato de sodio dibásico 0.025 M 6.86 6.84
4. KH2PO4 0.0087 M
Na2HPO4 0.304 M 7.41 -
5. Tetraborato sódico (bórax) 0.01 M 9.18 9.06
4.2.2. Cuidados del Electrodo de Vidrio.- Debe ser lavado bien después de cada
determinación de pH, especialmente después de trabajar con soluciones de proteínas, pues
estas, al adsorberse en la superficie de la membrana de vidrio causan serios errores. Otro
motivo de errores puede presentarse por deshidratación parcial de las soluciones no acuosas
sobre la membrana de vidrio, lo que determina cambios en la diferencia de potencial. Las
soluciones amortiguadoras se deben agitar vigorosamente durante las mediciones, a fin de
evitar que se forme una delgada capa de solución en la interfase entre el vidrio y la solución.
5. pH DE ACIDOS, BASES Y SOLUCIONES SALINAS

5.1. pH DE ACIDOS FUERTES Y DE BASES FUERTES.- Los ácidos fuertes, como el HCl, en
disolución acuosa se ionizan completamente, por tanto, la concentración de hidrogenión es
igual a la concentración del ácido. En consecuencia sus valores de la constante de disociación
(Ka) se aproxima al infinito y todos tiene una fuerza aproximadamente igual. El pH de una
disolución acuosa de un ácido fuerte, es el logaritmo negativo de su concentración.
El pH de una solución 1N de ácido monobásico fuerte es cero y la solución aumenta en

una unidad de pH por cada décuplo de dilución del ácido.
Similarmente, las bases fuertes tales como NaOH, se ionizan completamente en

solución y por tanto la concentración del ion OH- es igual a la concentración de la base. El pH
de una solución 1 N de una base monobásica es 14, y el pH decrece e una unidad por cada
décuplo de dilución. El pH se calcula según la siguiente ecuación:
5.2. pH DE ACIDOS Y BASES DEBILES.- Los ácidos débiles se disocian solo en pequeñas
+ -
proporciones en las soluciones muy diluidas. El grado de ionización y la [H ] y la [OH ] están
determinados por su constante de ionización. El pH de los ácidos débiles está dado por:
34
o puede calcularse el pH a partir de:
donde:
C = Concentración total del ácido
Y el pH de las bases débiles se calcula a partir de:
el pH de una solución 1 N de base débil = 14 - pKb/2, decreciendo e una unidad de pH por

cada céntuplo (cien veces) de dilución de la base. De igual modo el pH = pKa/2 para una
solución 1 n de un ácido débil monobásico y el pH aumenta en una unidad por cada cien
veces de dilución del ácido.
5.3. pH DE SOLUCIONES SALINAS.- Los iones de iones de ácidos y bases débiles

reaccionan con el agua para formar el ácido o la base no disociados. Esto altera la
concentración de iones H+ del agua y a menudo las soluciones salinas no poseen pH 7.
5.3.1. pH de Sales de Acido Fuerte y de Base Fuerte.- Estas soluciones salinas, como la de
NaCl, dan reacción neutra con el tornasol. Ninguno de los iones presentes reacciona con el
agua y por tanto la concentración del ion hidrógeno del agua permanece inalterada (pH 7).
5.3.2. pH de Sales de Acido Fuerte y Base Débil.- Estas soluciones salinas, como la
solución de NH4CL, dan reacción ácida con el tornasol. El catión reacciona con el agua y
forma l base débil no disociada; esto causa un exceso de iones H + en la solución.
Si consideramos una solución de una sal formada a partir de un ácido fuerte y una base
débil. Por ejm., la solución de NH4Cl:
(KH = constante de hidrólisis. El agua es constante por eso se le omite).
35
ésta ecuación da el pH de una solución de sal formada a partir de un ácido débil y una base
débil.
El pH de este tipo de soluciones salinas se incrementan en una unidad de pH por cada

céntuplo de dilución de la sal
5.3.3. pH de Sales de Base Fuerte y Acido Débil.- Estas soluciones salinas, como el acetato
de sodio, dan reacción alcalina con el tornasol. El anión experimenta hidrólisis para formar el
-
ácido débil no disociado; esto causa un exceso de iones OH en la solución.
El pH de una solución de una sal formada a partir de un ácido débil y de una base fuerte
está dado por:
EL pH de este tipo de soluciones salinas decrece e una unidad de pH por cada céntuplo
de dilución de la sal.
5.3.4. pH de Sales de Acido Débil y de una Base Débil.- Estas soluciones salinas, como el
NH4CN, pueden dar reacción neutra, ácida o alcalina con el tornasol. Tanto el anión como el
catión experimentan hidrólisis, el grado de la cual depende de la fuerza relativa del ácido y de
la base a partir de los cuales se deriva la sal. Si Ka = Kb, la solución dará reacción neutra; si
Ka > Kb, la solución salina tendrá pH menor de 7; a la inversa se Ka < Kb, la solución salina
tendrá un pH mayor de 7.
El pH de una solución de una sal formada a partir de un ácido débil y de una base débil
está dado por:
El pH de este tipo de soluciones salinas es independiente de la concentración.
6. CURVAS DE VALORACION
Si se va añadiendo poco a poco una base, a una solución de ácido, el pH de la solución
se incrementará con cada adición de base. Si se representa gráficamente el pH en función de
la cantidad de base añadida, se produce una subida brusca en el punto de equivalencia; en el
que el ácido está neutralizado exactamente.
La región de subida brusca se llama punto final y el conjunto del proceso de adición de
la base y determinación del punto final se llama valoración. El diagrama que representa la
variación del pH durante la valoración se llama curva de valoración. En la figura 2 se ha
dibujado diversas curvas de valoración de 20 ml de algunos ácidos 0.1 N, con NaOH 0.1 N.
Obsérvese que aunque el punto final se produce exactamente al añadir 20 ml de NaOH, las
curvas difieren en su forma y también en el pH del punto final. La curva tiene s subida más
brusca en la valoración de un ácido fuerte (HCl) con una base fuerte (NaOH) y menos brusca
en la valoración de un ácido débil (CH3COH) con base fuerte (NaOH).
6.1. NEUTRALIZACION DE UN ACIDO FUERTE CON UNA BASE FUERTE.- La naturaleza

del proceso de neutralización, se entiende mejor por la forma en que cambia el pH cuando se
titula una disolución acuosa de ácido fuerte (HCl) con una base fuerte NaOH). El NaOH actúa
-
con una concentración equivalente de iones OH . Por lo tanto, la interacción del HCl con el
NaOH puede representarse por:
36
Los productos de la neutralización son el ácido excesivamente débil H 2O y la base

-
infinitamente débil Cl . Por tanto, la neutralización será completa, ya que la reacción inversa
ocurrirá en una magnitud no significativa y la ecuación de neutralización será:
Esto indica que:

1. Cuando se haya añadido menos de una cantidad equivalente de NaOH la concentración de
+
iones H será igual a la concentración de HCl que queda sin neutralizar, ya que el HCl está
completamente disociado en agua.
2. En el punto de equivalencia, el pH de la mezcla será 7, ya que contiene además de agua,
+ -
solo iones Na y Cl que son insignificantemente ácidos o básicos (el pH 7 es, por tanto, el
pH de una disolución acuosa de cloruro de sodio).
+
3. Cuando se añade más de un equivalente de NaOH, la concentración de iones H residual
es inversamente proporcional a la concentración de NaOH presente en exceso.
La forma de la curva indica que al ir añadiendo base se producen tan solo pequeños
cambios en el valor de pH hasta cuando se obtiene la neutralización completa; pero en este
punto un exceso de base causa un cambio brusco en el pH. En efecto, el ácido fuerte está
impidiendo el cambio en el pH, en otras palabras, está actuando como una solución
amortiguadora. La zona donde adiciones grandes de álcali producen cambios pequeños de
pH, se denomina zona de tampón ácida.
Fig. 2. Curvas de titulación para 20 ml de soluciones de algunos ácidos 0.1 N.
6.2. NEUTRALIZACION DE UN ACIDO DEBIL CON UNA BASE FUERTE.- Si titulamos ácido
acético con NaOH, el proceso de neutralización se escribe:
37
-
El otro producto de la neutralización, a parte del agua, es el ion acetato (CH3COO ), es
la base conjugada del ácido débil CH3COOH, o sea:
Es decir el pH de una disolución de ácido acético, a la que se le añadió menos de un

equivalente de NaOH, dependerá o solo de la cantidad de ácido acético que queda sin
disociar, sino también de la magnitud en la que se disocia, la cual está dada por la
-
concentración del ion CH3COO en la solución. Por tanto, el curso del cambio del pH durante la
titulación reflejará:
1. la eliminación, por neutralización del ácido acético, con la consiguiente producción de
-
CH3COO ,
2. el progresivo incremento de la represión de la disociación del ácido acético residual debido
-
a la progresiva subida de la concentración del ion CH3COO producida por (1).
El efecto cuantitativo, de estos acontecimientos sobre el pH durante la neutralización se

puede calcular a partir de la ecuación que define la constante de disociación de un ácido débil:
De acuerdo con la ley de acción de masas, la constante de disociación Ka se define

como:
Sacando los logaritmos negativos,
En términos generales:
Esta es la llamada ecuación de Henderson-Hasselbalch. En la práctica significa que la

curva de titulación de ácido débil-base fuerte tendrá la forma mostrada en la figura anterior
para la titulación de ácido acético con NaOH.
En esta curva se observa que el pH del punto de equivalencia es mayor de 7. En

segundo lugar, la zona de cambio rápido del pH alrededor del punto de equivalencia tiene una
extensión menor que en la titulación de un ácido fuerte con NaOH. Pero el hecho más notable
es que esta curva de titulación tiene forma sigmoidea en el lado ácido de la equivalencia con
una inflexión en el punto medio de este brazo. En este punto, la mitad del ácido inicial se ha
38
convertido en su base conjugada y la mitad queda sin neutralizar. Por tanto, en este punto
[base conjugada] = [ácido], y el pH es igual a (pKa + log 1) = pKa (ya que el Log de 1 = 0). Por
tanto, midiendo el pH en el punto de media equivalencia, cuando se titula un ácido débil con
álcali, se obtiene un valor experimental (aparente) para el pKa del ácido.
El pH en esta curva cambia sólo lentamente por la adición de álcali (o de ácido fuerte)
aunque cerca del principio y cuando se aproxima a la equivalencia el pH cambia más rápido.
Es decir, las mezclas en medio del margen de pre-equivalencia tienen una mayor capacidad
tamponante que las situadas en los extremos. La forma sigmoidea de la curva de titulación
obedece a la ecuación de Henderson-Hasselbalch. El cambio de pH por adición de álcali
depende solo del cambio ejercido por esta adición en el valor de la relación [base
conjugada]/[ácido], puesto que pKa es constante en cualquier titulación. En el punto de media
equivalencia [base conjugada]/[ácido] es 1, y la adición de una décima parte de un equivalente
de álcali a esta mezcla, solo producirá un pequeño cambio en la proporción, y por tanto, un
ligero incremento en el pH (la proporción sería 1.5 log de 1.5 = 0.176). Por otra parte, la
adición de esta cantidad de álcali a mezclas en las que [base conjugada]/[ácido], es
inicialmente de 10 o de 1/10 producirá un cambio mucho más grande en la proporción y por
tanto en el pH. Entonces, la alteración del pH producida por una pequeña cantidad de álcali (o
de ácido fuerte) es mínima en el punto de mínima equivalencia y aumenta cuando más difiere
de la proporción [base conjugada]/[ácido]; de aquí la forma sigmoidea de la curva de titulación.
De igual modo se puede concluir que:

a) una mezcla en la que la proporción [base conjugada]/[ácido] es 1, y el pH e igual al pKa del
ácido componente, es la mezcla tampón más eficiente.
b) la capacidad tamponante de una mezcla disminuye cuanto más difiere su pH del pK del
ácido débil componente.
En la práctica, se considera que una mezcla de un ácido débil y su base conjugada

forman un tampón satisfactorio en el margen de pH que va desde a
. De la curva de titulación, se puede hacer predicciones bastante exactas
respecto a la capacidad relativa tamponante de mezclas que tienen iguales concentraciones
del mismo ácido débil y su base conjugada. Estas son:
1. La mezcla cuyo pH es igual al pKa del ácido débil, en la que la proporción [base
conjugada]/[ácido] es 1, es la mezcla tampón óptima en el sentido que hace mínimo el
cambio de pH por la adición de una pequeña cantidad de álcali o ácido fuerte.
2. Una mezcla cuyo pH se igual a (pKa - 1), en la que la proporción [base conjugada]/[ácido]
es 0.1, es un tampón efectivo "contra" un álcali, pero poco efectivo "contra" un ácido fuerte.
3. La mezcla cuyo pH es igual a (pKa + 1) y cuya proporción [base conjugada]/[ácido] es 10,
es un tampón efectivo "contra" ácidos fuertes, pero poco efectivo "contra" álcalis.
No obstante, la capacidad real tamponante de una disolución sólo está determinada por
la proporción inicial [base conjugada]/[ácido], sino también por la magnitud real de estas
concentraciones. Se nota también que la misma curva de titulación de "pre-equivalencia" se
obtendrá si se titula una disolución de acetato sódico con un ácido fuerte, aunque ahora el pH
descenderá.
Para el cálculo de pH, en la práctica, no es deseable generalmente aplicar la ecuación

de Henderson-Hasselbalch a disoluciones acuosas de pH menor de 4 o mayor de 10, pues
esta ecuación solo da valores aproximados.
7. SOLUCIONES AMORTIGUADORAS Y SU CAPACIDAD DE AMORTIGUACION

Solución amortiguadora es aquella que se opone a los cambios de pH cuando se
agrega álcali o ácido. Los mejores tampones en el margen de pH de 4 a 10 son los que
contiene un ácido débil con su base conjugada; o una base débil con su ácido conjugado. Son
importantes las siguientes propiedades de los tampones:
39
(a) aquella mezcla que tenga una proporción [base]/[ácido] = 1, tiene el máximo de
tamponamiento contra ácidos fuertes y bases fuertes y su pH es igual al pKa del ácido
componente;
(b) las mezclas con una proporción [base]/[ácido] entre 0.1 y 10, tiene un tamponamiento
significativo y su pH cae entre 1 unidad por arriba y por debajo del pKa del ácido
componente;
(c) el pH de cualquier mezcla de este tipo se calcula aplicando al fórmula de Henderson-
Hasselbalch, pH = pKa + log [base]/[ácido], donde pKa es el valor de pKa del ácido
componente.
En la elección de un tampón para estabilizar el pH de una mezcla de reacción, se debe

cuidar que sus componentes no interfieran con la reacción de ninguna forma. De varias
mezclas tampón no perjudiciales, se escogerá aquella cuyo componente ácido posea, a la
temperatura de trabajo, un valor de pka muy cercano al pH requerido.
Para preparar una mezcla tampón, en vez de neutralizar parcialmente un ácido débil
con álcali, es más conveniente mezclar una determinada cantidad de ácido débil en solución,
con una cantidad de su sal cuyo anión es su base conjugada y cuyo catión sea neutro La
composición real de un tampón requerido se calcula a partir de la ecuación de Henderson-
Hasselbalch y la concentración de sus componentes elegidos para dar una mezcla con
capacidad tampón lo suficientemente grande como para mantener un pH constante durante el
tiempo que dura el experimento.
7.1. ACCION BUFFER.- Si consideramos la acción buffer de un ácido débil (HX) y su sal
(NaX):
El ácido se ioniza solo en una cantidad muy limitada y la sal se considera

completamente ionizada. Por tanto, si consideramos un tampón formado por ácido acético y
acetato de sodio, la concentración de ácido es casi la misma que se agregó a la mezcla, y de
igual modo la concentración del ion acetato puede ser considerado igual a las concentraciones
de la sal añadida.
+ -
En este caso, los iones H son absorbidos por la sal y los iones OH son absorbidos por
el ácido.
+
La adición de iones H (como HCl, que se disocia completamente), produce la reacción
+ - -
1 "en la dirección inversa"; los iones H se combinan con los aniones CH3COO (X )
procedentes de la sal para formar el ácido no disociado (HX) o CH 3COOH y, por esto, la
+
concentración del ion H permanece más o menos constante.
-
Inversamente, la adición de OH (como NaOH) hace que la reacción 1 vaya hacia la
- +
derecha; los iones OH se combinan conos iones H para formar agua y por tanto, la
+
concentración del ion H permanece más o menos constante. (En buffer de una base débil y
+ -
su sal, es la base la que tampona frente a los iones H y la sal frente a los iones OH ).
40
-
Como el NaOH se disocia en forma completa, por ser bases fuertes, su OH forma H2O
+
con el H del ácido acético. La mayor parte del ácido acético no está disociado porque es
+ -
débil, pero como sus H son captados inmediatamente por el OH para formar agua, esto
permite que la disociación del ácido acético continúe y continúe hasta que finalmente todo el
ácido acético es convertido e acetato de sodio.
+
El constituyente del buffer que absorbe iones H es frecuentemente referido como
-
"reserva alcalina" y el constituyente que absorbe los iones OH es la "reserva ácida".
Los buffer tienen una capacidad tamponante limitada. Cuando se añade una cantidad
equivalente de ácido a la "reserva alcalina", la acción tamponante es pobre en la región ácida.
A la inversa, cuando se añade una cantidad equivalente de base a la "reserva ácida" la acción
amortiguadora es baja en la región alcalina.
7.2. CAPACIDAD TAMPON.- Las soluciones amortiguadoras difieren en su capacidad para

resistir los cambios de pH, por lo que Van Slyke introdujo el término capacidad tampón, que
se define como los equivalente gramo por litro de ácido fuerte o base fuerte que se requieren
para alterar 1 unidad de pH a 1 litro de amortiguador 1 N. Está dad por la reacción:
siendo dB el incremento (en equivalente gramo por litro) de base o ácido fuerte añadido a la
solución tampón; y el dpH el incremento resultante de pH. Una solución tiene una capacidad
tampón de 1 cuando un litro de la misma necesita 1 equivalente gramo de un ácido o de una
base fuerte para experimentar un cambio de pH en una unidad.
7.3. FUERZA IONICA Y AMORTIGUADORES.- La constante Ka (constante de ionización del

