AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LINFOCITOS Y NEUTROFILOS HUMANOS

1. INTRODUCCIÓN
Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en los seres humanos. Ellos son el
principal componente celular del sistema inmune innato y actúan como una primera
línea de defensa contra los microorganismos invasores. Por su lado, los linfocitos son
un Tipo de célula inmunitaria elaborada en la médula ósea; se encuentra en la sangre y
el tejido linfático. Los dos tipos de linfocitos son los linfocitos B y los linfocitos T. Los
linfocitos B elaboran anticuerpos y los linfocitos T ayudan a destruir las células
tumorales y a controlar las respuestas inmunitarias. No obstante, a pesar de la función
indispensable de los ambos en la inmunidad, la comprensión detallada de los factores
moleculares que median efectos efectoras e inmunopatogénico en diferentes
enfermedades infecciosas y condiciones inflamatorias aún falta. Por lo tanto, los
métodos simples, rápidos, económicos y fiables son muy deseables para la recolección
de un número suficiente de los neutrófilos para evaluar funciones como la fagocitosis,
la matanza, la producción de citoquinas, degranulación y la trata. Para ese fin,se
presenta un protocolo basado en centrifugación de gradiente de densidad
reproducible

2. METODOLOGÍA

a. Reactivos y Materiales
 Tubos falcon
 Centrifugas
 Micropipetas
 Tubos eppendorf
 HISTOPAQUE
 Sangre con anticoagulate
 Azul de trypan

b. Procedimiento

 Obtencion de la sangre
 Se procedió a colectar 20ml de sangre en tubos de vidrio con anticoagulante y
se mezcló apropiadamente.

 Sedimentación
 La muestra (3 ml) se mezcló con 3 ml de suero fisiológico.
 Se trasvasó a un tubo falcon, donde se junto con la sangre diluida con 3 ml de
HYSTOPAQUE.
  Separación de células
 Se llevó a la centrifuga por 20 minutos a 2500 rpm.
 Se retiró el tubo cuidando de no mezclar las fases.
 Se retiro el sobrenadante que contenía plaquetas, Hystopaque, linfocitos y
proteínas.
 Obtenido el precipitado se trasvaso a un tubo eppendorf, donde se añadió
nuevamente suero fisiológico.
 Se llevó a la centrifuga por 5 minutos a 2500 rpm.
 Finalizada la centrifugación, se obtuvo un pellet, se eliminó el sobrenadante, y
se añadió suero fisiológico para proceder con el conteo en la cámara de
Neubauer.

3. RESULTADOS

La viabilidad celular, mide la proporción de células vivas en un procedimiento, nos

ayuda a determinar la impermeabilidad de la membrana. Utilizamos azul de tripan
para poder verificar, ya que la entrada de este indica el rompimiento de la membrana.
El porcentaje de viabilidad se determinó de la siguiente manera:

% viab. = (# de cel. Viables/ # de cel. Total) x 100

Por otro lado, para el conteo celular, nos permite conocer un numero aproximado al
numero total de células. Hallándose de la siguiente forma:

# células = células contadas x 10000 cell/ml

Al momento de trabajar con la cámara de Neubauer se obtuvieron los siguientes

resultados
Grupo #1
% VIABILIDAD: 100%
CONTEO: 2.46X106 cell/ml
Grupo #2
% VIABILIDAD: 92.48%
CONTEO: 7.98X106 cell/ml
Grupo #3
% VIABILIDAD: 97.78%
CONTEO: 8.82X106 cell/ml
Grupo #4
% VIABILIDAD: 97.74%
CONTEO: 1.145x 107 cell/ml

4. CONCLUSIONES
Se obtuvo un porcentaje de viabilidad mayor al esperado (mínimo 80 %), siendo este
un resultado exitoso, de la misma forma con el conteo celular (minimo 3x10^5)

5. ANEXOS

Sangre diluida
Sangre diluida junto a Hystopaque

Sangre centrifugada

Pellet obtenido
6. BIBLIOGRAFÍA

Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse

Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer
Experiments. J. Vis. Exp. (77), e50586, doi:10.3791/50586 (2013).

