Ministério da Educação

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Biociências
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

DENGUE

Aedes aegypti
Josélio M. Galvão de Araújo, D.Sc.
Professor Adjunto
UFRN
O VÍRUS
 CLASSIFICAÇÃO / MORFOLOGIA

Classificação Vírus Dengue (DENV 1-4)

Vírus da Febre Amarela
Vírus St. Louis
Família Flaviviridae Gênero Flavivirus Vírus da encefalite do carrapato
Vírus da encefalite japonesa
Vírus do Nilo Ocidental

Morfologia M
Características físico-químicas

-Inativado: 500C por 10 min

Bicamada
Lipidica raios UV
E detergentes iônicos e não-iônicos
digestão por tripsina
prM
RNA

Nucleocapsideo

40-50 nm
 ESTRUTURA DO GENOMA

5’ NCR C prM/M E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5

3’ UTR

Estrutura do Genoma dos Flavivírus

NON-M M

RNAss (+)
prM
C E

ESTRUTURAL NÀO- ESTRUTURAL

5’ UTR UTR 3’
RNA Cap No poly A tail

NS2a NS2b NS4a NS4b

NS1 NS3 NS5

40-50 nm Protease Polimerase

(Chambers et al., 1990)

 REPLICAÇÃO E MODELO DE BIOSSÍNTESE DOS DENV

Células-Alvo
- Macrófagos
- Fibroblastos
- Hepatócitos
- Linfócitos
- Cél. Dérmicas
- Cél. Dendríticas

(Modificado de Albert et al., 1994)

 Dengue
Patogenia

Inseto vetor

Fígado
Baço
Pele Linfonodos Viremia Rins
Células
Dendríticas Medula óssea
Coração Pulmões
SNC
 301arg00-ARGENTINA2000
259par00-PARAGUAY2000
2000-PARAGUAY1988
BeH584526-BRASIL1997
BR97-233-BRASIL1997
BR01-MR-BRASIL2001
125239-VENEZUELA1994
150172-VENEZUELA1995
RIOH36589-ANGOLA1988
BR90-BRASIL1990
CAREC780572-TRINIDAD1978
CAREC778156-TRINIDAD1978
PRS-288690-JAMAICA1977
CESARA1-COSTARICA1993
NI04VI04-NICARAGUA1996
297arg00-ARGENTINA2000
280par00-PARAGUAY2000
DEI0151-PERU1991
99-36-1HuNIID-PARAGUAY1999
6222-VENEZUELA1995

DIVERSIDADE GENÉTICA DOS DENV 438VI03-NICARAGUA2003

INS371869-COLOMBIA1996
GR125VI05-GUYANE2001
1298-MEXICO1980
BEAR404147-BRASIL1982
CAREC86471-TRINIDAD1986
INS347869-COLOMBIA1985
1378-MEXICO1983
FGA-89-F.GUYANA1989
5103-FRENCHPOLYNESIA1989
141602-VENEZUELA1994
5736-VENEZUELA1995
PERU95-81-PERU
PERU96-15-PERU
64411-INDIA1964

Sorotipo Genótipo
S275-SINGAPORE1990
28164-VENEZUELA1997
1222VI04-INDIA2003
SK1216-INDIA2003
SK1216-INDIA2004
WI52VI04-INDIA2003
WI22VI05-INDIA2004

I WI37VI05-SUDAN2004
1170VI04-LAOS2004
23819-MYANMAR1996
32514-MYANMAR1998

DENV-1 II PRS228686-BURMA1976
8114-SINGAPORE1993
NI06VI04-INDIA1996
SC417VI03-XB2001

(Ong et al., 2008) III SC416VI03-xA2001

ABIDJAN-ABIDJAN19
DAKARA-1520-IVORYCOAST1985

IV IBH28328-NIGERIA1968
2543-63-THAYLAND1963
16007-THAYLAND1964
TH-SMAN-THAYLAND1954
V 02-07-1HuNIID-INDONESIA2002
02-17-1HuNIID-INDONESIA2002
98901530-INDONESIA1998
AUSHCS1-AUSTRALIA1983
AUSHATI7-AUSTRALIA1983

Sudeste Asiático/Americano 192206-FRENCHPOLYNESIA2001

GR117VI05-INDONESIA1998
6VI02-INDONESIA2002

Ásia I SC418VI03-Xc2001
01-44-1HuNIID-TAHITI2001
SC419VI03-XD2001

DENV-2 Ásia II
SC412VI03-POLYNESIA2001
SC411VI03-POLYNESIA2001
98901518-INDONESIA1998
GD23-95-CHINA1995

(Weaver & Vasilakis, 2009) Cosmopolita

SC01-INDONESIA2004
Yap27-2004
Yap31-MICRONESIA2004
A88-INDONESIA1988

Americano 28VI03-INDONESIA2003
PRS228682-PHILIPPINES1974
Philippines836-1
WESTPAC-NAURU1974
Selvagem 02SA029-PHILIPPINES2002
02-13-1HuNIID-PHILIPPINES2002
01-37-1HuNIID-SAMOA2001
95SLMC28-PHILIPPINES1995

