DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMETRÍA DE SUSTANCIAS PROBLEMA

Arboleda Valencia Lina María (lina.arboleda04@usc.edu.co)

Medina Delgado Carol Lizeth (carol.medina00@usc.edu.co)
Siachoque Meza Laura Vanessa (laura.siachoque00@usc.edu.co)
Triviño katherin (katherin.8c@gmail.com)
________________________________________________________________________
Facultad de Ciencias Básicas
Universidad Santiago de Cali
Programa de Química
Laboratorio de Bioquímica
Profesora Luz Dary Caicedo
Santiago de Cali
2019-2

RESUMEN

En la práctica se determinaron los espectros de longitud de onda de máxima absorción del

azul de bromotimol a pH ácido y de la mezcla de azul de bromotimol y rojo congo a pH
7,5. Esto se llevó cabo por medio de la técnica de espectrofotometría. De esta manera,
se obtuvo que la longitud de onda de máxima absorción del azul de bromotimol y de la
mezcla con rojo congo fue de 430 nm y 610, respectivamente. Posteriormente, se realizó
una curva de calibración con el azul de bromotimol (con coeficiente de correlación R​2 =
0,9987) y de esta manera se determinó la concentración de la muestra problema,
obteniendo como resultado 9,72 mg/L, un porcentaje de error del 2,8% y el coeficiente de
absortividad igual a 0.027.

Palabras Clave:​ Espectrofotometría, absorción, espectro, longitud de onda.

1. INTRODUCCIÓN instrumentos más común y utilizado es el

El estudio a nivel bioquímico requiere de la
utilización de métodos analíticos e instrumentos
científicos que permitan la determinación
cuantitativa, cualitativa y las características
físico-químicas y biológicas de cualquier
biomolécula.​[1] La espectrofotometría es una de
las técnicas más representativa de estudio en
la biología molecular y celular. Uno de los
1
espectrofotómetro que contribuyó durante al
menos 3 décadas en gran medida al desarrollo
de la bioquímica.​ [2]
El espectrofotómetro es un instrumento que
deja pasar la proyección de un haz de luz a
través de una solución muestra permitiendo
medir la absorbancia o la transmitancia. La
cantidad de luz absorbida o transmitida a una
longitud de onda particular es proporcional a la La determinación de los espectros de
concentración del material. Cuando el medio no absorbancia se realizó para obtener la
absorbe luz por sí mismo, se puede mezclar longitud de onda de máxima absorción
con otros reactivos para obtener, mediante una tanto del azul de bromotimol a pH ácido,
reacción química determinada, una solución como de la mezcla de azul de bromotimol y
que si absorba luz. [3] La absorción de las rojo congo a pH 7.5. En la tabla 1 y tabla 2
radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas se recopilaron los resultados obtenidos de
depende de la estructura de las moléculas, y es los indicadores de pH empleados en el
característica de cada sustancia química. laboratorio.
La ley de Beer-Lambert establece que hay una
relación lineal entre la absorción de luz a través Tabla 1. Recopilación de datos obtenidos para el
de una sustancia y la concentración de la azul de bromotimol a pH ácido.
sustancia.​ [4] [5] Azul de Bromotimol a pH ácido
2. OBJETIVOS Longitud de onda Absorbancia
400 0,270
2.1. Objetivo general
430 0,338
Aprender y ejecutar el manejo y funcionamiento 460 0,286
del espectrofotómetro. 490 0,167
2.2. Objetivo específico 520 0,072
550 0,026
Efectuar el espectro de absorción de luz visible
de varias sustancias y aplicar la ley de 580 0,013
Beer-Lambert para determinar la concentración 610 0,010
de una sustancia. 640 0,009
670 0,008
3. METODOLOGÍA 700 0,008

Se utilizó la técnica de espectrofotometría para De esta manera, el espectro de absorción de

determinar los espectros de absorción del azul para el azul de bromotimol a pH ácido se puede
de bromotimol a pH ácido y de la mezcla de apreciar en la figura 1.
azul de bromotimol y rojo congo a pH 7.5; se
midió la absorbancia de cada sustancia cada
30 nm, iniciando en 400 nm hasta 700 nm, en
cada lectura se efectuó una calibración con el
blanco (agua destilada), se anotó cada
medición y se resaltó a cual longitud de onda
se obtuvo un absorbancia máxima.

