OBSERVACIÓN MICROSCOPICA Y TÉCNICAS
DE COLORACIÓN
S. Hernández Castañeda 1 Y. Urrego Urrego
1, Ingeniería Ambiental. Limnología y Microbiología. Universidad Central. Grupo 2
I. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos, concretamente las bacterias, pueden
observarse directamente al microscopio de campo claro. Sin
embargo, debido al bajo contraste entre las células y su
entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy
limitadas, como por ejemplo para la observación de la
movilidad bacteriana. Los microscopios de contraste de fases,
interferencia diferencial (DIC o la microscopía de Nomarski) y
campo oscuro permiten aumentar el contraste, empleándose
para la observación de vainas, filamentos u otras estructuras
bacterianas. (Tortora, G. J., Funke, B. R. y Case, C. L. 2007)
La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste
entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar
la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos
colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el
contraste. (Tortora, G. J., Funke, B. R. y Case, C. L. 2007)
Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción
positiva es la más frecuente, en ella un colorante se une a
ciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados
en microbiología tienen en común la presencia de grupos
cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los
responsables del color mediante la unión a estructuras celulares
por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que
establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los
colorantes que se unen por enlaces covalentes destaca el
reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de DNA, donde el
colorante se une a la desoxi-ribosa.
Por otra parte, en la tinción negativa se utilizan compuestos que
no penetran en las células sino que impregnan el medio
circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre
un fondo negro (Tortora, G. J., Funke, B. R. y Case, C. L. 2007)
¿Existen diferencias entre las diferentes células
microbianas?
La de células procariotas, a diferencia de la de eucariotas,
carece de orgánulos limitados por una membrana unitaria. A
menudo esta compactada con ribosomas y se encuentra muy
organizada.
La diferencia más obvia entre las células procariotas y
eucariotas radica en el uso de las membranas.
Células procariotas contienen numerosas estructuras. Además,
existen diferencias significativas entre cada género y pared
celular de las células Gram negativas y Gram positivas. Sin
2
embargo, a pesar de estas variaciones, se puede considerar que
las células procariotas son constantes en su estructura
fundamental y en la presencia de ciertos componentes
fundamentales.
¿Por qué el azul de lactofenol permite observar hongos y no
bacterias?
La tinción de Azul de lactofenol se emplea para observar
hongos.
Es una tinción simple (un sólo colorante) y como tal está basada
en la afinidad del colorante por componentes de las células, en
este caso por las estructuras fúngicas.
Este colorante es fuertemente acido, por lo que su función es la
tinción directa del micelio, el cual toma un delicado azul claro.
La función del azul de lactofenol es que el fenol destruye la
flora acompañante y el ácido láctico conserva las estructuras
fúngicas al provocar un cambio de gradientes osmótico con
relación al interior del fúngico generando una película por así
llamarlo protectora.
II. OBJETIVO PRINCIPAL
Observar una preparación fijada y teñida, conociendo el uso y
correcto manejo del microscopio. Verificando las
características de las bacterias, levaduras y hongos observados
en el mismo.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
 Conocer, aprender y manejar las diferentes partes del
microscopio.
 Realizar la esterilización correspondiente a los materiales
de laboratorio.
 Determinar pruebas macroscópicas y microscópicas de
bacterias, hongos y levaduras de algunos alimentos.
III. MARCO TEÓRICO
EL MICROSCOPIO
El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la
imagen de un objeto pequeño. Es el instrumento que más se usa
en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante
un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer
visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden
aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original.
Pedro F. Mateos (20-08-2019)
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el
electrónico. En el microscopio óptico el aumento del objeto se
consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de
los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio
electrónico utiliza un rayo de electrones controlado por un
campo magnético. Pedro F. Mateos (20-08-2019)
OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS
Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser
observados mediante microscopios ópticos, por lo que nos
vamos a limitar a describir las técnicas más comúnmente
usadas para realizar preparaciones para microscopios ópticos.
Preparación en fresco: para poder observar la movilidad de
un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en
suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre
un portaobjetos y cubriéndola, sin formar burbujas de aire, con
un portaobjetos se observa al microscopio de contraste de
fases.
Las tinciones y técnicas de coloración permiten visualizar las
células y la observación de estructuras. Para los
procedimientos de tinción se requiere realizar previamente un
proceso de extendido o frotis del cultivo a revisar, que se debe
dejar secar (a excepción del montaje de cinta pegante para
hongos) y dependiendo del caso fijar al calor para evitar el
retiro de la muestra de la lámina a trabajar, cuando se apliquen
los colorantes y líquidos que se requieran. La mayoría de
colorantes son compuestos orgánicos con afinidad con ciertos
componentes celulares, existen varios tipos, sin embargo, los
más comunes son: 1) Sales colorantes 2) Colorantes
liposolubles. Los que corresponden a sales colorantes pueden
ser, no por su pH en solución, sino por la carga de sus
moléculas más significativas: a) ácidos: catión incoloro unido
a anión coloreado, ejemplo: Eosinato (-) de Sodio (+), y no
tiñen la célula bacteriana y se usan con frecuencia para dar
contraste (coloración de contraste) b) básicos: catín coloreado
unido a anión incoloro, ejemplo: clorhidrato (-) de azul de
metileno (+). Los colorantes liposolubles se combinan con los
componentes lipídicos de la célula bacteriana, por lo que se
usan comúnmente para determinar la ubicación de los depósitos
de grasa en la célula, por ejemplo: Negro de Sudán (Madigan,
2002).
La coloración de Gram Es definida como una tinción
diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las
bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y
bacterias Gram positivas Para el caso de los hongos se puede
realizar una tinción simple con Hidróxido de Potasio al 10 % o
por medio de Azul de Lactofenol, luego de un montaje en fresco
sobre las gotas de los colorantes o bien por montaje con cinta
pegante.
Técnicas de tinción:
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva
las siguientes etapas: extensión, fijación, tratamiento con
colorantes y observación.
1.- Extensión: se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar
totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente
y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota
de H2O.
2.- Fijación: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos
y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del
colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la
muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.
3.- Tinción: se realiza añadiendo los colorantes sobre los
microorganismos sometidos a los procesos anteriores. Puede
ser de varios tipos:
Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el
entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se
extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).
Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier
tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo nos permite observar
la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.
Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno
diferencia una estructura. El colorante que se usa en segundo
lugar es de color diferente al del primero, denominándose
colorante de contraste. Pedro F. Mateos (20-08-2019)
Tinción de Gram
Es la técnica de tinción diferencial más importante que se utiliza
en bacterias. El primero en describirla fue el danés Christian
Gram. Consiste básicamente en añadir lo siguiente:
Cristal violeta (colorante azul)
Lugol (mordiente, sustancia no colorante que refuerza la acción
de un colorante)
Etanol 96° (decolorante que remueve el colorante de ciertas
bacterias)
Safranina (colorante de contraste, rojo)
Esta tinción distingue entre dos amplios grupos de bacterias
según la composición de la pared celular; las Gram (-) que no
OBSERVACIÓN DE BACTERIAS DEL AIRE
retienen el complejo cristal violeta-lugol después de la
decoloración con alcohol y aparecen teñidas de rojo, y las
Gram (+) que sí lo retienen y aparecen teñidas de azul oscuro. ↓
Pedro F. Mateos (20-08-2019)
OBSERVACIÓN DE PROTISTOS
PASOS GRAMPOSITIV GRAMNEGATIV
AS AS ↓
Colorante Violeta Violeta
principal: crist OBSERVACIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS
al violeta
Mordiente: Violeta Violeta ↓
Lugol
Decolorante: Violeta “Transparente” OBSERVACIÓN DE LEVADURAS
alcohol-
acetona Procedimiento para cada uno de las preparación
Colorante de Violeta Rojo
contraste:
safranina