ácido) depende en gran parte de la concentración total de iones en la solución. Los iones
tienden a atraer iones de carga opuesta. Alrededor de un ion dado existe una "atmósfera
iónica" formada por iones de carga opuesta. Por tanto, el pKa varía según la fuerza iónica (I).
La fuerza iónica se define como:
donde Ci es la concentración de la variación iónica i y Zi es la carga de este ion. Por tanto,

para sales monovalentes, la fuerza iónica es igual a la concentración molar de la sal.
Ejm. Prepare amortiguador acetato de sodio, de pH 5 con un fuerza iónica de 0.1.
Método 1: Disuelva 0.1 mol de NaOH o de acetato de sodio en 800 ml de agua

aproximadamente. Añada ácido acético hasta pH 5. Afore a 1 litro.
Método 2:
41
En vista de que sal = 0.1 M, ácido = 0.05 M. Añada 0.1 mol de acetato de sodio, 0.05
mol de ácido acético, y afore a un litro.
Ejm. Prepare un amortiguador fosfato de pH 7.4 con una fuerza iónica de 0.05.
Como el pKa del fosfato es 6.8, para una fuerza iónica de 0.05,
tomando antilogaritmos:
Para que se respete la neutralidad eléctrica:
Introduciendo estas dos últimas ecuaciones en la primera:
- =
por tanto, [H2PO4 ] = 0.00385. Empleando la tercera ecuación se despeja [HPO 4 ].
Para obtener un amortiguador que tenga la fuerza iónica buscada, diluya hasta 1 litro
0.00385 mol de NaH2PO4 y 0.0154 mol de Na2HPO4.
8. CUESTIONES PRÁCTICAS SOBRE CURVAS DE TITULACION
8.1. LIMITES PRACTICOS DE LAS CURVAS DE TITULACION.- Si en la titulación se usan

ácido fuertes o bases fuertes 0.1 M, las curvas se aproximan asintóticamente al pH 1 o a pH
13, después de producirse la neutralización completa. En forma similar, los límites para las
soluciones 0.01 M serán pH 2 o pH 12 y por tanto, valores de pKa por debajo de 2 o por
encima de 12 no pueden ser determinados usando soluciones 0.01 M.
8.2. CORRECCION POR SOLVENTE.- Se deben corregir las curvas experimentales de

titulación para tomar en cuenta la cantidad de ácido o base usados en la titulación del
solvente, que generalmente es agua destilada. esto se hace de la siguiente manera:
a. Dibuje las curvas de titulación para los mismos volúmenes de muestra.
b. Seleccione un valor cualquiera de pH en la curva para la muestra y anote el volumen de
ácido o base usado; denomine esto X ml. En la misma forma, anote la cantidad de ácido o
base consumida para llevar el agua al mismo valor de pH; denomine esto Y ml.
c. La cantidad neta de ácido o base consumida en la titulación de la muestra está dada por (X
- Y) ml. Repita esto para varios valores de pH y haga la curva correcta de titulación.
8.3. DETERMINACION DE pKa.- Es esencial el conocimiento del pKa de un ácido, para su
42
debido uso como tampón. Los valores de pKa pueden obtenerse por varios métodos, a partir
de la curva de titulación:
a. El pH en el punto de inflexión en una curva de pH frente a equivalentes de base o ácido
añadidos, es igual al pKa y se puede leer directamente. Una forma más conveniente
consiste en hacer el gráfico de dB / dpH, que es el valor amortiguador en función del pH y
cuando se obtiene un máximo este corresponde al pKa.
-
b. El pKa es igual al pH al cual se ha titulado la mitad de ácido, es decir [HA] / [A ] = 1 . Este
punto de titulación medio se obtiene fácilmente de la curva de titulación si puede
determinarse o calcularse el punto final (conociendo los equivalentes de ácido añadido, o
superponiendo 2 unidades de pH por encima del punto aproximado de inflexión).
c. El pKa se puede calcular de cualquier punto de la curva de titulación sustituyendo los
-
valores experimentales de pH, [HA] y [A ] en la ecuación:
Estos cálculos pueden hacerse para diferentes puntos de la curva de titulación, y tomarse
para pKa la medida de estos valores. A valores extremos de pH (por encima de 10 y por
debajo de 3) el ácido o base requerido para titular el disolvente solo a cada pH debe
respetarse la cantidad añadida a la solución.
d. El cociente sal / ácido puede calcularse experimentalmente y se puede hacer un gráfico de
log10 sal / ácido en función de pH. La intersección en el eje es el valor de pKa.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. DETERMINACION DEL pH MEDIANTE USO DE INDICADORES y

pHMETRO
MATERIAL:
1. Indicador Universal, Fenolftaleína Anaranjado de metilo.
2. Muestras diluidas 1:10 de agua, soluciones de diferentes ácidos, jugo de naranja, limón,
bebidas gasificadas, agua embotellada, etc.
METODO DE TRABAJO
En un tubo de ensayo pipetee 2 ml de cada muestra, agregue dos gotas de indicador
universal y observe el color. Repita el experimento con otros indicadores comparando los
colores de las muestras con las formas ácida, intermedia y básica del indicador (tabla 3 y 5).
Indicador Anaranjado
Fenolftaleína pHmetro
Universal de metilo
Color pH Color pH Color pH pH
Agua destilada
HCl 0.1 N
Jugo de limón
NaOH 0.1 N
Bebida gaseosa
43
RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA

Presentar figuras (fotos) que representen el tipo de muestra y el indicador de pH utilizado.
EXPERIMENTO N° 2. TITULACION DE UN ACIDO FUERTE CON UNA BASE FUERTE
MATERIALES
Buretas
pHmetro de inmersión
Beakers de 50 ml
Baguetas
Pipetas de 5 ml
HCl 0.1 N (solución valorada)
Fenolftaleína 1%
NaOH o KOH 0.1 N (solución valorada)
Anaranjado de metilo 0.1%
METODO DE TRABAJO
En un beaker de 50 ml pipetee 10 ml de HCl 0.1 N y mida el pH con ayuda del pH-
metro, agregue 3 gotas de fenolftaleína. Seguidamente titule esta solución con NaOH 0.1 N y
mida el pH después de agregar alícuotas de 1 ml de álcali. Cuando se aproxime al punto final
de la titulación, reduzca la cantidad de álcali agregada, hasta obtener un cambio razonable en
el pH.
Anote sus resultados y calcule los valores de pH teóricos para cada mililitro de NaOH añadido.
NaOH 0.1 N
(ml)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
pH Exper.
pH Teór.

En papel milimetrado construya la curva de titulación de los valores de pH del ácido
clorhídrico frente al volumen de NaOH añadido. En el mismo sistema grafique los valores
teóricos encontrados. Compare las gráficas.
EXPERIMENTO N° 3. TITULACION DE UN ACIDO DEBIL CON UNA BASE FUERTE:

DETERMINACION DEL pKa DEL ACIDO ACETICO
MATERIAL
Beakers de 50 ml
pHmetro
Bagueta
Acido acético 0.1 N
NaOH 0.1 N
METODO DE TRABAJO
Titúlese 10 ml de ácido acético 0.1 N con NaOH 0.1 N y anote el pH para cada mililitro
de álcali añadido.
Durante la práctica calcular teóricamente, los valores de pH para 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 11, 12, 13, 14 ml de álcali añadido, usando las fórmulas de disociación de ácidos
44
débiles, la ecuación de Henderson-Hasselbalch y la de disociación de sales.
Anote sus resultados y calcule los valores de pH teóricos para cada mililitro de NaOH
añadido.
NaOH 0.1 N
(ml)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
pH Exper.
pH Teór.

Presentar gráficamente, en papel milimetrado, los valores de pH del ácido acético frente
al volumen de NaOH añadido. En el mismo sistema grafique los valores teóricos encontrados.
Compare las gráficas. Determine el valor de pKa del ácido acético.
EXPERIMENTO N° 4. BUFFER FOSFATO Y CAPACIDAD TAMPON
MATERIALES
Beakers de 50 ml
pHmetro
Goteros
Bagueta
Pipetas de 10 ml
Solución 0.2 M de fosfato monobásico de sodio, pKa 6.8 (27.8 g de NaH 2PO4 en 1000 ml
de agua destilada)
Solución 0.2 M de fosfato dibásico de sodio (53.65 g de Na 2HPO4 ó 71.7 g de
Na2HPO4.12H2O en 1000 ml de agua destilada)
METODO DE TRABAJO
Calcular la relación y los ml de NaH2PO4 0.2 M y de Na2HPO4 0.2 M requerida para
obtener 100 ml de una solución de pH 6. Diluir estos 100 ml hasta 200 ml para obtener un
buffer fosfato 0.1 M.
Tome 10 ml de la solución anterior y mida el pH utilizando un pHmetro.

Incluya figuras (fotos) o haga un esquema del experimento.
CUESTIONARIO
1. Calcule los valores de pH y trace la curva de titulación de 500 ml de ácido acético 0.010 M
(pKa 4.76) con KOH 0.010 M.
2. Calcular la concentración de protones, en moles por litro de una solución 1M de ácido

-5
acético, sabiendo que la Ka del ácido acético a 25°C es de 1.86 x10
3. Cuál es el pH de las siguientes mezclas de soluciones tampón?

a) Acido acético 1 M más acetato sódico 0.5 M
b) Acido fosfórico 0.3 M más KH2PO4 0.8 M
45
4. Supóngase que quiere conseguir un tampón de un pH exactamente 7.00 utilizando KH2PO4

y Na2HPO4. Si tiene una solución de KH2PO4 0.1 M. Qué concentración de Na2HPO4
necesitaría?
5. Una muestra de 500 ml de tampón formiato 0.100 M, pH 3.75, se trata con 5 ml de KOH
1.00 M. Qué pH se obtiene tras dicha adición?.
6. Describa la preparación de 2.0 litros de tampón glicina 0.100 M, pH 9.0, a partir de glicina
(PM en forma de zwitterion, 75.07 g/mol) y NaOH 1.00 M. El pK de la glicina es 9.6.
46
PRACTICA N° 4
CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE CARBOHIDRATOS
INTRODUCCIÓN
Los carbohidratos están muy difundidos en la naturaleza, sobre todo en el reino vegetal.
Constituyen los productos finales de la fotosíntesis en las plantas verdes. Los animales,
incapaces de tal acumulación de energía solar, aprovechan las sustancias acumuladas por las
plantas. Los carbohidratos participan en la construcción de las estructuras del organismo vivo,
sirve como material para la biosíntesis de otro tipo de compuestos y juega un papel importante
en la bioenergética de la célula. Los carbohidratos entran a formar parte de los ácidos
nucleicos las glicoproteínas, glicolípidos y de algunas vitaminas y coenzimas. Como
integrantes de las glicoproteínas, participan en la formación de la capa externa adyacente a la
membrana, que desempeña un papel importante en la protección de las células contra la
penetración en ellas de microorganismos y virus. Estos carbohidratos están relacionados con
las propiedades inmunoquímicas de los tejidos.
Los carbohidratos son compuestos polifuncionales que contiene grupos carbonilo

(aldehído o cetónico) y grupos hidroxilo alcohólicos. Por esto; poseen propiedades de
aldehídos y cetonas y de alcoholes polihidroxílicos. Los carbohidratos se dividen en
monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.
Los monosacáridos pueden unirse entre sí mediante un proceso denominado síntesis

por condensación o deshidratación. En dicho proceso se unen dos o más monosacáridos para
formar un disacárido, trisacárido, tetrasacárido, etc. liberándose una molécula de agua. La
fórmula general de los carbohidratos es (CH2O)n. Todos los monosacáridos naturales que
tienen átomos de carbono asimétrico, son ópticamente activos y desvían el plano de la luz
polarizada.
Los oligosacáridos y los polisacáridos son carbohidratos complejos, los cuales al ser
calentados con ácidos diluidos o hidrolizados por enzimas, se desintegran en monosacáridos.
Los polisacáridos poseen una masa molecular muy elevada, son insolubles en agua y la
mayoría de ellos forman soluciones coloidales.
PARTE EXPERIMENTAL
1. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS CARBOHIDRATOS
EXPERIMENTO N° 1. FORMACION DE FURFURALES
FUNDAMENTO
Esta reacción es general para los hidratos de carbono y se aplica para detectar su
presencia en los materiales biológicos. El ácido sulfúrico concentrado hidroliza enlaces
glicosídicos para dar monosacáridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural a
partir de pentosas y 5-hidroximetilfurfural a partir de las hexosas. Estos productos se
combinan luego con α-naftol sulfonato originando un complejo púrpura o con timol dando una
coloración roja.
47
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Timol al 1% en alcohol etílico
Acido sulfúrico concentrado
Soluciones al 1% de almidón, glucosa, maltosa, sacarosa, etc.
METODO DE TRABAJO
En cada uno de los tubos de ensayo colocar 2.0 ml de solución de carbohidrato. Añadir
4 gotas de -Naftol o Timol. Luego añadir, por las paredes del tubo, 2.0 ml de ácido sulfúrico
concentrado teniendo cuidado que no se mezcle con la capa acuosa. Lleve a baño en
ebullición por 1 min, Retire y observe en la interface la aparición de una coloración roja.
Anote sus resultados en la siguiente tabla
CARBOHIDRATO OBSERVACIÓN
Glucosa
Sacarosa
Almidón

Además comente la utilidad de la reacción en muestras biológicas
48
EXPERIMENTO N° 2. REACCIONES DE REDUCCION: PRUEBA DEL HIDROXIDO

CUPRICO.
FUNDAMENTO
Los carbohidratos que en su molécula poseen un grupo carbonilo libre, se llaman
reductores. Estos azúcares, en un medio alcalino tienen la capacidad de oxidarse, reduciendo
+2 +
a su vez las sales de óxido cúprico (Cu ) a sales de óxido cuproso (Cu ). Esta es la base para
una serie de métodos de determinación cualitativa y cuantitativa de carbohidratos. En solución
alcalina los monosacáridos y disacáridos reductores reducen el hidróxido cúprico (II) en óxido
cuproso (I).
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Reactivo alcalino de cobre
Soluciones al 1% de almidón, glucosa, maltosa, sacarosa, etc.
METODO DE TRABAJO
En los tubos de ensayo vierta 2.0 ml de solución de carbohidratos; luego añada 2.0 ml
del reactivo de cobre y agite. Colocar en baño maría hirviente. La aparición de un precipitado
de color rojo (óxido cuproso) indica la presencia de carbohidratos reductores.
Anote sus resultados en la siguiente tabla:
TIPO DE HIDRATO DE CARBONO NO

CARBOHIDRATO REDUCTOR
Monosac. Oligosac. Polisac. REDUCTOR
GLUCOSA
SACAROSA
ALMIDÓN

Además comente la utilidad de la reacción en muestras biológicas
49
2. HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN
EXPERIMENTO N° 3. HIDROLISIS ACIDA DEL ALMIDON
FUNDAMENTO
Durante el calentamiento del almidón con HCl diluido, este se descompone en
fragmentos de diferente tamaño llamados dextrinas. Estas se distinguen entre sí por la masa
molecular y por el color que dan en presencia de yodo. A continuación se da un esquema de la
hidrólisis ácida del almidón:
Almidón + I2 Azul
Amilodextrinas + I2 Violeta azul
Eritrodextrinas + I2 Pardo rojiza
Acrodextrinas + I2 Incolora
Maltodextrinas + I2 Incolora
Maltosa + I2 Incolora
Glucosa + I2 Incolora
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Almidón al 1%
Solución de Lugol (20 gr de ioduro potásico y 10 gr de yodo en 100 ml de agua)
HCl concentrado
METODO DE TRABAJO
Vierta 10.0 ml de solución de almidón en un tubo de ensayo. Añada 0.5 ml de ácido
clorhídrico concentrado. Tomar 0.5 ml de la muestra y colocarla en 5.0 ml de agua destilada,
agite y añada 1 gota de lugol. Anote el color que aparece. Luego coloque la muestra en baño
maría hirviente. Después de 10 minuto se toma una muestra para la reacción con yodo. Para
esto se extrae 0.5 ml de solución y se vierte en un tubo de ensayo que contiene 5.0 ml de
agua destilada, se agita y se añade 1 gota de lugol. El color azul violeta indica la presencia de
amilodextrinas en la solución. Repita la misma operación cada 10 minutos, hasta que la
prueba con lugol sea negativa.
Para comprobar que lo que ha quedado en el tubo es glucosa, tomar 2.0 ml de muestra
y añadir 2.0 ml del reactivo de cobre. Colocar en baño maría hirviente hasta observar un
precipitado rojo ladrillo.
TIEMPO
COLOR
(minutos)
0
10
20
30
40
50
60
50

Además comente la utilidad de la reacción en la industria alimentaria
EXPERIMENTO N° 4. HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDON
FUNDAMENTO
Por acción de la amilasa el almidón se hidroliza para dar lugar al disacárido maltosa, que
luego se hidroliza por acción de la maltasa hasta glucosa.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Almidón al 1%
Solución de Lugol (20 gr de ioduro potásico y 10 gr de yodo en 100 ml de agua)
Solución de saliva diluida (1:5)
METODO DE TRABAJO
Verter en un tubo de ensayo 5.0 ml de la solución de almidón; añadir 1.0 ml de solución
de saliva diluida. Tomar 0.5 ml de la muestra y colocarla en 5.0 ml de agua destilada, agite y
añada 1 gota de lugol. Anote el color que aparece. Luego coloque la muestra en baño maría a
37 °C. Después de 20 segundos se toma una muestra para la reacción con yodo. Para esto
se extrae 0.5 ml de solución y se vierte en un tubo de ensayo que contiene 5.0 ml de agua
destilada, se agita y se añade 1 gota de lugol. Se repita la misma operación cada minuto,
hasta que la prueba de lugol nos dé negativa.
Para comprobar que lo que ha quedado en el tubo es glucosa, tomar 2.0 ml de muestra
y añadir 2.0 ml del reactivo de cobre. Colocar en baño maría hirviente hasta observar un
precipitado rojo ladrillo.
TIEMPO
COLOR
(SEGUNDOS)
0
20
40
60

