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Rapport de stage

Master d’Université
Spécialité:
Management de qualité et sécurité des aliments

Analyse microbiologique des aliments et assurance


qualité au sein de laboratoire de microbiologie ‘AGQ
LABS’

Présenté par :
HARKATI Ayoub
Encadré par :
AALAGUI CHAIMAA
EL GHARBAOUI MOUSAAB

Année universitaire : 2019-2020


Introduction
I. Présentation d’AGQ LABS :

AGQ Labs est un Centre Technologique internationale, propose des solutions et


des services de valeur destinés aux secteurs Agronomique, Alimentaire,
Environnemental, Minier, de la Santé et de la Sécurité. Il s´agit d´une
combinaison entre la technologie (Chimie analytique) et l´expertise sectorielle
(Ingénierie Chimique appliquée). Les laboratoires AGQ sont situés dans les pays
suivants : MAROC ,Espagne ,PÉROU ,CHILI ,ÉTATS-UNIS ,Portugal
,Mexique ,Italie ,ARGENTINE ,COLOMBIE ,EQUATEUR ,GUATEMALA
,COSTA RICA ,EGYPTE ,TUNISIE ,SUDÁFRICA , RÉPUBLIQUE
DOMINICAINE

AGQ Labs opère sur le marché Marocain depuis 2005. Au départ, c’était
uniquement le suivi nutritionnel aux producteurs d’agrumes et de baies du le nord
du pays (dans l’axe Larache-Kenitra), ce suivi est réalisé dans le centre
technologique d’AGQ Labs au niveau d’Espagne.

La première délégation technique a été fondée à Mohammedia en 2008, équipé


d’un centre logistique de conditionnement et de préparation d´ échantillons, qui
étaient envoyés à l’Espagne. Cette délégation, en plus de sa structure logistique,
avait aussi une équipe technique pour apporter un soutien et une assistance
technique portant sur l’agriculture et la sécurité alimentaire. C´est à cette époque
que le travail sur la sécurité alimentaire (résidus de pesticides, de métaux lourds
etc.)a commencé, agrandissant la zone d’activité à Marrakech, le Gharb et l’axe
Agadir-Taroudant, dans le sud du pays.

C´est en 2011 qu´ AGQ Labs monta un projet d’investissement afin de créer un
grand laboratoire capable de couvrir toutes les opérations générées au Maroc. Ce
centre technologique est situé à Mohammedia, à seulement 30 km de Casablanca.
Il est doté d´un laboratoire à la fois organique (chromatographie) pour l’analyse
des résidus de pesticides ; inorganique (analyse foliaire, engrais, eaux, sols et
solutions du sol) ; et microbiologique.
Avec plus de 500 clients présents dans le secteur agro-alimentaire, AGQ Labs est
le laboratoire de référence dans ce domaine. Il collabore avec les plus importantes
entreprises produisant et exportant des agrumes, des olives, des baies, des raisins
de table, des légumes, des fruits à noyaux, des thés, des plantes aromatiques etc.

AGQ Labs Maroc a l’accréditation ISO 17025 pour Laboratoires d’essaies,


conféré par le Service International d' Accréditation (IAS).[1]

AGQ Labs Maroc est constitué de 3 départements présentés dans la figure 1 :

AGQ Labs Maroc

Département Département Département de


organique inorganique microbiologie

Analyse
Analyse de résidus de Analyses physico- microbiologique de
pesticides et métaux chimiques des sols/ l’eau , aliment air et
lourds eaux/ plantes… surface

Figure 1 : Les différents départements de AGQ LABS


II. Le laboratoire de microbiologie :

II.1. Présentation de laboratoire de microbiologie :

Figure 2 : schéma de laboratoire de microbiologie

Le laboratoire de microbiologie est constitué de salles suivantes :

 Une salle de réception des échantillons.


 Une salle d’analyse d’eau et des aliments.
 Une salle d’incubation.
 Une salle de lecture/confirmation.
 Une salle d’autoclavage et laverie (la salle la plus pathogène).
Cette organisation de laboratoire n’est pas faite au hasard, en effet il est organisé selon
la démarche de ‘marche en avant’ qui consiste à séparer les locaux de travail, de telle
façon qu’un produit souillé ou déchet ne rencontre jamais le produit initial. [2]

Le laboratoire est organisé également selon la méthode 5S (figure 3) :

Figure 3 : Organisation de laboratoire selon la méthode 5S

La méthode 5S est une démarche japonaise qui permet la gestion des différents équipements
dans un environnement d travail, ce qui permet d’éviter le gaspillage de temps et d’espace, et
une optimisation de travail.

Les 5S est une abréviation de 5 mots japonais dont chacun a une explication (tableau1) :

Mot en Equivalent Explication


japonais en français

Seiri Séparer
Distinguer entre ce qui est désirable et non. Retirer les éléments
indésirables.

Seiton Systématiser Organiser le lieu de travail. Gardez les objets dans leur place correcte
pour les récupérer facilement et immédiatement.
Seiso Supprimer Supprimer toute source de saleté, et assurer que l’environnement de
travail est toujours propre

Seiketsu Standardiser Maintenir le lieu de travail selon les normes établies. Exposer tous les
affiches de procédures, les comprendre et les suivre.

Shitsuke Autodiscipline Suivez les règles de l'entreprise et les procédures établis. Faire des
choses comme ils doivent être faites.

