Info Fina16

“AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCION E INPUNIDAD”
UNIVERSIDAD PRIVADA DE HUANCAYO FRANKLIN ROOSEVELT
RESOLUCIÓN Nº 078-2019-SUNEDU/CD
ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA
INFORME FINAL:
PRÁCTICAS DE PRIMER NIVEL (C) EN

TOXICOLOGÍA
LUGAR DE PRÁCTICAS : LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA DE LA
UNIVERSIDAD PRIVADA DE HUANCAYO FRANKLIN
ROOSEVELT.
ASESORA : Q.F. ESTHER NANCY QUISPE QUISPE.
PRESENTADO POR : ARCOS SAMANIRGO, CECILIA YANET
FECHA DE INICIO : 09 DE AGOSTO DEL 2019
FECHA DE TÉRMINO : 06 DE SETIEMBRE DEL 2019
SEMESTRE ACADEMICO : X
HUANCAYO – PERÚ
UNIVERSIDAD PRIVADA DE HUANCAYO “FRANKLIN ROOSEVELT”
OFICINA DE SECRETARÍA ACADÉMICA DE CIENCIAS
FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA
Av. Giráldez N°542 – Huancayo
SUPERVISORA
Q.F. ESTHER NANCY QUISPE QUISPE.
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3
4
INTRODUCCIÓN
La toxicología puede ser definida como la ciencia de los venenos o de las

sustancias tóxicas, sus efectos, antídotos y detección; o bien como señala la
Organización Mundial de la Salud (OMS): "Disciplina que estudia los efectos
nocivos de los agentes químicos y de los agentes físicos (agentes tóxicos) en
los sistemas biológicos y que establece además, la magnitud del daño en
función de la exposición de los organismos vivos a dichos agentes. Se ocupa
de la naturaleza y de los mecanismos de las lesiones y de la evaluación de los
diversos cambios biológicos producidos por los agentes nocivos".
El presente informe final fue elaborado en base a formato y conocimientos

adquiridos durante la permanencia en el Laboratorio de Toxicología de la
Universidad Privada de Huancayo Franklin Roosevelt, bajo la supervisión de la
Q.F. Esther Nancy Quispe Quispe.
Dichas prácticas nos permitieron ampliar los conocimientos adquiridos dentro

de la malla curricular de la Universidad, en la cual se logró aprender la
importancia de la toxicología, el cual constituye una parte fundamental de la
investigación científica del delito y la determinación de el o los delincuentes,
siendo su principal objetivo la búsqueda de la verdad a través de la aplicación
del método científico. Asimismo, se conoció los procedimientos y normas de la
cadena de custodia el cual se realiza con la finalidad de asegurar, embalar y
proteger cada elemento probatorio hallado en el lugar de los hechos para así
evitar su suplantación alteración o destrucción.
El presente informe consta de seis capítulos, en donde se demuestra los

conocimientos adquiridos durante la práctica de toxicología en donde la
investigación técnico científica permite al personal contar con fuente de
consulta apropiada. Asimismo, en este informe se habla sobre la determinación
y concentración de alcohol etílico dentro del organismo de una persona.
Finalmente se determina la presencia de sustancia toxicas o venenos en
alimentos en casos de envenenamiento o intoxicación.
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OBJETIVOS
Objetivo general
 Aplicar el desarrollo de los conocimientos, habilidades compartidas en

las aulas de la universidad, y la extensión de nuevos experiencias en el
laboratorio de toxicología de la Universidad Privada de Huancayo
Franklin Roosevelt teniendo en cuenta los protocolos para cada
procedimiento.
Objetivos específicos
1. Cumplir con las normas de bioseguridad que se rigen dentro y fuera del
Laboratorio de Toxicología de la Universidad Privada de Huancayo
Franklin Roosevelt para proteger al personal evitando riesgos de
posibles accidentes.
2. Conocer los procedimientos y normas de la cadena de Custodia.
3. Diferenciar y conocer los métodos de extracción de sustancias tóxicas.
4. Aprender los procedimientos en el proceso de identificación de las
sustancias toxicas en el organismo.
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ÍNDICE
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………..5
OBJETIVOS……………………………………..…..………………………………….6
1. TOXICOLOGÍA …………….…………………………………………..……...9
1.1. Definición…………………………………………………………….....9
1.2. Clasificación de los tóxicos……………………………..…….……..9
1.3. Métodos de extracción de los tóxicos……………..…..…...……..12
1.4. Métodos de bioseguridad en el laboratorio de toxicología……..
1.5. .16
2. CON RESPECTO A LA MUESTRA……………………………...…………19
2.1. Selección adecuada de la muestra……………………..………….19
2.2. Cantidad adecuada de la muestra……………………………...…..21
2.3. Cadena de frio……………………………………………….………...22

2.4. Normas para la recogida, embalaje y remisión de la muestra…………23
3. CADENA DE CUSTODIA………………………………….…………..……25
4. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA…………………………….………31
5. ACTIVIDADES REALIAZADAS DURANTE LAS PRÁCTICAS DE

