UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

FACULTAD DE CIENCIAS APLICADAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA
AGROINDUSTRIAL

Monografía

CULTIVO INVITRO

PRESENTADO POR:

CALZADO ROJAS, Deysi Carolina

FLORES RICALDI, Cesia Jimena
GRANADOS TAZZA, Rosmery Pilar
LAZO SEDANO, Josely Lidia

CATEDRA:
BIOTECNOLOGÍA

CATEDRATICO:
Dra. PARRAGA MELGAREJO, Nancy

SEMESTRE:
IX

TARMA – PERÚ

2019
 INTRODUCCIÓN

La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un

frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas

tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes,

etc), y el control de los factores que afectan el crecimiento. El avance

alcanzado por las ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el

estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en

condiciones de laboratorio es posible actualmente reproducir todos los factores

que puedan incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este principio

general se aplica también al cultivo in vitro de plantas. Haberlandt, un científico

alemán, postuló a principios del siglo pasado que las plantas eran capaces de

reproducir su crecimiento a partir de células aisladas, originando la hipótesis

de la totipotencia celular en plantas. Sin embargo, este investigador no pudo

demostrar en forma práctica su hipótesis, debido a que la mayoría de los

componentes complejos que integran los medios de cultivo actuales todavía

no habían sido descubiertos. Sería recién en la década del ´50 cuando se

determina la importancia del balance hormonal en las plantas, con el

descubrimiento de las hormonas vegetales más usadas en la actualidad.

El crecimiento de orquídeas in vitro ha sido objeto de amplios esfuerzos de

investigación sobre especies de interés comercial. La germinación de

embriones de orquídea en medios preparados con sales de nutrientes,

micronutrientes, hormonas y gelificantes ha sido la solución para que la

industria propague masivamente a estas plantas que, en la naturaleza,

requieren de tiempo y condiciones muy particulares para crecer.

Objetivo:

 Describir el cultivo invitro de plantas.

 CAPITULO I
GENERALIDADES
1.1. Cultivo invitro:

La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones

más generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micropropagación,

a partir de un fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una

descendencia uniforme, con plantas genéticamente idénticas,

denominadas clones. El explante más usado para los procesos de

propagación in vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Los

frascos que contienen las plantas se ubican en estanterías con luz

artificial dentro de la cámara de crecimiento, donde se fija la

temperatura en valores que oscilan entre los 21 y 23°C, además de

controlar la cantidad de horas de luz. Por su parte, el medio de cultivo

se compone de una mezcla de sales minerales, vitaminas reguladores

de crecimiento, azúcar, agua y agar. La composición del medio

depende de la especie vegetal y de la etapa del proceso de

micropropagación.

1.2. Factores biológicos que afectan el desarrollo del cultivo invitro

a) Ambiente químico

- Composición del medio de cultivo

- pH
 b) Ambiente físico

- Temperatura

- Luz y fotoperíodo

- Humedad

1.3. Procesos de micropropagación del cultivo invitro

 Fase 0: Preparación de la planta madre

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se

deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de

desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es

recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta

donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede

oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero

bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la

planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la

nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso

y libre de enfermedades.

 Fase 1: Desinfección del material vegetal

Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a

partir de los cuales se obtendrán los explantes. Los explantes

pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces,

semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una

desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los

 contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son

los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el

ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe

mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las

condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar

para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos

explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo

medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la

viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con

hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluida

durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4

enjuagues en agua esterilizada.

 Fase 2: Introducción del material in vitro

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas

dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de

cultivo estéril. En un período de una semana o quince días,

comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos

tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

 Fase 3: Multiplicación de los brotes

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron

la FASE 1 y 2 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia)

con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se
 desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de

cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben

subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras

en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas

operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un

lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de

asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada

repique o división de las plantas.