Tableau 1 : La signification des 5S [3]

II.2. Méthodologie de travail dans le laboratoire :

Figure 4 : Procédure générale de travail dans le laboratoire

La figure 4 présente la procédure générale de travail dans le labo qui commence par la
réception d’échantillon, puis son analyse microbiologique, en suite :

Une destruction des déchets, à savoir les boites de Petrie qui ont étés lus, ceci nécessite une
élimination de toute trace de vie pour cela, les déchets sont mis dans l’autoclave pendant 30
min et dans une température de 121 °c.

Une stérilisation de matériel comme, les flacons qui vont être réutilisés dans la préparation
des milieux de culture, les tubes qui vont entre réutilisés dans les dilutions, les embouts de
pipettes, ceci se fait dans l’autoclave pendant 15 min et une température de 121 °c.
III. But des analyses microbiologiques :
Les analyses microbiologiques des aliments, ont 2 objectifs :

Pour la santé publique : Il s’agit de l’objectif ultime des analyses


microbiologiques, certaines agents pathogènes s’ils ne sont pas détectés au temps
convenable peuvent nuire à la santé publique voire causer la mort.

Pour des raisons économiques : on parle ici des agents d’altération, qui peuvent
rendre le produit inconsommable, les analyses microbiologiques dans ce cas
portent une information pour le producteur qui peut agir en temps opportun et
éviter l’altération de son produit.

En bactériologie alimentaire il n’est pas obligatoire de rechercher et identifier


toutes les bactéries, levures et moisissures présentes dans le produit. Il suffit
souvent d’effectuer :
1) une étude quantitative de la flore microbienne :
- soit par dénombrement d’une flore microbienne donnée caractérisée par un
ensemble de propriétés physiologiques communes comme par exemple numération
de la flore aérobie mésophile revivifiable sur un milieu du type gélose nutritive
ordinaire (germes hétérotrophes peu exigeants, mésophiles si la température
d’incubation est voisine de 30°C avec une durée d’incubation généralement
inférieure à 72 heures, neutrophiles si le pH est voisine de 7, aérobie ou aéro-
anaérobie si l’incubation est réalisée à l’air), la numération des levures et
moisissures confondues (germes acidophiles, aérobies pour la plupart, mésophiles
“bas” etc.), la numération des anaérobies sulfito-réducteurs (germes hétérotrophes,
réduisant les sulfites en sulfure d’hydrogène, mésophiles, anaérobies stricts).
La présence de bactéries d’origine fécale ou tellurique témoigne dans nos aliments
d’un manque d’hygiène et d’un défaut de rigueur technique.
- soit par dénombrement d’un groupe bactérien pouvant correspondre à une
contamination déterminée: coliformes thermotolérants et/ou streptocoques du
groupe D pour la mise en évidence d’une contamination d’origine., staphylocoques
pour la mise en évidence d’une contamination d’origine cutanée, germes
indologènes, germes putrides , etc...
2) une recherche orientée de certaines bactéries pathogènes telles que Salmonella,
Staphylococcus, Shigella, Mycobacterium, Listeria, Brucella, Campylobacter,
Yersinia , etc.... Cette recherche exige l’utilisation de méthodes spécifiques
hautement sélectives. Le plus souvent, ces analyses ne diffèrent d’un produit
alimentaire à un autre que par certains détails d’exécution. Parmi les analyses
“communes” à tous (ou presque tous) les produits alimentaires on peut citer par
exemple les numérations des coliformes ou de la flore “totale”.
La bonne qualité microbiologique (hygiénique et marchande) est donc fonction
de très nombreux facteurs ; le microbiologiste se doit néanmoins de définir le plus
rapidement possible la notion quantitative et qualitative de flore normale de son
produit ou de ses matières premières (microorganismes “habituels”et tolérables), et
d’une flore contaminante dont le seuil de tolérance sera défini en fonction du
risque que fait courir cette flore à un type donné de consommateur.[4]
MATERIEL ET METHODES
I. Analyse microbiologique de l’eau :

I.1. Les micro-organismes retrouvés dans l’eau :

Il est aujourd’hui évident que l’eau est essentielle à bien des égards. Les eaux
destinées à l’alimentation humaine (boissons, préparation d’aliments etc.) ont des
origines diverses (eaux souterraines ou de surface). La flore microbienne présente
dans l’eau est très variée et dépend de l’origine de l’eau (eau de captage ou de
distribution, eau résiduaire etc.).
Parmi les principaux microorganismes susceptibles de se trouver dans l’eau on
rencontre essentiellement des germes normalement aquatiques, des germes
telluriques et des germes d’origine intestinale :
• Les bactéries vivant normalement dans l’eau sont surtout représentées par des
bacilles ou des vibrions Gram - (Vibrio, Flavobacterium, Achromobacter,
Pseudomonas, Cytophaga, Acinetobacter, bactéries sulfato-réductrices ou
ferrugineuses, Sphaerotilus, Spirillum etc...) des bactéries Gram + (Streptomyces,
Micrococcus, Corybacterium). Bon nombre des bactéries typiquement aquatiques
sont difficiles à cultiver au laboratoire et requièrent des milieux très dilués
ne cultivent pas ou peu sur les milieux ordinaires) et ont des températures
optimales de croissance de 20°C ou moins. Certaines de ces bactéries
(Sphaerotilus, Leptothrix, Gallionella et à un degré moindre Pseudomonas et
Acinetobacter) sont qualifiées de mucogènes car elles induisent des troubles et la
formation de “filaments” qui peuvent engendrer des corrosions ou bloquer les
canalisations. Les germes typiques de l’eau sont souvent rencontrés sur les parois
des canalisations ;
• Les germes telluriques sont surtout représentés par des germes sporulés comme
par exemple Clostridium, Bacillus ou des germes des genres Enterobacter ou
Streptomyces.
• Les germes de contamination intestinale humaine ou animale sont souvent
pathogènes (Streptocoques D, entérobactéries dont Salmonella, Clostridium,
Vibrio etc...). Ces bactéries ne se multiplient pas dans l’eau “peu chargée” en
matières organiques. Ces germes sont “blessés” dans l’eau et leur culture nécessite
souvent la revivification.[4].
I.2. Le mode opératoire d’analyse microbiologique de l’eau :