IV. METODOLOGÍA

DIAGRAMA DE FLUJO

↓
OBSERVACION DE BACTERIAS

↓
Preparación y observación de muestras de yogurt

↓
Prender el mechero, esterilizar el asa con el calor

↓
Colocar dos gotas de muestras, realizar un frotis con el asa

↓
Fijar la muestra en el mechero

↓
Antes de la observación microscópica debe realizar
observación macroscópica
 Muestra Descripción
V. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE macroscópica Colonia
RESULTADOS. borde, forma, elevación
Durante el desarrollo de la práctica se analizaron los diferentes
montajes, en los cuales pudimos identificar sus estructuras
utilizando soluciones colorantes. Logrando así una Morfología Colonial;
observación detallada de las estructuras celulares con una Bacteriana: Colonias
correcta identificación de estas. Se procede hacer una Grandes, planas,
observación macro y microscópica de los blanquecinas, forma
microorganismos observados. irregular y filamentosa
en partes, bordes
lobulados, dan la
OBSERVACIÓN DE BACTERIAS
apariencia de estar secas.
CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS
Se realiza el laboratorio donde se concluyen las descripciones
macroscópicas de las muestras. Ilustración 3. Fotografía macroscópica A.N

Muestra Descripción
macroscópica Colonia
borde, forma, En este proceso no es
elevación viable diferenciar las
bacterias presentes en la
muestra a la vista.
En este proceso no es
viable diferenciar las
bacterias presentes en
la muestra a la vista.