El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie

vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de

plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite

alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos

los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

 Fase 4: Elección de un medio de enraizamiento de los

explantos

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines

individuales de un tamaño aproximado de 2 centímetros. Los

brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren

a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo

contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de

plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en

el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por

 lo tanto, el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren

en forma simultánea.

 Fase 5: Aclimatación de los explantos enraizados

Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los

cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo

el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas

sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación

de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento

en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los

frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya

que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con

una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen

estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y

pérdida de agua en la planta) que no son completamente

funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo

tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante.

Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele

implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que

representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a lo

largo de toda la superficie de la planta.

La siguiente lista presenta una comparación de las

características de una planta en condiciones de laboratorio (in

vitro) respecto a una planta en condiciones naturales (in vivo):

 In vitro

- No realiza fotosíntesis

- Crecimiento en condiciones controladas

- Crecimiento en condiciones de asepsia

- Alta humedad relativa

- Estomas no funcionales

- Ausencia de pelos radiculares

- Ausencia de cera en la cutícula

 In vivo

- Realiza fotosíntesis

- Crecimiento en condiciones no controladas

- Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente

- Humedad relativa variable

- Estomas funcionales

- Presencia de pelos radiculares

- Presencia de cera en la cutícula

Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las

condiciones de humedad del invernadero disminuyendo

progresivamente la humedad relativa e incrementando

 progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se

plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un

plástico, para mantener la humedad relativa elevada. La elección

de un sustrato con buenas características físicas, es clave para

el éxito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato

suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cáscara de arroz

quemado, para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces

muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de

acuerdo a la especie con la que estamos trabajando.

1.4. Tipos básicos de cultivos in vitro

Se pueden clasificar en grupos según su mayor o menor organización

semejante a la de los vegetales enteros cultivados habitualmente:

1.4.1. Cultivos organizados: cultivo de órganos o fragmentos

Sería el cultivo de semillas, fragmentos de órganos o tejidos. Son

ejemplos de uso habitual el cultivo de ápices meristemáticos

(principalmente el ápice de tallo), los cultivos nodales, los

embriones cigóticos, así como fragmentos radicales con o sin

ápice.

1.4.2. Cultivos desorganizados

Pueden ser cultivos de una o varias células relacionadas, o

incluso de diferentes orgánulos celulares. Son ejemplos de

cultivos de este tipo “desorganizado” el Cultivo de células

 indiferenciadas agregadas (conocido como callo), agregados

celulares (clusters), células aisladas, microsporas, protoplastos,

orgánulos celulares

1.5. Características generales de los cultivos in vitro

- Ocupa pequeña superficie

- Control condiciones de cultivo. Ambientales (temperatura,

humedad, luz), nutricionales (minerales, otros compuestos).

- Cultivo “aislado” biótica (ausencia de otros organismos) y

abióticamente (viento, etc).

- Alteraciones de las fases de desarrollo (indiferenciación y

diferenciación, plantas carentes de sistema radical, etc)

- Posibilita manipulaciones

- Necesidad de reestablecer el equilibrio del explanto (requerimientos

exigentes).
1.6. Ventajas y desventajas del cultivo in vitro

1.6.1. Ventajas de la técnica in vitro

- Producción de gran número de plantas.

- Obtención de plantas en cualquier época del año

Almacenamiento de plantas en poco espacio.

- Producción de plantas libres de contaminación,

enfermedades y plagas.

- Herramienta para el fitomejoramiento: plantas mejoradas

- Propagación de especies de difícil propagación por otros

métodos, o en vías de extinción.

- Clonación de individuos "élite", son desempeño agronómico

destacado.

- Obtención de plantas libres de virus.

- Producción de semillas sintéticas.

- Conservación de germoplasma: material de un conjunto de

individuos que representa la variabilidad genética de una

población vegetal.

- Obtención de metabolitos secundarios.

- Producción de nuevos híbridos.

- Mejora genética de plantas.

- Germinación de semillas.

- Producción de haploides y dobles haploides.

 - Estudios fisiológicos diversos.