Figure 5 : Principe d'analyse microbiologique de l'eau par filtration [4]

L’analyse microbiologique de l’eau se fait par filtration, il s’agit d’une méthode qui consiste à
couler 100 mL voire 250 mL d’échantillon d’eau à analyser dans la rampe de filtration, par la
suite l’eau va être aspiré à travers une membrane poreuse de 0,45 µm ou 0,25 µm (ca dépend
du paramètre), cette dernière déjà mise sur le disque poreux de la rompe et l’ensemble est
renfermé, et bien sûr dans des conditions stériles (on travail prés de bec bensen). Par la suite
la membrane va être mise dans une boite contenant le milieu de culture convenable pour
chaque paramètre.(figure 5)

Avant chaque manipulation il faut s’assurer les éléments suivants :

 Rincer les rampes avec l’éthanol (100%) et les flamber


 Préparer les géloses qui vont être utilisés.
 Rincer la pince avec lequel on va placer les membranes poreuses (par l’éthanol
également)
 Désinfecter l’espace de travail (par l’éthanol 50%)
 S’assurer de la disponibilité de nombre suffisant de membranes
 Vider le recueil de distillat, (en général il est vidé pour chaque 3 échantillon
manipulé).
 Préparer les différentes boites de Petrie et les géloses qui vont être utilisés, ainsi que
mentionner le code d’échantillon, la date, le paramètre recherche ainsi que la dilution.

N.B : L’analyse microbiologique par filtration concerne tous les paramètres à l’exception
des FMAT (flore mésophile aérobie totale), leur analyse nécessite un ensemencement en
masse, puis une addition d’un milieu de culture ordinaire maintenu en surfusion mais qui
n’est pas très chaud (pour ne pas choquer les micro-organismes).Ceci se fait sous une
hotte à flux laminaire de classe II (figure 6)

Figure 6 : Hotte à flux laminaire verticale de classe II[4]

La hotte de classe II protège l'opérateur, la manipulation et l'environnement. Le flux d'air est


soufflé verticalement à travers un filtre HEPA , ce dernier ne laisse pas passer les particules
d’un diamètre égale ou supérieur à 0,3 µm l'air est de ce fait « propre » et donc empêche la
contamination des échantillons. Plus un débit supplémentaire provenant de l'ouverture
frontale de manipulation. Ce débit d'air frontal aspiré par la hotte permet de protéger le
manipulateur en évitant toute sortie de danger microbiologique. Enfin l'air est rejeté au travers
d'un autre filtre HEPA protégeant l'environnement de toute éventuelle pollution ; la hotte de
classe II est utilisé non seulement au cours de manipulation de FMAT, mais également au
cours de coulage des milieux de culture ainsi que la manipulation d’aliment qu’on va voir par
la suite.[4]

Certificati Paramètre Méthode Résultat R


on

NM iso Clostridia  Choc thermique de 100 ml


6461-2 d’échantillon dans le bain Marie à 75
2007
°c pendant 30 min
NM
 Filtration dans une membrane de
03.7.009
0,25 µm
 Incubation dans le milieu sulfite-fer
viande foie dans une jarre anaérobie Dans le cas de leur présence apparition
pendant 48h
Des colonies noires entourés parfois par

Un précipité noir

NM iso Salmonelle spp  Filtration de 250 mL voire plus dans une


19250 2012 membrane de 0,45 µm

I.N : NM  1er enrichissement : Incubation dans 50


03.7.050 mL d’eau peptoné pendant 24h à 37 °c
 2éme enrichissement : transfert de 0,1
mL d’eau peptoné dans un pot contenant
10 mL de milieu Rappaport Vassiliadis
Soja (RVS) pendant 24 h à 44 °c
 Isolement : A partir de milieu RVS faire
des ensemencement dans les géloses :
gélose Xylose-Lysine-Désoxycholate et
gélose Hecktoen et les incuber pendant
24 h à 37 °c Pour le gélose Hecktoen les colonies
 Lire les boites s’il ya présence de
Caractéristiques ont un couleur noir
colonies spécifiques, procéder à
l’identification par la GALERI API 20E Alors que pour le gélose XLD ils ont un

Couleur rouge avec un précipité noir

NM iso Entérocoques  Filtration de 100 mL de l’échantillon


7899-2 intestinaux dans une membrane de 0,45 µm
2007  Incubation de la membrane pendant

I.N : 24 h dans le milieu Slanetz et


03.7.006 Bartely (SB) pendant 48h à 37 °c
 S’il y’a apparition de colonies
spécifiques dans le milieu SB,
procéder à une confirmation par le
transfert de membrane vers le milieu Pour le milieu SB Colonie caractéristique
BILE, ESCULINE ET AZOTURE
couleur rouge à marron, alors pour BEA
(BEA) pendant 4h à 44 °c
Colonie caractéristique : petite, incolore

et entourée d’un halo noir.