Además comente la utilidad de la reacción en la industria alimentaria.
3. DETERMINACION COLORIMETRICA DE AZUCARES
EXPERIMENTO N° 5. DETERMINACION DE ACIDO ASCORBICO EN ORINA
FUNDAMENTO
El ácido ascórbico es oxidado por el colorante 2,6-diclorofenolindofenol. Al mismo
51
tiempo, el colorante se reduce a un compuesto incoloro permitiendo determinar fácilmente el

punto final de la reacción. Además del ácido ascórbico otros compuestos pueden decolorar el
pigmento, pero la especificidad puede aumentar hasta cierto punto efectuando la reacción en
solución ácida en la cual las sustancias que interfieren reaccionan muy lentamente.
La determinación de ácido ascórbico nos puede determinar escorbuto haciendo una prueba
de saturación.
MATERIAL
Matraz
Pipetas
Bureta
Solución de 2,6-diclorofenolindofenol 1mM (pesar 32.6 mg de 2,6-diclorofenolindofenol y
disolverlo en agua destilada hasta 100 ml)
Solución patrón de ácido ascórbico (20 mg/ 1000 ml). (Prepárese en el momento de
usarse)
Acido acético glacial
Muestra de orina
METODO DE TRABAJO
Para colectar la muestra de orina, se indica al paciente que bebe realizarse una higiene
de los genitales, previa a la recolección de la muestra, para la cual se debe utilizar un frasco
de boca ancha (esterilizado).
En un matraz pipetear 0.5 ml de orina y agregar 4.5 ml de agua destilada (dilución 1:10),
luego agregar 0.5 ml de ácido acético glacial y titular con 2,6-diclorofenolindofenol hasta
obtener un color rosa estable. Anotar el volumen usado en la titulación (T). Repetir por lo
menos dos veces.
Asimismo, titule dos tubos, usando para el blanco 5.0 ml de agua destilada (Bl) y 5.0 ml
de solución patrón de ácido ascórbico (Pt). Además, agregue a ambos 0.5 ml de ácido acético
glacial y titule como en el caso anterior.
El contenido de vitamina en la muestra se determina utilizando la siguiente fórmula:
2,6-DICLOROFENOLINDOFENOL
TUBO
(ml añadidos)
T
Bl
Pt

Además comente la utilidad de la reacción en patología clínica.
52
EXPERIMENTO N° 6. DETERMINACION DE GLUCOSA POR EL METODO DE TRINDER
FUNDAMENTO
La reacción de Trinder (Trinder, 1969) ha sido ampliamente usada para determinar
glucosa enzimáticamente. Esta reacción involucra la oxidación de la glucosa en presencia de
glucosa oxidasa a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno, y la formación de una quinonimina
roja (4(p-benzoquinona-imino) aminofenazona) por reacción del peróxido con 4-aminofeazona
y fenol en presencia de peroxidasa. La quinonimina formada se determina
espectrofotométricamente a 505 nm.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Espectrofotómetro
Baño maría
Amortiguador de fosfatos 100 mmol/l pH 7.0. A 800 mL de agua destilada se agregaron
12.95 g de fosfato disódico dihidratado, 4.95 g de fosfato de potasio anhidro y 0.5 g de
azida de sodio. Los reactivos se disolvieron, se ajustó a un pH de 7.0 y la solución se llevó
a un volumen final de 1 L.
Reactivo de color. A 100 ml del amortiguador de fosfatos se añadieron 16 mg de 4-
aminofenazona, 1,800 U de glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4), 100 U de peroxidasa (EC
1.11.1.7), 105 mg de fenol y 50 µL de tween 20.
Solución estándar de glucosa 100 mg/dl
Muestra problema (Suero)
METODO DE TRABAJO
A 1.0 ml de reactivo de color se adicionaron 10 µl de suero, estándar o agua para
preparar los problemas, estándares o blanco respectivamente. Las mezclas de reacción se
incubaron durante 10 min a 37°C y se realizaron las lecturas espectrofotométricas de los
problemas y estándares a 510 nm, calibrando el espectrofotómetro contra el blanco de
reactivos.
El contenido de glucosa en las muestras se determinan utilizando la siguiente fórmula:
53
TUBO Absorbancia
Muestra 1 1,789
Muestra 2 0.820
Estándar 0.868

Además comente la utilidad de los resultados en patología clínica.
CUESTIONARIO
1. Describa la interacción de hormonas y enzimas en el control de las concentraciones de
glucógeno.
2. Cuál es la función de la vitamina C en el organismo.
3. Describa un método para determinar carbohidratos totales en plantas (Investigue!!!).
54
PRACTICA N° 5
ANALISIS DE LIPIDOS
Se llama lípidos a un conjunto de moléculas orgánicas, la mayoría biomoléculas,

compuestas principalmente por carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno, aunque
también pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno. Tienen como característica principal ser
insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos como el benceno.
Los lípidos son un grupo heterogéneo de compuestos emparentados, con los ácidos
grasos. Son constituyentes importantes de la alimentación no solo por su elevado valor
energético, sino también por las vitaminas liposolubles y los ácidos grasos esenciales
contenidos en la grasa de los alimentos naturales.
SOLUBILIDAD
Es importante tener presente que la solubilidad de los lípidos, en general, dependen de
la relación numérica entre el número de grupos hidrófilos de hidrófobos de los ácidos grasos,
mientras que los grupos hidrófobos están representados por el resto de la cadena
hidrocarbonada. De esto se desprende que, cuanto más larga sea la cadena hidrocarbonada
del ácido graso, la relación entre los grupos mencionados será tanto menor y menos soluble,
en agua, será el ácido graso. La solubilidad en los solventes orgánicos, por el contrario,
depende de la afinidad del solvente por la cadena carbónica no funcional.
INDICE DE ACIDEZ
Se define como el número de mg de KOH necesarios para neutralizar 1 gr. de grasa.
Está en relación con la cantidad de ácidos grasos libres presentes en la grasa. Tiene interés
porque nos indica el estado de conservación y el grado de ranciamiento de una grasa, puesto
que todo tipo de grasa tiene una cantidad característica de ácidos grasos libres, más allá del
cual significa alteración.
INDICE DE SAPONIFICACION
Se define como el número de mg de KOH, que se requiere para saponificar
completamente 1 gr. de grasa. Depende del tamaño de las moléculas de los ácidos grasos
que forman parte de la grasa en estudio. Las relaciones son inversas. Puesto que las grasas
son mezclas de glicéridos, la mayoría de tipo mixto, el índice de saponificación da un promedio
del tamaño molecular de los ácidos grasos presentes en los glicéridos constituyentes de
dichas grasas. Es decir, que su importancia reside en la relación existente entre el índice de
saponificación y la longitud de la cadena de los ácidos grasos del triglicérido.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. SOLUBILIDAD DE LOS LIPIDOS
FUNDAMENTO
Los grupos principales de los lípidos tienen características de solubilidad diferentes y
esta propiedad se usa en su extracción y purificación a partir de materiales biológicos. La
mayoría de los lípidos son solubles en etanol al 95%, pero forman una emulsión de gotas
pequeñas cuando se les agrega agua. Esto da a la suspensión una apariencia lechosa
característica y constituye una prueba muy sencilla para grasas.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Alcohol
55
Acetona
Eter Dietílico
Cloroformo
Aceite de Oliva
METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:
TUBOS 1 2 3 4 5
Agua Destilada (ml) 2.0 - - - -
Alcohol Frío (ml) - 2.0 - - -
Alcohol Caliente (ml) - - 2.0 - -
Eter (ml) - - - 2.0 -
Acetona (ml) - - - - 2.0
Aceite de Oliva (gotas) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
Agitar enérgicamente, dejar en reposo.
SOLUBILIDAD
Agua Destilada
Alcohol Frío
Alcohol Caliente
Eter
Acetona

Explique a qué se debe la solubilidad o insolubilidad del aceite de oliva en cada uno de los
solventes utilizados
EXPERIMENTO N° 2. DETERMINACION DEL VALOR DE ACIDEZ DE UNA GRASA
FUNDAMENTO
Las grasas almacenadas pueden sufrir enranciamiento debido a la oxidación de los
dobles enlaces para formar peróxidos y a su hidrólisis por microorganismos con liberación de
ácidos grasos. La cantidad de ácidos grasos libres da, por lo tanto, un índice de la frescura y
calidad de la grasa.
El presente experimento consiste en disolver la muestra con un solvente neutralizado y

en titular la acidez con una solución de KOH de normalidad conocida. Es decir, se titulan los
ácidos grasos libres.
MATERIAL
Matraz
Beaker
Cloroformo
Alcohol al 95%
Fenolftaleína al 1%
56
KOH 0.1 N
Aceite de Oliva
METODO DE TRABAJO
Proceder de la siguiente manera:
1. Neutralización de los solventes.- En un matraz se mezclan 2.5 ml de cloroformo y 5.0 ml de
alcohol, se agregan 4 gotas de fenolftaleína, seguidamente se titula con KOH, hasta que
aparezca un leve color rosado que persista durante 30 seg.
2. En un beaker previamente tarado, pesar 1.0 g. de grasa (aceite de oliva u otra grasa),
agregar la mezcla alcohol-cloroformo neutralizado, mezclar bien la grasa con los
disolventes. Se agrega 4 gotas de fenolftaleína y se valora inmediatamente con KOH, hasta
que el color rosado pálido permanezca por más de 30 seg.
CÁLCULOS
Donde:
I.A. = Indice de Acidez
n = ml de KOH 0.1 N usados en la titulación.
1 ml de esta solución es igual a 0.0056 g. de KOH.
P = Peso de la muestra problema
Si se desea expresar en términos de % de ácidos grasos libres, referidos a ácido oleico,

con los mismos datos tendremos:
0.0282 = 1 g. de ácido oleico (PM = 282).
Anote el número de mililitros gastados de álcali en la siguiente tabla:
Aceite de oliva
Gasto de KOH (ml)

Explique qué indica el valor de índice de acidez, respecto al estado de conservación y aptitud
para el consumo de la grasa utilizada?
EXPERIMENTO N° 3. INDICE DE SAPONIFICACION DE UNA GRASA
FUNDAMENTO
Este índice nos da la medida de los ácidos grasos producidos durante la hidrólisis
alcalina de una mezcla de grasa natural. Dado que una molécula de triglicérido requiere 3
moléculas de KOH (PM = 56), para saponificarse, independientemente del peso molecular de
los ácidos grasos presentes, este hecho ha sido usado para tener una información del peso
molecular medio de los ácidos grasos presentes en una grasa.
MATERIAL
Matraz
Aceite de Oliva
57
Mantequilla u otra grasa

Solución de KOH alcohólico 0.5 N
HCl 0.5 N
METODO DE TRABAJO
Proceda como se indica a continuación:
Beaker 1 2 3
Aceite de Oliva (g.) 1.0 - -
Mantequilla (g.) - 1.0 -
Sol. KOH en Alcohol 0.5 N (ml) 10.0 10.0 10.0
Colocar los beakers en baño de agua hirviente, durante 30 ó 45 minutos, agitar

continuamente para favorecer un mejor contacto. Transcurrido el tiempo indicado, se deja
enfriar. Seguidamente se agrega 4 gotas de fenolftaleína en cada beaker y se titula con HCl.
Anote el número de mililitros gastados en cada una de las titulaciones:
Sol. KOH en
Aceite de oliva Mantequilla
Alcohol
Gasto de HCl (ml)
CÁLCULOS
Calcule el índice de saponificación usando la siguiente fórmula:
Donde:
I.S. = Indice de saponificación
V = ml gastados en el blanco
V' = ml gastados en la muestra
(1 ml de solución de KOH = 0.2805 g. de la misma sustancia = 28.05 mg).
Si se desea saber el peso molecular medio de los ácidos grasos presentes en la

muestra problema usar la siguiente fórmula:

Explique qué indica el valor de índice de Saponificación de la grasa utilizada y cuál es su
utilidad.
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué la trioleína, a temperatura ambiente, se encuentra en estado líquido, y la
tripalmitina se encuentra en estado sólido a la misma temperatura?
2. Las grasas y aceites son moléculas apolares, ¿y los fosfolípidos? Razona la respuesta.
3. ¿Qué tipo de ácidos grasos preferentemente contendrá el tocino de cerdo?
58
4. El aceite de oliva, como sabes, se obtiene a partir del fruto del olivo, la aceituna. ¿Puede
tener este aceite colesterol? Razona la respuesta.
5. La mantequilla y la margarina son productos alimenticios sólidos a temperatura ambiente.

La mantequilla se fabrica a partir de la leche, mientras que las margarinas a partir de
aceites vegetales. En la etiqueta de una determinada margarina se indica que se ha
fabricado a partir de aceites vegetales hidrogenados. ¿Cómo es posible que ambos
productos sean sólidos a temperatura ambiente?
6. El índice de saponificación de una muestra de mantequilla es 230. Calcular el peso

molecular de los triglicéridos
7. El índice de yodo de una muestra de mantequilla es 68. Si el índice de saponificación de la

muestra es210. Cuántos dobles enlaces, hay en una molécula de triglicérido?
59
PRACTICA N° 6
CARACTERIZACION DE AMINOACIDOS
Los aminoácidos son los sillares de construcción de las proteínas. El número de

aminoácidos comunes se reduce a 20. Todos con excepción de la prolina, tiene un grupo
carboxilo libre y un grupo amino libre no sustituido unido al carbono a. Difieren unos de otros
en la estructura de su cadena lateral que se denomina grupo R. Siendo su estructura general:
Los aminoácidos son importantes en la alimentación humana. En forma de proteínas los

aminoácidos realizan una multitud de funciones estructurales, hormonales y catalíticas
esenciales para la vida. Por lo tanto, no sorprende que defectos genéticos en el metabolismo
de los aminoácidos pueden conducir a transtornos graves como el retraso mental y muerte
temprana. Además de sus actividades como proteínas, los L-aminoácidos y sus derivados
participan en funciones intracelulares tan diversas como transmisión nerviosa, regulación del
desarrollo celular y en la biosíntesis de porfirinas, purinas y pirimidinas así como urea.
REACCIONES QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS

Los aminoácidos presentan reacciones de significación biológica que evidencian su
capacidad de interactuar covalentemente entre sí mediante el grupo -carboxilo de una
molécula y el -amino de otra molécula para formar un enlace peptídico.
Los aminoácidos participan además en una gran variedad de reacciones químicas que
incluyen la alquilación, arilación y acilación del grupo amino, la formación de ésteres y
anhídridos que implican al grupo carboxilo y reacciones similares en las que interviene los
grupos reactivos de las cadenas laterales. El conocimiento de estas reacciones es útil en
varios aspectos importantes de la química proteica:
a. Para identificar y analizar los aminoácidos en un hidrolizado proteico.
b. Para identificar la secuencia de los aminoácidos en las proteínas.
c. Para la identificación de los residuos específicos de aminoácidos requeridos para la función
biológica de las proteínas.
d. Para producir cambios en la actividad biológica de la proteína mediante modificaciones
químicas de los residuos de los aminoácidos constituyentes.
e. Para la síntesis química de los polipéptidos.
Dentro de las principales reacciones podemos mencionar:

1. REACCION CON ACIDO NITROSO.- El ácido nitroso reacciona con los grupos amino
primarios alifáticos con liberación de nitrógeno para formar alcoholes. Esta reacción puede ser
usada para estimar cuantitativamente los aminoácidos midiendo la cantidad de nitrógeno
liberado.
60
2. REACCION CON NINHIDRINA.- Usada para la determinación cuantitativa de los

aminoácidos y péptidos. Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina para dar un
característico color azul violáceo llamado azul de Ruheman con una absorción máxima a 540
nm a excepción de la prolina e hidroxiprolina que dan un color amarillo, con una absorción
máxima a 440 nm. La ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y descarboxilado.
La determinación cuantitativa puede hacerse también midiendo el CO 2 desprendido.
3. REACCION CON EL DINITROFLUOROBENCENO (DNB).- El grupo amino reacciona con

el DNB en condiciones alcalinas para formar un derivado amarillo. Esta reacción es importante
en la determinación del grupo amino terminal en proteínas, lo que permite identificar el
aminoácido iniciador de la cadena polipeptídica. Ya que al realizar la hidrólisis ácida de la
proteína se libera el aminoácido N-terminal arilado; pudiendo ser identificado por
cromatografía en papel o capa fina.
4. REACCION CON CLORURO DE DANSILO.- Un grupo amino libre reacciona con el cloruro
de dansilo para formar un compuesto fluorescente que puede detectarse y medirse en
cantidades pequeñas, mediante métodos fluorimétricos.
61
5. REACCION CON FENILISOTIOCIANATO.- Es la reacción de Edman para determinar el N-

terminal de una cadena polipeptídica. El fenilisotiocian -aminoácidos
para dar los ácidos feniltiohidantóicos correspondientes. Estos ácidos al ser tratados con
solventes no hidroxilados, como el nitrometano; se ciclan para dar las feniltiohidantoínas; las
cuales son reconocidas por cromatografía de gas-líquido, de papel o de capa fina.
6. REACCION CON CLORURO DE TRIOFLUOROACETILO.- Se utiliza en la cromatografía

de gas-líquido. Los derivados trifluoroacéticos se volatilizan fácilmente sin descomponerse
para separarse por cromatografía gas-líquido mientras que los aminoácidos libres se
descomponen.
Las reacciones antes señaladas son comunes a todos los aminoácidos. Pero los
aminoácidos presentan reacciones que dan color y dependen de su cadena lateral y por lo
tanto, son más específicas en la identificación de aminoácidos. Entre las reacciones químicas
que se usan para la detección o estimación de algunos aminoácidos específicos tenemos:
reacción xantoproteica, reacción de millon, reacción del acetato de plomo, reacción de
sakaguchi, etc. Cuyo fundamento se explica en la parte experimental.
62
DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO EN LOS AMINOACIDOS

