Cultivo de células NT2

Las células se mantuvieron en DMEM-GlutaMax complementado con 10% de SFB. Para inducir
el estrés oxidativo, las células se trataron con las diversas concentraciones de paraquat o
H2O2. Para inducir la diferenciación neuronal, las células NT2 también se trataron con ácido
retinoico todo-trans 10μM. Para investigar el efecto del antioxidante sobre la expresión génica
neuronal, las células oxidadas se trataron con 50μM de glutatión durante dos días. Las células
NT2 se trataron con SL327 para examinar el efecto de la inhibición de MEK1 / 2 sobre la
diferenciación neuronal inducida por paraqué de las células. Las células se trataron con SL327
a diversas concentraciones durante 24 horas y 6 días, respectivamente.

Medición de niveles de ROS en células NT2

Las células NT2 se cultivaron en placas de 6 pocillos hasta una confluencia del 80% y se
trataron con 0μM, 5μM y 25μM de paraquat. Después, las células se recogieron después de 24
y 40 horas, y se tiñeron con colorante clorometil-H2DCFDA 10μM durante 30 minutos a 37 ° C.
La intensidad del tinte que puede reflejar los niveles de ROS en las células se midió usando el
citómetro de flujo SpectraMax M5 y DAKO CyAn ADP. Todos los valores se expresaron en
media ± error estándar de la media. Utilizando la prueba t no apareada, se analizaron los datos
y p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Inmunocitoquímica

Las células NT2 se cultivaron en cubreobjetos de 13 mm hasta una confluencia del 80%, y
luego se trataron con 0μM y 50μM de paraquat. Después del tratamiento, las células se fijaron
en paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron usando Triton X-100 al 0,2% en 1X PBS. Las
células se bloquearon en BSA al 1% en PBS 1X y se tiñeron a 4ºC con los siguientes anticuerpos
primarios: OCT4, NANOG, TDGF1, β3-tubulina y NeuroD1. Posteriormente, las células se
tiñeron con los siguientes anticuerpos secundarios: DyLight 488-AffiniPure Rabbit Anti-Mouse
IgG y Goat Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 Conjugate. Para medir la actividad ROS, las células
NT2 se tiñeron con dihidroetidium 30μM durante 5 minutos. Los portaobjetos contenían DAPI
en un portaobjetos de vidrio y se observaron bajo el microscopio confocal.

Extracción de proteínas y análisis de Western Blot

Las células NT2 se cultivaron hasta un 80% de confluencia y se trataron con 0μM, 50μM, 75μM
y 100μM de paraquat durante 40 horas. La proteína se extrajo utilizando el reactivo de
extracción de proteínas de mamíferos M-PER complementado con cóctel inhibidor de
proteasas Halt y EDTA. Se resolvieron 30μg de lisado de proteína en geles de SDS-PAGE al 8%,
se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y luego se bloquearon usando 5% de BSA o
leche en 1X TBST. La membrana se sondeó durante la noche a 4 ° C con los respectivos
anticuerpos primarios: NANOG, OCT4, TDGF1, ERK1 / 2, fosfo-ERK1 / 2, p38, fosfo-p38, JNK1 /
2, fosfo-JNK1 / 2, MEK1 / , fosfo-MEK1 / 2 y β-actina. La membrana se lavó posteriormente en
1X TBST y se sondeó con anticuerpos secundarios durante dos horas: conjugado con
peroxidasa de IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa de cabra de cabra y conjugado con IgG
anti-conejo de cabra y cabra. El sustrato de transferencia Western Clarity ™ ECL se usó para la
detección, y las películas de rayos X se desarrollaron usando el desarrollador Konica Minolta
SRX-101A.
Extracción de ARN y PCR de transcripción inversa cuantitativa

Las células NT2 tratadas con paraquat, GSH o atRA se lisaron en Trizol. El ARN total extraído se
cuantificó. Se trataron 2 μg de ARN total con la TurboDNasa para eliminar el ADN genómico
residual. La muestra de ARN se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el kit de
transcripción inversa GoScript. El cDNA resultante se usó como plantilla para qPCR en la
plataforma Fast. La abundancia relativa de transcripciones génicas se cuantificó. La
significación estadística fue determinada por la prueba t de Student.