I Caribbean495-1-ARUBA1985
Caribbean-924-1
AHF82-80-THAYLAND
CV1636-77

DENV-3 II HAWAII-HAWAII1945
MOCHIZUKI-JAPAN1953
GZ

(Araújo et al., 2009) III WI1210VI04KENYA2004

DJIBOUTI-DJIBOUTI1998
60VI05-KENYA2005
My00D136981-MYANMAR2000
IV 765101-TAIWAN1987
My01D138862-MYANMAR2001
My00D137143-MYANMAR2000

V LAOCH323-LAOS1996
PUO359-THAYLAND1980
My01D139067-MYANMAR2001
My00D136393-MYANMAR2000
NI13VI04-THAYLAND2003
CAMBODIA1998
NI10VI04-THAYLAND1998
I 98-35-1HuNIID-THAYLAND1998
NI11VI04-THAYLAND1998
NI08VI04-THAYLAND1997

DENV-4 II NI07VI04-THAYLAND1997
01-42-1HuNIID-CAMBODIA2001
49-THAYLAND1999
Zhejiang-07-04-CHINA2004
(Weaver & Vasilakis, 2008) III 02-38-1HuNIID-THAYLAND2002
01-36-1HuNIID-INDONESIA2001
01-65-1HuNIID-THAYLAND2001

Selvagem NI09VI04-THAYLAND1998
NI12VI04-THAYLAND2003
01-61-1HuNIID-CAMBODIA2001
01-15-1HuNIID-THAYLAND2001
2308-THAYLAND1993
GD05-99-CHINA1995
NC prM ns2a ns4a NC 2302-THAYLAND1993
AF1561VI04-THAYLAND2004
WI25VI05-THAYLAND2004

3´ 5´
SC40VI05-MALAYSIA2004

C E NS1 NS3 NS5 1671F02-MALAYSIA2002

02-20-1HuNIID-THAYLAND2002
P72-1244-MALAYSIA1972

ns2b ns4b DEN3-H87-OUTGROUP

DIVERSIDADE GENÉTICA
DOS DENV-1

Weaver & Vasilakis, 2009

DIVERSIDADE
GENÉTICA
DOS DENV-2

Weaver & Vasilakis, 2009

 Diversidade Genética
dos DENV-3 BR 2005 AY960632
BR 2005 AY960630
BR 2000 AY038605
BR 2005 AY960635
PY 2003 DQ118883
BR 2002 DQ118869
BR 2004 DQ118882
BR 2002 DQ118880
BR 2002 AY679147
BR 2003 DQ118867
BR 2003 DQ118877
PY 2003 DQ118891
PY 2002 DQ118884
BO 2003 DQ177886
BR 2002 DQ118866
BR 2002 DQ118881
BR 2003 DQ118868 Caribe/SA
BR 2003 DQ118870
Araújo et al., 2009 PY 2003 DQ118888
PY 2003 DQ118889
BR 2003 DQ118873
BR 2002 DQ118875
BR 2003 DQ118874
BR 2004 DQ118864
MQ 1999 AY099337
CU 2000 AY702032
MQ 2001 AY099341
MQ 2001 AY099342
MQ 2001 AY099340
BR 2002 DQ118865
MQ 2000 AY099339
MQ 2000 AY099338
PE 2004 DQ177888
America
BR 2005 AY960632
BR 2005 AY960630
BR 2000 AY038605
BR 2005 AY960635
PE 2003 DQ177896
PE 2002 DQ177895
PY 2003 DQ118883
BR 2002 DQ118869
BR 2004 DQ118882
BR 2002 DQ118880
BR 2002 AY679147
BR 2003 DQ118867

PE 2005 DQ177902
BR 2003 DQ118877
PY 2003 DQ118891
PY 2002 DQ118884
BO 2003 DQ177886
BR 2002 DQ118866
BR 2002 DQ118881
Caribe/SA
BR 2003 DQ118868
BR 2003 DQ118870
PE 2005 DQ177897
III
PY 2003 DQ118888
PY 2003 DQ118889
BR 2003 DQ118873

PE 2000 DQ177903
BR 2002 DQ118875
BR 2003 DQ118874
BR 2004 DQ118864
MQ 1999 AY099337
CU 2000 AY702032
MQ 2001 AY099341

PE 2004 DQ177894
MQ 2001 AY099342
MQ 2001 AY099340
BR 2002 DQ118865
MQ 2000 AY099339
MQ 2000 AY099338
PE 2004 DQ177888
America
PE 2003 DQ177896