NM iso GAM (FMAT)  Ensemencer en masse deux boites de


6222 2007 petri chacune par 1 mL de la solution

I.N : mère de l’échantillon puis ajouter le


03.7.005 bouillon gélose extrait de levure (GEL) ,
une boite va être incubé à 37 °c pendant
48h et l’autre va être incubé à 22 °c
pendant 72h
 Ensemencer en masser deux boites,
chacune par 1mL de la dilution au 1/10
de l’échantillon (Dilué par la solution
Ringer) ajouter le même gélose et
incuber dans les mêmes températures et
durées.

NM iso CT + EC  Filtrer 100 mL de l’échantillon à


9308-1 travers une membrane poreuse de
2007
0,45 µm
I.N :  Incuber la membrane dans la gélose
03.7.003 Concernant E. Coli , ses colonies
COMPASS® cc pendant 24 h a 37
°c spécifiques ont une couleur bleu-violet,

Alors les coliformes ont une couleur

Rose.
NM iso Staph  Filtrer 100 mL de l’échantillon à
03.7.036 travers une membrane poreuse de
2012
0,45 µm de diamètre
 Incuber la membrane dans la gélose
Baird-Parker pendant 48h à 37 °c,
s’il y’a apparition de colonies
spécifiques procéder à
la Au niveau de gélose Baird Parker , les
confirmation en repiquant une
Colonies spécifiques de staph ont un
colonie dans un tube de bouillon
Couleur grise à noire, brillante, entourée
cœur cervelle, ce bouillon va être
incubé à 37 °c pendant 24h, puis on d’un anneau opaque et d’un halo
réalise le teste coagulase en ajoutant d’éclaircissement En ce qui concerne le
le plasma lapin.
bouillon cœur- Cervelle la présence de

staph est mise en évidence par la

turbidité

Tableau 2 : Méthodologie de travail et certification des différents paramétres de l'eau.

La confirmation de Salmonelle :

La galerie Api 20 E nous permet de confirmer le résultat obtenu par test Kligler-Hajna. C'est
une galerie de 20 micro tubes contenant des substrats déshydratés qui permettent de réaliser
20 tests biochimiques (enzymatiques ou des fermentations de sucres) en même temps des
entérobactéries. Ces micro tubes sont par la suite inoculés avec une suspension bactérienne
purifiée. Cette suspension est réalisée à l'aide de l'ensemencement de 5 ml de l'eau
physiologique par une colonie prélevée de milieu XLD ou G.H. Après inoculation de la
galerie, l'incubation est réalisée à 37°C pendent 24 heurs. La lecture des réactions est
réalisée visuellement, après incubation et juste après révélation des réactions selon les réactifs
additionnés :

 Pour le test de VP : une goutte de VP1 + une goutte de VP2 (lecture après 10
minutes).
 Pour le test de TDA : une goutte de chlorure ferrique (lecture immédiate).
 Pour le test IND : une goutte du réactif de Kovack's (lecture immédiate).
Ensuite la lecture des réactions se fait en se référant au tableau de lecture fournit par le
fabricant (BIOMERIEUX), on additionne les chiffres selon les résultats obtenus et on vérifie
le code dans le livre de référence.(figure 7)

Figure 7 : Galerie Api 20E pour la confirmation de Salmonelle

N.B : Le comptage des colonies se fait par un compteur de colonies manuel (figure 8), il suffit
de mettre la boite qu’on souhaite compter sur le support qu’on peut modifier son éclairage,
par la suite avec un marqueur à chaque fois qu’on marque une colonie, le compteur va générer
un avertissement sonore, et au niveau d’écran il y’aura ajout de +1 pour chaque clic. Le
comptage ne concerne que les boites avec un nombre de colonies < 300 , sinon on passe au
comptage de la dilution suivante.

Figure 8 : Compteur de colonies mannuel.


I.3. Expression de résultats microbiologiques :

I.3.1. Cas de comptage de colonies totales (FMAT) :

Pour le comptage il faut calculer les boites avec au moins 10 colonies (colonies totales,
colonies typiques ou colonies répondant aux critères d'identification) (voir le tableau 2).
Calculez le nombre N de micro-organismes présents dans l’échantillon d’essai sous forme de
moyenne pondérée de deux dilutions successives en utilisant l'équation

∑C
𝑁=
V x 1,1 x d

Avec :

 ∑ 𝐂 : est la somme des colonies comptées sur les deux coupes retenues de deux
dilutions successives, à dont au moins une contient au moins 10 colonies;
 V : est le volume d'inoculum placé dans chaque boîte, en millilitres;
 d : est la dilution correspondant à la première dilution retenue (d= 1 lorsque le produit
liquide non dilué)

Arrondissez le résultat calculé à deux chiffres significatifs. Si le troisième chiffre est


inférieur à 5, ne pas modifier la figure précédente; si le troisième chiffre est supérieur
ou égal à 5, augmentez le chiffre précédent d’une unité. Exprimez le résultat de
préférence sous forme d'un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par la puissance
appropriée de 10.