Ilustración 4. Fotografía macroscópica de la

muestra de yogurt.

Ilustración 1. Fotografía macroscópica de

la muestra de la tinta china

En este proceso no es
En el tomate se viable diferenciar las
evidencia, el talo o bacterias presentes en la
colonia de moho muestra a la vista.
consiste en largos
filamentos celulares
agrupados. Estos
filamentos se llaman
hifas.
Ilustración 2.Fotografía macroscópica de Ilustración 5. Fotografía macroscópica de la
la muestra hongos filamentosos. muestra de levadura.

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS
 Muestra Descripción microscópica
Durante este laboratorio,
OBSERVACIÓN DE
después de precisar la
MUESTRA DE YOGURT
muestra y dejarla secar, se
logran observar bacterias
con dos tipos de
morfología, Una textura
filamentosa y una forma
granular.
Con una elevación plana.
También se observan cocos
de tipo collar de perlas y
diplococo. Las primeras se
observaron en filamentos
organizados en forma de
cadena, se trataba de varios
cocos unidos entre sí a lo
Ilustración 6. Fotografía microscópica largo de un eje, y las
de la muestra del yogur segundas se observaron solas
o formando diplobacilos,
Objetivo empleado: 40X
pues estaban dos unidas o
próximas entre sí.
OBSERVACIÓN DE Durante este laboratorio,
BACTERIAS DEL AIRE después de precisar la
muestra y dejarla secar, Se
puede observar la cápsula, es
la capa que rodea la esfera.
La cápsula es una estructura
superficial mucosa, más o
menos gruesa que envuelve
la pared celular formada por
polisacáridos o polipéptidos,
que confiere protección a las
bacterias contra la
desecación y la fagocitosis. A
Ilustración 7. Fotografía microscópica consecuencia de su elevado
de la muestra A.N con tinción tinta
china
contenido en agua, se tiñen
débilmente por los
Objetivo empleado: 40X colorantes.
OBSERVACIÓN DE Durante este laboratorio,
HONGOS después de precisar la
FILAMENTOSOS muestra y dejarla secar, Se
puede observar; Hifas,
elementos filamentosos
cilíndricos característicos de
la mayoría de los hongos.
Micelios masa de hifas
constituye o forman cuerpo
vegetativo del hongo.
ESPORAS Elemento o
cuerpo reproductor,
Ilustración 8. Fotografía microscópica típicamente unicelular.
de la muestra del tomate
Objetivo empleado: 40X
Muestra Descripción
microscópica
Durante este
OBSERVACIÓN DE
laboratorio, después de
MUESTRA DE PAN
precisar la muestra, se
logra observar,
Esporangio, Estructura
a modo de saco cuyo
contenido
protoplasmático se
convierte en gran
cantidad de esporas.
Se evidencian las
esporas y sus
Ilustración 9. Fotografía microscópica de la
filamentos.
muestra del Pan
Objetivo empleado: 40X
Durante este
OBSERVACIÓN DE
laboratorio, después de
MUESTRA DE
precisar la muestra y
LEVADURAS
dejarla secar se
observa la formación
de blastosporas (con
puntos regulares de
estrechamiento),
clamidosporas,
micelio. Las levaduras
suelen comportarse
como Gram positivas
Ilustración 10. Fotografía microscópica de
la muestra del Levaduras
Objetivo empleado: 40X
VI. CONCLUSIONES
Se identifico y realizo manejo del microscopio óptico en la
práctica de observación de las bacterias y hongos,
identificando aspectos fundamentales para la vida educativa y
laboral.
Se conoció e identifico las técnicas de coloración simple y
compuesta en el laboratorio con la observación de bacterias y
hongos, comprendiendo los conceptos teóricos vistos en clase.
Se presentaron algunos errores en la práctica debido al manejo
erróneo del material, como en la toma del agua para el estudio
ya que esta no mostro ningún microrganismo en su revisión.
Se determinó por medio de pruebas macroscópicas y
microscópicas las bacterias, hongos y levaduras de algunos
alimentos. Reconociendo su aspecto e identificando sus
características generales.
CUESTIONARIO
¿Cuál es la razón por la cual se utiliza metanol para fijar
muestras?
RTA: Fijan por deshidratación y coagulación de las proteínas,
sobre todo las citosólicas. Extraen los lípidos de los tejidos,
pero no afectan a los carbohidratos. En general, son buenos
fijadores de muestras de pequeño tamaño, preservan el
glucógeno, los pigmentos y las proteínas, como las enzimas. Se
usan frecuentemente para para fijar las extensiones citológicas
o secciones de criostato obtenidas de tejido no fijado. También
como unos conservantes de las muestras. Pueden producir
endurecimiento y retracción de los tejidos, muy evidentes en
bloques de tejido muy grandes. Carecen de efecto mordiente.
¿Describa características de tinción de los siguientes grupos