Los aminoácidos presentan propiedades eléctricas por lo que son considerados como
anfolitos, puesto que poseen un grupo ácido y un grupo básico. En solución existen como
moléculas cargadas. En su punto isoeléctrico, existen en forma de zwitterion o ion dipolar (sal);
a pH menor que el punto isoeléctrico existen como cationes, que actúan como ácidos; y a un
pH mayor, existe como un anión, que actúa como base. Estas formas no tienen una acción
+ -
buffer buena o total y la adición de pequeñas cantidades de H ó OH alteran rápidamente el
pH de la solución . Cuando el aminoácido existe como una mezcla de la sal y la forma ácida o
básica en concentraciones aproximadamente equimolares (en la región de sus valores de pK),
el sistema actúa como un buffer estable.
Como se mencionó anteriormente el punto isoeléctrico es el pH al que el aminoácido no

lleva carga neta; es en esta forma que los aminoácidos no poseen acción buffer. La acción
tamponante es más grande cuando la concentración de la forma de la sal iguala a la
concentración de la forma ácido o de la forma de base.
Considere la reacción:
El pK = pH cuando la [sal] = [ácido]. Esto en el rango de pH ácido para la mayor

capacidad tamponante.
Similarmente para la reacción:
El pKb = pH cuando la [base] = [sal]. Esto en el rango de pH alcalino para la mayor

capacidad tamponante.
En el punto isoeléctrico la concentración de ácido iguala a la concentración de base:
Por lo tanto:
63
Si disponemos de una solución que contiene 1 mol de un aminoácido monocarboxílico y

monoaminado a un pH de 0 y le agregamos progresivamente alícuotas de una solución de
NaOH con el objeto de hacer variar el pH de la solución, se podrá obtener una gráfica como la
que muestra la Fig. 1.
12
10
pKb
8
pH
6 Punto
isoeléctrico
4 pKa
ml de ácido 0 ml de álcali
Fig.1. Curva de titulación de la glicina.
Se puede notar dos sectores en donde la curva tiende a la horizontalidad, es decir en

donde ocurren las menores variaciones en el pH, no obstante que la cantidad de NaOH
añadida, es la misma que para otros sectores de la curva. Si reparamos en que pH ocurren
estos sectores de casi horizontalidad de la curva, notaremos que están muy próximos a 2.3 y
9.6; lo que quiere decir que en las proximidades del pK de sus grupos ionizables, el
aminoácido tendrá una mayor acción amortiguadora del pH. Esto nos permite anotar que de
los diferentes aminoácidos, la histidina (por su núcleo imidazol) es el más importante en el
control del pH de los líquidos extracelulares, que como se sabe es de aproximadamente 7.4.
En el punto isoeléctrico los aminoácidos son menos solubles en agua y no migran a

ningún electrodo bajo la influencia de una corriente eléctrica.
AISLAMIENTO Y SEPARACION DE AMINOACIDOS

Los aminoácidos pueden ser separados por Cromatografía de intercambio iónico, en
este procedimiento las moléculas de las soluciones son separadas por diferencias en sus
propiedades ácido-base. Para tal fin, se usan columnas con resinas sintéticas, la cual tiene
grupos químicos con una carga determinada. Una de las más usadas corresponde al
-
poliestireno, con grupos de ácido sulfónico (SO 3 ) unidos coovalentemente a los anillos
bencénicos. Esta resina, por intermedio de sus grupos sulfónicos puede captar cationes e
intercambiarlos con otros cationes (resina de intercambio catiónico).
En virtud de la propiedad de los aminoácidos de adoptar determinada forma eléctrica
64
según el pH del medio en que se encuentren, los aminoácidos pueden ser separados
fácilmente por Electroforesis. La técnica consiste en suspender a los aminoácidos en un medio
de pH determinado y colocar la solución sobre un soporte, que puede ser simplemente papel y
someterlo a la acción de un campo eléctrico. Según la intensidad de carga y secundariamente
según su tamaño, los aminoácidos migrarán a uno u otro polo y con mayor o menor velocidad.
Existe otro método muy usado para la separación de aminoácidos y que no está basado
en sus propiedades eléctricas sino en la diferente solubilidad que tienen en una mezcla de
solventes no miscibles.
Cuando un aminoácido se disuelve en una mezcla de solvente no miscible se reparte

entre ellos de acuerdo a su grado de solubilidad, que en la práctica corresponde a su
coeficiente de partición o de reparto. Este principio se aplica en la técnica denominada
Cromatografía de Papel y Cromatografía de Capa Fina.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. REACCION CON NINHIDRINA
FUNDAMENTO
Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina dando un color azul violáceo. En esta
reacción la ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y descarboxilado.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina, cisteína, histidina, arginina, tirosina,
triptofano y cistina)
Caseína 1%
Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
Ninhidrina 0.1% en etanol de 95%
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4
Aminoácidos 0.1 M 0.5 - -

Caseína 1% - 0.5 -
Ovoalbúmina 0.1% - - 0.5 -
Agua destilada - - - 05
Ninhidrina 0.1% 1.5 1.5 1.5 1.5
Mezclar mediante agitación suave y llevar a baño de agua hirviente por 10 minutos.
Retire y enfríe.
Anote sus observaciones. Indique si la reacción es positiva o negativa según
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada
65

Presente fotos de la reacción y explique los resultados.
EXPERIMENTO N° 2. REACCION XANTOPROTEICA
FUNDAMENTO
Es una prueba positiva para aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina y triptófano).
Se basa en la nitración del núcleo de benceno (anillo aromático) dando derivados amarillos,
cuando se calientan con ácido nítrico concentrado; estos derivados se tornan anaranjados por
adición de NaOH (se forman sales).
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, tirosina y triptofano)
Caseína 1%
Acido nítrico concentrado
NaOH 1 N
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4
Aminoácidos 0.1 M 1.0 - - -
Caseína 1% - 1.0 - -
Agua destilada - - - 1.0
Ácido Nítrico 1.0 1.0 1.0 1.0
Agite suavemente y lleve a baño maría por 10 minutos. Retire y enfríe. Adicione 1.0 ml de
NaOH.
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada

EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE MILLON
FUNDAMENTO
Esta prueba para ser positiva requiere la presencia de un radical hidroxibenceno, y por
lo tanto, es específica para tirosina y sus derivados ya sea que estén libres o en una proteína
o en sus productos de hidrólisis. Esta reacción también se emplea en la cuantificación de
66
tirosina.
El reactivo de Millon es una solución de nitratos mercuriosos y mercúricos, conteniendo

ácido nítrico. Las proteínas del tipo de las albúminas de huevo, que precipitan por ácidos
minerales fuertes, producen un precipitado blanco que se va volviendo rojo a medida que se
calienta. Otras proteínas como las proteosas y peptonas solo producen una coloración roja en
-
las mismas condiciones, debido a que las soluciones contienen sales inorgánicas (Cl ) en gran
cantidad, precipitando el reactivo de Millon, este método no se emplea para determinar
proteínas en la orina
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (tirosina)
Caseína 1%
Reactivo de Millon
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4
Caseína 1% - 1.0 - -
Reactivo de Millon 1.0 1.0 1.0 1.0
Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 5 minutos. Retire y enfríe.
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada

EXPERIMENTO N° 4. REACCION CON ACETATO DE PLOMO
FUNDAMENTO
Cuando un compuesto orgánico que contiene azufre, es tratado con una solución fuerte
de NaOH, este se hidroliza según:
Este sulfuro inorgánico es altamente ionizable y como resultado de esto se puede

obtener algún test de precipitación para el ion sulfuro. Uno de los más comunes es la
67
precipitación por el plomo. En efecto, la adición de acetato de plomo causa la formación de

sulfuro de plomo (negro o pardo).
El azufre de la cisteína reacciona fácilmente con el acetato de plomo en cambio el

azufre de la metionina a causa de su gran estabilidad no ennegrese con el plomo. La mayor
parte de las proteínas contienen azufre formando parte de la metionina. Son excepciones las
queratinas, insulina y ciertas seroalbúminas que contienen azufre en forma de cistina o
cisteína. La fibroína de la seda y algunas protaminas no contienen azufre. La ergotioneina
también contiene azufre y puede dar esta reacción.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (cisteína, cistina y metionina)
NaOH 40%
Acetato de Plomo 0.5 M
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4
Caseína 1% - 2.0 - -
NaOH 40% 1.0 1.0 1.0 1.0
Acetato de plomo 0.5 M 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 3 minutos. Retire y enfríe.
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada

EXPERIMENTO N° 5. REACCION McCARTHY-SULLIVAN
FUNDAMENTO
Sirven para identificar la presencia de metionina. Para tal efecto se utiliza nitroprusiato
de sodio (Na2NOFe(CN)5) desarrollándose una coloración roja en presencia de dicho
aminoácido.
MATERIAL
Tubos de ensayo
68
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina)
NaOH 6 N
Nitroprusiato de sodio (20 g/L. Prepárese fresco).
HCl 2 M
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4
Caseína 1% - 1.0 - -
NaOH 6 N 1.0 1.0 1.0 1.0
Nitroprusiato de sodio 0.5 0.5 0.5 0.5
Lleve los tubos a baño maría a temperatura no mayor de 40°C durante 10 minutos.
Luego enfríe y por las paredes del tubo deslice 1.0 ml de HCl.
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada
Luego agite los tubos y observe otra vez

EXPERIMENTO N° 6. REACCION DE HOPKINS-COLE
FUNDAMENTO
Esta prueba es positiva para aminoácidos que poseen un anillo indol como el triptofano.
El grupo indol del triptofano reacciona con el ácido glioxílico (CHO-COOH) del reactivo en
presencia del ácido sulfúrico dando un color púrpura o violeta en la interfase de los dos
líquidos.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, triptofano)
Caseína 1%
Acido sulfúrico concentrado
Reactivo de Hopkins-Cole
69
METODO DE TRABAJO
Color
Tubo N° 1 2 3 4
observado
Caseína 1% - 1.0 - -
Reactivo Hopkins-Cole 0.5 0.5 0.5 0.5
Después de añadir el reactivo de Hopkins-Cole agite y agregue a cada tubo, deslizando

por las paredes, 1.0 ml de ácido sulfúrico concentrado, luego lleve al baño de agua hirviente
por 3 minutos. Retire y enfríe.
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada

CUESTIONARIO
1. Calcular el punto isoeléctrico de los siguientes aminoácidos: a) glicina, b) ácido glutámico
y c) lisina. Desarrolle las reacciones de disociación
2. Cuáles son las movilidades electroforéticas relativas a pH 5.68 de alanina, arginina, ácido
glutámico, serina y triptófano.
3. Una solución que contiene ácido aspártico (pI=2.98), glicina (pI=5.97), leucina (pI=5.98) y
lisina (pI=9.74) en tampón citrato pH=3 es aplicada a una columna cambiadora de cationes
equilibrada con el mismo tampón. En qué orden eluirán los aminoácidos de la columna?
4. Un determinado péptido fue tratado con el reactivo de Sanger y al realizar la hidrólisis se

observó que el 1-fluoro, 2,4-dinitrobenceno (DNFB) no reaccionó con ningún aminoácido,
Cómo explica?
5. Al hidrolizar el péptido X, se obtuvo la siguiente composición: Lis, His. Asp, Glu (2), Ala,
Pro, Val, Tir. Al tratar el péptido con DNFB dio Asp-DNF y al ser tratado con
Carboxipeptidasa A, liberó valina. La digestión del péptido con Tripsina produjo dos
péptidos: 1) Lis, Asp, Glu, Ala, Tir y 2) His, Glu, Pro, Val. Éste último dio His-DNF al ser
tratado con DNFB. Cuando se trató con Quimotripsina se obtuvo otros dos péptidos: 1)
Asp, Ala, Tir y 2) Lis, Pro, His, Glu (2), Val. Con una tercera enzima se aisló el dipéptido
His, Glu. Con los datos proporcionados, deduzca la estructura primaria del péptido X e
indique a que polo migrarán los péptidos obtenidos con la digestión con Tripsina si el pH
de la corrida es 6.2.
6. Calcular las concentraciones de las especies iónicas de una solución de histidina 0, 25 M

a pH 2. (pK1= 1.82, pK2= 6, pK3= 9.17)
70
PRACTICA N° 7
CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS
Las proteínas constituyen más del 50% del peso seco de las células. Son estructuras
formadas por una o más cadenas polipeptídicas. El número de permutaciones y
combinaciones que se pueden obtener a partir de los 20 aminoácidos es enorme y por esto el
número posible de proteínas es realmente muy grande.
Las proteínas, presentes en los organismos vivos, cumplen diferentes funciones. Actúan
como transportadoras de vitaminas, oxígeno y bióxido de carbono. Actúan también como
enzimas, hormonas, anticuerpos, moléculas de almacenaje, unidades estructurales, fuentes de
energía, etc.
Muchas proteínas son lábiles y fácilmente modificables por una serie de agentes:
variaciones del pH, radiaciones ultravioleta, calentamiento en solución acuosa, solventes
orgánicos, etc., que determinan cambios dentro de su molécula (alteraciones de la disposición
de las cadenas peptídicas) y modificaciones en sus propiedades, constituyendo la llamada
“desnaturalización”.
Uno de los trabajos más laboriosos e interesantes del Bioquímico es la purificación de

proteínas para su caracterización y cuantificación posterior.
I. PRECIPITACION DE PROTEINAS
Las proteínas son coloides liofílico (en particular, hidrofílicos); se hallan estabilizadas
por ambas cargas y por interacciones proteína-solvente. Cuando una de estas influencias
estabilizadoras es removida, la proteína precipita algunas veces; cuando ambas de estas
influencias son eliminadas, la proteína siempre precipita.
1.1. Precipitación en el Punto Isoeléctrico. Las proteínas, como los aminoácidos, son
menos solubles en su punto isoeléctrico. Algunas proteínas, por ejm. caseína, son precipitadas
ajustando el pH de la solución al punto isoeléctrico de la proteína.
1.2. Precipitación por Sales. La adición de una sal neutra causa la precipitación de las
proteínas. Las diferentes proteínas son precipitadas a diferentes concentraciones de sal. Esto
ocurre más fácilmente en el punto isoeléctrico de la proteína. El efecto de la sal es eliminar el
agua de solvatación, lo cual disminuye la interacción proteína-agua y aumenta la interacción
proteína-proteína, causando así la precipitación. La sal comúnmente usada para este
tratamiento es el sulfato de amonio, pues es extremadamente soluble.
1.3. Precipitación por Solventes Orgánicos. La adición de ciertos solventes orgánicos,

como etanol y acetona, precipitan las proteínas, y otra vez la precipitación ocurre más
fácilmente en el punto isoeléctrico de la proteína. Los solventes orgánicos también eliminan
agua, así disminuyen la interacción proteína-agua. Este procedimiento debe ser llevado a cabo
a 0°C, de otro modo puede ocurrir desnaturalización.
1.4. Precipitación por Aniones Complejos. Los ácidos como tricloroacético, sulfosalicílico,
pícrico, tánico, tungstico, fosfomolibdico, etc. precipitan proteínas. La precipitación
probablemente se debe a la neutralización de la carga positiva de la proteína por el anión libre.
Este tipo de precipitación causa muchas veces desnaturalización debido al pH extremo al que
se le lleva a la proteína.
1.5. Precipitación por Metales Pesados. Los cationes de metales pesados como mercurio,
plomo, cobre, plata, oro, platino, etc., precipitan las proteínas en condiciones alcalinas. El
catón libre disminuye la carga negativa de la proteína, causando así la precipitación. Estos
71
iones algunas veces desnaturalizan las proteínas porque reaccionan con los grupos SH para
formar sulfuros.
II. DESNATURALIZACION DE LAS PROTEINAS

Las proteínas nativas son altamente ordenadas, son moléculas complejas. Cualquier
fuerza que altere la estructura tridimensional de la molécula sin que haya ruptura del enlace
peptídico causa desnaturalización. Las proteínas desnaturalizadas tienen propiedades
diferentes a las proteínas nativas y ellas ya no poseen actividad fisiológica. Además, la
desnaturalización disminuye la solubilidad de las proteínas en agua, porque el arreglo de los
grupos hidrofílicos, orientados hacia la superficie, está destruido. Son comunes agentes
desnaturalizantes, el calor, pH extremo, oxidación y reducción los cuales afectan el enlace
disulfuro, agitación, radiación y urea. Las proteínas presentan diferentes susceptibilidades
para cada agente desnaturalizante. La desnaturalización puede ser un proceso reversible.
Algunas veces, cuando se remueve el agente, como en el caso de la urea, a proteína nativa es
restaurada.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO Y SOLUBILIDAD DE

LA CASEINA.
FUNDAMENTO
El punto isoeléctrico (pI) es la concentración de iones hidrógeno a la que la proteína es
eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al número total de
cargas negativas de la proteína. En este punto, algunas proteínas son muy insolubles y
precipitan, pero otras permanecen en solución (ovoalbúmina, gelatina). En este punto la carga
neta de todos los grupos disociables, como carboxilo, amino, imidazol, guanidino, etc., es igual
a cero. La superficie de la proteína siempre posee una carga eléctrica que depende del pH, de
los electrolitos presentes y del solvente, en particular del agua, y de los puentes hidrógenos;
pero existe un conjunto de condiciones, basado en las relaciones de todos estos factores, para
el cual la suma de las cargas positivas es igual a la suma de las cargas negativas. En este
momento el número de moléculas de proteína que tienen una carga neta positiva o negativa
es mínimo o nulo. Como las cargas del mismo signo se rechazan, en estas condiciones
algunas moléculas pueden formar agregados en lugar de rechazarse. Pero a ambos lados del
punto isoeléctrico, todas las moléculas tienen una carga neta positiva o negativa; estas
moléculas se rechazan, y es mínima la tendencia a la agregación y precipitación. Por tanto, en
general, el pH coincide con la solubilidad mínima de las proteínas.
Los solventes orgánicos como el etanol, también causan precipitación de proteínas de

un proceso que puede ser atribuido generalmente a la acción deshidratante.
Cada proteína tiene un determinado punto isoeléctrico (Tabla 1) que puede ser
determinado aprovechando algunas propiedades de las proteínas que están comprometidas,
utilizando por lo general efecto del pH sobre la solubilidad de las proteínas. Algunas proteínas,
como la caseína de la leche son fácilmente precipitables, ajustando el pH de la solución a su
pI, por lo cual este procedimiento se describe como “precipitación isoeléctrica”.
72
Tabla 1. Punto Isoeléctrico de algunas proteínas
PROTEÍNA pI
Ovoalbúmina 4.6
Tiroglobulina 4.6
Caseína 4.7
Gelatina 4.7
Seroalbúmina 4.8
(humana)
Fibrinógeno 5.5
Seroglobulinas 6.4 – 7.2
Homoglobulina 6.9
(caballo)
Mioglobina (caballo) 7.0
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Solución de caseína al 0.5% en acetato de sodio 0.1 N
Acido acético 1 N
NaOH al 10%
METODO DE TRABAJO
Preparar el siguiente sistema de tubos:
Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Agua destilada 8.38 7.15 8.75 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
Ac. Acético 0.01 N 0.62 1.75 - - - - - - -
Ac. Acético 0.1 N - - 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -
Ac. Acético 1.0 N - - - - - 1.6
Caseína 1% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Agitar los tubos antes y después de agregar la solución de caseína. Haga el cálculo del
pH teórico para cada uno de los tubos. Anote los resultados, marcando la falta de turbidez con
0, los grados de la misma con signos + (emplee hasta ++++ con la máxima turbidez), según
corresponda para cada tubo. Determinar con la mayor precisión el tubo que presenta el
máximo de precipitación, lo cual se producirá en el tubo que tiene un pH próximo al punto
isoeléctrico y al de solubilidad mínima de la caseína. Observar a los 10 minutos y 20 minutos,
anote los cambios. Seguidamente calentar los tubos en baño maría a 37 °C y anote sus
apreciaciones. Agregar NaOH al 10% gota a gota y observe los cambios.
Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH teórico
Turbidez inmediata
Turbidez a los 10 min
Turbidez a los 20 min
Turbidez y precipitado
después de calentar
NaOH 0.1 N
73

