Prácticas de

Bioquímica y Biotecnología de Alimentos

PRACTICAS DE LABORATORIO

Asignatura:

“BIOQUÍMICA y BIOTECNOLOGÍA DE ALIMENTOS”

3º Licenciado en Química 08/09

Universidad de Huelva

FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES

Departamento de Química y Ciencia de los Materiales

Área de Bioquímica y Biología Molecular

• PRACTICA 1. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE PROTEÍNA EN

LECHE DE VACA Y EXTRACCIÓN DE CASEÍNA
• PRÁCTICA 2: DIGESTIÓN DE NUTRIENTES (AMILASA SALIVAL)
• PRÁCTICA 3. VALORACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL MEDIANTE
TALLA, PESO Y CREATININA
• PRÁCTICA 4: ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE
EXTRACTOS DE FRUTAS.
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PRACTICA 1. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE

PROTEÍNA EN LECHE DE VACA Y EXTRACCIÓN DE CASEÍNA

La leche contiene diversas proteínas (Tabla 1), de las cuales las caseínas son
las más abundantes, ya que representan el 80% de las proteínas totales. Las
caseínas de la leche tienen pesos moleculares que oscilan entre 25.000 y
40.000; las más importantes son la α, la β y la κ, que representan,
respectivamente, el 50, 30 y 15% del total de las caseínas. En la leche, estas
proteínas se asocian entre si para formar micelas, que se encuentran
estabilizadas y solublilizadas gracias a la presencia de la caseína κ, y del
calcio.

Tabla 1
MICELAS DE CASEÍNA EN LA LECHE Composición proteica de las leches de
vaca y humana
Proteína vaca humana
(g/100ml) (g/100ml)
Caseina 2,80 0,25
α -lactalbúmina 0,12 0,25
β -lactoglobulina 0,30 No
contiene
Inmunoglobulinas 0,05 0,10
Lactoferrina 0,02 0,17
Lactoperoxidasa 0,003 No
contiene
Totales 3,40 0,89

Cuando se va a fabricar queso, se agregan a la leche cuajo (enzimas

coagulantes, principalmente Renina), que catalizan la ruptura de un solo enlace
peptídico de la κ-caseína, la unión entre el aminoácido fenilalanina en la
posición 105 y la metionina en la 106, lo que provoca la desestabilización de
las micelas y por lo tanto la precipitación de casi todas las caseínas, las que
posteriormente se van a transformar en queso.

El suero restante contiene principalmente lactosas y proteínas solubles

(lactoalbúmina y lactoglobulina), las proteínas del suero del queso tienen
excelentes propiedades funcionales y un valor nutritivo muy alto debido a su
excepcional contenido en lisina, triptofano, metionina y cisteína.
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1.1. Determinación colorimétrica del contenido de proteínas en leche de

vaca

Con frecuencia se nos presenta el problema de tener que analizar proteína en

una muestra de alimento, como puede ser la leche de vaca entera. En este tipo
de casos es bueno saber el contenido aproximado de proteína de la muestra
(en el caso de la leche de vaca está en torno al 2-3% p/v) para hacer las
diluciones pertinentes que nos permitan encajar la muestra en la recta patrón.
Lo que se pide en este caso es que el alumno haga precisamente eso y
obtenga un valor exacto del contenido proteico de una muestra de leche de
vaca.

PREGUNTA1.
¿Cual es la dilución de la leche necesaria para que, al hacer la determinación
de proteína el valor de absorbancia se encuentre dentro del rango del patrón?,
tomar como referencia una concentración de proteína en leche del 2%.

Realización de la practica:

1. Reactivos y tampones:

- Reactivo de Bradford
- Patrón de calibrado: Seroalbúmina bovina (BSA), 0,02 mg/ml

2. Determinación de proteína

La determinación de proteína se realiza de acuerdo con el siguiente protocolo,

donde la toma de muestra se realizará de la disolución diluida preparada en
base a los cálculos anteriores :
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Nº de Tubo C 1 2 3 4 5 M1 M2 M3
H2O(ml) 1,8 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,6 1,4 1,2
Patrón BSA (ml) - 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - - -
leche diluida (ml) - - - - - - 0,2 0,4 0,6
R. Bradford (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Agitar suavemente

Esperar 15 min a que se desarrolle el color y medir la absorbancia de cada

tubo a 595 nm. Representar en papel milimetrado los datos obtenidos y
calcular, teniendo en cuenta la dilución que se ha hecho, la concentración de
proteína en el extracto crudo.

3. Cálculos numéricos
Para obtener la recta de calibrado, se representan las absorbancias obtenidas
para los tubos del 1 al 5 en función de los µg de proteínas presentes en cada
tubo.