y su importancia en diagnósticos de aguas y suelos, en que se
diferencian?:
a) Coliformes fecales.
b) Coliformes totales.
Coliformes Totales: Bacterias gram negativas, no esporo
formadoras, oxidasa negativa, con capacidad de crecimiento
aeróbico y facultativamente anaeróbico en presencia de sales
biliares, que a temperatura especificada de 35ºC +/- 2ºC causan
fermentación de lactosa con producción de gas. Poseen la
enzima B-galactosidasa.
E. coli: Escherichia coli: Bacilo gram negativo, capaz de
desarrollarse en presencia de sales biliares u otros agentes
(tensoactivos) que tengan propiedades similares e inhibitorias
del crecimiento y que son capaces de fermentar la lactosa a
temperaturas de 35°C +/- 2°C, con producción de ácido, gas y
aldehído en un lapso de 18 a 48 horas. Oxidasa negativa, no
esporógena y reduce el nitrato a nitrito. También es capaz de
producir indol a partir de triptofano a una temperatura de 44°c
+-05 en un tiempo de 21+/- 3 horas. Poseen la enzima B-
glucoronidasa, la cual es detectada por medios cromógenos o
fluorógenos.
Medio de Cultivo Selectivo: Medio que promueve el
crecimiento de microorganismos específicos, al tiempo que
inhibe, total o parcialmente, el crecimiento de otros
microorganismos. Como es este medio de cultivo
UFC/100mL: Unidades formadoras de colonias por 100
mililitro
mL:mililitros.
LDM: Limite de Detección del Método
Salmon-GAL: Sustrato cromogénico que reacciona con la
enzima galactosidasa y las colonias toman color rojo salmón
X-glucoronide: Sustrato cromogénico que reacciona con la
glucoronidasa y produce color azul en las colonias.
El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias
Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con
producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este
grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más
prominente es Escherichia coli. La demostración y el recuento
de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo
de medios de cultivo líquidos y sólidos con características
selectivas y diferenciales.
El método del número más probable fue descrito por McCrady
en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En
un principio este método fue empleado para estimar el número
de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin
embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado
para la determinación de microorganismos aerobios y
anaerobios en lodos, sedimentos marinos
y suelos contaminados, por tanto este método es aplicable para
estimar el número de microorganismos en muestras
de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias.
Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes
totales, capaces de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC
como lo hacen los totales.
Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes
presentes en heces están formados por Escherichia coli y ciertas
especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se
encuentran casi exclusivamente en las heces de
los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor
la presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se
denominan termotolerantes por su capacidad de soportar
temperaturas más elevadas. Esta es la característica que
diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los
Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los
animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de
condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad.
Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador
ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como
una indicación de que los organismos patógenos pueden estar
presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento
estudiado se hallan exentos de organismos productores
de enfermedades.
¿Qué Describa la utilidad, finalidad y los pasos para
desarrollar para las siguientes coloraciones :
a) Ziehl Neelsen:
La tinción de Ziehl-Neelsen en una técnica de coloración para
identificar microorganismos alcohol-ácido resistentes (AAR).
El nombre de este procedimiento de microbiología hace
referencia a sus autores: el bacteriólogo Franz Ziehl y el
patólogo Friedrich Neelsen.
Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica
el uso de distintos colorantes con la finalidad de crear contraste
entre las estructuras que se desean observar, diferenciar y
posteriormente identificar. La tinción de Ziehl-Neelsen sirve
para identifica ciertos tipos de microorganismos.