Presente fotos y explique los resultados.
EXPERIMENTO N° 2. DESNATURALIZACION DE PROTEINAS
FUNDAMENTO
Una proteína está en su estado nativo cuando existe en su forma natural dentro de las
células. El aislamiento de proteínas tiene por objeto no alterar este estado nativo y si este se
altera se dice que la proteína se ha desnaturalizado. La desnaturalización proteica se debe a
la ruptura de los enlaces secundarios, como puentes de hidrógeno y enlaces de tipo iónico, lo
que hace que la estructura globular de la proteína se altere desenrollándose la molécula,
ocurriendo la precipitación. En el estado desnaturalizado, las proteínas se vuelven menos
solubles. Esta solubilidad puede ser restablecida por acción de álcalis o bases.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Solución de albúmina da huevo al 1%
Acido acético
Acido clorhídrico
Nitrato de plata
Nitrato de potasio
METODO DE TRABAJO
a) Desnaturalización de las proteínas por acción del pH:
En 3 tubos de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina a cada uno de ellos. Al tubo
1 agregue 10 gotas de HCl concentrado, al tubo 2 agregue 10 gotas de ácido acético glacial
y al tubo 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de
Biuret a cada tubo.
Anote sus observaciones.
Tubo Observación Prueba de Biuret

1 Albúmina + HCl
2 Albúmina + CH3COOH
3 Albúmina + Agua destilada
b) Desnaturalización de las proteínas por acción de los metales pesados:

En 3 tubos de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina a cada uno de ellos. Al tubo
1 agregue 10 gotas de nitrato de plata, al tubo 2 agregue 10 gotas de nitrato de potasio y al
tubo 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret
a cada tubo.

1 Albúmina + Nitrato de plata
2 Albúmina + Nitrato de potasio
3 Albúmina + Agua destilada
74
c) Desnaturalización de las proteínas por acción de la temperatura:

En un tubo de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina. Lleve el tubo al calor
(llama de mechero). Luego realice la prueba de Biuret.

1 Albúmina + Calor

Presente fotos, analice los resultados anote sus conclusiones
EXPERIMENTO N° 3. PRECIPITACION POR SALES DE METALES PESADOS Y IONES

NEGATIVOS.
FUNDAMENTO
Las proteínas pueden ser precipitadas de una solución con varios iones positivos o
negativos.
Los iones positivos comúnmente usados son aquellos de metales pesados, tales como
el zinc, cadmio, mercurio, fierro, cobre y plomo. Estos iones precipitan las proteínas de
-
soluciones alcalinas, porque a este pH la proteína está disociada como proteína (anión), la
cual se combina con los iones metálicos positivos para dar un precipitado insoluble de
proteinato de metal. Estos iones metálicos pueden ser removidos del proteinato de metal por
acidificación, lo cual convierte a la proteína negativa en proteína positiva.
Los iones negativos (aniones) más usados son el tungstato, fosfotungstato,

tricloroacetato, picrato, tanato, ferrocianato y sulfosalicilato. Estos precipitan proteínas de
soluciones ácidas, es decir, cuando la proteína está carada positivamente (catión), formando
sales de proteínas. Muchas de estas sales son insolubles y son la base de los métodos de
desproteinización.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Solución de caseína al 1%
Solución de ovoalbúmina al 1%
Cloruro de mercurio al 5%
Acetato de plomo al 10%
Ácido acético al 5%
Ferrocianuro de potasio al 10%
Ac. Tricloroacético al 10%
METODO DE TRABAJO
Preparar el siguiente sistema de tubos:
TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caseina 0.5% 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 - - - - -
Ovoalmúmina 1% - - - - - 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Cloruro de mercurio 5% 0.5 - - - - 0.5 - - - -
Acetato de plomo 10% - 0.5 - - - - 0.5 - - -
75
Ac. Acético 5% - - 0.5 - - - - 0.5 - -

Ferrocianuro de potasio 10% - - - 0.5 - - - - 0.5 -
Ac. Tricloroacético 10% - - - - 0.5 - - - - 0.5
Anote los resultados en la tabla. Luego a los tubo 3, 4, 7 y 9 agregue NaOH 10% gota a
gota y observe los resultados.
Caseina Ovoalmúmina NaOH

Cloruro de mercurio
Acetato de plomo
Ferrocianuro de potasio
Ac. Acético
Ac. Tricloroacético

Presente fotos, analice los resultados anote sus conclusiones.
EXPERIMENTO N° 4. ESTIMACION CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE PROTEINAS.

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BIURET
FUNDAMENTO
Este método colorimétrico es una prueba confiable para determinar la concentración de
proteínas, pero requiere cantidades relativamente grandes de proteínas.
El reactivo de Biuret es sulfato de cobre diluido en una solución alcalina. Los compuestos que
tienen dos o más enlaces peptídicos reaccionan con los iones cúpricos para dar un complejo
que tiene un característico color púrpura o violáceo. No está demás recalcar, que la proteínas
dan un color violeta intenso, las proteosas y peptonas (que son productos de la hidrólisis de
las proteínas solubles en agua y no coagulables por el calor) dan color rosado intenso y los
péptidos dan un color rosado claro. La gelatina da un color azul, y; de los aminoácidos, la
histidina es el único que da positiva la reacción de biuret.
MATERIALES
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Espectrofotómetro
Estándar de proteínas (Albúmina de suero Bovino) 10 mg/ml en NaOH 1 N
NaOH 1 N
Reactivo de Biuret: Disolver 1.5 g de sulfato de cobre y 6 g de Tartrato de sodio y potasio
en 500 ml de agua destilada. Añadir agitando constantemente 300 ml de NaOH al 10%.
Completar a 1000 ml con agua destilada
PROCEDIMENTO
a) Determinación cualitativa de proteínas. Para realizar la prueba se toman 2 ml de la
solución a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 2 ml del reactivo de Biuret. Se
mezcla y se deja en reposo 30 minutos a 37 °C. Si la prueba es positiva se desarrollará un
color violeta.
b) Curva Estándar para proteínas. A una cantidad de proteína en un rango comprendido

entre 2 a 10 mg se le adiciona NaOH para obtener un volumen final de 1.0 ml. Luego se le
agrega 4.0 ml del reactivo de Biuret. Se mezcla y se deja en reposo 30 minutos a 37 °C.
Transcurrido este tiempo se lee en el fotocolorímetro frente a un blanco apropiado (1.0 ml
de NaOH más 4.0 ml de Biuret). Anote sus resultados. Determinar el factor de calibración.
76
Tubo [Proteína]
Ab Fc
N mg/ml
Bl -
1 2
2 4
3 6
4 8
5 10
Para obtener la curva de calibración, utilice papel milimetrado y grafique los valores de
absorbancia en las ordenadas y la concentración de proteína en las abscisas.
c) Determinación cuantitativa de proteínas. Se toma 1.0 ml de suero diluido 10 veces

(1:10). Se añade 4.0 ml del reactivo de Biuret, se agita y se deja en reposo durante 30
minutos a 37 °C. Transcurrido este tiempo se lee en espectrofotómetro a 540 nm frente a
un blanco apropiado.
Determinar la cantidad de proteína en mg/ml teniendo en cuenta el factor de

calibración determinado anteriormente.
*En los cálculos no se olvide de la dilución realizada*
CUESTIONARIO
1. Al titular 2.0 ml de una solución de proteína al 7% entre pH 11.5 y 13.5, se gastaron 1.8
ml de NaOH 0.001N. Estimar el número de residuos de arginina que tiene dicha proteína,
sabiendo que su peso molecular es de 93.330.
2. Qué pH eligiría para separar mediante electroforesis una mezcla de las siguientes
proteínas:
Mezcla A: Ureasa (pI = 5.0) y Seroalbúmina (pI = 4.9)
Mezcla B: Mioglobina (pI = 7.0) y Citocromo C (pI = 10.6)
3. La insulina es sintetizada en las células ß del páncreas a partir de la proinsulina, que es un

polipéptido de una sola cadena. Señale los métodos que Ud. utilizaría para realizar la
separación de ambas proteínas, teniendo en cuenta los siguientes datos fisico-químicos.
Indique los resultados que esperaría encontrar al usar cada uno de los métodos que
propone. Proinsulina: PM = 6000, pI = 5.3; Insulina: PM = 9000, pI = 6.4.
4. Una muestra de suero sanguíneo tiene 6.7 g de proteínas totales. Mediante la electroforesis
en papel se analizan sus fracciones proteicas y se encuentran los siguientes porcentajes:
Albúmina 55%, -1-Globulina 6%, -2-Globulina 9%, -Globulina 11% y -Globulina 19%.
Encontrar el contenido de cada fracción proteica en g%. Determine si existe alteración en la
concentración de cada una de estas proteínas.
77
PRACTICA N° 8
EXTRACCION E IDENTIFICACION DE DNA
La Biología Molecular contemporánea se centra en: 1) como la información está

ordenada en el cromosoma, 2) como se procesa la información, 3) como se reproducen a sí
mismas la información cada vez que la célula se divide, y 4) como puede modificarse la
información para generar nuevas instrucciones. La regulación y el control de cada una de
estas transacciones de información constituyen otro aspecto de la biología molecular,
disciplina que nos permite conocer la vida al facilitarnos la comprensión de las funciones que
desempeñan las macromoléculas.
Hoy se sabe que una sola molécula, el DNA, puede explicar en su totalidad los
fenómenos de codificación, procesamiento, replicación y modificación de la información. El
DNA por lo tanto es el responsable de la transmisión de la información de una generación a
otra para conservar la continuidad genética entre progenitores y descendientes
Uno de los procedimientos básicos en la biología molecular es la extracción y

purificación de moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA), como primer paso a posteriores
análisis.
Son varios los métodos utilizados para la extracción de DNA, todos ellos por lo general
tienen el mismo principio, es decir, empiezan con una lisis celular, seguido por una remoción
de proteínas y por último la obtención del DNA de alta pureza por precipitación etanólica.
Entre las técnicas más comunes de extracción de DNA, se considera:

- Hervir la muestra en agua destilada
- Acción de detergentes
- Acción de NaOH
- Acción de enzimas proteolíticas
- Uso de solventes orgánicos
- Sonicación
- Congelamiento y descongelamiento
Después de la extracción y purificación del DNA, el paso siguiente es la cuantificación

del DNA. Esta cuantificación es importante para posteriores análisis como PCR, secuenciación
hibridación, etc. Tres son los métodos más utilizados para la cuantificación, los cuales se
diferencian en la precisión, así como en la cantidad de muestra requerida. Dichos métodos
son:
- Espectrofotometría
- Fluorometría
- Fluorescencia en Bromuro de Etidio
Otros métodos sólo nos determinan la presencia de bases nitrogenadas

(espectrofotometría), la identificación de desoxirribosas y la identificación de grupos fosfato.
EXPERIMENTO N°1. EXTRACCION DE DNA A PARTIR DE BULBO DE CEBOLLA
OBJETIVO
Purificar DNA de células vegetales
FUNDAMENTO
Una característica importante del DNA es el hecho de que sus dos cadenas pueden ser
78
separadas cuando se rompen los puentes de hidrógeno que unen sus bases. Esto se puede
conseguir, por ejemplo, por medio del calentamiento de una solución de DNA a altas
temperaturas. El punto medio de una serie de temperaturas en las cuales las cadenas de un
DNA se separan se conoce como temperatura de fusión o Tm (melting temperature). Esta
separación puede ser monitoreada por el aumento de densidad óptica de la solución de DNA o
por la pérdida de la viscosidad. Cada molécula de DNA tiene una temperatura de fusión
característica que depende principalmente de la proporción de pares G-C. Debido a que cada
par G-C presenta tres puentes de hidrógeno, es más estable que el par A-T que forma dos
puentes de hidrógeno. Cuanto más pares G-C estén presentes en el DNA mayor será la
energía necesaria para separar las dos hebras. El valor de Tm aumenta cerca de 0.4ºC cada
vez que la cantidad de pares G-C aumenta en 1%. Una solución de DNA en condiciones
fisiológicas, por lo general, presenta un valor de Tm de 85-95ºC. Un DNA con 40% de pares
G-C (típico del genoma de mamíferos) presenta una Tm de 87ºC, mientras que un DNA con
60% de G-C tiene un Tm de 95ºC, ambos en condiciones fisiológicas.
El enfriamiento de la solución que contiene el DNA desnaturalizado, permite que se

vuelvan a formar los puentes de hidrógeno y que el DNA readquiera las propiedades que
pueden ser medidas tanto por la disminución de la densidad óptica como por el aumento de la
viscosidad. El hecho de que el DNA se desnaturaliza y se re naturaliza por la variación de la
temperatura permitió el establecimiento de la técnica de PCR (polymerase chain reaction).
REACTIVOS
Solución de lisis
Alcohol etílico al 95%
Reactivo de difenilamina
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

1. Solución de lisis: mezclar 0.1% de dodesilsulfato de sodio (detergente SDS) en 25 mmol/L
de EDTA pH 8.0
2. Reactivo de difenilamina: Disolver 1 g de difenilamina en 100 ml de ácido acético glacial y
adicionar 2.75 ml de ácido sulfúrico concentrado.
PROCEDIMIENTO
1. Descascarar un cebolla de tamaño medio
2. Rallar la cebolla con un rallador común. Es importante que no haya grandes pedazos de
cebolla.
3. Pesar unos 50 g de cebolla rallada y adicionar 100 ml de la solución de lisis.
4. Dejar la mezcla a temperatura ambiente por 10 a 20 minutos.
5. Filtrar la suspensión a través de un embudo que contiene algodón, y recoger el filtrado en
una probeta. Anotar el volumen.
6. En un tubo de ensayo colocar 4 ml del filtrado. Adicionar 2 volúmenes de etanol al 95%,
procurando no mezclar las dos soluciones. Observar en la interface, la formación de un
precipitado blanquecino. Con la ayuda de una varilla de vidrio enrollar el material
blanquecino.
7. Transferir el material de la varilla de vidrio a otro tubo de ensayo y disolverlo en 0.5 ml de
agua. A esta solución, adicionar 1.5 ml de reactivo de difenilamina.
8. En otro tubo de ensayo adicionar 0.5 ml de agua y 1.5 ml de reactivo de difenilamina.
Colocar los dos tubos en baño maría hirviente por 10 minutos. Comparar los resultados
obtenidos.
9. El filtrado restante (ítem 5) debe ser transferido a un beaker y a esta solución se le añade 2
volúmenes de etanol al 95%. El material blanquecino formado en la interface de las dos
soluciones debe ser enrollado en una varilla de vidrio y transferido a otro tubo deensayo.
10. Disolver el precipitado en 5 ml de agua con el auxilio de la varilla de vidrio. Dividir esta
solución en dos tubos para observar cambios de viscosidad n diferentes condiciones.
11. Pipetear la solución de uno de los tubos con una pipeta graduada de 0.2 ml y cronometrar
el tiempo de desplazamiento de la solución a partir de la marca 0 ml hasta la marca 0.15
ml.
79
12. El otro tubo debe ser mantenido en baño maría hirviente por 10 minutos. Después del
periodo de calentamiento, proceder como en el ítem 11, anotando el tiempo de
desplazamiento.
13. Enfriar la solución en hielo por 15 minutos y repetir el procedimiento 11.
14. Interpretar los resultados.
15. Esquematice lo realizado.
EXPERIMENTO N° 2. IDENTIFICACION DE BASES NITROGENADAS
a) Método 1: Tomar 2 ml del extracto de DNA y leer su absorbancia en el espectrofotómetro a

260 nm. Si está muy concentrado diluir en etanol.
b) Método 2: Agregue gotas de Hidróxido de amonio (NH4OH) concentrado hasta obtener un

medio básico y algunas gotas de Nitrato de Plata 0.1 M a una pequeña cantidad del
precipitado obtenido que ha sido colocado en un tubo de ensayo. Observe y anote sus
resultados
EXPERIMENTO N° 3. IDENTIFICACION DE AZUCARES
MATERIAL
Solución ácida de difenilanima
Ribosa 1%
Reactivo de bial
Tubos de ensayo
Pipetas
Baño maría
Hielo
a) IDENTIFICACION DE DESOXIRRIBOSA
Utilizando el reactivo de Dische, se toma en un tubo de prueba 2 ml del extracto de
DNA, añadir 4 ml de la solución ácida de difenilamina, mezclar bien y colocarlos por 10 mim en
baño de agua hirviente. Retirar y enfriar en hielo y observar la reacción. Anote sus resultados.
b) IDENTIFICACIÓN DE LA RIBOSA
Tome 4 tubos de ensayo y agregue lo siguiente en cada uno:
Tubo Sustrato Reactivo de Bial HCL concentrado

1 1 ml Agua destilada 1 ml 2.5 ml
2 1 ml de ribosa 1% 1 ml 2.5 ml
3 1 ml de ribosa 0.5% 1 ml 2.5 ml
4 1 ml del precipitado 1 ml 2.5 ml
Lleve al calor por 5 minutos o hasta que observe un cambio de color.

