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Ingeniería en Biotecnología Laboratorio de Bioquímica microbiana

ENZIMAS

Ingeniería en Biotecnología
BIOQUÍMICA MICROBIANA

Profesor: Ramón Cervantes Rivera

Práctica No. 1: Enzimas


Ingeniería en Biotecnología Laboratorio de Bioquímica microbiana

REPORTE DE LA PRÁCTICA

DATOS GENERALES
Práctica 01 ENZIMAS
No.
Profesor: Ramón Cervantes Rivera

Fecha de 27/11/2014 Fecha de 01/12/2014


práctica: reporte:

No. equipo: 4 Grupo: A


Participantes: BAUTISTA VALENTE ALEJANDRA
ACOSTA LANDA GPE. MONTSERRAT

RUIZ GUERRERO KAREN AZUCENA.


SOLÍS VERÓNICA PAMELA ARELI
2

Objetivos de la práctica
Que el alumno adquiera competencias para identificar enzimas de diferentes muestras
biológicas.
Que el alumno adquiera las competencias para tratar correctamente muestras de enzimas a
analizarse posteriormente.
Que el alumno analice los efectos en el funcionamiento de las enzimas, como resultado
Justificación
La aplicación de técnicas para la identificación de enzimas en diferentes compuestos y los
factores que afectan la actividad enzimática, proporcionará a los alumnos herramientas que
incrementarán su competitividad como ingenieros biotecnólogos.

Habilidades necesarias: Competencias a desarrollar:

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Al finalizar la práctica, el alumno debe ser Utilizar técnicas de análisis para determinar las
capaz de: características de los productos biotecnológicos
Analizar muestras biológicas para la mediante parámetros físicos, químicos.
identificación de enzimas. – Realizar el informe de los resultados de los
Comprender la utilidad de la técnica para el análisis que permitan caracterizar el producto con
análisis de enzimas de interés biotecnológico base a sus propiedades físicas, químicas y
biológicas

Comentarios del profesor: Calificación:

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INTRODUCCIÓN
Una enzima es una proteína que tiene función de biocatalizador; este proceso se lleva acabo
sobre una molécula denominada como sustrato, también como aclaración, las enzimas son
específicas con el sustrato con el que reacciona, dejando que solo puede realizar el proceso
de catalizacion sobre un solo sustrato o molécula, este proceso se lleva a cabo en la parte de
la enzima llamada sitio activo que tiene características especiales para que el proceso de
catalizacion se lleve a cabo. Este proceso no afecta en si el proceso natural de la reacción
que cataliza si no que su función es el de ayudar a que el proceso se realice más rápido.
La acción de la enzima se puede ver de 2 formas:
 La vía alterna que se realiza gracias a la enzima, que sin la presencia de la enzima ya
que existe una barrera virtual entre los sustrato o productos para que estos se
conviertan a productos denominada energía libre de activación, es la energía que se
requiere para su conversión de sustrato a productos y que gracias a la ayuda de la
enzima se requiere menos energía, por consiguiente también la velocidad con que la
reacción se realiza en menor que de forma natural.
 El sitio activo de las enzimas contiene diferentes mecanismos químicos que facilita la
conversión de sustrato a productos, este actúa como un molde tridimensional
específico que se une al sustrato. El sitio activo contiene grupos catalíticos que 4
facilitan la reacción como una catálisis tipo acido-base donde algunos residuos de
aminoácidos proveen o aceptan protones.

El proceso enzimático tiene diferentes factores que afectan a que el proceso se realice
con mayor o menor eficacia tales como:
 Concentración del sustrato: Cuando se tiene altas cantidades de sustrato en
comparación con la concentración fija de la enzima se obtiene la velocidad máxima,
donde cuando se está en forma inversa las concentraciones decrece la velocidad.
 Temperatura: Un incremento en 10ºC duplica la velocidad de la reacción, hasta ciertos
límites. Pero cuando se incrementa mucho la temperatura desnaturaliza la proteína y
pierde su actividad.
 pH: el pH es óptimo es 7, y un cambio en este pH afecta su actividad haciéndola
incrementar o bajar su actividad.
 Cofactores: Muchas enzimas para sus procesos requieren cofactores sean activadores
o coenzimas.