Algunos de estos microorganismos son micobacterias (por
ejemplo, Mycobacterium tuberculosis), nocardias (por
ejemplo, Nocardia sp.) y algunos parásitos unicelulares (por
ejemplo, Cryptosporidium parvum). Muchas de las bacterias
pueden clasificarse a través de una técnica común llamada
tinción de Gram.
No obstante, algunos grupos bacterianos requieren otros
métodos para poder identificarlos. Técnicas como la tinción de
Ziehl-Neelsen requieren combinaciones de colorantes con
calor para fijar el primero a la pared celular.
Luego viene un proceso de decoloración que permite obtener
dos resultados: resistencia o sensibilidad a la decoloración por
ácidos y alcoholes.
Fundamento
El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las
propiedades de la pared celular de estos microorganismos. La
pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados
ácidos micólicos; estos se caracterizan por presentar cadenas
muy largas.
Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas,
estos pueden retener los colorantes con mayor facilidad.
Algunos géneros de bacterias son muy difíciles de teñir
mediante tinción de Gram, debido al alto contenido de ácidos
micólicos de la pared celular.
En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico
carbol fucsina, un colorante básico. Este tiene la capacidad de
interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual es
de textura cerosa a temperatura ambiente.
La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de
calor, debido a que la cera se derrite y las moléculas de
colorante se mueven con mayor rapidez hacia el interior de la
pared celular.
El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las
células que no fueron teñidas porque su pared no era lo
suficientemente afín al colorante; por lo tanto, la fuerza del
decolorante ácido es capaz de eliminar el colorante ácido. Las
células que resisten esta decoloración se llaman ácido-
resistentes.
Colorante secundario
Después de la decoloración de la muestra, esta se contrasta con
otro colorante llamado colorante secundario. Generalmente se
utiliza el azul de metileno o el verde de malaquita.
El colorante secundario tiñe el material de fondo y, en
consecuencia, crea contraste a las estructuras que fueron
teñidas en el primer paso. Solo las células decoloradas
absorben el segundo colorante (contra-tinción) y toman su
color, mientras que las células ácido-resistentes conservan el
color rojo.
Este procedimiento se usa frecuentemente para la
identificación de Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium leprae, las cuales son llamadas
bacilos ácido-alcohol resistentes.
Técnica
Procedimiento de tinción ácido-rápida
Preparar un frotis bacteriano
Esta preparación se hace en un portaobjetos limpio y seco,
siguiendo las precauciones de esterilidad.
Secado del frotis
Dejar que el frotis se seque a temperatura ambiente.
Calentar la muestra
La muestra se debe calentar aplicando fuego al portaobjeto por
debajo. Se puede hacer una fijación con alcohol cuando el
frotis no se ha preparado con esputo (tratado con hipoclorito de
sodio para blanquearlo) y si no se va a teñir inmediatamente.
M. tuberculosis se elimina con lejía y durante el proceso de
tinción. La termofijación del esputo no tratado no matará a M.
tuberculosis, mientras que la fijación con alcohol es
bactericida.
Cubrir la mancha
La mancha se cubre con la solución de carbol fucsina
(colorante básico primario).
Calentar la mancha
Esto se hace durante 5 minutos. Debe notar un desprendimiento
de vapor (aproximadamente a 60 °C). Es importante no
sobrecalentar y evitar quemar la muestra.
Con relación al calentamiento de la mancha, se debe tener
mucho cuidado al calentar la carbol fucsina, especialmente si
la tinción se lleva a cabo sobre una bandeja u otro recipiente en
el que se hayan recogido productos químicos altamente
inflamables de la tinción previa.
Solo se debe aplicar una pequeña llama debajo de los
portaobjetos usando un hisopo encendido previamente
humedecido con unas gotas de alcohol ácido, metanol o etanol
al 70 %. Evitar usar un hisopo grande empapado en etanol
porque esto es un riesgo de incendio.
Lavar la mancha
Este lavado debe hacerse con agua limpia. Si el agua del grifo
no está limpia, lavar el frotis con agua filtrada o destilada,
preferiblemente.
Cubrir el frotis con alcohol ácido
Este alcohol ácido debe estar al 3 %. La cobertura se lleva a
cabo durante 5 minutos o hasta que el frotis esté lo
suficientemente decolorado, es decir, de color rosa pálido.
Hay que tomar en cuenta que el alcohol ácido es inflamable;
por lo tanto, debe usarse con mucho cuidado. Se debe evitar
estar cerca de fuentes de ignición.
Lavar la mancha
El lavado debe ser con agua limpia, destilada.
Cubrir el frotis con colorante
Puede ser colorante verde de malaquita (0,5 %) o azul de
metileno (0,3 %) durante 1 o 2 minutos, utilizando el tiempo
más prolongado si el frotis es delgado.
Lavar la mancha
Nuevamente debe utilizarse agua limpia (destilada).
Drenar