Nº de Tubo C 1 2 3 4 5 M1 M2 M3
Patrón BSA (mg/ml)
Abs (595 nm)

Una vez obtenida la recta, y a partir de las absorbancias obtenidas para las
muestras M1, M2, y M3, se determinan la concentración de proteínas de cada
muestra, teniendo en cuenta las diluciones.

Comparar el resultado con el valor de proteína en g/ml de la leche comercial.

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1.2. Aislamiento de la caseína en leche de vaca

Introducir 200 ml. de leche descremada en un vaso de precipitado de 600 ml.

No se debe dejar la leche en reposo durante mucho tiempo antes de utilizarla,
ya que la lactosa puede convertirse lentamente en ácido láctico, aunque se
guarde en la nevera.

Calentar la leche hasta aproximadamente a 30° C y añadir 2 ml de ácido

acético (también puede realizarse en con 0,2 ml de cuajo líquido (renina), o
bien jugo de limón). Agitar continuamente la mezcla con un imán durante todo
el proceso de adición hasta que se forma una gran masa amorfa.

Para separar la caseína, tomar 40 + 40 ml de la suspensión en 2 tubos Falcon

(pesar antes) y con el tapón puesto centrifugar a 3000 rpm durante 3 min.
Separar el suero lacteo de la caseína en un vaso de precipitado de 100 ml.

Para retirar la caseína añadir 5 ml del suero a cada uno de los tubos Falcon y
agitar vigorosamente. Verter la suspensión sobre una placa de petri, con papel
de secado en la base (determinar el peso antes de añadir la suspensión) y
dejar en la estufa a 35º C durante 24 h.

Pesar la placa y determinar los gramos de caseina de la leche.

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PRÁCTICA 2: DIGESTIÓN DE NUTRIENTES (AMILASA

SALIVAL)

Una de las funciones fundamentales del aparto digestivo es transformar los

alimentos ingeridos en estructuras sencillas capaces de ser absorbidas a nivel
intestinal. La digestión de carbohidratos ingeridos (como es el caso del
almidón) comienza en la boca a través de la ptialina. Esta enzima es una α-
amilasa que hidroliza enlaces α(1,4) internos, pero no los α(1,6) próximos a las
ramificaciones. Los productos de esta digestión en la boca son maltosa e
isomaltosa y otros polímeros que contienen de 3 a 9 moléculas de glucosa.
Aunque el alimento permanece en la boca un corto período de tiempo, la
acción de la amilasa salivar continúa hasta que el pH ácido del contenido
estomacal la inactiva, de manera que hasta ese momento la enzima hidroliza
de un 30 a un 40% de los almidones de la dieta.
A nivel intestinal actúa otra α-amilasa de origen pancreático y con una actividad
semejante a la salival, rindiendo productos de degradación similares. Estos
productos sufren finalmente la acción de otras carbohidrolasas (maltasa,
lactasa, isomaltasa) liberando los monosacáridos que posteriormente son
absorbidos.

OBJETIVO
El objetivo de esta práctica es determinar cualitativamente la actividad de la α-
amilasa salival (ptialina).

MATERIALES Y REACTIVOS
- Baño termostatizado
- Tubos de ensayo
- Baño a 100ºC
- Papel de filtro
- Embudo
- Pipetas
- Solución de almidón al 0,2% (preparar en agua destilada calentando)
- Solución de lugol (comercial)
o 16,6 g IK
o 1,25 g I2
o c.s.p. 1000 mL agua destilada
- Fehling A: 17,34 g CuSO4/100 mL agua (comercial)
- Fehling B: (comercial)
o 173 g Tartrato sódico potásico
o 50 g de NaOH
o c.s.p. 500 mL agua

PROCEDIMENTO
El almidón es el polisacárido de reserva más abundante en los vegetales. Esta
formado por α-amilosa (lineal de unas 200 unidades de D-glucosa unidas por
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elaces α-(1,4) glucosídicos) y por amilopectina (lineal de glucosa con enlaces

α-(1,4) y con ramificaciones mediante enlaces α-(1,6)-glucosídicos).

La α-amilosa en agua presenta una ordenación espiral característica, con 6 ó 7

residuos de glucosa por vuelta. En esta hélice los grupos hidroxilos quedan
hacia fuera, mientras que en el interior se disponen los grupos hidrofóbicos. En
este interior es donde se incluye el yodo, formando un complejo de intenso
color azul que permite la identificación positiva de trazas de almidón.

La amilasa salival actúa sobre el almidón de los alimentos liberando azucares

reductores. Los azúcares reductores, en medio alcalino, son capaces de
reducir el ion Cu2+ de color azul a Cu+ de color rojo. Por otro lado, en medio
fuertemente básico, el ión Cu2+ formaría Cu(OH)2 insoluble, por ello se añade
tartrato sódico potásico que actúa como estabilizador al formar un complejo con
el Cu2+.