El reactivo de Bial está compuesto por iones férricos, etanol y orcinol. Consiste en la
formación de un producto de color azul-verdoso entre el furfural y el orcinol en medio
clorhídrico. Es específico de pentosas. Anote sus resultados.
EXPERIMENTO N° 5. IDENTIFICACION DEL GRUPO FOSFATO
MATERIAL
Acido perclórico 7.5 N
Molibdato de amonio 2.5%
Acido 1-amino-2,4-naftol sulfónico
Hidróxido de amonio
80
Acido nítrico
Molibdato de amonio
Tubos de ensayo
Pipetas
Embudo
Perlas de vidrio
Baño maría
Hielo
PROCEDIMIENTO
a) Método 1: Se procede colocando en un tubo de ensayo 0.5 ml del extracto de DNA y 0.5 ml
de ácido perclórico 7.5 N. Colocar en el tubo un embudo pequeño con una perla de vidrio.
Colocar en baño maría hirviente por 30 min. Dejar enfriar y proceder a identificar el fosfato
inorgánico de la siguiente forma: colocar en un tubo de ensayo 0.5 ml del contenido del
tubo anterior, añadir 3.5 ml de agua destilada, luego 0.5 ml del reactivo de molibdato de
amonio al 2.5% y finalmente 0.5 ml del reactivo reductor (Acido 1-amino-2,4-naftol
sulfónico). Dejar reposar por 5 min. El color azul nos indica la presencia de fosfato
inorgánico. Anote sus resultados.
b) Método 2: Agregue un poco del precipitado en un tubo de ensayo y añada Hidróxido de

Amonio (NH4OH) concentrado hasta obtener un medio básico, acidifique con algunas gotas
de HNO3 y agregue Molibdato de Amonio (1mL). Observe y anote sus resultados.
CUESTIONARIO
1. Cuál es los componentes de la solución de lisis y para que se usan cada uno de ellos?
2. A qué se debe la diferencia de viscosidad del DNA observada en los experimentos?
3. Si las temperaturas altas desnaturalizan al DNA, porqué en la extracción de DNA a partir

de tejidos vegetales se requiere de temperatura de 65 °C?
4. Para la extracción de DNA se puede utilizar proteinasas?. Si su respuesta es afirmativa,

explique a que componente podría reemplazar o en que paso sería apropiada utilizarla
durante la extracción de DNA.
5. ¿Qué condiciones físicas conducen a la desnaturalización del DNA?. ¿Por qué se observa
un incremento en la absorción de luz UV (efecto hipercrómico) al desnaturalizarse el DNA?
81
PRÁCTICA N°9
EFECTO DE CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO: DETERMINACIÓN DE Km

y Vmax DE LA FOSFATASA ÁCIDA DE QUINUA
Las enzimas son moléculas proteicas especializadas, que aceleran las reacciones
químicas llevándolas más rápidamente a su posición de equilibrio.
Las fosfatasas ácidas denominadas también Monoéster Ortofosfórico Fosfohidrolasa,

actúan en un rango de pH entre 5.0 y 6.5, hidrolizan sustratos que tienen un enlace fosfoéster,
liberando como productos de la reacción fosfato inorgánico y un alcohol, el cual varia
dependiendo del sustrato utilizado. Estas enzimas no necesitan de metal alguno para
evidenciar su actividad.
Son varios los factores que afectan la actividad enzimática, haremos mención de alguno
de ellos:
1. EFECTO DEL TIEMPO. La cantidad de producto formado en una reacción enzimática es
proporcional al tiempo de incubación. La reacción es lineal en el tiempo hasta un período
determinado en que se puede expresar la actividad enzimática en términos de velocidad, o
sea la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. Generalmente la velocidad se
expresa en micromoles de producto formado por minuto.
2. EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA. Cuando el sustrato se encuentra en

exceso, a concentraciones saturantes, la velocidad de la reacción es proporcional a la
concentración de la enzima.
3. EFECTO DEL pH. La mayor parte de las enzimas tienen un pH característico en el cual su
actividad es máxima, a ese pH se le denomina pH óptimo, y se define como el pH en el cual la
enzima y el sustrato presentan una conformación estructural adecuada para la actividad
catalítica. Por encima y por debajo de este pH la actividad declina, adoptando una forma
característica de campana.
4. EFECTO DE LA TEMPERATURA. La velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas

generalmente se incrementa con la temperatura dentro del margen de estabilidad y plena
actividad de la enzima. Cuando la temperatura alcanza un cierto valor, variable, según la
enzima que se trate, esta empieza a desnaturalizarse y la velocidad de la reacción empieza a
disminuir. La temperatura a la que se alcanza ese valor máximo se denomina temperatura
óptima.
5. EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO. Es el más importante, ya que

determina la velocidad de la reacción. En la mayoría de los casos, cuando se representa la
velocidad en función de la concentración de sustrato, manteniéndose constante la
concentración de enzima, se obtienen curvar hiperbólicas en las cuales puede observarse que
para valores muy pequeños de concentración de sustrato [S], la velocidad de reacción es
directamente proporcional a la concentración del propio sustrato.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N°1. EFECTO DE CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
82
Espectrofotómetro
Baño maría a 37 °C
Buffer Acetato de Sodio 0.1 M pH 5
-2 -3
Sustrato: p-Nitrofenilfosfato 1 x 10 M y 1 x 10 M
Enzima: Fosfatasa ácida
NaOH 1 N
PROCEDIMIENTO: Prepare un sistema de tubos por duplicado tal como se indica a

continuación:
-2 -3
Conc. Inicial de p-NO2ϕ-P 1 x 10 M 1 x 10 M
-3 -4 -4 -4 -5
Conc. Final de p-NO2ɸ-P 1x10 B 5x10 B 2x10 B 1x10 B 5x10 B
Buffer Acetato 0.1 M pH 5 (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
p-NO2-P (ml) 0.2 0.2 0.1 0.1 0.4 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1
Agua Destilada (ml) 0.7 0.8 0.8 0.9 0.5 0.6 0.7 0.8 0.8 0.9
Preincubar 2 min a 37 °C
Enzima 0.1 - 0.1 - 0.1 - 0.1 - 0.1 -
Incubar 3 min a 37 °C
NaOH 1 N (ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Leer en espectrofotómetro a 400 nm.
CÁLCULOS
4 -1 -1
Coeficiente de Extinción Molar del p-Nitrofenol: 1.8 x 10 M cm
Anotar las absorbancias para cada concentración de sustrato utilizada
ABSORBANCIAS Abs Velocidad [p-Nitrofenol]

1/ µMoles/min 1/[p-Nitrofenol]
Blanco Tubo 1 Tubo 2 Neta µMoles/min Moles
-4
10x10
-4
5x10
-4
2x10
-4
1x10
-4
0.5x10

Presente figuras de velocidad frente a concentración de sustrato (Diagrama de Michaelis-
Menten), y 1/V frente al 1/[S] (Diagrama de Lineweaver-Burk). A partir de ésta última
determina Km y Vmax. Analice los resultados anote sus conclusiones.
CUESTIONARIO
1. Describa el mecanismo de la reacción enzimática de la fosfatasa ácida
2. Se ha determinado la velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente para

diversas concentraciones de sustrato. Los datos obtenidos son los siguientes:
-
[S] (mol/L) V [(mol/L) min ]
5 22
10 39
20 65
83
50 102
100 120
200 135
Estime Vmax y Km utilizando las representaciones gráficas de Michaelis-Menten y Lineweaver-
Burk
3. El efecto de la temperatura en la hidrólisis de la lactosa mediante una ß-galactosidasa se

muestra a continuación. Calcular la energía de activación y también Q 10.
T Vmax
(°C) (uM/min/mg de proteína)
20 4.50
30 8.65
35 11.80
40 15.96
45 21.36
4. Se estudia la cinética del estado estacionario de una enzima en ausencia y en presencia de

un inhibidor (inhibidor A). La velocidad inicial viene dada en función de la concentración de
sustrato en la siguiente tabla:
-1 -1
V[(mmol/L) min ]
[S] (mmol/L) Sin inhibidor Inhibidor A Inhibidor B Inhibidor B
3 mM 5 mM
1.25 1.72 0.98 1.25 1.01
1.67 2.04 1.17 1.54 1.26
2.5 2.63 1.47 2.00 1.72
5.00 3.33 1.96 2.86 2.56
10.00 4.17 2.38 3.7 3.49
a) Qué tipo de inhibición produce el inhibidor A?

b) Determina Vmax y Km en presencia y ausencia del inhibidor A
c) Qué tipo de inhibidor es el inhibidor B?
d) Determine Vmax y Km para cada concentración del inhibidor B
e) Estime Ki a partir de estos datos.
84
PRACTICA N° 10
TRANSPORTE ELECTRONICO: ESTUDIO DE LA ACCION ENZIMATICA DE

LA SUCCINATO DESHIDROGENASA Y DE LACTATO DESHIDROGENASA
OBJETIVO
1. Poner de manifiesto experimentalmente una de las etapas del metabolismo intermediario y
la acción de las enzimas de oxido-reducción, haciendo uso de un aceptor de electrones
como el azul de metileno.
2. Verificar la acción inhibitoria del malonato sobre la succinato deshidrogenasa y del cianuro
a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial.
ESTUDIO DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA
INTRODUCCIÓN
Las transformaciones biológicas de sustratos comprenden procesos de oxido-reducción
y transferencia de electrones a través de una serie de sistemas enzimáticos.
En las oxido-reducciones se produce transferencia de electrones a partir de un dador

hasta un aceptor. Algunas veces el transporte de electrones es realizado mediante la
transferencia de átomos de hidrógeno o bien átomos de hidrógeno y un electrón. Las enzimas
que realizan este tipo de reaccione son las deshidrogenasas pudiendo ser piridin (NAD,
NADH) o flavina (FAD) dependientes; además existen los citocromos que son de naturaleza
ferroporfirínica y se encuentran ordenados de acuerdo a su potencial de oxido reducción
constituyendo la llamada "Cadena de Transporte Mitocondrial".
Algunos compuestos orgánicos coloreados, al aceptar hidrógenos se convierten en

leucoderivados. Tal es el caso del azul de metileno cuyo potencial de oxido-reducción es +0.01
y el 2,6-diclorofenolindofenol cuyo potencial de oxido-reducción es +0.22.
La succinato deshidrogenasa (SHD) es una flavoproteína unida a hierro no hémico. El

metal tiene como finalidad actuar como enlace para conservación de energía y desacoplar los
dos equivalentes reductores del ion hidrogeno aceptado por la flavina y, finalmente estabilizar
la forma semiquinoide de la flavina.
Diversas sustancias pueden actuar inhibiendo los sistemas biológicos de oxido-

reducción. Por ejemplo, el malonato actúa específicamente inhibiendo a la succinato
deshidrogenasa por un mecanismo competitivo; por lo tanto la prueba experimental con azul
de metileno será negativa, es decir no se decolora por no haber movilización de electrones. El
cianuro, actúa impidiendo la reoxidación de los citocromos, pues se combina específicamente
con el Fe++ de la citocromo oxidasa; por ello los citocromos permanecen reducidos e
incapaces de seguir actuando y se bloquea la respiración.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
Sucrosa 0.25 M
Succinato de sodio 0.1 M
Malonato de sodio 0.5 M
Buffer fosfato pH 7.4 0.1 M
Azul de metileno 0.05%
Aceite mineral
Tubos de ensayo
85
Pipetas
Morteros
Centrífuga
METODO DE TRABAJO
A) Preparación del homogenizado. Colocar un mortero sobre hielo picado, luego pesar 10.0
g. de hígado, corazón o músculo de rata o de conejo; picarlo y colocarlo sobre el mortero.
Añadir 90.0 ml de sucrosa 0.25 M la cual debe estar fría, homogenizar y luego centrifugar a
8000 rpm durante 10 min. Decantar el sobrenadante en un beaker y guardarlo e frío hasta su
uso.
Tubo N° 1 2 3 4
Succinato de sodio 0.1 - 0.5 0.5 0.5
Buffer fosfato pH 7.4 2.0 2.0 2.0 2.0
Malonato de sodio - - 0.5 -
Cianuro de potasio 0.1 M - - - 0.5
Agua destilada 1.5 1.0 0.5 0.5
Azul de metileno 0.05% 0.5 0.5 0.5 0.5
Extracto enzimático 0.5 0.5 0.5 0.5
Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0
El contenido de cada uno de los tubos se mezcla rápidamente antes de agregar el

aceite mineral, el cual tiene la función de crear un medio libre de oxígeno. Llevar a baño maría
a 37°C observar el decoloramiento de cada tubo cada 5 min. Discuta los resultados.
CUESTIONARIO
1. Haga un esquema de la oxidación del succinato por acción de la succinato
deshidrogenasa, además acople la cadena respiratoria para indicar el destino final del
hidrógeno y de los electrones del succinato.
2. Cuál es el efecto de cada uno de los siguientes inhibidores sobre el transporte electrónico
y la formación de ATP en la cadena respiratoria.
a) Azida
b) Atractilósido
c) Rotenona
d) Monóxido de carbono
f) Antimicina A
3. Que son los desacopladores ed la fosforilación oxidativa. Ponga por lo menos dos
ejemplos.
4. Asumiendo que las concentraciones mitocondriales de succinato y fumarato son

respectivamente de 0.0002 M y 0.00003 M, estimar el potencial redox en estas
condiciones. Considere que el proceso se estudia a pH 7.0 y a 25°C.
86
5. En el estudio de la reacción catalizada por la fosfoglucomutasa se encontró que en el

equilibrio las concentraciones de glucosa-1-fosfato y glucosa-6-fosfato fueron 4.5 mM y
96.0 mM respectivamente. Calcular la constante de equilibrio y el G°' para esta reacción
que se procesa a 25 °C.
6. Cuando el citrato es descompuesto para dar acetato y oxalacetato, el G°' es de -680

cal/mol. Para la reacción catalizada por la citrato sinteasa la constante de equilibrio es de
0.000032. Estime con estos datos la constante de equilibrio para la reacción de hidrólisis
del acetil CoA y el G°'.
7. La reacción de hidrólisis de la lactato deshidrogenasa tiene un G°' de -3.8 Kcal/mol.

Encontrar la constante de equilibrio para dicha reacción que se realiza en condiciones
estándar.
87
PRACTICA N° 10
GLICOLISIS
PRODUCCION DE ACIDO PURIVICO DURANTE LA FERMENTACION DE

LA GLUCOSA POR LA LEVADURA Y SU IDENTIFICACION
INTRODUCCION
La glucólisis es el proceso por el cual la glucosa se degrada a Etanol y CO2, y/ó a ácido
láctico dependiendo del organismo que lo efectúe.
Ambas rutas de fermentación son similares hasta la formación de piruvato, manteniendo

idénticas las etapas de conservación de energía que conducen a la formación de ATP.
La glucólisis no solo es la ruta principal para el metabolismo de la glucosa que conduce a

la producción de Acetil−Co−A y a su oxidación en el ciclo del ácido cítrico, sino que también
proporciona una vía importante para metabolizar fructosa y galactosa derivada de los
alimentos. La característica de la glucólisis de proporcionar ATP en ausencia de oxígeno es de
significado crítico biomédico, porque permite al músculo esquelético hacer un trabajo
sumamente eficiente aún cuando la oxidación aeróbica se vuelva insuficiente, a la vez que los
tejidos con capacidad glucolítica pueden sobrevivir a episodios de anoxia. Inversamente, el
músculo cardíaco, que está adaptado al trabajo aeróbico, tiene una capacidad glucolítica
relativamente deficiente y supervivencia escasa bajo condiciones de isquemia. Hay un número
pequeño de enfermedades en las que las enzimas del sistema glucolítico como por ejemplo la
piruvatocinasa muestran actividad deficiente; estas anomalías se manifiestan principalmente
como anemias hemolíticas. En las células cancerosas que proliferan con rapidez, la glucólisis
procede a una velocidad mucho mayor que la requerida por el ciclo del ácido cítrico; por tanto,
se produce más piruvato que el que puede ser metabolizado. El resultado es una producción
excesiva del lactato, que favorece un entorno local relativamente ácido en el tumor, situación
que puede tener implicaciones con ciertos tipos de terapéutica contra el cáncer. También se
produce acidosis láctica por deficiencia de piruvato deshidrogenasa.
OBJETIVOS
- Demostrar la formación de ácido pirúvico durante la fermentación de la glucosa por
levadura.
- Producir e identificar ácido pirúvico a partir de glucosa.
- Observar el comportamiento reaccionante del sistema.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Tubos de centrifuga
Trípode, rejilla con asbesto, mechero
Baño maría
Pipetas
Centrifuga
Vasos de precipitados de 250 y 600 ml.
Pinzas para tubos de ensayo.
Solución de glucosa a diversas concentraciones 0.5, 1.0 y 2.0%
Suspensión de levadura al 5 % en Na2HPO4 y KH2PO4 (18 hrs de fermentación antes de su
utilización).
Acido tricloroacético al 10%
Nitroprusiato de sodio.
88
2,4 dinitrofenil−hidracina.
Hidróxido de amonio concentrado.
Hidróxido de sodio 0.1N
Sulfato de amonio sólido.
Nota: un día antes de la práctica llevar su levadura para fermentarla
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. FORMACIÓN DE PIRUVATO