PE 2004 DQ177892
Caribe/SA
PE 2002 DQ177895
PE 2005 DQ177902
PE 2005 DQ177897
PE 2000 DQ177903 III
CU 2002 AY702031
PE 2004 DQ177894
PE 2004 DQ177892
CU 2002 AY702031 Caribe/SA
CU 2001 AY702030
EC 2000 DQ177899
EC 2000 DQ177898

CU 2001 AY702030
PE 2001 DQ177890
PE 2003 DQ177891
PE 2004 DQ177893
PE 2003 DQ177901
VE 2000 AY146767
VE 2001 DQ367720
VE 2003 DQ367721
VE 2001 DQ371245
VE 2003 DQ367722
VE 2001 AY146774
VE 2001 AY146777
Venezuela
EC 2000 DQ177899
EC 2000 DQ177898
MX 2000 DQ341207
MX 1996 DQ341203
MX 1997 DQ341205
MX 1995 AY146763
Mexico
MX 1997 DQ341204
NI 1994 AY702033

PE 2001 DQ177890
PA 1994 DQ341209
MX 1995 DQ341202
SO 1993 DQ341208
JP 2000 AB111081
LK 1989 L11437
LK 1991 L11438

IN 1984 L11424
SG 2004 AY662691
LK 2000 AY099336
TW 2006 DQ675533
LK 1999 DQ518679
PE 2003 DQ177891
PE 2004 DQ177893
LK 1985 L11436
LK 1981 L11431
AS 1986 L11435
VN 2005 DQ518658
VN 2003 DQ518657
VN 2004 DQ518656 Vietnam

PE 2003 DQ177901
VN 1996 DQ518655
TH 2001 AY676410
TH 1998 AY676388
TH 1998 AY676348
TH 1997 AY676412
TH 2000 AY676408

TH 1992 AY676386
TH 1999 AY676413

TH 1995 AY676373
TH 1994 AY676366
TH 1996 AY145727
VE 2000 AY146767
VE 2001 DQ367720
TH 1997 AY676404
TH 1998 AY676393
TH 1997 AY676405
TH 1998 AY676349
TH 2001 AY676407
TH 1999 AY676411

VE 2003 DQ367721
TH 2002 AY676383
TH 2000 AY676414
TH 1997 DQ518661
TH 1996 AB111084

Venezuela
TH 1993 AY676381
TH 1997 AY145728
TH 1996 AY145726
TH 1998 AY676392
TH 1994 AY876494
TH 1993 AY676350
TH 1995 AY145725
VE 2001 DQ371245
VE 2003 DQ367722
TH 2001 AY676409
TH 2002 AY676420
TH 1991 AY676367
ID 1998 DQ675520
TH 1990 AY676361
MM 1988 AY145712
II
VE 2001 AY146774
TH 1986 AY676374
TH 1992 AY145719
TH 1991 AY145716
TH 1988 AY676417
TH 1987 L11442
TH 1986 AY676354
TH 1983 AY676372
BD 2002 AY496874
BD 2002 AY496871
BD 2002 AY496878
BD 2001 AY656673 Bangladesh
VE 2001 AY146777
MX 2000 DQ341207
BD 2000 AY656671
BD 2000 AY656674
BD 2000 AY656670
MM 2005 DQ518666
TH 1985 AY676418
TH 1987 AY676378

MX 1996 DQ341203
TH 1985 AY676368
MY 1993 AF147459
MY 1992 AF147457
MY 1994 AF147460 Malaysia

Mexico
MY 1993 AF147458
SG 1995 AY766104
TH 1989 AY145715
TH 1987 AY676379
TH 1988 AY145713
TH 1981 AY676370
TH 1984 AY676371
MX 1997 DQ341205
MX 1995 AY146763
TH 1983 AY676358
TH 1986 L11441
TH 1982 AY676355
TH 1981 AY676356
TH 1980 AY676380
TH 1977 AY676384

MX 1997 DQ341204
TH 1980 AY676385
TH 1973 M86733
TH 1973 L11620
TH 1974 AY676360
TH 1962 L11440
CH 1980 AF317645
JP 1973 AB111085
PH 1956 L11423
V
ID 2004 AY858044
ID 2004 AY858045
ID 2004 AY858046
NI 1994 AY702033
PA 1994 DQ341209
ID 2005 DQ518678
ID 2004 AY858041
ID 1998 AB189125
ID 1998 AY265857
ID 2005 AB219138
ID 1998 DQ518676