Se debe limpiar la parte posterior del portaobjeto y colocar la
mancha en un estante de drenaje, para que esta se seque al aire
(no usar papel absorbente para el secado).
Examinar el frotis en el microscopio
Debe usarse el objetivo de 100X y el aceite de inmersión.
Escanear el frotis sistemáticamente y anotar las observaciones
pertinentes.
Interpretar los resultados
Teóricamente, los microorganismos que se tiñan de un color
rojizo se consideran ácido alcohol resistente positivos
(AAR+).
Al contrario, si los microorganismos se tiñen de azul o verde,
dependiendo del colorante utilizado como contra-colorante, se
consideran ácido alcohol resistente negativos (AAR-).
b) Tinta China
La tinción negativa es un método de coloración especial para
destacar la presencia de la cápsula en algunos microorganismos
—principalmente Streptococcus pneumoniae, Klebsiella
pneumoniae y Cryptococcus neoformans—, provenientes de
muestras clínicas o de cultivos puros.
La muestra directa comúnmente utilizada para aplicar tinción
negativa es el líquido cefalorraquídeo. Esta técnica representa
una alternativa rápida para el diagnóstico presuntivo
de meningitis, especialmente por Cryptococcus neoformans.
Así mismo, esta tinción puede ser aplicada sobre esputo y
líquidos estériles en general, así como también sobre cepas
obtenidas de cultivos puros jóvenes. Esta técnica utiliza
nigrosina o tinta china para su ejecución; por tanto, es una
metodología muy sencilla y económica de aplicar que brinda
información de gran valor diagnóstico en poco tiempo.
En este sentido, cualquier laboratorio está en la capacidad de
realizar esta coloración. Claro está, el laboratorio debe contar
con un personal competente, capaz de reconocer las levaduras
del Cryptococcus neoformans aislado o en gemación y
diferenciarlas de leucocitos y artefactos que pueda presentar la
muestra.
Fundamento
La nigrosina y la tinta china actúan de manera similar; por ello
se puede usar cualquiera de las dos sustancias indistintamente.
Esta técnica recibe el nombre de tinción negativa porque actúa
de forma contraria al resto de las técnicas de coloración. En
esta lo que queda sin teñir es la estructura que se está buscando
o que se desea ver; es decir, los microorganismos.
Por lo tanto, la coloración se basa en teñir el fondo del frotis en
un color oscuro. En este escenario las estructuras capsuladas
resaltaran en color claro o incoloro.
Por lo general las levaduras se observan refringentes, rodeadas
por un halo claro que corresponde a la cápsula. Esto ocurre
porque la tinta china y la nigrosina son sustancias incapaces de
penetrar el polisacárido que conforma la cápsula de los
microorganismos vivos.
Vale destacar que tampoco penetran otras estructuras que
pueden estar presentes en la muestra directa, como leucocitos o
hematíes.
Ahora bien, si los microorganismos están muertos, la tintura
puede penetrar dentro de los mismos, de tal manera que esta
tinción también es útil para evaluar la viabilidad de los
microorganismos.
Técnica
La nigrosina debe su nombre al color negro que posee. Es una
sustancia sintética que se obtiene del calentamiento de la
mezcla de compuestos orgánicos —tales como la nitrobencina,
la anilina y el hidroclorito de anilina—, utilizando en dicha
reacción un catalizador (hierro o cobre).
Tinta china
La tinta china es una sustancia utilizada principalmente por los
asiáticos para la escritura, la elaboración de obras de arte y la
pintura monocromática. Es muy popular en la cultura china.
Se obtiene de la tinta del calamar mezclada con carbón
pulverizado, producto de la quema de árboles poco resinosos.
También es posible prepararla a partir del hollín de la
incineración de hidrocarburos (aceites vegetales), junto con una
gelatina proteica que le da la consistencia adecuada para evitar
la precipitación de las partículas de carbón.
Especificaciones para la toma de muestra
– No requiere ayuno.
– La muestra de LCR, esputo o líquido estéril debe contener al
menos 1 ml de volumen y debe ser trasladada a temperatura
ambiente al laboratorio de forma inmediata.
– Las muestras de LCR y líquidos estériles deben ser tomadas
por un médico especializado.
– También puede ser un cultivo puro de una cepa sospechosa
vinculada con los patógenos ya mencionados.
Ejecución de la técnica con muestras directas
– Las muestras deben ser centrifugadas, luego se descarta el
sobrenadante y se toma el sedimento.
– En una lámina portaobjeto limpia se coloca una gota del
material centrifugado (sedimento) y una gota de tinta china o
nigrosina.
– Debe mezclarse bien y cubrir con una lámina cubreobjeto,
dejando que la gota se extienda como una película fina sin que
rebase los bordes.
– Posteriormente se monta la preparación en el microscopio.
– Si la preparación queda muy oscura, se puede diluir con agua.
Ejecución de la técnica con cepas provenientes de cultivo
– Se toma una porción muy pequeña de un cultivo joven con
una aguja de sembrado y se disuelve en una gota de tinta china
colocada previamente sobre un portaobjeto limpio.