4. RESULTADOS

4.1. Determinación de los espectros de

absorción Figura 1​. Espectro de absorción del azul de
bromotimol a pH ácido.

2
Tabla 2. Recopilación de datos obtenidos para la rojo congo a pH 7,5. 0.510 610
mezcla de azul de bromotimol y rojo congo a pH 7,5. 4.2. ​Comprobación de la ley de
Azul de Bromotimol + Rojo congo a pH 7,5 Beer-Lambert
Longitud de onda Absorbancia
400 0,291 Para esta parte, se dispuso de una curva de
430 0,304 calibración de siete estándares elaborada a
partir de una solución madre de concentración
460 0,340
conocida. En este caso, la solución madre
490 0,403 trabajada fue el indicador azul de bromotimol a
520 0,402 pH ácido con una concentración conocida de
550 0,361 100 mg/L. A partir de esta solución se
580 0,392 prepararon los estándares como se muestran
610 0,510 en la tabla 4.
640 0,383 Tabla 4. Preparación de estándares para la curva
670 0,089 de calibración.
700 0,000 Tubo # 1 2 3 4 5 6 7 *8
Volumen de
solución original 0,25 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 0
(mL)
Así, el espectro de absorción de para la mezcla Agua destilada
9,75 9,5 9,0 8,5 8,0 7,0 6,0 10
(mL)
del azul de bromotimol y rojo congo a pH 7,5 se * ​El tubo 8 corresponde al blanco de calibración, el cual es agua
aprecia en la figura 2. destilada

Para hallar la concentración final de cada uno

de los tubos según la tabla 4 se procedió a
utilizar la ecuación 1.
C​1​*V​1​=C​2​*V​2
​[Ecuación 1]
Al despejar se obtuvo la ecuación 2.
C 1 *V 1
C2 = V2

​[Ecuación 2]
Figura 2​. Espectro de absorción de la mezcla azul
de bromotimol y rojo congo a pH 7,5. En la tabla 5 se observa las concentraciones de
cada uno de los tubos, obtenidas mediante la
ecuación 2.
Con lo anterior, se puede observar la longitud
de onda de máxima absorción de los Tabla 5. Concentración final de cada uno de los
indicadores trabajados, tal como se observa en tubos​.
la tabla 3. Tubo # 1 2 3 4 5 6 7 8
Volumen de
la sustancia 0,25 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 0
Tabla 3. Longitud de onda de máxima absorbancia original (mL)
de los indicadores de pH utilizados en el laboratorio. Agua
destilada 9,75 9,5 9,0 8,5 8,0 7,0 6,0 10
Sustancia Abs λ (nm) (mL)
Azul de bromotimol pH ácido 0.338 430 [X] mg/L 2,5 5 10 15 20 30 40 0
Mezcla azul de bromotimol y
3
 Donde
Mediante el cálculo de la concentración de y​ = absorbancia
cada uno de los tubos, se procedió a realizar
x ​= concentración de la muestra
una gráfica de absorbancia vs Concentración
para establecer la concentración de una m​ = pendiente, representa la absortividad
muestra problema.
b​ = punto de intercepción en la ordenada
Los estándares y las muestras problema se
leyeron en el espectrofotómetro a la longitud de Evaluando en la ecuación de la recta se tiene:
onda de máxima absorción registrada por la y=0,0287x-0,02
solución indicadora azul bromotimol a pH ácido
100 mg/L (​λ​máx = 430 nm), y tomando como [Ecuación 4]
blanco agua destilada para la calibración del Además de la ecuación de la recta se tiene
equipo con un 100% de transmitancia. Los también el coeficiente de correlación
resultados se pueden observar en la tabla 6. 2​
R​ = 0,9987. Siendo un valor muy cercano a 1
Tabla 6. Variación de la absorción con relación a la indica que la curva realizada para la solución
concentración. azul de bromotimol a pH ácido no presentó
ninguna interferencia que afecte la curva.
Tub
1 2 3 4 5 6 7
o#
A partir de la ecuación 4, se determinó la
A 0,060 0,099 0,268 0,410 0,549 0,831 1,144 concentración de la muestra problema:
[X] y+0.02
mg/L
2,5 5 10 15 20 30 40 X= 0.0287