Una de las enzimas que se encuentran con gran abundancia es la catalasa o


hidrógeno-peróxido-oxido-reductasa, su función es proteger a las células del efecto tóxico
del peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) producido en distintas reacciones redox, esta se

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encuentra en diversos alimentos como el hígado, vegetales (espinacas, papa, zetas,


cebollas, pepinos), y algunas frutas (piña, cerezas, plátanos, entre otros) y aun que todas las
células vegetales contienen catalasa algunas la contiene en mayor cantidades como las
brotes jóvenes de trigo, trébol, coles de Bruselas; pero en especial se encuentra en el
hígado.
Esta enzima se encuentra dentro del peroxisoma que es un organelo celular con un
membrana lipídica, se ubica en los tejidos pero mayor mente en el hígado en los animales y
en los animales, también las plantas tienen peroxisomas que les ayuda a la fosforespiracion.
Entre las especificaciones de la catalasa esta se reporta con el símbolo U que la
cantidad de enzima que una reacción enzimática cataliza la conversión de 1 micro mol de
sustrato por minuto. Esta unidad de U se puede combinar con U/mg o U/ml, también existe
el kamal que equivale a 60*106.
Los factores que pueden afectar a la actividad enzimática de la catalasa son el pH
siendo su pH óptimo de 7 y una variación de este hace que descienda la velocidad de
reacción, al igual la temperatura siendo su temperatura ideal de 37ºC y una variación más
alta hace que descienda bruscamente su actividad al punto de ser nula su actividad por la 5
desnaturalización que llega a ser a los 45ºC aproximadamente o en menor temperatura si
realiza el proceso pero con mucha menor velocidad.
La forma en que reacciona este enzima en descomponer el peróxido de
hidrógeno (agua oxigenada) en agua y oxígeno al ser una oxidorreductasa que Catalizan una
amplia variedad de reacciones de óxido-reducción, empleando coenzimas, tales como NAD+ y NADP+.
𝐻2 𝑂2 → 𝐻2 𝑂 + 𝑂2 .
Dentro de la practica en las diversas muestras se encontraba en diferentes
concentraciones la catalasa siendo más predominante en el hígado y posiblemente en menor
cantidad en la zeta donde se observó una menor reacción en la practica, siendo asi también
que las catalasas de origen animal y vegetal la reacción visual que se presento fueron muy
diferentes entre ellas, siendo las rápida y constante las del hígado y la espinaca, pero
mayormente en el hígado y de igual forma más rápida en el hígado, y con mayor lentitud en
los vegetales. Tanto el almidón, que pertenece a las células vegetales, como el glicógeno, de
las células animales, ambos son polímeros de glucosa en distintas estructuras, siendo ambas
estas distintos tipos de azucares.

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MATERIAL REQUERIDO POR EQUIPO

CRISTALERÍA
CANTIDAD MATERIAL ESPECIFICACIONES
1 Gradilla para tubos de ensayo
15 Tubos de ensayo
1 Bulbo para pipeta
4 Pipeta 5 𝑚𝑙
1 Mechero
2 Pipetas Pasteur con bulbo
1 Pinzas para tubo de ensayo
1 Termómetro
1 Placa de porcelana
2 Goteros
2 Morteros
6
2 Perilla de seguridad
3 Vaso de precipitados
1 Pizeta 50 𝑚𝑙

Equipos requeridos
Baño maría

OTROS MATERIALES REQUERIDOS (no suministrados por el laboratorio)


CANTIDAD MATERIAL ESPECIFICACIONES
1 papa
5 Hígado
1 Hongos (setas)
1 Hoja de espinaca
15 Gasas
Hielo

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REACTIVOS REQUERIDOS
NOMBRE CANTIDAD S I R O
Peróxido de hidrógeno 𝐻2 𝑂2 50 𝑚𝑙 2 0 3
Solución 3 𝑀 de Hidróxido de sodio 20 𝑚𝑙 3 0 1 Corrosivo
𝑁𝑎𝑂𝐻
Solución 3 𝑀 de Ácido clorhídrico 𝐻𝐶𝑙 20 𝑚𝑙 3 0 0 Corrosivo

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PARTE EXPERIMENTAL

Preparación de las muestras:


1. Se cortó en pedazos por separado las muestras de papa, hígado, setas y espinaca.
2. Se utilizó una licuadora y un mortero para moler el material con un poco de agua hasta
que se diluyo la mayor parte de la muestra.
3. Se filtró el macerado con una tela parecida a una gasa.
Funcionamiento de la enzima catalasa en diferentes organismos:
1. Se rotularon cinco tubos de ensayo con las letras de la A a la E.
2. Se colocó 3𝑚𝑙 de cada muestra en los tubos de la siguiente manera.
A – Hígado
B – Papa
C – Setas
D – Espinaca
E - Agua
3. Se marcó el nivel hasta de cada muestra. 8