MX 1995 DQ341202
ID 1998 AB189126
ID 1998 AB189127
ID 2003 DQ518677
ID 2004 AY858040
ID 2004 AY858043
ID 1998 AY265856
ID 1998 AY858039
ID 2004 AY858037
TP 2005 DQ453979
TP 2005 AB214882
TP 2005 DQ453970
East Timor
SO 1993 DQ341208
JP 2000 AB111081
ID 1991 DQ518674
TH 1988 AY145714
ID 2005 AB219137
I
ID 1998 AB189128
ID 1988 AY858038
ID 1985 L11428

LK 1989 L11437
MY 1974 L11429
PH 1998 DQ518671
PH 2005 DQ518673
PH 1997 DQ518670
TW 1994 DQ518667
Philippines
PH 1997 AY496879
ID 1978 L11426
PF 1994 AY744685
PF 1989 AY744678
PF 1992 AY744683
PF 1990 AY744679
South Pacific
LK 1991 L11438
SG 2004 AY662691
FJ 1992 L11422
TA 1989 L11619
PF 1990 AY744680
PF 1989 AY744677
ID 1973 L11425
MY 1981 L11427

LK 2000 AY099336
PR 1977 AY146761
PR 1963 AY146762
PR 1963 L11433
IV
0.2

TW 2006 DQ675533
LK 1999 DQ518679
IN 1984 L11424
LK 1985 L11436
LK 1981 L11431
AS 1986 L11435
VN 2005 DQ518658
VN 2003 DQ518657
VN 2004 DQ518656 Vietnam
VN 1996 DQ518655
TH 2001 AY676410
DIVERSIDADE GENÉTICA
DOS DENV-4

Weaver & Vasilakis, 2009

 Qual a importância do
monitoramento da diversidade
genética dos vírus dengue?
A DOENÇA
 DENGUE CLÁSSICO E DENGUE HEMORRÁGICO

Infecção por DENV

Assintomático Sintomático

Febre Dengue
Dengue
Indiferenciada Hemorrágico
Clássico
(Síndrome viral)

S/ Hemorragia Hemorragias S/ Choque SCD

DENGUE CLÁSSICO DENGUE HEMORRÁGICO

 DENGUE CLÁSSICO E DENGUE HEMORRÁGICO

Tabela 1.1: Critérios para a distinção do dengue clássico (DC) dos graus de febre
hemorrágica do dengue (FHD)

Extravazamento do Insuficiência Teste do

Plasma1 Plaquetas (µl) circulatória torniquete Sangramento
DC Ausente Variável Ausente Variável Ás vezes
FHD grau I Presente < 100.000 Ausente Positivo Ausente
FHD grau II Presente < 100.000 Ausente Positivo Presente
FHD grau III Presente < 100.000 2
PP <20mmHg Variável Ás vezes
FHD grau IV Presente < 100.000 PA3 não detectável Variável Ás vezes
1 Identificado por um hematócrito 20% acima do normal
2 Pressão do pulso / milímetro de mercúrio
3 Pressão arterial
PRINCIPAIS SINAIS E SINTOMAS DE PACIENTES
COM DENGUE

TGI: Trato gastrointestinal

DENGUE CLÁSSICO
 DENGUE HEMORRÁGICA

Prova do laço positiva

A) Hemorragia
subconjuntival
bilateral
B) Hemorragia
suconjuntival intensa
O que causa a forma grave da
dengue?
 PATOGENIA

Inexistência de modelo animal capaz de reproduzir a infecção

Rosen, 1977 Teoria Immune-enhancement (Halstead, 1980)

FHD Formação de Imunocomplexos

Infecções
Virulência
primárias (Ac da Classe IgG subneutralizantes)
SCD

Hipótese integral (Kouri et al., 1987)

Fatores de risco Infecções secundárias

individuais FHD FHD/SCD

epidemiológicos
virais SCD
Conclusão sobre a patogenia do dengue...

◼ Várias teorias têm sido propostas para explicar a

ocorrência da FHD/SCD. No entanto, muitos estudos
superestimam um aspecto apenas em detrimento de
outros e desconhecendo a interação entre eles.

◼ Nesse sentido, a teoria da hipótese integral (Kourí et al.,

1989) é a mais adequada, onde considera-se três
fatores:
◼ O vírus;
◼ O hospedeiro e
◼ A epidemiologia.
Qual a principal causa de morte
por dengue?
◼ Este estudo contempla a maior casuística de casos fatais por DENV-3 da
literatura, entre os estudos que correlacionam a viremia e a gravidade da
doença.
 ◼ A alta viremia está relacionada com a gravidade das
infecções por DENV-3?