 Marcar dos series de tubos de 3 cada una y adicionar 3 ml de las soluciones de glucosa a
las diferentes concentraciones (0.5, 1.0, 2.0%) a ambas series.
 A una de las series de tubos adicionarles 3 ml de suspensión de levadura con fosfatos de
sodio (0.213 g/100 ml) y marcarlos como A; y a la otra serie adicionarle 3 ml de la
suspensión de levadura con fosfatos de potasio (0.09 g/100 ml) y marcarlos como B.
 Colocar todos los tubos en baño maría a 37ºC por 30 minutos y añadir posteriormente a
cada tubo 1 ml de TCA al 10%. Mezclar vigorosamente y centrifugar a 2500 r.p.m. por 10
minutos. Separar el sobrenadante y desechar el precipitado.
EXPERIMENTO N° 2. IDENTIFICACIÓN DE PIRUVATO

1. Reacción con nitroprusiato de sodio. En un tubo de ensayo colocar 1 ml del
sobrenadante obtenido y hervirlo. Adicionarle 0.5 g de sulfato de amonio sólido y agitar.
Agregar dos gotas del reactivo y mezclar vigorosamente y dejar deslizar por las paredes del
tubo unas gotas de hidróxido de amonio concentrado, hasta la formación de dos capas. La
formación de un anillo verde o azul en la interfase indica que la reacción es positiva. Repetir
lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series. Esquematice e interprete sus
resultados.
2. Reacción con 2,4 dinitrofenil−hidracina. En un tubo de ensayo colocar 1 ml del

sobrenadante obtenido y adicionar 1 ml del reactivo, agitar con fuerza y pasar a otro tubo la
mitad de la mezcla formada, y adicionar 1 ml de NaOH 0.1N. La aparición de un color rojo
indica reacción positiva. Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series.
Observar la coloración e intensidad de la misma en cada caso. Esquematice e interprete sus
resultados.
CUESTIONARIO
1. Señale cinco características que usted considere más importa con respecto a la vía
glicolítica
2. De qué manera la glicólisis influye en el transporte de electrones?
3. Cuántos enlaces fosfato de alta energía surgen en el catabolismo de la glucosa? Tanto

aeróbica como anaeróbicamente.
4. Calcular la constante e equilibrio para la fosforilación de la glucosa si el G°´ para la

hidrólisis de glucosa-6-fosfato es de -3 Kcal/mol. Indicar si la formación de la glucosa-6-
fosfato a partir de la glucosa es un procesos exergónico o endergónico.
5. Describa los principales centros de control de la vía glicolítica.
89
PRACTICA N° 12
FOTOSINTESIS
Es el proceso químico más importante de la biología. Incluye todos los procesos por los
que: a) la luz solar absorbida se utiliza para impulsar las biosíntesis; b) el CO 2 es reducido
hasta glucosa por las plantas verdes y; c) el agua es oxidada para liberar oxígeno. Por esta
razón, el fenómeno global de la fotosíntesis se representa por la siguiente ecuación:
Energía solar
2H2O + CO2 (CH2O) + H2O + O2
Clorofila
G°'= +118000 cal/mol de CO2 reducido
El agua es el donador de electrones que se emplea para reducir el CO2 y el fenómeno

está acoplado al desprendimiento de oxígeno.
Este proceso se realiza en los cloroplastos, los cuales contiene los pigmentos que
absorben la luz y las enzimas necesarias. Los cloroplastos se asemejan a las mitocondrias por
poseer capas apiladas de membranas internas en las que las transferencias de electrones se
asocian con fosforilación; también tienen su propio DNA y los sistemas para la síntesis de
proteínas. Los cloroplastos elaboran glucosa y la acumulan como almidón durante las horas
de luz; las mitocondrias oxidan el piruvato desde residuos de glucosa, especialmente durante
la noche, para proporcionar energía a la planta.
CENTROS DE REACCION. Para una eficaz absorción de la luz solar, los cloroplastos
contienen los carotenos y las clorofilas que tienen estructuras altamente resonantes. La
energía de excitación pasa desde un pigmento a otro hasta que llega a un centro de reacción,
donde los complejos de clorofila "a" se hallan asociados con otras proteínas necesarias para la
utilización de la energía. La clorofila "a" en el centro de reacción pierde la energía de
excitación y es oxidada por la transferencia de electrones hasta un aceptor.
FOTOFOSFORILACION CICLICA. En los centros de reacción tipo I los electrones

desplazados por fotooxidación son transferidos de nuevo desde sus receptores hasta la
clorofila oxidada. La transferencia se da a través de varios transportadores a la vez que son
utilizados para generar ATP. En este mecanismo, los electrones desplazados por la luz
absorbida son devueltos continuamente a la clorofila original pero la recombinación ocurre por
el aparato de fosforilación oxidativa.
PRODUCCION DE OXIGENO. Los electrones necesarios para llevar la clorofila oxidada del
PS I a su estado inicial, también pueden ser donados por el agua. Para que suceda esto, la luz
es absorbida por el PS II, en el que la clorofila oxidada después de la eliminación de un
electrón reaccionará con los iones hidroxilos del agua y liberará oxígeno. Los electrones
también se transfieren desde el PS II al PS I a través de parte del aparato de fosforilación
oxidativa, y en este caso se genera por lo menos un ATP por cada par de electrones
transferidos.
REDUCCION DE FERREDOXINA. El uso del agua como donador de electrones permite a los
electrones ser liberados del sistema para otros fines, dejando atrás el oxígeno. El aceptor
inmediato de los electrones liberados por el PS I es una sustancia reductora de ferredoxina, la
cual es reducida por la SRF y es utilizada en las plantas verdes para reducir NADP hasta
NADPH.
REDUCCION DEL DIOXIDO DE CARBONO. La glucosa se elabora a partir de CO 2, utilizando

el NADPH y el ATP producidos en los procesos fotoquímicos. El CO 2 es fijado por la
90
combinación con ribulosa-1,5-difosfato, esta se escinde para formar dos moléculas de 3-

fosfoglicerato, las cuales se reducen con NADPH. La pentosa transportadora de CO 2 se
regenera por una reordenación de parte de las triosas fosfato obtenidas, y el remanente sirve
para formar glcosa-6-fosfato que será utilizada como combustible. La secuencia completa
constituye el Ciclo de Calvin, en el que el ATP se utiliza para regenerar ribulosa difosfato y
para formar 1,3-difosfoglicerato el que se reducirá a triosa fosfato por el NADPH.
El funcionamiento del Ciclo de Calvin depende de la isomerización y epimerización de

las pentosas fosfato, a través de una reacción de transcetolasa en la que dos unidades de
carbono son transferidas vía tiamina pirofosfato desde un donador cetosa hasta un donador
aldosa.
RUTA DE HATCH-SLACK. Los cloroplastos están construidos de tal forma que la velocidad
del Ciclo de Calvin varía con la concentración de CO 2 atmosférico. Una planta que disminuye
su pérdida de agua cerrando los estomas de las hojas, restringe también el suministro de CO 2,
excepto algunas plantas evolucionadas que sobreviven en condiciones secas y calurosas, y
utilizan el ATP para concentrar el CO2. La ruta de Hatch-Slack comprende la carboxilación de
piruvato hasta oxalcetato a expensas de ATP en un anillo externo de las células mesófílicas,
seguido de la reducción hasta malato por NADH. El malato se difunde en el interior de un
anillo de células de la vaina, donde es descarboxilado oxidativamente por NADP para formar
piruvato y una elevada concentración de CO2 para el ciclo de Calvin.
ALTERACION DE LA ATMOSFERA. La fotosíntesis es responsable de la oxido-reducción,

representada por la acumulación de compuestos de carbonos reducidos en los sedimentos a
expensas de carbonatos, y de la acumulación de oxígeno en la atmósfera a expensas del
agua. Las alteraciones en el equilibrio de CO 2 y O2 actualmente se autocompensan, siendo el
sistema tan masivo que las alteraciones catastróficas debidas a la interferencia del hombre no
son sino perturbaciones sencillas en la estequiometría del sistema.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS Y FRAGMENTOS DE

CLOROPLASTOS.
FUNDAMENTO
Los cloroplastos enteros y los cloroplastos desintegrados se preparan macerando hojas
u otro material vegetal en agua o solución hipertónica, los desechos celulares groseros se
remueven por filtración y los otros constituyentes protoplasmáticos por centrifugación
diferencial los procedimientos que se describen se basan en que los cloroplastos intactos se
obtienen utilizando solución hipertónica de sacarosa, en cambio el uso de agua u otra solución
hipotónica acompañada de trituración vigorosa provocan la ruptura de los cloroplastos
obteniéndose así los fragmentos de cloroplastos.
Los métodos descritos son satisfactorios para preparar suspensiones de cloroplastos a

partir de hojas de espinaca, tabaco y algunas otras especies y también a partir de algunas
algas.
INSTRUCCIONES GENERALES
Todas las operaciones se deben realizar a 0°C o a temperaturas cercanas a 0°C (4°C).
Se debe lavar varias veces las hojas recientemente colectadas o almacenadas en el frío. Se
les deja escurrir y se les coloca en una bolsa plástica en un cuarto frío durante unas horas
hasta que las hojas se hinchen. Luego se remueven los peciolos y las levaduras y se secan
las hojas entre papel filtro. Si se utilizan algas, estas deben ser lavadas por filtración o
centrifugación. Examine las suspensiones de cloroplastos bajo el microscopio (400 a 1000x)
antes de usarlas.
91
MATERIAL
Centrífuga
Homogenizador de cuchillas
Tejido de nylon o gasa
Tubos de ensayo
Fiolas
Sacarosa 0.5 M
Solución buffer fosfato de potasio (solución 0.1 M de KH2PO4 en sacarosa ajustada a pH
6.5)
Medio de sucrosa (solución de EDTA en solución buffer fosfato 10 mM, ajustada a pH 6.5)
METODO DE TRABAJO
1. Cloroplastos enteros a partir de hojas de espinaca. En la licuadora homogenice 100 g.
de hojas de espinaca bien lavadas con 100 ml. de medio de sucrosa por no más de 3 min.,
poniendo al máximo de velocidad las cuchillas del homogenizador. Filtrar el homogenizado
verde a través de una doble capa de tejido de nylon o gasa para remover las paredes
celulares y fibras. centrifugar el filtrado a 200 xg por 5 min, para remover las partículas
extrañas y las células intactas. Desechar el precipitado.
El sobrenadante se centrifuga a 600 xg por 12 min para sedimentar los cloroplastos

intactos. Descartar el sobrenadante. El precipitado se resuspende con 20 ml de sucrosa 0.5 M
fría y se centrifuga de nuevo a 600 xg durante 12 min. Descartar el sobrenadante. El
sedimento así obtenido constituye los cloroplastos enteros. Resuspenda los cloroplastos en 20
ml de sucrosa u otro medio hipertónico (medio de reacción helado) agitándolo suavemente con
una varilla de vidrio y almacenándolo sobre hielo hasta cuando lo utilice.
Anote el volumen obtenido:
2. Aislamiento de cloroplastos desintegrados a partir de hojas de espinaca. Homogenizar

100 g. de hojas de espinaca en 100 ml de agua destilada a máxima velocidad por 3 a 5 min.
Filtra el homogenizado a través de una doble capa de tejido de nylon o gasa. Centrifugar el
filtrado a 600 xg por 12 min y descarte el sedimento. Centrifugar el sobrenadante a 15000 xg
por 15 min. Descartar el sobrenadante, suspenda el sedimento en agua, centrifugue y
descarte el sobrenadante. Resuspenda el precipitado el cual contiene los cloroplastos
desintegrados en agua u otra solución.
EXPERIMENTO N° 2. DETERMINACION DEL CONTENIDO DE CLOROFILA.
FUNDAMENTO
La concentración de clorofila de una suspensión de cloroplastos, de fragmentos de
cloroplastos o de algas intactas se puede determinar midiendo la densidad óptica en un
extracto de metanol o de acetona.
MATERIAL
Centrífuga
Tubos de ensayo
Metanol
Acetona al 80%
METODO DE TRABAJO
1. Extracto con Metanol. Centrifugue 1 ml de la suspensión verde oscura por 20 min a 20000
xg por 20 min y descarte el sobrenadante. Suspenda el sedimento en 5.0 ml de metanol
absoluto a la temperatura del laboratorio, centrifugue y decante el metanol sobrenadante.
Extracte el sedimento dos veces, y diluya hasta un volumen final de 20 ml con metanol.
a. Método de Warburg. Determine la densidad óptica del extracto de metanol a 578 nm en
una cubeta de 1 cm.
92
Cálculo:
b. Método de Mackinney. Determine en una cubeta de 1 cm., la densidad óptica del

extracto de metanol a 665 nm y a 650 nm, la absorción máxima para la clorofila "a" y
para la clorofila "b".
Cálculo:
-----------------------------------------------------------------------------
Nota: 1 mg de clorofila/ ml = 1.11 x 10-3 M.
Método de Warburg Método de Mackinney

D.O. 578
D.O. 660
D.O. 665
Realice los cálculos necesarios para determinar los mg de clorofila por ml.
2. Extracto con Acetona. Agregue 1 ml de la suspensión de cloroplastos a 10 ml de acetona

al 80% v/v en agua, mezcle fuertemente. Filtre a través de papel Whatman N° 1 y recoja en
un matraz volumétrico de 25 ml. enjuague los tubos con 5 ml de la solución acuosa de
acetona usándola luego para lavar el papel filtro. Repita el lavado una vez más y completa
hasta la marca de 25 ml con acetona al 80% v/v. Mida la extinción de la solución verde a
652 nm contra un blanco de solvente.
Cálculo:
D.O. 652
Bl
Muestra
EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE HILL
FUNDAMENTO
La síntesis de carbohidratos a partir de CO 2 y agua se da en dos etapas, reacción
luminosa y reacción oscura. La reacción luminosa que se demuestra en este experimento se
efectúa solo en presencia de luz visible, que es absorbida por la clorofila de los cloroplastos.
Los electrones de la clorofila son llevados a niveles más altos de energía y retornan al estado
inicial por una serie de reacciones semejantes a las de la cadena respiratoria mitocondrial.
Durante este proceso de transporte de electrones se produce ATP. Al mismo tiempo se
producen equivalentes reductores en forma de NADPH2 y se libera O2.
La fotólisis del agua o "Reacción de Hill" se define como una reacción de oxido-
reducción dependiente de luz, catalizada por cloroplastos, fragmentos de cloroplastos, o en
algunos casos, células vegetales intactas, en la que el agua es el donador de hidrógeno, se
produce oxígeno, y alguna otra sustancia. El CO 2 (reactivo oxidante de Hill es el aceptor de
93
hidrógenos. La reacción lleva el nombre de Robert Hill, quien fue el primero en observar la
reducción del oxalato férrico por cloroplastos iluminados (aislados). La reacción de Hill se
puede estudiar: a) siguiendo la evolución del oxígeno, b) por el cambio de la concentración del
ion hidrógeno, c) por el cambio del potencial de óxido-reducción; y d) por la reducción de un
oxidante.
En este experimento usamos el 2,6-diclorofenolindofenol como un aceptor artificial de

hidrógenos. La reducción del colorante no se efectúa en la oscuridad. Tampoco se aprecia
reducción cuando se usa cloroplastos hervidos.
La lenta oxidación espontánea del 2,6-diclorofenolindofenol permite usar una cubeta

abierta (de 1 cm. de trayectoria de luz y de 5 a 10 ml de capacidad), como un vaso de
reacción o un tubo de ensayo. Sobre la cubeta se enfoca un rayo de luz que proviene de un
foco de 100 watt. La cubeta de reacción, a su vez está sumergida e un baño de agua a
temperatura constante.
MATERIAL
Fotocolorímetro
Tubos de ensayo
Cubetas de vidrio
Focos de 100 watt
Mezcla de reacción (buffer fosfato de potasio 0.02 M pH 6.5, que contiene KCl 0.05%) 2,6-
diclorofenolindofenol 0.1 M
Ácido Ascórbico
Preparación de cloroplastos: diluya los cloroplastos enteros o fragmentados con la mezcla
de reacción hasta obtener una concentración de clorofila de aproximadamente 5 mg/ml.
METODO DE TRABAJO
Mezcle 1.0 ml de suspensión verdosa de cloroplastos con 4.0 ml de la solución de 2,6-
diclorofenolidofenol. Prepare cuatro tubos de la misma forma. Coloque el primer tubo en la
oscuridad durante el experimento. Al segundo tubo añada suficiente ácido ascórbico para
reducir completamente el colorante y lea inmediatamente la extinción a 520 nm; esta solución
reducida nos da una lectura cero en el instrumento. Lea la extinción del tercer tubo (lectura
inicial) frente al al segundo tubo. Introduzca el cuarto tubo (tubo experimental) en el baño de
temperatura constante y dejar 5 min en la oscuridad para que se establezca el equilibrio
térmico. Para poner en marcha la reacción, se retorna el aparato a la luz (frente al foco de 100
watt). Siga la reducción del colorante midiendo la extinción de las muestras retiradas a
intervalos convenientes hasta un tiempo de 30 min. Al final del experimento, lea la extinción
del tubo que guardó en la oscuridad.
La diferencia entre la lectura inicial y la lectura cero es proporcional al cambio de la DO

cuando todo el colorante está reducido. Puesto que se conoce la concentración del colorante,
calcule el número de micromoles de colorante reducido.
Con los valores de densidad óptica obtenidos durante los 30 min de experimentación,
haga una gráfica colocando los datos de densidad óptica en el eje vertical y el tiempo en
minutos en el eje horizontal.
EXPERIMENTO 4. HERBICIDAS: INHIBICION DE LA REACCION DE HILL
FUNDAMENTO
La intensa búsqueda y desarrollo de la industria de agroquímicos, en los 25 años
pasados, ha dado lugar a un amplio rango de herbicidas para el control de malezas. Se han
hecho considerables esfuerzos para examinar su absorción y translocación en plantas, su
destino molecular y los mecanismos bioquímicos a través de los cuales ejercen su actividad
herbicida. Moreland indica que muchos herbicidas parecen no específicos y que su
94
fitotoxicidad es una expresión de varias respuestas bioquímicas deletéreas. Sin embargo, se

han revelado algunos sitios bioquímicos particularmente sensibles, sobre los cuales son
efectivas concentraciones muy bajas de un herbicida apropiado. La inhibición de la reacción
de Hill por amidas sustituidas (ureas, fenilcarbamatos y acilanilidas), s-triazinas y uracilos es
un buen ejemplo.
METODO DE TRABAJO
Los métodos para la preparación de cloroplastos y la reacción de Hill ya han sido
descritos: aquí sólo es necesario indicar algunas alternativas adoptadas.
La lechuga rinde preparaciones de cloroplastos con buena actividad de Hill y es fácil de

conseguir. Cada lechuga provee unos 100 g de tejido foliar útil. Los cloroplastos se aislan por
maceración y centrifugación a 4ºC en un cuarto frío.
La mezcla de reacción para determinar la actividad de Hill comprende 3 ml de solución

salina “alternativa”, 3 ml de DPIP 1 mM, 0.2 ml de etanol o herbicida en solución etanólica,
suspensión de cloroplastos (el volumen se ajusta de modo que la preparación exhiba una
velocidad no inhibida de reducción del colorante de unos 0.2 umol/min) y agua para un
volumen final de 10 ml. La reacción se realiza a 24ºC preincubando los componentes más
voluminosos de la mezcla (solución salina, agua y DPIP) en tubos de colorímetro a esta
temperatura. El herbicida y los cloroplastos se añaden inmediatamente antes del ensayo. La
temperatura no variar más 1ºC. La reacción se sigue iluminando el tubo por periodos de 15 o
30 segundos y registrando, entre sucesivas iluminaciones, la disminución en la absorción de la
luz roja. Como referencia se usa un tubo no iluminado, que contiene todos los componentes
de la mezcla de reacción y un exceso de ascorbato para reducir el DPIP.
CUESTIONARIO
1. Explique en qué se diferencia el fotosistema I del fotosistema II.
2. Algunas bacterias degradan H2S en vez de H2O durante la fotosíntesis de modo que
despiden azufre. Fue durante sus investigaciones acerca de estas bacterias cuando Van
Niel se percató de que el oxígeno desprendido por las plantas superiores durante la
fotosíntesis proviene del agua y no del CO 2. Qué razonamiento condujo a Van Niel a esa
conclusión?
3. Los siguientes datos, describen la cinética de la incorporación de CO 2 por la enzima

rubisco en presencia de N2 y con O2 puro. Determine si el O2 es un inhibidor competitivo o
no competitivo.
[CO2] (mM) Con N2 Con O2