– Se coloca un cubreobjeto encima.
– Se observa en el microscopio a 10X y luego a 40X.
También puede disolverse una porción de la colonia en agua
destilada, y de allí tomar una gota y mezclarla con la tinta
china. De esta manera el preparado no quedará tan grueso,
haciendo posible la observación de las estructuras en forma
aislada; si hay aglomeraciones, no se observará bien.
Otra metodología es la siguiente:
– Colocar una gota del cultivo en suspensión en un extremo del
portaobjeto.
– Colocar una gota de nigrosina en el mismo extremo y
mezclar.
– Con ayuda de otro portaobjeto, extender la muestra como si
se estuviese haciendo un frotis hematológico.
– Dejar secar y observar en el microscopio.
Observación en microscopio
Primero se debe enfocar con objetivo de 10X para tener una
visión amplia del campo. Posteriormente se debe buscar si hay
espacios claros; si los hay, enfocar con 40X para ver los
detalles.
Ventajas
– Es fácil de ejecutar.
– Es una técnica económica.
– Este método no requiere que el frotis sea fijado al calor ni
con productos químicos; por lo tanto, los microorganismos son
observados sin distorsiones.
– La preparación en fresco no necesita ser secada, por lo que
se puede observar inmediatamente, generando resultados de
forma rápida.
Desventaja
Una vez montadas, las preparaciones en fresco deben ser
observadas inmediatamente; si se dejan secar ya no es posible
observarlas y se deberá montar una nueva.
Tinción de tejidos con tinta china
Otra función que puede cumplir la tinta china es en los
laboratorios de patología. Esta se aplica en muestras de tejido
extraídas quirúrgicamente con la finalidad de marcar los
márgenes de resección del tumor.
El tejido marcado se rocía con ácido acético. Este actúa como
un mordiente y evita que la tinta se salga cuando el tejido es
sometido al procesamiento de rutina para el preparado de la
biopsia.
El procedimiento consiste en bañar el tejido en alcohol y
xileno, y luego embeber en cera de parafina. Este marcaje
orienta al patólogo al momento de observar el tejido,
indicándole dónde está el margen de resección quirúrgica u
otro punto de interés.
c) Shaeffer – Fulton
La tinción de esporas es la metodología usada para colorear
las estructuras de resistencia que forman algunos géneros
bacterianos cuando se encuentran en condiciones
desfavorables; estas estructuras corresponden a una forma de
supervivencia.
Existen muchos géneros que forman esporas; sin embargo, los
principales son Bacillus y Clostridium. Estos géneros se
consideran más relevantes debido a que poseen especies
patógenas para el ser humano.
Cada bacilo puede dar origen a una espora. Al momento de
teñir la preparación, la espora se puede encontrar dentro del
bacilo (endospora) o fuera de este (exospora). Con las técnicas
de coloración convencionales para bacterias —como la tinción
de Gram— las esporas quedan incoloras.
En la actualidad se cuentan con varias metodologías de
coloración que son capaces de atravesar la gruesa estructura de
la espora para teñirla. Estas metodologías son muy variadas;
entre estas se pueden mencionar la técnica de Dorner, la tinción
de Möeller y la metodología de Shaeffer–Fulton, también
conocida como Wirtz-Conklin.
De todas las técnicas mencionadas, la metodología de
Shaeffer-Fulton es la más utilizada en los laboratorios de
rutina. Debe su nombre a dos microbiólogos que crearon la
coloración en 1930: Alicia Shaeffer y MacDonald Fulton. Sin
embargo, en ocasiones la técnica es denominada Wirtz-
Conklin en honor a dos bacteriólogos de los años 1900.
Fundamento
Las esporas no se tiñen con las coloraciones convencionales
debido a que poseen una pared muy gruesa. La compleja
composición de las esporas impide la entrada de la mayoría de
los colorantes.
Si se estudia la espora de afuera hacia dentro se observan las
siguientes capas: en primer lugar está el exosporium, que es la
capa más fina y externa formada por glicoproteínas.
Luego viene la cutícula, que brinda resistencia a las altas
temperaturas, seguida de la corteza compuesta por
peptidoglicano. Posteriormente está la pared de la base que
protege al protoplasto.
La espora es una estructura deshidratada que contiene un 15 %
de calcio y ácido dipicolínico. Por ello, la mayoría de las
técnicas de coloración de esporas se basan en la aplicación de
calor para que el colorante pueda penetrar la gruesa estructura.
Una vez que la espora se tiñe, esta no puede eliminar al
colorante. En la técnica de Shaeffer–Fulton el verde de
malaquita entra a las células vegetativas y, al aplicar el calor,
penetra en la endospora y también en las exosporas.
Al lavar con agua, el colorante se elimina de la célula
vegetativa. Esto ocurre porque el tinte verde de malaquita es
ligeramente básico, por lo que se une débilmente a la célula
vegetativa.
En cambio, no puede salirse de la espora y finalmente se
contratiñe el bacilo con safranina. Este fundamento es válido
para el resto de las técnicas, en las que ocurre algo similar.