◼ Qual o tipo de infecção predominante nas formas

The Thinker (Rodin, 1882) graves por DENV-3, primária ou secundária?
 Quantificação dos DENV-3 em casos fatais e não-fatais:
correlação entre viremia e gravidade da doença.

◼ Material e Métodos

◼ Amostras clínicas: Foram estudados 23 casos fatais e 19 casos não fatais de DENV-
3 ocorridos durante a epidemia de 2002 no estado do Rio de Janeiro;

◼ Extração RNA: QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA);

◼ RT-PCR em tempo real: Houng et al. (2001); Johnson et al. (2005);

◼ IgG-ELISA: Miagostovich et al. (1999);

PCR EM TEMPO REAL
Houng et al. (2001)

5’ NCR C prM/M E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5

3’ UTR

3’ UTR
Primer Forward

5’ - CCCG AGCACTGAGGGAAGCTGTACCTCC TTGCAAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCCCGCAAACAAAAACAGCA

TCGTGACTCCCTTCGACATGGAGG
TATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTG CTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCA C AGAACGCCAGAAAATGGAATG
GACAGAGGAGTCGTAGTAAGGTCCGT TCTTGCGGTCTTTTACCTTAC
GTGCTGTTGAATCAACGGG - 3’
R Primer Reverse
PROBE Q
FAM
(Houng et al., 2001)
TAMRA
 Quantificação dos DENV-3 em casos fatais e não-fatais:
correlação entre viremia e gravidade da doença.

◼ Resultados Literatura:
• Gubler (1981): Indonésia, 1975 e 1978.
16
• Vaughn et al. (2000): Tailândia, 1994 e 1996.
• Wang et al. (2003): Taiwan, 1998.
14
• Guilarde et al. (2008): Brasil, 2005.
12
Log10 Copies/ml (95% C.I.)

10

8
Fig. 1. Média do número de cópias de RNA/mL
6 (log10) em casos fatais (n=23) e não fatais (n=19)
(95% C.I.). A média do nº de cópias foi
4 significativamente maior nos casos fatais em
N= 23 19 comparação aos casos não fatais: 12,5 log10 copias
Fatal Non fatal
de RNA/mL e 7.9 log10 copias/mL, respectivamente
Outcome (t-test, P=0.001; Mann-Whitney test; P=0.002).
 Quantificação dos DENV-3 em casos fatais e não-fatais:
correlação entre viremia e gravidade da doença.

◼ Resultados
Fatais:
16
- Primário: 65%
14 - Secundário: 26%
12 - Não classificado: 8,6%
Number of cases

10
Não fatais:
8
- Primário: 47%
6 - Secundário: 52%
4 - Não classificado: 0%
2 Primary
Secondary
0 Fig. 2. Tipo de infecção dos casos fatais e não-fatais
Fatal Non Fatal classificados de acordo com os títulos de IgG e dias
de doença em relação ao início dos sintomas.
 Quantificação dos DENV-3 em casos fatais e não-fatais:
correlação entre viremia e gravidade da doença.

◼ Resultados
20
Fatais:
- Primário: 12,48 log10 cópias de RNA/ml
18
- Secundário: 11,86 log10 cópias de RNA/ml
16
Não fatais:
14
Log10 Copies/ml (95% C.I.)

- Primário: 9,74 log10 cópias de RNA/ml

12 - Secundário: 6,23 log10 cópias de RNA/ml
10

Immune response
8

6 Fig. 3. Média do nº de cópias/ml (log10) entre casos fatais e não-fatais de

Primary
DENV-3, classificados como infecção primária e secundária (95% C.I.). Nos
4 casos não fatais, observou-se um nº de cópias significativamente maior em
casos classificados como infecção primária (9.74 log copias/ml), quando
2 Secondary
comparado a casos classificados como infecção secundária (6.23 log
N= 15 6 9 10
copies/ml) (t-test, P=0.05; Mann-Whitney test, P=0.02). Para o grupo de
Fatal Non fatal
casos fatais, não observou-se diferenças significativas entre casos
classificados como infecção primária (12.48 log copias/ml) e secundária
Outcome (11.86 log copies/ml) (t-test, P=0.10; Mann-Whitney test, P=0.21)
 Ministério da Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Instituto Oswaldo Cruz – Dep de Virologia
Laboratório de Flavivírus

OBJETIVO 2:
PESQUISA DOS DENV EM DIFERENTES TECIDOS
PROVENIENTES DE CASOS FATAIS
◼ Este é o primeiro estudo descrito na literatura que envolve a aplicação do RT-PCR em
tempo real em amostras de tecidos (n=77) provenientes de casos fatais suspeitos de
dengue.
 Pesquisa dos DENV em diferentes tecidos provenientes
de casos fatais.