Indiquez le résultat en N nombre de micro-organismes par millilitre (produits liquides)

I.3.2. Cas de comptage après identification :

Lorsque la méthode utilisée nécessite une identification, un nombre donné A (généralement 5)


de colonies présumées est identifié à partir de chacun des plats retenus. Après identification,
calculer, pour chacun des les boîtes, le nombre a de colonies répondant aux critères
d’identification, en utilisant l’équation :

b
𝑎= ×c
𝐴

Où :
 b : est le nombre de colonies satisfaisant aux critères d'identification parmi les
colonies identifiées A;
 c : est le nombre total de colonies présumées comptées sur le plat.

II. Analyse microbiologique d’aliment :

II.1. Les micro-organismes retrouvés dans l’aliment :

Les groupes microbiens importants dans les aliments comprennent plusieurs espèces et types
de bactéries, levures, moisissures et virus. Ils sont importants dans les aliments pour leur
capacité à causer des maladies d'origine alimentaire et la détérioration des aliments. De
nombreuses espèces bactériennes et certaines moisissures et virus, mais pas les levures, sont
capables causer des maladies d'origine alimentaire. Pour être plus précis pendant toute la
période de stage, 100 % d’échantillons alimentaires étaient des fruits et des légumes, ces
derniers hébergent des microorganismes à la surface; leur nature niveau varie en fonction de
l'état du sol, du type d'engrais et l'eau utilisée et la qualité de l'air. Les moisissures, levures,
bactéries lactiques et bactéries de genres Pseudomonas, Alcaligenes, Micrococcus, Erwinia,
Bacillus, Clostridium et Enterobacter peuvent provenir de cette source. Les agents
pathogènes, en particulier les entérobactéries , peuvent être présents si le sol est contaminé
avec des eaux usées non traitées. Les dommages à la surface de plante (avant, pendant et
après la récolte), long délai entre la récolte et le lavage et les conditions défavorables de
stockage et de transport après la récolte et avant le traitement peut considérablement
augmenter le nombre de microbes ainsi que les types prédominants. Des conditions de
stockage inappropriées après le traitement peuvent augmenter également leur nombre. Les
méthodes appropriées utilisées pendant la croissance (telles que l’utilisation des eaux usées
traitées ou autres) types d’engrais), réduction des dommages pendant la récolte, lavage rapide
et de bonne qualité l'eau pour enlever la terre et la saleté, et le stockage à basse température
avant et après transformation peut être utilisé pour réduire la charge microbienne dans les
aliments d’origine végétale. Comme dans le cas de l’eau, pas tous les micro-organismes vont
être recherchés , mais la recherche va être orienté vers des indicateurs d’hygiène : tel que
E.Coli , les entérobactéries , d’une part et d’autre part les bactéries pathogènes vont être
recherchés tel que Salmonelle , Listeria , Staph et Bacillus Cereus.[5]

II.2. Mode opératoire pour analyse microbiologique d’aliment :

Avant la réception d’échantillon il faut s’assurer des éléments suivants :


 Assurer la fusion des milieux de culture qui vont être utilisés sur la plaque chauffante
 Préparer les différentes boites qui vont être utilisés, les coder avec la date, le code, le
paramètre et la dilution.
 Désinfecter les espaces qui vont être occupés au cours de travail

Après la réception d’échantillon , ce dernier va subir une étape primordiale à savoir un


broyage , pour cela et sous la hotte (figure 6) il faut prélever dans un sac 25 g d’échantillon ,
avec laquelle on va ajouter 225 mL d’eau peptonée tamponnée , ce dernier a comme rôle le
pré-enrichissement des salmonelles et permet notamment de revivifier les microorganismes
ayant subi des traitements sublétaux tels que atomisation, pasteurisation, ajout de
conservateurs, pressions osmotiques élevées, fortes acidités , le sac doit porter le code ainsi
que le paramètre ( Salmonelle ou Listeria ) cette dernière nécessite un autre pré-
enrichissement avec un autre milieu qu’on va voir par la suite . Le sac préparé va ensuite subir
un broyage dans un appareil ‘ Stomacher ‘ pendant 1-2 min. (figure8)

Figure 9 : Préparation et broyage d'échantillon

Concernant Listeria Monocytogenes, on effectue un autre pré-enrichissement, en prélevant


sous la hotte, dans un sac 25g d’échantillon + 225 mL de bouillon Fraser-Demi ce dernier
grâce au polypeptone, l’extrait de levure et l’extrait de viande apportent les éléments nutritifs
nécessaires à la croissance des Listeria. La forte teneur en chlorure de sodium permet
d’accroître la sélectivité du milieu. Par la suite l’ensemble (25g d’échantillon + 225 mL d’eau
peptoné ) sont mis dans le ‘Stomacher’ selon le même principe montré dans la figure 8.