PREGUNTA. ¿A qué se debe al presencia de azucares reductores, tras tratar

el almidón con la amilasa salival?, ¿si el Cu2+ se reduce, qué se oxida y a qué?

En consecuencia, se podrá demostrar la acción de la α-amilasa salival sobre el

almidón, comprobando que los productos resultantes de la acción enzimática
son reductores y no dan la reacción del yodo.

PROTOCOLO
a) Disponer en una gradilla de 4 tubos numerados del 1 al 4, colocando en
cada uno de ellos 2 mL de solución de almidón al 0,2%.
b) Tubo 1: añadir 3-4 gotas de solución diluida de Lugol (una parte de lugol
y dos de agua). Anotar el resultado
c) Añadir al tubo 2, 1 mL de solución Fehling A y otro de Felhing B.
Calentar a 100 ºC y anotar el resultado.
d) Agregar a los tubos 3 y 4, una pequeña cantidad (0,5 ml) de saliva. Para
ello tras enjuagar la boca, se mastica un trozo de filtro para estimular la
salivación. La saliva se recoge en un tubo Falcon (pequeño). Incubar los
tubos 3 y 4 durante 15-20 min en un baño a 35-40º C. Transcurrido ese
tiempo se sacan del baño y se dejan enfriar.
e) Añadir al tubo 3, 3-4 gotas de solución diluida de Lugol y observar el
resultado.
f) Añadir al tubo 4, 1 mL de Fehling A y 1 mL de Fehling B. Calentar a 100
º C y observar el resultado.

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS:
- Tubo I …………………………………………………………………………..
- Tubo II ………………………………………………………………………….
- Tubo III …………………………………………………………………………
- Tubo IV …………………………………………………………………………
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INTERPRETACIÓN:
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PRÁCTICA 3. VALORACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL

MEDIANTE TALLA, PESO Y CREATININA

La talla es un parámetro antropométrico de fácil obtención e interpretación, que

nos indica el estado de nutrición y que varía según la edad y otros factores.

El peso corporal es uno de los parámetros antropométricos que más se utiliza.

Es un indicador global del estado nutricional. Muestra el estado nutricional
actual, es de fácil uso pero de difícil interpretación.

La creatinina procede de la degradación de la creatina, una

molécula energética de síntesis hepática situada en los
músculos. La creatinina formada es excretada
íntegramente por la orina y está relacionada con la masa
muscular.

OBJETIVO
La práctica permite:
- Detectar posibles problemas de malnutrición
- Evaluar el estado nutricional de un individuo a partir de la observación
de los parámetros antropométricos antes citados, así como con los
valores de la creatinina.

MATERIAL Y REACTIVOS
- Peso de precisión
- Tallímetro
- Cinta métrica inelástica
- Calculadora
- Tabla de peso ideal, excreción ideal de creatinina.
- Reactivo (Picrato alcalino: ácido pécrico en NaOH) (comercial)

PROTOCOLO:

- Talla: medida en el tallímetro dispuesto al efecto. La medida se efctúa

con el sujeto descalzo, en posición firme, con los brazos relajados y
cuidando que el ojo y meato auditivo estén en el mismo plano horizontal.

- Peso: en ropa ligera y descalzo

- Circunferencia de la muñeca: del brazo no dominante, con una cinta

métrica distal a la apófisis estiloides en el pliegue de la muñeca.
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- Determinación de creatinina:
La creatinina reacciona con el ácido pícrico, a saturación, en medio
alcalino, formando un complejo marrón, cuya absorbancia a 510 nm es
proporcional a la concentración de creatinina. Para el cálculo de la
creatinina utilizar la siguiente recta de calibrado:

Y = 29,74x + 0,0019 (r2=0,9998)

Donde Y es la Abs a 510 de la muestra y X los mg/ml de creatinina.

Se diluye la orina: 1:50 con agua destilada

Se preparan los siguientes tubos:

Control M1 M2 M3
Agua destilada 0.1 0.04 0.02 0
Muestra diluida 0 0.06 0.08 0.1
Reactivo 1 1 1 1
1 min a 35-37 ºC
Abs 510 (alumno 1)
Abs 510 (alumno 2)

Calculo de creatinan (mg/ml):

Conociendo la cantidad de orina eliminada (600-1800 ml) por el paciente

en 24 h, se calcula la excreción total de creatinina por día (en mg/dl).
Sabiendo que los valores normales son 23 mg/Kg/d para el hombre y 17
mg/Kg/d para la mujer, se calcula el índice de excreción de creatinina y
se interpreta el resultado. El dato también puede compararse con las
tablas suministradas.