◼ Tecidos estudados:
◼ Fígado (n=28),
◼ Pulmão (n=14),
◼ Baço (n=16),
◼ Cérebro (n=11),
◼ Rim (n=5),
◼ Medula óssea (n=1),
◼ Coração (n=2).

◼ Total = 77 amostras.
 Pesquisa dos DENV em diferentes tecidos provenientes
de casos fatais.

◼ Materiais e Métodos

◼ Amostras Clínicas: Foram estudadas 77 amostras clínicas provenientes de 29 casos fatais

ocorridos durante a epidemia de dengue em 2002 no estado do Rio de Janeiro.

◼ Tratamento de Vísceras: Araújo et al. (2009);

◼ Fragmentos de tecido (1-2g) macerados em 1,5mL de L-15;
◼ Centrifugado 10.000 rpm a 4ºC por 15min;
◼ Sobrenadante inoculado em C6/36 e usado para extração de RNA.

◼ Isolamento viral: Igarashi (1978);

◼ IFI: Henchal et al. (1982), Gubler et al. (1984);

◼ Extração RNA: QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN);

◼ Semi-nested RT-PCR: Lanciotti et al. (1992);

◼ RT-PCR em tempo real: Houng et al. (2001);

◼ Immunohistoquímica: Vectastain AEC Kit;

 MATERIAL E MÉTODOS

ISOLAMENTO VIRAL (Igarashi, 1978)

TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) (Henchal et al., 1982;

Gubler et al., 1984)
CULTURA DE CÉLULAS C6/36 IFI CULTURA C6/36
 MATERIAIS E MÉTODOS
Semi-nested RT-PCR (Lanciotti et al., 1992)
5’ NCR C prM/M E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5

3’ UTR

TRANSCRIÇÃO REVERSA E SEGUNDA ETAPA DE AMPLIFICAÇÃO

PRIMEIRA ETAPA DA AMPLIFICAÇÃO PCR SEMI-NESTED
D1
CAPSIDEO prM 5’ 3’
DENV
RNA 5’ 3’ 511 pb
3’ 5’ produto
1 hora/ 42ºC D2
D1
TS3 TS1
5’ 3’ TS2 TS4
cDNA Amplicon DENV-1 (482 bp)
3’ 5’
Amplicon DENV-4 (392 bp)
30sec/ 94ºC Amplicon DENV-3 (290 bp)
1 min / 55ºC 35 ciclos
2 min / 72ºC Amplicon DENV-2 (119 bp)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
5’ 3’
3’ 5’ 482 bp
392 bp
290 bp

119 bp

511 pb
produto
 Resultados

Tab.1. Pesquisa dos DENV em diferentes tecidos provenientes de casos fatais por
diferentes métodos de diagnóstico.

Amostras Clínicas Isolamento Semi-nested RT-PCR IHQ RT-PCR TaqMan

Fígado 2/26 8/27 14/22 18/28

Pulmão 0/14 5/12 3/11 8/14
Baço 0/15 3/15 5/13 8/16
Cérebro 0/11 3/11 2/7 8/11
Rim 0/5 2/5 2/4 3/5
Medula Óssea 0/1 NR NR 1/1
Coração 0/2 1/2 0/2 1/2

Total 2/74 (2,7%) 22/72 (30,5%) 26/59 (44%) 45/77 (58,4%)

70

60 Estes resultados reforçam a importância da incorporação da

50 técnica de RT-PCR em tempo real como mais uma
40 ferramenta a integrar os Programas de Vigilância
%

30 Epidemiológica do Ministério da Saúde.

20

10

0
Isolamento Nested RT-PCR IHQ RT-PCR TaqMan Fig.1. Porcentagem de detecção dos DENV em diferentes tecidos por Isolamento,
Nested RT-PCR, imunohistoquímica e RT-PCR em tempo real.
 Resultados

Tab.2. Pesquisa dos vírus dengue em diferentes tecidos provenientes de casos fatais
suspeitos de dengue.

Literatura:
Caso nº Fígado Pulmão Baço Cérebro Rim Medula Óssea Coração
• Bhamarapravati (1965);
1 + + + + + • Lum et al. (1996);
2 - + - +
3 + • Miagostovich et al. (1997);
4 + + • Huerre et al. (2001);
5 + -
6 - - - - - • Leao et al. (2002);
7 + + + • Nogueira et al. (2002);
8 -
9 + - - - • Horta Veloso et al. (2003);
10 + + + + • Jessie et al. (2004);
11 + - +
12 + - + • Basílio-de-Oliveira et al. (2005);
13 + + +
14 + + + +
15 - - + -
16 + ( + ) Amostras positivas
17 + + + + ( - ) Amostras negativas
18 + + + + ( ) Amostras indisponíveis
19 +
20 - Fígado (Hepatócitos e Células de
21 + Kupfer)
22 + +
23 + Baço (Células linfoides,
24 + especialmente macrófagos)
25 +
26 + + + + + Cérebro (Corpo de neurônios)
27 +
28 + +
29 + + - + +
- EPIDEMIOLOGIA -
EPIDEMIOLOGIA
EPIDEMIOLOGIA

(OMS, 2009)
 EPIDEMIOLOGIA

DISTRIBUIÇÃO DOS DENV NO MUNDO

1970 2004

Mackenzie et al. Nature Medicine. 2004 Dec;10(12 Suppl):S98-109.