0.259+0.02
X= 0.0287 = 9.72 mg/L
Partiendo de los datos de la tabla 6, se graficó
así la curva de calibración. Se sabe que la concentración teórica de la
muestra problema es 10 mg/L, por lo tanto, se
calcula el porcentaje de error con la ecuación 5.
|V lr. teórico−V lr. experimental|
% error = V lr. teórico * 100

[Ecuación 5]
|10−9.72|
% error = 10 * 100

% error = 2.8%

Con el valor obtenido de la concentración de la

muestra y siguiendo la definición de la Ley de
Beer-Lambert (Ecuación 6), se pudo calcular el
Figura 2. Curva de calibración azul de bromotimol a
coeficiente de absortividad.
pH ácido
A = axbxc
De la curva de calibración se obtiene que la
ecuación de la recta es: [Ecuación 6]

y=mx+b Siendo:

[Ecuación 3] A = Absorbancia
4
a = coeficiente de absortividad
b = longitud del paso de luz (en centímetros)
c = concentración de absorbente
A posible para la realización de la curva de
a= b*c
0.259
a= = 0.027
1*9.72
5. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
En el espectro electromagnético se encuentran
representadas las regiones visible y no visibles
de la distribución energética, al considerar la
máxima absorbancia que absorben las
sustancias, en la cual cada fotón tiene una
energía , que está dada por (E=hcv/ λ), donde h
corresponde a la constante de planck y v
corresponde al número de ondas, donde se
observa que la energía es inversamente
proporcional a la longitud de onda y
directamente proporcional al número de onda,
por lo tanto en el caso del azul de bromotimol
en medio ácido, mostró una longitud de onda
de 430 nm, en este caso el pH, la polaridad del
solvente o moléculas vecinas y la orientación
de los cromóforos “es la parte o conjunto de
átomos de una molécula responsable de su
color”, son factores que originan variaciones en
los valores, en el caso del pH son debidas al
efecto de éste sobre la ionización del
compuesto.
Incluso en muy bajas concentraciones, como
en la mezcla de azul de bromotimol pH 7.5 más
Rojo Congo la absorbancia de una solución a
una longitud de onda dada es la suma de las
absorbancia de cada una de las especies en la
solución a esta longitud de onda, es decir la
absorbancia es aditiva en esta mezcla se
encontró una longitud de onda de (610 nm) que
era de color Amarillo [6], aunque se puede
observar un alteración considerable a los 500
nm por lo cual se puede resaltar que se
evidencian dos puntos de máxima absorbancia
en la mezcla.
Se utilizó el máximo de absorbancia obtenido
5
en el espectro de absorción de un analito (azul
de bromotimol), que mostrará la longitud de
onda que proporciona la mayor sensibilidad
calibración, y por tanto será la que se utilizará
en el análisis espectrofotométrico de la muestra
desconocida.[7].
La ley de Beer-Lambert establece que la
absorbancia de una solución es directamente
proporcional a su concentración a mayor
número de moléculas se evidencia una mayor
interacción de la luz con ellas; también
depende de la distancia que recorre la luz por
la solución a igual concentración.
Para el cálculo de la relación lineal se realizó
un estudio de regresión lineal de la recta
hallada: Y = m + b X, Donde b es la pendiente
de la recta y a la ordenada al origen. La
pendiente b representa la linealidad
fotométrica. La recta ideal sería Y = X por lo
cual la pendiente ideal es 1,00, por lo cual
indicará que el instrumento responde
linealmente en el rango de absorbancias
estudiadas.
Se realiza la gráfica de la absorbancia de la
sustancia desconocida en función de la longitud
de onda. Al determinar las longitudes de onda
de los picos de absorción, estos pueden
correlacionarse con los tipos de enlace en una
determinada molécula. La absorción UV-Vis no
es, sin embargo, una prueba específica para
ningún compuesto determinado. La naturaleza