N.B : Au cours de préparation d’échantillon, il faut faire attention aux aliments avec une
texture tranchante, ou lisse ces derniers peuvent provoquer des fissures au niveau de sac, pour
cela ils doivent subir un prélèvement approprié, dans certains cas pas de broyage est
nécessaire.
Le même sac qu’on vient de préparer ne va pas être seulement utilisé pour la recherche de
salmonelle mais également, c’est à partir lequel on va réaliser les différents ensemencements
pour la recherche des autres paramètres tel que E.Coli, Staph…

Dans le cas d’aliment on parle plus de la solution mère, une fois l’échantillon est mis dans
l’eau peptoné la dilution de départ est de -1.

Certification Paramètr Méthode Résultat


e

NM iso Levures  Prélever 1 mL de sac déjà préparé (25 g


21527-1 2012 et d’échantillon +225 mL d’eau peptoné)., la
moisissur
I.N : NM es mettre dans la première boite, puis réaliser
08.0.137 des dilutions successives -2 , -3 , -4 par des
+ tubes d’eau peptoné tamponné mettre 1 mL

NM iso de chaque dilution dans une boite .


21527-2 2012  Ajouter le milieu maintenu en surfusion mais

I.N : NM à une température modérée pour ne pas


08.0.138 choquer les micro-organismes
 Incuber pendant 5 J à 22 °c.

NM iso 6888- Staph  A partir de même sac déjà préparé, prélever


1 2008 (coagulas avec une pipette stérile, 0,1 mL et la mettre
e +)
+ dans la gélose Baird-Parker

NM iso 6888-  Avec un étaleur stérile, assurer la distribution


2 2008 homogène de 0,1 mL dans toute la boite
 Incuber à 37 °c pendant 1 jour.

Au niveau de gélose Baird Parker ,


les Colonies spécifiques de staph
ont un Aspect Couleur grise à
noire, brillante, entourée d’un
anneau opaque et d’un halo
d’éclaircissement .En ce qui
concerne le bouillon cœur- Cervelle
la présence de staph est mise en
évidence par la turbidité

NM iso Listeria  Incuber la préparation (25g d’échantillon + 225


11290-1 2008 monocyto mL de bouillon Fraser demi) à 30 °c pendant 24h.
genes
I.N : NM  Après incubation transférer 0,1 mL vers un pot
08.0.172 contenant 10 mL de bouillon Fraser (contient une
double concentration en acide nalidixique et en
+
acriflavine par rapport au Fraser Demi) par la
NM iso Pour le gélose PALCAM : Colonie
suite le pot sera incubé à 37 °c pendant 24h
11290-2 2008
 Après incubation de pot, faire à partir du pot des caractéristique : De couleur vert-
I.N : NM ensemencements de 4 géloses ; 2 géloses olive avec un centre concave
08.0.173 PALCAM et 2 géloses ALOA typique, entourée d’un halo noir
(Gélose Listeria selon Ottaviani et Agosti )
incuber ensuite les géloses pendant 24 h à 37 °c.
 Après incubation des géloses, effectuer leur
lecture s’il y’a apparition de colonies spécifiques
procéder à a confirmation par la galeri Listeria.
Pour le gélose ALOA : colonies de
couleur bleu/bleu-vert pour toutes
les espèces de Listeria.

NM iso E.Coli  A partir de la préparation (25g échantillon +


16649-1 2006 225 mL eau peptoné) prélever 1 mL la mettre
+ dans la première boite, préparer la dilution -2

N.M iso puis la mettre également dans une autre boite.


16649-2 2007  Ajouter aux 2 boites le gélose TRYPTONE-
BILE-GLUCURONATE (TBX) maintenu en
Après incubation les colonies
surfusion
caractéristiques : couleur bleue à
 Incuber à 44 °c pendant 24h bleu vert
NM iso ASR  A partir de la préparation (25 g d’échantillon
08.0.154 2011 + 225 mL d’eau peptoné ) prélever 1 mL la
mettre dans la première boite , prélever
encore une fois 1 mL et réaliser la dilution -2
puis la mettre dans la deuxième boite.
 Ajouter aux 2 boites le gélose TRYPTONE-
SULFITE-CYCLOSERINE (TSC) Colonie caractéristique : couleur
 Incuber à 37 °c pendant 1 jour dans une jarre noire entourée d’un halo noir.
anaérobie

NM iso 6579 Salmonell  Incuber la préparation (25g d’échantillon +


2012 e 225 mL d’eau peptoné) à 37 °c pendant 1 jour
I.N : NM  Après incubation transférer dans des
08.0.103 conditions stériles , 0,1mL dans un pot
contenant 10 mL de bouillon rappaport
Vassiladis , ce dernier a une forte
concentration en chlorure de magnésium ainsi
que la présence de vert malachite ralentissent Pour le gélose Hecktoen les
la croissance des germes autres que les colonies caractéristiques ont un
salmonelles. couleur noir
 Transférer encore une fois 1 mL de la
préparation déjà incubé vers un pot de 10 mL
de bouillon MULLER-KAUFFMANN AU
TETRATHIONATE-NOVOBIOCINE
(MKTTN) ce dernier grâce à la forte
concentration en sels biliaires et vert brillant
inhibent principalement le développement des alors que pour le gélose XLD ils

microorganismes à Gram-positif. ont un Couleur rouge avec un

 Incuber le pot de RVS à une température de précipité noir


41,5 °c pendant 24h, et le pot de MKTTN à
une température de 37 °c pendant 24h.
 Après l’incubation à partir de chaque pot
réaliser dans des conditions stériles des
ensemencements de 2 boites XLD et 2 boites
G.H
 Incuber les géloses ensemencées à 37 °c
pendant 24 h
 S’il y’a apparition des colonies spécifiques
dans les géloses, procéder à la confirmation
par la galeri API 20E