3 bilhões de pessoas expostas ao risco de infecção (Gubler, 1998)

Dengue possui caráter endêmico em cerca de 100 países de clima tropical e subtropical

50-100 milhões de casos de infecções por DENV no mundo anualmente (WHO, 1997)
 EPIDEMIOLOGIA

DENV possui 3 grupos de hospedeiros naturais (Gubler, 1998):

Primatas Inferiores Homem Mosquitos do

Gênero Aedes
Ciclo de transmissão dos vírus dengue
DENGUE NO BRASIL

Roraima
1981 DEN-1
DEN-4

1986 DENV-1
1990 DENV-2
2000 DENV-3

Regiào
Metropolitana
 TRATAMENTO

◼ Não existe tratamento específico.

◼ Entretanto, dados de anamnese e exame físico são utilizados para

estadiar os casos (A-D) e orientar as medidas terapeuticas
cabíveis.

◼ Procurar a unidade de saúde mais próxima;

◼ Ingerir líquidos:
◼ Soro caseiro;
◼ Sucos;
◼ Água em abundância;

◼ Repouso
 MEDICAMENTOS

◼ Não existe medicamento específico contra o vírus.

◼ Para aliviar os sintomas, pode-se utilizar analgésicos e antitérmicos

(Dipirona, Paracetamol);

◼ Não adotar auto medicação.

 VACINAS

◼ Ainda não existe nenhuma vacina licenciada contra a dengue,

entretanto, existem diversas vacinas candidatas em
desenvolvimento.

◼ Vacinas de vírus vivos

◼ Atenuação em cultura;
◼ Atenuação através de engenharia genética;
◼ Construção de vacinas quiméricas;

◼ Vacinas de vírus mortos

◼ Proteínas recombinantes do envelope viral;
◼ Vacinas de subunidades;

◼ Estratégias mistas
 A VACINA MAIS AVANÇADA

◼ Vacina quimérica tetravalente que utiliza a base genética do vírus vacinal

da Febre Amarela (17D).

◼ A maioria dos adultos e crianças vacinadas desenvolveram anticorpos

neutralizantes, que persistem por, pelo menos, um ano após vacinação.

◼ Apesar de se detectar viremia na primeira semana após a vacinação, os títulos

virais foram baixos e a taxa de eventos adversos foi similar à da vacina contra
febre amarela.

◼ Os vírus vacinais não replicam no trato gastrintestinal dos vetores;

◼ Estudos de fase I e II na Ásia, EUA e América Latina, atenderam a todas as

exigências para a realização de estudos da fase III, que deverão ser iniciados
em breve (Deauvieau et al., 2007).
 DIAGNÓSTICO
LABORATORIAL
 Sorologia pelo método de ELISA

Pesquisa de anticorpos
da classe IgM/IgG
 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

ISOLAMENTO VIRAL (Igarashi, 1978)

TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) (Henchal et al., 1982;

Gubler et al., 1984)
CULTURA DE CÉLULAS C6/36 IFI CULTURA C6/36

EXTRAÇÃO DO RNA VIRAL

- Boom et al. (1990)
- Kit Qiagen (QIAGEN, Inc., Valencia, EUA)
 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
RT-PCR (Lanciotti et al., 1992)
5’ NCR C prM/M E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5

3’ UTR

TRANSCRIÇÃO REVERSA E SEGUNDA ETAPA DE AMPLIFICAÇÃO

PRIMEIRA ETAPA DA AMPLIFICAÇÃO PCR SEMI-NESTED
D1
CAPSIDEO prM 5’ 3’
DENV
RNA 5’ 3’ 511 pb
3’ 5’ produto
1 hora/ 42ºC D2
D1
TS3 TS1
5’ 3’ TS2 TS4
cDNA Amplicon DENV-1 (482 bp)
3’ 5’
Amplicon DENV-4 (392 bp)
30sec/ 94ºC Amplicon DENV-3 (290 bp)
1 min / 55ºC 35 ciclos
2 min / 72ºC Amplicon DENV-2 (119 bp)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
5’ 3’
3’ 5’ 482 bp
392 bp
290 bp