1.6.2. Desventajas de la técnica in vitro

- No todas las especies son viables de propagar in vitro;

algunas son recalcitrantes.

- Cada especie requiere de métodos específicos.

- La estandarización de protocolos resulta costosa.

1.7. El cultivo in vitro y la biotecnología:

La micropropagación

La propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada en

cultivos de importancia económica. Permite cultivar células, tejidos,

órganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma

rápida. Los cultivos son realizados por personal especializado en

medios específicos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente de

carbono, agente gelificante, agua, etc.) y condiciones ambientales

controladas (temperatura, humedad y luz). Una vez ajustados los

protocolos para la especie o cultivo de interés, es posible automatizar

el proceso de modo de llevarlo a mayor escala de producción.

La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro) constituye

uno de los métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al

desarrollo de la agricultura, ya que se la usa en la producción masiva

de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas,

ornamentales y forestales.
 Micropropagación vegetal.

Entre las ventajas de la micropropagación se pueden mencionar:

- Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.

- Permite controlar las condiciones ambientales, debido a su

independencia de los mismos (luz, temperatura y humedad controlada).

- Permite estudiar diversos procesos fisiológicos.

- Evita el riesgo de contaminación con patógenos, ya que se realiza en

medios esterilizados.

- Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos.

- Permite la obtención de individuos uniformes.

- Facilita el transporte del material.

El cultivo de meristemas

En la yema apical se encuentran un grupo de células que conforman el

meristema apical (tiene un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido embrionario

que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta. A partir de ellos

se pueden regenerar plantas completas.

El cultivo de meristemas tiene numerosas aplicaciones. Una de las más

importantes es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña

zona de tejido generalmente no es afectada por estos patógenos vegetales.

Otra muy importante es la multiplicación vegetal. La potencialidad de la técnica

se demuestra con un ejemplo: a partir de una yema apical, se pueden obtener

4.000.000 de claveles en un año. La técnica permite también multiplicar

especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas),

o acelerar la producción de plantas bianuales.

Cultivo de células y órganos vegetales en biorreactores

Una vez obtenidos los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden

disgregarse para obtener una suspensión de células. Esta suspensión puede

utilizarse para generar embriones somáticos (la base de las semillas

sintéticas), o puede directamente cultivarse para producir metabolitos

secundarios, que son compuestos químicos sintetizados por las células

vegetales en determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias

farmacéutica y alimenticia, entre otras. Por ejemplo, son metabolitos

secundarios el mentol y las drogas anticancerígenos vincristina y taxol, y

algunos edulcorantes. Los cultivos celulares se llevan a cabo en biorreactores,

que son recipientes de distinta capacidad (de unos pocos a miles de litros),

diseñados para propiciar el crecimiento y/o la multiplicación de distintos tipos

de células y/o órganos (Figura 7). Las raíces vegetales también pueden ser

cultivadas en biorreactores, especialmente aquellas transformadas por

Agrobacterium rhizogenes, que produce un aumento abrupto en el tamaño y

ramificación de la raíz, aumentando así la biomasa, y por ende la cantidad del

producto deseado. Un ejemplo de compuesto farmacológico producido por

cultivo de raíces es el paclitaxel, o taxol, que es utilizado como

anticancerígeno.
 CAPITULO II
APLICACIONES

- Multiplicación vegetativa “en masa”

- Saneamiento

- Obtención rápida y numerosa de progenie a partir de un solo

individuo

- Soporte en programas de mejora convencional

- Sistema complementario a conservación de germoplasma

convencional

- Producción de metabolitos secundarios

- Base inicial de diferentes aplicaciones biotecnológicas

- Regeneración de plantas transgénicas

- Investigación básica y aplicada (ej: sistema de ensayos controlados)

 CULTIVO INVITRO DE LAS ORQUIDEAS

Obtención de cápsulas o semillas

Las orquídeas tienen estructuras conocidas como cápsulas que son

contenedores de miles de embriones desnudos o sin endospermo, es

decir, sin alimento que los sustente. Estos embriones o semillas son tan

pequeños que con frecuencia se les describe con apariencia de polvo. La

cápsula que los contiene se forma a partir de la columna ensanchada de

la flor e inmediatamente después de que la flor ha sido polinizada.