• pH (orina): normal (4,6 - 8)

• Cuerpos cetónicos:
Pequeña: < 20 mg/dL (normal) ; Moderada: 30-40 mg/dL; Grande: > 80 mg/dL

• Glucosa en orina: debe ser negativo

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INTERPRETACIÓN

PESO:
Es interesante conocer el peso actual (P); el peso ideal (PI)
Para el PI existen diversas fórmulas:

• Brocca: PI = A-100 donde (A=altura en cm)

• Lorenz: PI = A – 100 – [(A-150)/4] + [(E-20)/k];

donde A=altura en cm; E= edad en años; k= 4(Hombres) ó 2,5 (Mujeres)

• Metropolitan Life Insurance Company

PI = 50 + 0,75(A-150) donde A= altura en cm

COMPLEXION CORPORAL
Se clasifica en pequeña, mediana y grande. Se mide como la razón (r) entre la
talla y la circunferencia de la muñeca del brazo no dominante.

r = Altura (cm) / Circunferencia de la muñeca (cm)

Complexión Hombres Mujeres

Pequeña r>10,4 r>11
Mediana 9,6 < r < 10,4 10,1 < r < 11
Grande r<9,6 r<10,1

INDICES:
• Porcentaje de peso habitual %PH = P/PI x 100 (valores superiores a
120% se considera obesidad)

• Indice de masa corporal, se obtiene mediante la siguiente fórmula

IMC = Peso (kg)/ Talla2 (m2)

- IMC < 20 Desnutrición

- 20 < IMC < 24,9 Normalidad
- 25 < IMC < 29,9 Sobrepeso
- 30 < IMC < 40 Obesidad
- > 40 Obesidad mórbida

• En un estado nutricional normal y con una función renal correcta, la

excreción de creatinina diaria sería:
o Hombres: 23 mg/kg de peso ideal
o Mujeres: 18 mg/Kg de peso ideal

El índice de excreción de creatinina (IEC) (ver tablas adjuntas)

IEC = excreción renal de creatinina en 24h / excreción ideal de creatinina en 24h x 100
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La excreción ideal de creatinina se obtiene de las tablas adjuntas.

Según el IEC se estima:

o Nutrición normal: 80-100 %

o Malnutrición leve: 60-80%
o Malnutrición moderada: 40-50%
o Malnutrición severa: < 40%

Presentación de resultados

Alumno (1): Alumno(2):

Peso
Talla
Diámetro muñeca
Peso Ideal
% PI
Complexión
IMC
IEC
pH
Cuerpos cetónicos
Glucosa (orina):
Glucosa (sangre):

EVALUACIÓN NUTRICIONAL
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PRÁCTICA 4: ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CON

EL DPPH (PARA LA FRESA)

El DPPH· (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) es un reactivo

utilizado para evaluar la capacidad antioxidante de
distintos compuesto naturales, entre ellos las
antocianinas contenidas en frutos.

Las antocianinas son un tipo de flavonoides complejos,

utilizados como colorantes naturales, que además se
caracterizan bajo el punto de vista nutricional por tener
un importante efecto antioxidante al apoyar la DPPH
regeneración de los tejidos, fomentar el flujo de la
sangre, reducir el colesterol, promover la formación de colágeno, reducir el
envejecimiento del cuerpo, disminuir los riesgos de ataque al corazón y son
excelentes preventivos contra el cáncer.

Antocianinas

Colorantes alimentarios:
E163a (cianidina): colorante rojo
E163b (delfinidina) : colorante azul
E163c (malvidina) : colorante púrpura
E164d (pelargonidina) : colorante anaranjado
E164e (peonidina) : colorante rojo-marrón
E165f (petunidina) : colorante rojo oscuro

La práctica consiste en evaluar la capacidad antioxidante de extractos de

fresas.

1. Preparación del extracto de las muestras.

- Se toman aproximadamente 0.25 g de fresa en crudo (procedente de un

“pull” homogeneizado)
- Rompemos con N2 líquido.
- Se extraen con 10 ml de metanol acidíficado al 1 % con HCl.
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- Se mantiene en oscuridad a 4º C durante 24 horas. Si el pellet no está lo

suficientemente blanco, re-extraer hasta que se crea conveniente.
- Centrifugar y filtrar las muestras.

2. Desarrollando el ensayo

- Tomar 3,9 ml de DPPH 6 x 10-5 M en metanol y añadir 0,1 ml del

extracto de antocianinas en una cubeta desechable.
- Medir la disminución de absorbancia a 0’, 1’ y cada 5’ a 515 nm durante
2 horas o hasta que la absorbancia llegue a ser constante.
- Calcular la concentración de DPPH restante usando la siguiente
ecuación:

CDPPH(M) = (A515 + 2.58·10-3) x 12509-1

OBSERVACIONES

• No es recomendable mantener la solución de DPPH más de un día ya

que su poder de degradación es bastante alto y podemos encontrarnos
con que la absorbancia disminuye considerablemente (se pierden
radicales libres). Esta solución debe mantenerse en frío a 4º C y en
oscuridad.