119 bp

511 pb
produto
PCR EM TEMPO REAL
Houng et al. (2001)

5’ NCR C prM/M E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5

3’ UTR

3’ UTR
Primer Forward

5’ - CCCG AGCACTGAGGGAAGCTGTACCTCC TTGCAAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCCCGCAAACAAAAACAGCA

TCGTGACTCCCTTCGACATGGAGG
TATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTG CTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCA C AGAACGCCAGAAAATGGAATG
GACAGAGGAGTCGTAGTAAGGTCCGT TCTTGCGGTCTTTTACCTTAC
GTGCTGTTGAATCAACGGG - 3’
R Primer Reverse
PROBE Q
FAM
(Houng et al., 2001)
TAMRA
Febre do Dengue
O VETOR
O VETOR
PRINCIPAIS CRIADOUROS
PRINCIPAIS CRIADOUROS
 Ministério da Educação

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Biociências
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

FEBRE AMARELA

Haemagogus Sabethes Aedes aegypti

Josélio M. Galvão de Araújo, D.Sc.
Professor Adjunto
UFRN
 CLASSIFICAÇÃO / MORFOLOGIA

Classificação Vírus Dengue (DENV 1-4)

Vírus da Febre Amarela
Vírus St. Louis
Família Flaviviridae Gênero Flavivirus Vírus da encefalite do carrapato
Vírus da encefalite japonesa
Vírus do Nilo Ocidental

Morfologia M
Características físico-químicas

-Inativado: 500C por 10 min

Bicamada
Lipidica raios UV
E detergentes iônicos e não-iônicos
digestão por tripsina
prM
RNA

Nucleocapsideo

40-50 nm
 ESTRUTURA DO GENOMA

5’ NCR C prM/M E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5

3’ UTR

Estrutura do Genoma dos Flavivírus

NON-M M

RNAss (+)
prM
C E

ESTRUTURAL NÀO- ESTRUTURAL

5’ UTR UTR 3’
RNA Cap No poly A tail

NS2a NS2b NS4a NS4b

NS1 NS3 NS5

40-50 nm Protease Polimerase

(Chambers et al., 1990)

 Febre Amarela
Patogenia

Inseto vetor

Pele Gânglios Viremia

Fígado
Baço
Rins
Coração
Medula óssea
 Febre Amarela
Formas Clínicas

◼ Assintomática

◼ Forma leve
◼ Febre e cefaléia (indistinguíveis de outras doenças infecciosas febris
agudas)

◼ Forma moderada
◼ Febre e cefaléia,

◼ Mialgia, mal-estar, lombalgia,

◼ Congestão conjuntival.
 Febre Amarela
Formas Clínicas

◼ Forma grave:
◼ Sintomas anteriores, mais:

◼ Vômitos hemorrágicos,

◼ Dor epigástrica, mialgia intensa,

◼ Febre elevada > 40ºC,

◼ Icterícia e oligúria (urina escura).

◼ Forma maligna:
◼ Sinais clássicos presentes com grande intensidade,

◼ Hemorragias de múltiplos órgãos

 Febre Amarela
Formas Clínicas

10% Febre + Icterícia + Sangramento e morte

20% Febre + Icterícia

Febre
20%
Infecções
Assintomáticas

50%
Febre Amarela
Formas Clínicas

Paciente com febre amarela, África.

Observar a icterícia e a congestão ocular.
 Febre Amarela
Formas Clínicas

ALS, 43 anos, trabalhador braçal, residente em Presidente Figueiredo/AM, há 2

meses trabalhando em uma fazenda em Rio Preto da Eva / AM.
Febre Amarela
Formas Clínicas
 Febre Amarela
Ciclo Silvestre

Haemagogus / Sabethes

O homem é um
hospedeiro acidental

Febre amarela silvestre

Haemagogus / Sabethes
 Febre Amarela
Ciclo Urbano

A. aegypti
Febre amarela urbana

A. aegypti
Febre Amarela
Regiões Endêmicas
Febre Amarela
Áreas de risco

AREA ENDÊMICA
AREA DE TRANSIÇÃO
AREA INDENE
 Febre Amarela
Prevenção e Controle

◼ Vacinação
◼ Vírus atenuado

◼ Cepa Asibi – vacina 17D

◼ Vacinação dos viajantes

◼ Vacinação de bloqueio
 Dengue e Febre Amarela
Questões

1) Com base no capítulo disponibilizado em sala de aula:

A) Esquematize a patogênese da Dengue e da Febre Amarela (FA).

B) Esquematize os ciclos silvestre e urbano da Dengue e da FA.

C) Cite diferentes métodos de diagnóstico da Dengue e FA e seus

alvos.

D) Descreva as principais formas de controle da Dengue e FA.