Alberto Checa Rojas. (2018). Método: aislamiento de células sanguíneas por

gradiente de Ficoll-Paque. 2019, Septiembre 10, Conogasi.org Sitio web:
http://conogasi.org/articulos/metodo-aislamiento-de-celulas-sanguineas-
por-gradiente-de-ficoll-paque/

https://es.slideshare.net/uscbio225/viabilidad-y-conteo-celular

7. CUESTIONARIO

a. Indique el fundamento del aislamiento de linfocitos y neutrófilos

humanos con ficoll-hystopaque
Ficoll-Paque es un medio en gradiente de densidad comúnmente usado
para aislar células mononucleares provenientes de sangre periférica
humana, utilizando un procedimiento de centrifugación basado en el
método desarrollado por Bøyum (Bøyum, A., Scand. J. 1968). La separación
de las células de sangre periférica humana normal generalmente se
obtienen: • 60 ± 20% de recuperación de las células mononucleares
presentes en la muestra de sangre original • 95 ± 5% de células
mononucleares •> 90% de viabilidad de las celdas separadas • Máximo 5%
de granulocitos, parte inmediata superior a los eritrocitos • Máximo 10% de
eritrocitos, parte baja del tubo Los linfocitos, monocitos y plaquetas no son
lo suficientemente densos para penetrar en las capas del medio de Ficoll-
Paque. Estas células, por lo tanto, se reúnen como una banda concentrada
en la interfase de la muestra. Esta banda permite aislar las células
mononucleares para ser recuperadas con un alto rendimiento en un
pequeño volumen.

b. Que característica física de las células de la sangre permiten la

distribución de las células de la sangre en distintas capas
Las células y plaquetas más densas se van hacia el fondo del tubo y forman
capas rojas y blancas, mientras que el plasma se mantiene en la parte de
arriba y forma una capa amarilla.
 c. Que es una gradiente de densidad
Columna de líquido de densidad concreta que se utiliza en la separación de
diferentes tipos de células por centrifugación. Las células van progresando
por el gradiente hasta que alcanzan el nivel en que su gravedad específica,
es la misma que la del medio.

d. Indique los tipos de linfocitos que se encuentran en la sangre

e. Que es la centrifugación isopicnica

La centrifugación isopícnica, separa cada componente de nuestra muestra, según su

densidad, haciendo uso de un gradiente de densidad. Es decir, se toma una muestra
con nuestra muestra y la colocamos sobre una solución con cambios incrementales en
densidad; es decir, con un gradiente de densidad; el cual va disminuyendo su densidad
desde fondo, hacia la parte superior.

Durante la centrifugación, cada partícula de nuestra muestra, comienza a desplazarse

hacia el fondo del tubo y cada componente, se irá quedando estancado en aquellas
zona donde su densidad sea igual a la de su entorno, ya que no podrá atravesar hacia
una franja con una densidad mayor.

f. Indique que otros medios de densidad se puede utilizar para la separación

de linfocitos
 Remoción de leucocitos de la sangre
 Sedimentación isopícnica
 Ensayo de RAPD para confirmar la remoción de leucocitos
 Filtración a través de diferentes matrices

g. Indique cual es la composición del medio de cultivo RPMI 1640 Y DMEM e

indique la importancia de sus componentes
 DMEM
DMEM es único en su tipo y difiere de otros medios en que contiene 4 veces más de
aminoácidos y vitaminas que el Medio mínimo esencial de Eagle´s. DMEM fue
originalmente formulado con bajo contenido en glucosa (LG) (1 g/L) y piruvato de
sodio, pero también es usado con altas concentraciones de glucosa (HG) (4.5 g/L) con o
sin piruvato de sodio. La adición de glucosa ha mostrado ser útil para el cultivo de
otras líneas celulares que incluyen cultivos primarios de células de ratón, y pollo.
DMEM no contiene proteínas, lípidos o factores de crecimiento. Por esta razón, DMEM
requiere de suplementos, habitualmente con 10 % de suero fetal bovino. Además,
como contiene bicarbonato de sodio (3.6 g/L) requiere atmósferas con 5 – 10%
CO2 para mantener el pH fisiológico.
 h. Porque se utiliza CO2 en el cultivo de células animales o humanas ¿cual es
su función?. Que buffer se puede emplear en vez del CO2
El dióxido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la
cantidad de CO2 disuelto, el pH y la cantidad de iones HCO3 - . Las reacciones que
tienen lugar son:

De modo que para establecer un pH determinado se debe tener en cuenta

especialmente los niveles de bicarbonato sódico y la tensión de CO2 . Cada medio
tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO2 para alcanzar
el pH correcto. Sin embargo, en la actualidad se emplean otras sustancias
tamponadoras en la formulación de muchos medios, ya que permite una estabilidad
superior del pH en el medio, así como una mayor capacidad tamponadora (por ej. los
denominados Good's buffers: HEPES, Tricina).
UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA
MARIA
Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Bioquímicas y
Biotecnológicas
Escuela Profesional de Ingeniería Biotecnológica

Inmunología

Docente: MSc. Jose Miguel Carpio Carpio

Presentado por:
Navarrete Herrera, Claudia Valeria
Ortiz Mendocilla, Chelsea Anais

AREQUIPA
2019