del disolvente, el pH de la solución.
6. PREGUNTAS
I. ¿Cuáles son los fundamentos en los que
se basan las técnicas
espectrofotométricas?
La espectrofotometría se basa en la propiedad
que tienen la mayoría de las sustancias para
interaccionar con la energía luz sea, para
absorberla o emitirla. En la espectrofotometría,
 una sustancia absorbe la luz radiante de IV. ¿Qué factores pueden producir
determinada frecuencia, de esta manera se desviaciones al aplicar la Ley de Beer
determina la relación que hay entre la Lambert?
absorción de la luz y la concentración de dicha
sustancia. [5]. Son pocas las excepciones a la relación lineal
entre la absorbancia y la longitud de trayecto a
II. ¿Qué relación existe entre los espectros una concentración fija. Sin embargo, es
de absorción de las sustancias y el color frecuente que se observen desviaciones
que poseen?
respecto de la proporcionalidad directa entre
absorbancia y concentración cuando la longitud
Cuando sobre una sustancia incide luz blanca (750
– 400 nm), la luz puede ser totalmente de trayecto b ​es una constante. Algunas de
reflejada o totalmente absorbida. ellas, llamadas desviaciones reales, son
En el primer caso, la sustancia se presenta como significativas y constituyen limitaciones
blanca y en el segundo caso como negra. verdaderas a la ley. Otras resultan del método
Si se absorbe una determinada proporción utilizado para medir la absorbancia
de luz, el resto se refleja, en este caso, la (​desviaciones instrumentales)​ o de cambios
sustancia presenta el color complementario químicos ocurridos al modificarse la
de la banda absorbida. Si se absorbe
concentración (​desviaciones químicas​)
solamente una banda única, la sustancia
presenta el color complementario de la
banda absorbida. Si una sustancia absorbe 7. CONCLUSIONES
toda la luz visible, excepto una banda que
refleja, la sustancia tendrá el color de la Se verificó que el equipo presenta una correcta
banda reflejada. De este modo, una precisión y exactitud, de esta manera se pudo
sustancia puede aparecer azul porque establecer que las mediciones realizadas en
absorbe solamente la parte amarilla del este son confiables.
espectro o porque absorba todo el espectro
visible, excepto el azul.
Al identificar todas las partes de
espectrofotómetro y su adecuado
III. ¿Qué aplicaciones tienen las técnicas
espectrofotométricas? funcionamiento, se pueden obtener de este
equipo resultados verídicos y conformes a lo
La espectroscopia se usa para resolver reportado en la teoría.
preguntas de diferente tipo:
8. REFERENCIAS
● Cómo es la estructura de las moléculas.
● Determinar algunas propiedades de las
moléculas. [1]​.​ Espectrofometría: Espectros de absorción y
● Análisis cualitativo y cuantitativo. cuantificación colorimétrica de biomoléculas
● Estudio de la cinética.
● Estudio de mecanismos de reacción. https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/p
● Medición exacta de las constantes de dfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf​ Visto.
disociación de ácidos y bases. 02/2019

[2].A Classic Instrument: The Beckman DU

Spectrophotometer and Its Inventor, Arnold O.

6
Beckman

http://www.jbc.org/content/278/49/e1​ Visto:
03/09/2019

[3]. Spectrophotometers

https://www.aami-bit.org/doi/full/10.2345/0899-8
205-45.2.139​ Visto: 03/09/2019

[4]. LEY DEBOUGUER-LAMBERT-BEER

https://www.uv.mx/personal/aherrera/files/2014/
05/L.-Ley-de-Bouguer-Lambert-Beer-0.pdf
Visto: 04/09/2019

[5]. Hernández L., González C., Introducción al

Análisis Instrumental, 1 ed., España, 2002, pp
45.

[6]. Harris, D. 1992. “Análisis Químico

Cuantitativo”, Editorial Iberoamericana. Estados
Unidos Pp.495-499

[7] Wade, L. G., 2004. Química orgánica, 5

edición, Prentice hall, Madrid, 438-439