NM iso Coliforme  A partir de la préparation (25g d’échantillon +


08.0.124 2012 s thermo- 225 mL d’eau peptoné) prélever avec une
tolérants
pipette sous la hotte 1 mL la mettre dans la
première boite , ensuite préparer une dilution
de -2 et -3 et mettre 1 mL de chaque dilution
dans une boite
Colonie caractéristique :
 Ajouter dans les deux boites la gélose
lactosée biliée au cristal violet et au rouge couleur rouge-violet (∅ > 0,5 mm)
neutre maintenu en surfusion entourée d’un halo violet
 Incuber pendant 24h à 44 °c.

NM iso Entéroba  A partir de la même préparation prélever 1mL


21528-2 2012 ctéries ensemencer en masse une première boite ,
I.N : NM puis préparer des dilutions de -2 et -3 , et
08.0.130 ensemencer 2 autres boites.
 Ajouter dans les boites ensemencées le gélose
glucosée biliée au cristal violet et au rouge
Les entérobactéries présentent des
neutre (VRBG) maintenu en surfusion
colonies violettes, entourées ou non
 Incuber à 37 °c pendant 24 h.
d’un halo violet de sels biliaires
précipités.

NM iso 4832 Coliforme Suivre la même procédure effectué pour les Voir les colonies caractéristiques de
2008 s totaux coliformes thermo tolérants , la différence c’est cette coliformes thermo tolérants

fois ci on utilise 2 dilutions (-1 , -2 ) au lieu de trois ,


ainsi que la température d’incubation est de 37 °c
NM iso 7932 Bacillus  A partir de la préparation (25g d’échantillon
2009 Cereus +225 mL d’eau peptoné ) prélever 0,1 mL la
I.N : NM mettre dans le gélose COMPASS® Bacillus
08.0.107 cereus Agar
 Etaler l’inoculum en surface à l’aide d’un
étaleur stérile.
Colonie caractéristique : Couleur
 Incuber à 30 °c pendant 24h verte avec un diamètre supérieur à
1 mm en surface

NM iso 4833 GAM 30°  Transférer 1 mL de la préparation (25g


2008 d’échantillon + 225 mL d’eau peptoné), vers
une boite de Petrie, puis préparer des
dilutions successives (-2 , -3 et -4) transférer
1 mL de chaque dilution également dans des
boites.
 Ajouter aux différents boites le gélose Caractéristiques : excellente
croissance de la flore mésophile
glucosée à l’extrait de levure (PCA) maintenu
en fusion
 Incuber à 30 °c pendant 72h.

Tableau 3 : Méthodolgie de travail pour les différents paramétres d'aliment

N.B : La lecture des boites se fait selon le même principe pour l’eau, en utilisant le compteur
de colonies manuel (figure 8)

Confirmation de Salmonelle :

La confirmation de salmonelles se fait selon le même principe déjà expliqué pour l’eau par la
galerie Api 20 E.

Confirmation de Listeria Monocytogenes :

La confirmation se fait par la galeri Api Listeria . Elle comporte 10 micro tubes, contenant des
substrats sous forme déshydratée qui permettent d'étudier les caractérisations enzymatiques
pour différencient entre les genres listeria. La différenciation est, basée sur plusieurs tests
comme : la présence ou l'absence de l'arylamidase (test DIM basée sur l'hydrolyse du
naphthylamide), hydrolyse de l'esculine, présence de a-mannosidase, et production d'acide à
partir du D-arabitol, D-xylose, Lrhamnose, a-methyl-D-glucoside, D-ribose, glucose-1-
phosphate et D-tagatose, (3- HEM .Hémolyse, observer le type d'hémolyse. Après
l'inoculation, l'incubation se fait à 37°C pendant 2 4 heures, la lecture de résultat est visuelle,
la révélation des réactions est effectuée après incubation de 3 min par addition d'une goutte de
réactif ZYM B au test DIM . La lecture des réactions est réalisée à l'aide du tableau de lecture
fournit par le fabricant .L'identification est obtenue grâce à un profil numérique.(figure )

Figure 10 : Principe de la galerie Api Listeria

II.3. Expression de résultats microbiologiques :

L’expression des résultats microbiologiques se fait selon le même principe déjà montré pour
l’eau. La seule différence c’est l’unité : nombre de colonies par grammes de produit.

III. Analyse microbiologique de surface :


III.1. Les microorganismes retrouvés en surface :
III.2. Mode opératoire d’analyse microbiologique de surface :
L’analyse microbiologique de surface se fait par écouvillonnage, c’est une
méthode qui consiste à envoyer au client, un écouvillon stérile et fermé , par la
suite après réception de l’écouvillon par le client , ce dernier doit ensemencer par
l’écouvillon la surface qu’il souhaite déterminer sa qualité microbiologique (figure
11 ) , comme exemple de surfaces analysés : Les frigos, table de manipulation, et
parfois même les mains d’ouvriers.