4. Se colocaron 3𝑚𝑙 de peróxido de hidrógeno (𝐻2 𝑂2 ) en cada tubo de ensayo.


5. Se marcó la reacción que sucedió en cada tubo y el cambio en el nivel del líquido.
6. Los resultados se tabularon en una tabla (Tabla 1).
Efecto de la temperatura sobre el funcionamiento de las enzimas:
1. Se rotularon cinco tubos de ensayo del 1 al 5.
2. Se añadieron 5𝑚𝑙 de muestra de hígado a cada tubo.
3. Se mantuvieron los tubos a las siguientes condiciones:
Tubo 1: 80°𝐶 por 15 minutos
Tubo 2: 37°𝐶 por 15 minutos
Tubo 3: Temperatura ambiente
Tubo 4: Hielo por 30 minutos
Tubo 5: Refrigerador a 4°𝐶 por 30 minutos
4. Se añadieron 2𝑚𝑙 de peróxido de hidrógeno (𝐻2 𝑂2 ) al tubo 1.
5. Se realizó la medición del tiempo transcurrido desde que se añadió el (𝐻2 𝑂2 ) hasta que
se produjeron burbujas y se anotó en una tabla. (Tabla 2)

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6. Se repitió el procedimiento con los demás tubos.


Efecto del pH sobre la actividad enzimática:
1. Se rotularon tres tubos de ensayo A, B y C.
2. Se añadieron 3𝑚𝑙 de muestra de hígado a cada tubo.
3. Se añadieron 3𝑚𝑙 de 𝐻𝐶𝑙 y 3𝑚𝑙 de 𝑁𝑎𝑂𝐻 a los tubos, y se realizó agitación suave hasta
mezclarlos:
Tubo A – 3𝑚𝑙 de 3𝑀 𝐻𝐶𝑙
Tubo B – 3𝑚𝑙 de 3𝑀 𝑁𝑎𝑂𝐻
Tubo C – Control (sin ácido ni base)
4. Se añadieron 3𝑚𝑙 de peróxido de hidrógeno (𝐻2 𝑂2 ) a cada tubo.
5. Se observaron y realizaron las anotaciones en una tabla (Tabla 3).

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RESULTADOS

REACCIÓN AL AGREGAR VOLUMEN FINAL DEL


# TUBO
𝑯𝟐 𝑶𝟐 TUBO
Mucha efervescencia con
A 5.8 mL
burbujas separada.
Leve efervescencia con
B 3 mL
burbuja junta.
Mucha efervescencia con
C 4.5 mL
burbujas separada.
Mucha efervescencia con
D 5.5 mL
burbuja continúa.
E N/A. 6 mL
Tabla 1: Funcionamiento de la enzima catalasa en diferentes organismos.

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# TUBO TEMPERATURA TIEMPO OBSERVACIONES

La enzima se
1 80°C Nulo. desnaturalizo por el
calentamiento.
Producción de
2 37°C 1s
abundante burbuja.
Producción de
3 27°C 1 s.
abundante burbuja.
Producción de poca
4 1°C 13 s.
burbuja.
Producción de poca
5 5°C 24 s. burbuja y poca
efervescencia.
Tabla 2: Efecto de la temperatura sobre el funcionamiento de las enzimas.

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TIEMPO EN QUE TOMA DESCRIPCIÓN


TUBO LA RECCIÓN EN COMPARATIVA DE
ACOMPLETARSE LAS REACCIONES

A N/A Sin reacción

Abundante burbuja.
B 1:19 s.
Separación de fase.

C 24 s Burbuja abundante.

Tabla 3: Efecto del pH sobre la actividad enzimática.

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Foto 1: Efecto del pH Foto 2:


sobre la actividad Reacción de las Foto 3: Funcionamiento de la
enzimática. espinacas con enzima catalasa en diferentes

peróxido de organismos.

hidrógeno.

Foto 4: Hígado a
1°C con
peróxido de
hidrogeno.

Foto 5: Hígado a
27°C con
peróxido de
hidrogeno.

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DISCUSIÓN DE RESULTADOS

1. ¿Qué ocurrió al añadir el peróxido?