0.20 16.7 10
0.10 12.5 5.6
0.067 8.3 4.2
0.050 7.1 3.2
95
PRÁCTICA N°13
HIDROLISIS ENZIMATICA DE LOS LIPIDOS POR LIPASA PANCREATICA
FUNDAMENTOS
Gran parte de los alimentos que ingiere un individuo está constituido por grasas, en los
cuales los triglicéridos constituyen un 90%. Los triglicéridos a nivel del intestino proximal, se
hidrolizan en sus componentes debido a la acción de la LIPASA PANCREATICA, cuya acción
se incrementa por la presencia de sales biliares que favorecen su emulsión. La lipasa
pancreática actúa en un rango de pH de 7.8 a 8.0. Los triglicéridos se hidrolizan en ácidos
grasos, glicerol, monoglicéridos y diglicéridos. Todos estos componentes son emulsionados
hasta pequeñas micelas que se absorben fácilmente.
Los aceites son lípidos constituidos básicamente de ácidos grasos insaturados, como el
palmítico, esteárico y el ácido mirístico.
La hidrólisis de los triglicéridos del aceite de oliva usando pancreatina (extracto de

enzimas pancreáticas) liberará ácidos grasos que podrán ser titulados.
EXPERIMENTO N° 1. HIDROLISIS DEL ACEITE DE OLIVA POR LA LIPASA

PANCREATICA.
MATERIALES
Tubos de ensayo
Baño maría
Pipetas
Buffer fosfato pH 8.0: A 100.00 ml de fosfato monopotásico 0.2 M, se le agrega 93.6 ml de
NaOH 0.2 M y se completa a 400.00 ml con agua destilada.
Solución de sales biliares al 1% en buffer fostato pH 8
Solución de pancreatina al 1% en suero fisiológico o buffer fosfato pH 8.0
Fenolftaleína al 0.1%
Hidróxido de sodio 0.01 N.
Emulsión de aceite: Agregar 5 gotas de fenolftaleína a 100.00 ml de aceite de oliva y la
cantidad suficiente de hidróxido de sodio 0.01 N para neutralizar. Se detiene la titulación
cuando aparece un color rosa tenue.
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4 5 6
Emulsión de aceite 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Buffer fosfato pH 8.0 2.0 2.0 - - - -
Sol. de sales biliares - - 2.0 2.0 - -
Sol. pancreatina 2.0 - 2.0 - 2.0 -
Sol. pancreatina hervida - 2.0 - 2.0 - 2.0
Agua destilada - - - - 2.0 2.0
96
Mezclar y colocarlos en baño maría a 37 °C durante 30 min, agitando los tubos a

intervalos. Al finalizar el tiempo de incubación, retirar los tubos del baño maría y agregar a
cada uno 3 gotas de fenolftaleína y realizar la titulación de ácidos grasos liberados, por acción
de la lipasa sobre las grasas, con NaOH 0.01 N hasta que aparezca una coloración rosada.
Anotar el volumen de álcali gastado en cada tubo. Calcular el número de equivalentes de
ácidos presentes en cada tubo.
1 2 3 4 5 6
ml de NaOH gastados
Equivalentes de ácido
EXPERIMENTO N° 2. HIDROLISIS DE LOS LIPIDOS DE LA LECHE POR LA LIPASA

PANCREATICA.
MATERIALES
Tubos de ensayo
Baño maría
Erlenmeyer
Pipetas
Buffer fosfato pH 8.0: A 100.00 ml de fosfato monopotásico 0.2 M, se le agrega 93.6 ml de
NaOH 0.2 M y se completa a 400.00 ml con agua destilada.
Solución de sales biliares al 1% en buffer fostato pH 8
Solución de pancreatina al 1% en suero fisiológico o buffer fosfato pH 8.0
Fenolftaleína al 0.1%
Hidróxido de sodio 0.01 N.
Leche hervida y diluida dos veces
METODO DE TRABAJO
En dos erlenmeyer de 50.0 ml se colocan 10.0 ml de leche y 1.0 ml de lipasa en cada
uno. A continuación, a uno de ellos se le añade 1.0 ml de agua destilada y al otro 1.0 ml de
solución de sales biliares y se mezcla rápidamente aspirando con la pipeta.
De cada matraz se toman 2.0 ml de mezcla y se colocan en tubos de ensayo, se le

añade 2 gotas de fenolftaleína y se valora con NaOH 0.01 N hasta la aparición de un color
rosado tenue.
La mezcla que quedó en los matraces se incuban a 37 °C y a intervalos de 15 min se

toman alícuotas de 2.0 ml y se valora con NaOH 0.01 N.
La cantidad de álcali consumido para la neutralización de los ácidos grasos libres

formados en el curso de la hidrólisis de la grasa se determina por la diferencia entre los
resultados de la primera y las siguientes valoraciones. En base a los datos obtenidos realice
un gráfico de la acción de la lipasa frente al tiempo, con y sin sales biliares.
Tiempo Gasto de NaOH Con Sales Biliares Sin Sales Biliares

0
15
30
45
60
97
CUESTIONARIO
1. En la solución de pancreatina además de la lipasa, existen otras enzimas que actúan sobre
lípidos?. Explique cómo actúa cada una de ellas.
2. Explique qué papel desempeñan las sales biliares en la hidrólisis de los lípidos.
3. Realice un esquema donde se aprecie la absorción y digestión de los triacilglicéridos.
4. Investigue que enfermedades se producen por deficiencia de enzimas y cofactores de la

oxidación de los ácidos grasos.
98
PRÁCTICA Nº 14
DETERMINACIÓN DE UREA EN MATERIAL BIOLÓGICO
OBJETIVOS
 Dosar urea en muestra de orina
 Demostrar que la enzima ureasa puede ser utilizada como reactivo específico para la
determinación de un metabolito como la urea
 Utilizar el reactivo de Nessler en la determinación de amonio
 Reforzar lo aprendido sobre aplicación de los métodos fotocolorimétricos
 Reforzar los cálculos que implican dilución y factores de corrección
FUNDAMENTOS
La urea es hidrolizada catalíticamente por la ureasa dando lugar a los productos CO 2 y
NH3 que en solución acuosa forman H2CO3 y NH4OH. Estos últimos reaccionan entre sí dando
carbonato de amonio.
El reactivo de Nessler reacciona con el amoniaco liberado, formando rápidamente un

complejo cuya coloración va desde el amarillo hasta el anaranjado intenso, dependiendo de la
concentración de amoniaco presente. Este complejo de color, permanece en solución coloidal
pero flocula cuando se le deja en reposo, por lo cual se recomienda la inmediata lectura
después de la adición del reactivo. El mecanismo de reacción no está del todo aclarado y se
admite la formación de H2NHg2I3. La sensibilidad de la técnica espectrofotométrica cuantitativa
con el reactivo de Nessler oscila entre 10 a 90 g de nitrógeno.
La tasa normal de urea excretada en los mamíferos es de 20 a 30 g en 24 horas.

Balance nitrogenado en mamíferos: la urea es el principal producto de excreción nitrogenado
en los mamíferos, siendo sintetizada en el hígado (ciclo de la urea) a partir del amoniaco
resultante de la desaminación oxidativa de los aminoácidos y a partir de la hidrólisis de los
grupos amida presentes en la glutamina y en la asparragina. Este metabolito es excretado por
los riñones y su determinación tanto en sangre como en orina indica el estado del balance
nitrogenado en los mamíferos.
REACTIVOS
Solución de ureasa
Reactivo de Nessler
Solución patrón de amonio
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

1. Solución de ureasa: disolver 150 mg de ureasa en 100 ml de solución de EDTA al 1%,
pH 6.5
2. Reactivo de Nessler: Solución A: disolver 12 g de bicloruro de mercurio en 100 ml de
agua destilada a 60ºC. Solución B: disolver 14.8 g de ioduro de potasio en 100 ml de agua
destilada a 60ºC. Mezclar las dos soluciones para obtener un precipitado rojo de ioduro de
mercurio. Sedimentar y lavar el precipitado varias veces con agua destilada. Adicionar 14
g de ioduro de potasio y agua destilada en cantidad suficiente para disolver el precipitado.
Pasar a un balón de 200 ml y agregar 40 g de hidróxido de sodio exento de carbonato, o
sea, una solución de NaOH al 40% p/v. completar el volumen a 200 ml. Dejar en reposo
en frasco oscuro, durante 48 horas, y decantar el líquido límpido (reactivo de Nessler) en
otro frasco oscuro.
3. Solución patrón de sulfato de amonio [(NH 4)2SO4] a 472 mg% (equivalente a 100 mg
de nitrógeno): disolver 472 mg de sulfato de amonio desecado al vacio, por 24 horas, en
un volumen final de 100 ml con solución de H 2SO4 0.1 mol/L. Para obtener la solución de
trabajo, diluir 100 veces la solución original de modo que 10 ml contengan 100 g de
nitrógeno disuelto en H2SO4 0.1 mol/L.
99
Anotar el volumen urinario de 24 horas y diluir la orina con agua en la proporción de 1/100,
1/150, 1/200 y 1/250.
PROCEDIMIENTO
A. Curva de calibración con solución patrón de sulfato de amonio a 472 mg% (= 100
mg% de nitrógeno).
1. En una gradilla, colocar 6 tubos de ensayo y adicionar los reactivos que se indican en la
tabla siguiente.
Tubo Bl 1 2 3 4 5
Solución patrón de (NH4)2SO4 (ml) - 1.5 2.0 4.0 6.0 9.0
Agua destilada (ml) 10.0 8.0 6.0 4.0 1.0
Reactivo de Nessler (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
2. Mezclar el contenido de cada tubo. Esperar 1 minuto y leer la absorbancia a 415 nm

(filtro azul). Calibrar el aparato con el tubo blanco. Determine el factor de calibración.
UK UK neta Ab [Nitrógeno] g Fc
Bl
1
2
3
4
5
3. Trazar un gráfico, ploteando las concentraciones de nitrógeno (g) en el eje de las

abscisas y las respectivas lecturas de absorbancia en el eje de las ordenadas.
B. Dosage de urea en orina

1. En dos tubos de ensayo colocar los reactivos que a continuación se indica: al tubo 7
(blanco de la muestra) adicionar 1.0 ml de agua destilada y 2 gotas de solución de
ureasa. Al tubo 8 (muestra) adicionar 1.0 ml de orina y 2 gotas de solución de ureasa.
2. Incubar a 50ºC, durante 30 minutos
3. Después de la incubación, centrifugar los contenidos de los tubos y, a los
sobrenadantes, añadirles 9.0 ml de agua destilada y 1.0 ml de reactivo de Nessler.
Mezclar y leer, después de 1 minuto, la absorbancia del tubo 8 (muestra) a 415 nm (filtro
azul), calibrando el parato con el tubo 7 (blanco de la muestra).
4. Calcular el resultado en gramos de urea por 24 horas.
NOTA: Para transformar miligramos de nitrógeno ureico en miligramos de urea basta

multiplicar por el factor 2.14 (sabiendo que la masa molecular de la urea es 60 y la masa del
nitrógeno molecular es 28, la razón 60/28 es 2.14).
CUESTIONARIO
1. Empleando la ecuación anterior, calcular la tasa de excreción de urea suponiendo una orina
diluida 50 veces en un volumen urinario de 24 horas de apenas 450 ml.
2. Justifique la utilización de sulfato de amonio como patrón en la determinación de urea.
3. Qué componente de los productos de la reacción catalizada por la ureasa es analizado con
el reactivo de Nessler?
100
4. Porqué la necesidad de dos tubos blancos, el tubo 1 y el tubo 7, para el ensayo?
5. Si la concentración determinada en la muestra excediera el límite de sensibilidad de la

técnica (90 g de nitrógeno), qué procedimiento se debe adoptar?.
101
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103

Guia Bioquimica

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Manual de Prácticas de Bioquímica

NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

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Las soluciones, físicamente se clasifican en:

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La normalidad de una solución se encuentra dividiendo el peso de la sustancia

La milésima parte del peso equivalente gramo, es el miliequivalente y se expresa en

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El uso adecuado de la centrífuga implica:

Figura 1. Centrifuga refrigerada

Figura 3. Diagrama de un espectrofotómetro

 P1000 es útil para volúmenes de 200 hasta 1000 µL

No Trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para

EXPERIMENTO 1: PREPARACION Y TITULACION DE UNA SOLUCION DE NaOH 0.1 N

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La normalidad de la solución es 0.105 N, pero queremos que la solución sea

Se deduce que quedan 90.5 ml de NaOH aproximadamente 0.1 N, que se ha

ml de agua = 90.5 x 0.5 / 9.5

EXPERIMENTO 2: PREPARACION Y TITULACION DE UNA SOLUCION DE HCl 0.1N

El HCl concentrado tiene las siguientes características: PM = 36.5, pureza 37%,

Cuando se trata de elementos o sustancias monovalentes, las soluciones normales son

2. Se quiere preparar 250 ml se solución de H2SO4 0.02 N a partir de una solución

4. Cuántos ml de HCl 0.5 N se requieren para que reaccionen exactamente con 2 g. de

5. Calcular la normalidad de una solución de HCl, sabiendo que 50 ml de esta solución

6. Cuántos moles de NaCl hay en 100 ml de solución 2 M ?

8. Qué volumen de HNO3 0.85 N se necesitará para neutralizar 36 ml de NaOH 0.86 N ?

9. Cuál es la molaridad de una solución que contiene 250 g. de CaCl 2 en 1500 ml de

Muchos compuestos, sean o no coloreados, tienen la capacidad de absorber luz de una

Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de la luz de una solución

La colorimetría es un procedimiento por el cual una solución coloreada de un material

En fotometría o en espectrofotometría se compara la transmitancia de la luz a través de

La velocidad (c), de propagación en el vacío es de 3 x 1010 cm/seg y algo menor al

y según la ecuación anterior inversamente proporcional a la longitud de onda.

En forma logarítmica tenemos:

Al pasar al sistema logarítmico de base 10, el coeficiente de absorción c, se convierte

Donde: log I0/I es la densidad óptica (D.O.) o absorbancia (A). A es directamente

2.2. Ley de Beer. Beer estudió la influencia de la concentración de la solución de una

donde: c = concentración en mol/l.

Cuando en la ley anterior, la transmitancia disminuye exponencialmente con el número

E = coeficiente de extinción molar

2.4. Coeficiente de extincion molar. Por definición, el coeficiente de extinción molar E, es la

2.5. Coeficiente de extincion específica. En muchas ocasiones no se conoce el peso

Si la solución es absolutamente transparente I = 1, y su transmitancia será 1; este valor

Por tanto, los valores de T % van de 0 a 100%. Como la transmitancia va de 0 a 100%,

Si se construye una gráfica de A en función de c, se obtiene una recta, pues la

Ejm. En un espectrofotómetro se ha ajustado al 100% la transmitancia de luz con agua

Ya que en la práctica, siempre se ajusta la transmitancia a 100% (cuyo log = 2), la

2.8. Limitaciones de la Ley de Beer-Lambert. Aunque la ley de Lambert se cumple en todos

2.8.2. Desviaciones Debidas a la Naturaleza de la Muestra. Se deben al cambio en la

2.8.3. Desviaciones Debidas al Investigador. Principalmente se deben a una mala elección

3. RANGOS ADECUADOS DE CONCENTRACION

4. CALCULO DE LA CONCENTRACION DE UNA MUESTRA PROBLEMA

Según la Ley de Beer - Lambert tenemos que:

teniendo en cuenta que el espesor X es constante y que la tratarse de soluciones de la misma

donde: Fc = factor de calibración (Fc = Cst/Ast); esta expresión referida a porcentaje se

v = volumen de la muestra utilizada para la determinación.

4.2. Mediante curvas de calibración. En este caso se utilizan varios patrones de

Luego se construye una gráfica en un sistema de coordenadas, colocando las lecturas

La muestra problema dará una lectura o absorbancia determinada que se busca en el

4.3. Mediante la ecuación A = Ecx. Ecuación obtenida de la combinación de las leyes de