Figure 11 : Protocole d'analyse microbiologique de surface

Le client doit déterminer la nature de surface ensemencé, ainsi que s’il s’agit d’une surface
humide ou sèche :

 S’il s’agit d’une surface sèche, il faut ajouter 5 mL d’eau peptoné à l’écouvillon.
 S’il s’agit d’une surface humide, l’addition d’eau peptoné n’est pas nécessaire.

Les paramètres recherchés pour la surface sont :


 Flore aérobie mésophile à 37°C
 Salmonelle
 Listeria
 Staphylocoques à coagulase positive
 Coliformes fécaux
 Levures et moisissures

Pour l’analyse de ces différents paramètres , on utilise les mêmes milieux de culture pour
l’aliment , et les mêmes protocoles , la seule différence cette fois , c’est aucun broyage
n’est nécessaire , même pour la recherche de Salmonelle et Listeria , durant le premier
enrichissement il suffit de transmettre 1 mL de l’échantillon vers des pots de 50 mL d’eau
peptoné pour Salmonelle , et un pot de 50 mL de bouillon Fraser pour Listeria.

Les mêmes résultats obtenus pour l’aliment sont observés également.

III.3. Expression de résultats microbiologiques :


IV. Analyse microbiologique de l’air :
IV.1. Les microorganismes retrouvés dans l’air :
Elle est constituée d’une flore de base et d’une flore accidentelle. La flore de base
comprend les micro-organismes saprophytes, les plus résistants aux agressions du
milieu extérieur. Elle provient essentiellement des milieux secs. Elle est composée
de bactéries (Bacillus sp., staphylocoques, microcoques, Sarcina ) et de
champignons microscopiques filamenteux : Aspergillus sp., Cladosporium sp.,
Penicillium sp., Fusobacterium sp., Alternaria sp., etc. qui suivent des variations
saisonnières. La flore accidentelle est à la fois d’origine humaine et
hydrotellurique. Certains micro-organismes fragiles émis par l’homme
(méningocoque, streptocoque hémolytique, certains virus respiratoires...) ne se
transmettent que par contact direct d’un individu à l’autre, d’autres sont plus
résistants dans le milieu extérieur et sont, pour certains d’entre eux, choisis comme
indicateurs de contamination humaine (staphylocoques, Escherichia coli ). Des
micro-organismes de la flore hydro-tellurique peuvent aussi être momentanément
présents dans l’air (Pseudomonas sp. et espèces apparentées, Legionella sp.,
mycobactéries atypiques, champignons filamenteux...).

IV.2. Mode opératoire pour analyse microbiologique de l’air :


L’analyse microbiologique de l’air consiste , à préparer des géloses convenables
pour chaque paramètre , ces derniers sont communiqués par le client , ensuite il
faut envoyer ces géloses entourés par le ‘Parafilm’ ce dernier à comme rôle
d’empêcher tout contact externe avec la boite ce qui va fausser le résultat , après
réception des boites par le client , ce dernier va ouvrir les boites dans l’espace qu’il
souhaite analyser pendant 30 min par la suite les boites sont fermés , et envoyés au
labo puis incubés pendant la durée et la température convenable pour chaque
paramètre.
N.B : Pour chaque paramètre il y’a envoi d’une boite témoin qui ne sera pas ouverte et
qui sera incubé également pour savoir si les conditions de transport étaient optimales
ou non. S’il y’a apparition de colonies dans cette boite témoin on distingue que les
conditions de transport n’étaient pas optimales.
L’analyse microbiologique de l’air concerne uniquement les paramètres suivants :
 Les levures et moisissures. (Envoi de 3 boites dont une est témoin)
 FMAT 30 °c. (Idem).
Les mêmes milieux de culture utilisés pour l’aliment et la surface sont utilisés pour
l’analyse microbiologique de l’air .Ainsi que les mêmes résultats (Les colonies
spécifiques).
ASSURaNCE qualité
dans le laboratoire
I. Contrôle qualité de milieux de culture :
La qualité des milieux de culture utilisés en microbiologie au laboratoire est
cruciale pour obtenir des résultats optimaux et fiables. Certains milieux de
culture sont essentiels pour isoler certains microorganismes, il est donc
impératif qu’ils fonctionnent comme prévu. Les procédures de contrôle de
qualité permettent de s’assurer que les milieux n’ont pas été contaminés avant
leur utilisation et qu’ils permettent la croissance de l’organisme avec lequel ils
ont été ensemencés.
Les performances de tous les milieux utilisés au laboratoire doivent être
vérifiées par des méthodes de contrôle de qualité appropriées. Pour les milieux
préparés sur place (au labo), cette évaluation doit concerner chaque chaque lot
, pour cela les éléments suivants sont vérifiés :

• La stérilité : incubation d’une journée avant utilisation ;


• L’apparence : vérifier la turbidité, la sécheresse, la régularité de la surface,
une couleur anormale ;
• Le pH ;
• La fertilité : en utilisant des souches de collection ;
• La capacité à produire des résultats biochimiques appropriés : en
utilisant des souches de collection.

II. Contrôle de la température :


II.1. Des réfrigérateurs et congélateurs :
Les réfrigérateurs et les congélateurs de labo auxquels, on stocks les milieux de
cultures, les suppléments de certains milieux, les souches de références et les
échantillons, doivent forcement avoir un intervalle de température qui est
respecté et qui ne dois pas être dépassé afin d’éviter , la péremption de produits
et de réactifs avec lesquels on effectue les analyse microbiologiques , pour cela