En la mayoría de las muestras se generó burbujeo en diferentes concentraciones y en
diferentes tiempos.
2. ¿Ocurrió lo mismo en todas las muestras?
No fue diferente ya que como evaluamos el comportamiento de una enzima (catalasa),
existen en diferente cantidad en las muestras organicas.
3. ¿Por qué se forman burbujas?
Porque al mezclar el peróxido de hidrogeno con las muestras que presentan la enzima
catalasa, la enzima manifiesta una actividad de peroxidasa, es decir, cataliza la oxidación de
sustratos acoplada a la reducción del H2O2, con lo cual se forma H2O y O2. El
desprendimiento de O2 es el que genera el burbujeo.
4. ¿Qué otros organismos podrían usarse para esta prueba?
Hígado de res, aguacate, cebolla, rábano, col, pepinos, nabos, apios, pues en estos
alimentos se encuentra la enzima catalasa
12
5. ¿Por qué no se añadió el peróxido directamente a los tejidos sin macerarlos?
Porque se obtiene mejor la enzimas si la tomamos directamente del jugo ya que se
encuentra en mayor concentración que si tomamos del tejido directamente pues aparte de la
enzima contiene otras proteínas que pudieran afectar la enzima.
6. Explique por qué la gran mayoría de las especies de plantas y de animales producen la
enzima catalasa.
La catalasa es una enzima que libera agua y oxigeno que resulta de la descomposición del
peróxido, el cual es el desecho del metabolismo de las células y necesita ser descompuesto
en agua y oxígeno, ya que el peróxido es toxico se necesita descomponer, es ahí donde
interviene la catalasa, entonces por ello las plantas y animales producen esta enzima.
7. ¿Cómo se relacionan la temperatura y la actividad enzimática?
La actividad enzimática es óptima en los rangos de temperatura de 35 a 37ºC, por arriba de
esos valores las Enzimas (Proteínas con funciones metabólicas) se Desnaturalizan, es decir,
pierden momentáneamente sus funciones metabólicas porque su estructura terciaria se
desorganiza.

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Por debajo de estos valores las Enzimas son Inhibidas, es decir, se mantienen inactivas de
tal manera que no pueden intervenir en una reacción enzimática.

8. ¿Qué le sucede a las enzimas cuando se exponen a temperaturas extremas (muy frías o
muy calientes)?
La enzima se desnaturaliza ya que a altas o bajas temperaturas, ésta pierde su estructura
terciaria, que es la que en definitiva le da la función a la enzima. Sin su estructura no está
formado el sitio activo, por lo que no tiene actividad alguna.
9. ¿Cómo se relacionan el pH y la actividad enzimática?
Si se mide la actividad enzimática a diferentes 𝑝𝐻, se puede demostrar el efecto de la
concentracion de 𝐻(protones), para la mayoria de las enzimas se encuentra entre un 𝑝𝐻 de 6
a 8 si está por debajo o por encima de estos valores la velocidad cae mas o menos
rápidamente, los cambios de 𝑝𝐻 del medio afectan el estado de ionización de ciertos grupos
funcionales en la molécula de la enzima y también en la del sustrato.
10. Las enzimas del estómago funcionan óptimamente a un pH de 2. ¿Cómo se afectaría la
digestión si el pH aumenta a 4? 13
El pH de estómago es muy acido entonces si nosotros aumentamos el pH no se realiza la
misma reacción de digestión ya que son enzimas las que llevan a cabo la digestión, sin
embargo la enzima catalasa funciona en un pH de entre 3 y 6 entonces si nosotros
aumentamos el pH del estómago la enzima funcionaria correctamente ya que se encuentra
en sus rangos de pH.
11. ¿Puede mencionar otras enzimas que actúan en nuestro cuerpo?
LIPASA PANCREÁTICA, sintetizada por la porción Exóctrina del páncreas, actúa sobre los
lípidos reduciéndolos en Glicerina (Alcohol) y Ácidos grasos simples (Glicéridos y
Triglicéridos).
LIPASA INTESTINAL, sintetizada por las glándulas intestinales, actúa sobre los Lípidos
reduciéndolos en glicerina y ácidos grasos simples.
TRIPSINA y QUIMIOTRIPSINA PANCREÁTICA, sintetizada por el Páncreas exocrino, actúa
sobre las cadenas poli peptídicas reduciéndolas en Oligopéptidos.
MALTASA, sintetizada por las glándulas intestinales, actúa sobre la Maltosa (Disacárido)
reduciéndola en 2 moléculas de Glucosa (Monosacáridos).