Protocolo de desinfección de cápsulas cerradas

Antes de abrir las cápsulas para sembrar a los embriones, estas tienen

que pasar por un proceso de desinfección que limpia la corteza exterior

y evita que se contaminen los medios de cultivo. Las técnicas de

desinfección que se aplican deben ser administradas con cuidado para

evitar la muerte de los embriones.

Protocolo de desinfección de cápsulas abiertas

Para la desinfección de cápsulas que ya están abiertas es necesario

aplicar la técnica que se describe a continuación. Se debe tomar en

cuenta que en este caso las probabilidades de contaminación del medio

de cultivo son más altas que cuando las cápsulas se encuentran aún

cerradas.
El equipo y reactivos utilizados en la desinfección de cápsulas abiertas

es el siguiente:

• Hipoclorito de sodio al 0.5%

• Tween 20

• Agua destilada estéril

• Vasos de precipitar (beakers)

• Embudo estéril

• Pinzas estériles

• Papel para filtrar

El protocolo de desinfección para cápsulas abiertas es el siguiente:

a) En un beaker con cloro comercial al 0.5% y una gota de Tween 20,

verter los embriones de la cápsula.

b) Dejarlos durante 15 minutos en cloro (0.5%) revolviendo cada minuto.

c) Ingresar a la cámara de flujo laminar con el beaker que contiene a los

embriones y filtrar utilizando papel filtro previamente tratado en

autoclave y un embudo desinfectado.

d) Realizar cinco lavados con agua destilada previamente esterilizada,

agregando el agua al papel filtro.

e) Dejar secar el papel filtro por completo antes de sembrar.

Preparación de medios de cultivo

Para la preparación de soluciones stock prepare y tenga disponibles los

siguientes materiales y equipo:

Siembra de cápsulas de orquídea

• Vasos de precipitar (beakers) de dos litros o más

• Probetas 1 litro y de 100 ml

• Espátulas

• Bandejas para pesar

• Papel o recipientes plásticos para pesar

• Goteros

• Plato agitador

• Agitadores magnéticos

• Balanza analítica 0.01mg (min)

• Autoclave

El procedimiento usual para preparar medio de cultivo es hacer

soluciones stock por separado, que después se agregan para hacer una

solución final. Estas soluciones stock pueden almacenarse para

utilizarse posteriormente en la preparación de más medio. Por el Medio

MS (Murashige & Skoog, 1962)

Para preparar un litro de medio MS:

Colocar un beaker sobre una plancha agitadora y activar la agitación.

Cuidado de orquídeas in vitro y traslado al invernadero

Los recipientes con cultivo pueden permanecer en sitios sin luz directa

hasta el momento de germinar. Al observar el primer indicio de

germinación, deben tener acceso a luz directa 14 horas diarias. Colocar

estos recipientes en áreas de acceso restringido para evitar su

exposición a agentes contaminantes y de preferencia fumigar el ambiente

cada seis meses contra ácaros.

Esta área de crecimiento debe permanecer a temperatura constante o

con cambios de temperatura muy leves. La temperatura a la que se

mantenga debe corresponder a la del hábitat de las plantas que se

trabajan.

El primer crecimiento será abundante, por lo que necesitará reubicar a

las plantas en otros recipientes. A este paso se le conoce como

trasferencia. Antes de sacar las plantas al aire libre, es necesario

reemplazar el medio de cultivo una vez al mes o al menos una vez cada

dos meses previo a su trasplante ex vitro.

 CONCLUSIONES

El crecimiento de varias especies de orquídeas en diferentes medios de cultivo

in vitro ha sido tema de investigación planteado dentro del marco de la línea

de Biotecnología del Iarna/URL, de acuerdo a las teorías recolectadas.