Técnica de Shaeffer–Fulton o Wirtz-Conklin
1- Hacer un extendido fino con una suspensión del
microorganismo esporulado en un portaobjeto y fijar al calor.
2- Cubrir el portaobjetos con solución acuosa de verde de
malaquita al 5 % (se puede colocar un papel de filtro sobre la
lámina).
3- Calentar sobre la llama del mechero de Bunsen hasta causar
desprendimiento de vapores y retirar la llama. Repetir la
operación durante de 6 a 10 minutos. Si durante el
procedimiento se evapora demasiado la solución de verde de
malaquita, se puede agregar más.
4- Retirar el papel de filtro (si fue colocado) y lavar con agua.
5- Cubrir el portaobjetos con safranina acuosa al 0,5 % durante
30 segundos (algunas variantes de la técnica usan safranina
acuosa al 0,1 % y la dejan por 3 minutos).
Con esta técnica las esporas se presentan de color verde y los
bacilos de color rojo.
Tiene el inconveniente de que las endosporas de cultivos
jóvenes no se tiñen bien, dado que se ven extremadamente
claras o incoloras. Para evitar esto se recomienda usar cultivos
de 48 horas de incubación.
d) Negro de Sudán
Fundamento
Los métodos citoquímicos son aquellos que determinan la
existencia o localización de los diferentes contituyentes
químicos de las células. Los compuestos químicos analizados
se ponen de manifiesto mediante la visualización de las
sustancias coloreadas resultantes de la reacción química
producida entre los compuestos que se estudian y los reactivos
específicos.
El Negro Sudán B tiñe los fosfolípicos y los esteroles. En
los neutrófilos tiñe los gránulos de color gris negruzco. En
los leucocitos, la tinción de Negro Sudán B tiene la misma
utilidad y resultados que la reacción de las mieloperoxidasas.
Tinción de lípidos: Técnica del Negro Sudán B
Las células de estirpe granulocítica son positivas para la
reacción de este colorante. Los componentes celulares
del Sistema Mononuclear Fagocítico (SMF) dan resultados
variables para esta tinción, ya que los monocitos en sangre
periférica se muestran débilmente positivos. Las células de la
línea linfoide, eritroide y megacariocítica son negativas.
Esta tinción puede servir para identificar el origen mieloide o
linfoide de las células blásticas presentes en la leucemia aguda.
La LAM7 (megacariocítica) es la única leucemia mieloblástica
aguda cuyos blastos son negativos para el Negro Sudán B.
Técnica
Preparación de la solución extemporánea de colorante y
tampón
 Preparar una solución extemporánea de Colorante
(Negro Sudán B) y Tampón (Reactivo de Fenol) en
proporción 3:2 (180 ml y 120 ml).
 Colorante: 0,6 gramos de Negro Sudán B en
polvo + 200 ml de etanol absoluto. Se deja
48 horas en agitación, sin que le de la luz, y
se filtra. De los 200 ml se cogen 180 ml.
 Tampón: 100 ml de disolución acuosa de
fosfato disódico 0,3% (m/v) + 16 gramos de
fenol en 30 ml de etanol absoluto. De los 130
ml se cogen 120 ml.
 Los datos pueden variar en función de la
hidratación del tampón.
Realización de la Tinción de Negro Sudan B
1. Realizar varias extensiones sanguíneas.
2. Fijar las extensiones con vapores de formol durante 10
minutos. Para ello hay que hacer una cámara de formol
haciendo uso del cristalizador, los capilares y papel de
filtro impregnado en algunas gotas de formol. Es
importante que los frotis no se pongan en contacto
directo con el papel de filtro impregnado en formol. El
cristalizador debe taparse una vez se haya dispuesto la
cámara.
3. Lavar las extensiones con agua desionizada.
4. Incubar las extensiones durante una hora a 37ºC en una
mezcla formada por reactivo de fenol y solución de
Negro Sudán B a una proporción de 2:3.
5. Lavar las extensiones con agua desionizada.
6. Limpiar las extensiones con una solución de etanol al
70% en agua destilada durante 2 o 3 minutos para
eliminar el exceso de colorante. Este lavado se realiza
introduciendo los frotis en una cubeta de tinción con
etanol al 70% y agitando durante unos minutos.
7. Lavar las extensiones con agua desionizada.
8. Contrastar durante 20 minutos con solución de Giemsa
recién diluída con agua destilada a una proporción de
1:9.
9. Lavar con agua desionizada y dejar secar al aire.
10. Observar al microscopio la presencia de precipitados
citoplasmáticos de color gris negruzco.
Describa el fundamento de la tinción de Gram mediante
un diagrama, explicando paso a paso lo sucedido en las
diferentes partes celulares
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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LOS MICROORGANISMOS: EL MICROSCOPIO,
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