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LACTASA, sintetizada por las glándulas intestinales, actúa sobre la Lactosa (Disacárido)
reduciéndola en Glucosa y Galactosa (Monosacáridos).
RIBONUCLEASA y DESOXIRRIBONUCLEASA, sintetizada por el Páncreas exocrino, actúa
sobre los Ácidos Nucleicos (ADN y ARN) reduciéndolos en Nucleótidos.
SACARASA, sintetizada por las glándulas intestinales, actúa sobre la Sacarosa (Disacárido)
reduciéndola en Glucosa y Fructosa (Monosacáridos).
12. ¿Qué efecto podría tener una fiebre alta prolongada sobre el funcionamiento de las
enzimas? Podría inhibir el funcionamiento de las enzimas ya que como son enzimas a una
temperatura alta estas empiezan a desnaturalizarse y por lo mismo no reaccionan
correctamente.

Durante el desarrollo de esta práctica observamos que los materiales orgánicos que
utilizamos fueron un poco complicados de triturar ya que solo utilizamos su jugo y algunos
como la papa y las setas fueron los más duros y por lo tanto los más complicados en
obtener su jugo, para obtener solamente el jugo fue necesario filtrara con gasa las muestras 14
además de exprimir para que se obtuviera todo el jugo que necesitamos. Las diferentes
temperaturas que utilizamos afectaban en la reacción con el peróxido de Hidrogeno, por ello
fue necesario de tomar las temperaturas extremas correctamente como fueron a 4°C Y 80°C
como también cuando la muestra se refrigero ya que como eran temperaturas opuestas la
reacción que provoco fue muy notoria en ambos casos. Fue necesario tomar la cantidad
exacta de peróxido para cada muestra ya que si se colocaba más o menos cantidad pudiera
que reaccionara diferente como de misma manera la persona que colocaba el peróxido tenía
que ser la misma persona para que la fuerza con la que cayera al tubo fuera la misma. Los
tiempos tomados en cada muestra fueron de ayuda para que existiera reacción ya que influía
con ello la temperatura y como ya sabemos la temperatura es necesaria para que cierta
enzima reaccione o también como es una proteína, es necesaria la temperatura para que
esta no se desnaturalice.

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CONCLUSIONES

Al realizar esta práctica se pudo comprobar y observar los eventos de la reacción de la


enzima catalasa en alimentos que el ser vivo consume a diario así como son algunos
vegetales y tejidos animales.
El equipo concluyó que algunos factores modifican la acción que tiene la enzima catalasa,
uno de ellos es por la modificación del pH , así como también a la temperatura, ya que estas
dos factores son muy importantes para el normal y buen funcionamiento de esta enzima
catalasa; en el caso de la temperatura se comprobó lo que la literatura señala, diciendo que
la acción de la catalasa con peróxido de hidrogeno tiene una temperatura optima de acción
entre los 21-24°C y a partir de los 44°C ya no hay reacción.
En la etapa de experimentación al poner la muestra a 80 C y al agregarle el agua oxigenada
se visualizó que no ocurrió nada lo cual se concluyó que la enzima al tener contacto con la
alta temperatura aplicada perder su estructura y también perdió su función, por lo que no
pudo descomponer el agua oxigenada, y por lo tanto se concluyó que la enzima catalasa fue
desnaturalizada al realizar esto la enzima manifestó una actividad efervescente puesto que 15

al agregar el peróxido de hidrogeno la enzima catalasa catalizo la oxidación y como resultado


nos dio la formación burbujeo.
Se afirmó que los resultados de las diferentes muestras dieron resultados distintos gracias a
las condiciones de temperatura y pH distintos que se utilizaron para cada uno de ellos.

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BIBLIOGRAFÍA

“Efecto del pH y la temperatura alta en la enzima catalasa” Elaborada por: Bióloga María del

Rosario López Mendoza. Universidad Nacional Autónoma De México; Colegio de ciencias y

humanidades plantel oriente área de ciencias experimentales (biología)

http://www.profesorenlinea.cl/Ciencias/Hidratos_carbono_Glicogeno.html

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/p

arte07/07.html

http://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-

2010/12%20Verano%20Ciencia%20Region%20Centro/UAQ%20Cedillo%20Jimenez.pdf

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http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmi

dth02/parte03/01.html

http://www.infobiologia.net/2011/09/lisosomas-peroxisomas-y-vacuolas.html

http://webs.uvigo.es/mmegias/5-celulas/6-peroxisomas.php

http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/funcion%20enzima.html

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