TOXICOLOGÍA………………………..………………………………………37
6. TÉCNICAS DE INSTRUMENTACIÓN PARA IDENTIFICAR SUSTANCIAS

TÓXICAS……………………………...……………………. 53
6.1. Espectrofotométricas…………………………………………………53
6.2. Cromatografías……………………………………………………….64
6.3. Inmunoquímicas…………………………………………………….73
6.4. Microscópicas……………………………………………………….77
CONCLUSIONES…………………………………….………………………………79
RECOMENDACIONES……………………………………………………….……..80
GLOSARIO DE TÉRMINOS…………………………………………..…………….81
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………83
ANEXO………………………………………………………………………..………84
7
CAPÍTULO I
8
TOXICOLOGÍA
1.1. Definición
La toxicología es el estudio de los venenos o, en una definición más

precisa, la identificación y cuantificación de los efectos adversos
asociados a la exposición a agentes físicos, sustancias químicas y otras
situaciones. En ese sentido, la toxicología es tributaria, en materia de
información, diseños de la investigación y métodos, de la mayoría de las
ciencias biológicas básicas y disciplinas médicas, de la epidemiología y de
determinadas esferas de la química y la física. La toxicología abarca
desde estudios de investigación básica sobre el mecanismo de acción de
los agentes tóxicos hasta la elaboración e interpretación de pruebas
normalizadas para determinar las propiedades tóxicas de los agentes.
Aporta una importante información tanto a la medicina como a la
epidemiología de cara a comprender la etiología de las enfermedades, así
como sobre la plausibilidad de las asociaciones que se observan entre
éstas y las exposiciones, incluidas las exposiciones profesionales. Cabe
dividir la toxicología en disciplinas normalizadas, como la toxicología
clínica, la forense, la de investigación y la reguladora; otra clasificación
hace referencia a los sistemas o procesos orgánicos que se ven
afectados, y tenemos entonces la inmunotoxicología o la toxicología
genética; puede presentarse también desde el punto de vista de sus
funciones, y entonces se habla de investigación, realización de ensayos y
evaluación de los riesgos.
1.2. Clasificación de los tóxicos
Un tóxico es cualquier sustancia, elemento o compuesto químico que,

absorbido por el organismo ya sea por es capaz de producir un daño, a
bajas dosis. Cualquier agente químico o físico presente en los sistemas
biológicos capaz de producir efectos nocivos una vez absorbido por los
individuos que los habitan se clasifican:
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a. Según su estado fisico
 Sólidos (polvos)
 Líquidos (neblinas)
 Gases (humos, polvos, gases)
 Plasma atómico
b. Según la vía de entrada
 Oral  Cutánea
 Respiratoria  Mucosas
c. Según su toxicidad
Los criterios de clasificación de toxicidad de la

Organización Panamericana de la Salud se basan en los
establecidos por Casarett y Doull’s. entre ello tenemos la
naturaleza fisicoquímica, el tiempo de exposición, la
frecuencia, dosis, vía de entrada, vehículo, velocidad de
absorción, tiempo de concentración plasmática
(sanguínea), biotransformación (cambios que sufre en su
composición dentro del organismo), órgano blanco,
características genéticas, factores individuales y factores
ambientales.
GRADO DE TOXICIDAD DOSIS LETAL PROBABLE

PARA EL SER HUMANO
I Inocuos 15 g/kg
II Ligeramente tóxicos 5-15 g/kg
III Medianamente 0.5-5 g/kg

tóxicos
IV Muy tóxicos 50-500 mg/kg
V Extremadamente 5-50 mg/kg

tóxicos
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VI Súper tóxicos Menos de 5 mg/kg
d. Según estructura química
Obedece a la gran cantidad de compuestos químicos que

se ha creado principalmente en la segunda mitad del siglo
XX. cada uno de estos grupos, sus compuestos más
representativos y el uso más frecuente que se les da en el
medio laboral que tenemos son:
1. Metales 9. Cetonas
2.Pseudometales 10. Esteres
3. Azufre y sus derivados 11. Ácidos orgánicos
4. Halógenos 12. Hidrocarburos
5. Derivados del nitrógeno 13. Fenol y derivados
6. Alcoholes 14. Acetales
7. Aldehídos y acetales 15. Cianuros y nitrilos
8. Glicoles 16. Plásticos
e. Según sus efectos en el organismo
La clasificación de tóxicos según los daños que producen

en el organismo es la siguiente:
 Neurotóxicos: Son sustancias que se fijan en el tejido

nervioso y producen síntomas tales como:
convulsiones, inconsciencia, hiperactividad, delirio;
manía y depresión del sistema nervioso central. Uno de
los más importantes es el lindano.
 Neuneumotóxicos: Afectan principalmente a los
pulmones. Producen obstrucción respiratoria, depresión
respiratoria no central, edema pulmonar, neumonía
química. Ejemplo: ciclohexanol.
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 Cardiotóxicos: Afectan al corazón y a los grandes

vasos. Producen insuficiencia cardiaca, insuficiencia
circulatoria periférica (estado de choque) o también
paro cardiaco. Ejemplo: polipropilenglicol.
 Nefrotóxicos: afectan al riñón y a las vías urinarias.
Producen insuficiencia renal, retención urinaria,
etcétera. Ejemplo: fenotiacina.
 Gastroenterotóxicos: afectan al aparato digestivo y al
hígado. Producen vómitos, diarrea, parálisis del
intestino, insuficiencia hepática, etcétera. Ejemplo:
arsénico.
 Hematotóxicos: afectan a la sangre y a los órganos
donde se produce, como la médula ósea. Ocasionan
alteraciones de la hemoglobina, pérdidas de glóbulos
blancos, destrucción de glóbulos rojos, etcétera.
Ejemplo: anilina ynitrotoluenos.
 Dermatotóxicos: afectan a la piel y sus anexos
(glándulas sudoríparas, cabello, etcétera). Producen
dermatitis por contacto, lesiones de la córnea y de las
mucosas oral, nasal, etcétera. Ejemplo: tricloruró de
fósforo.
 Teratógenos: sustancias que producen
malformaciones congénitas. Ejemplo: dimetilacetamida.
 Carcinogenéticos: producen tumores malignos en

cualquier parte del cuerpo, dependiendo de la
sustancia.
1.3. Métodos de extracción de los tóxicos
La extracción es una técnica que se emplea para separar un

determinado producto orgánico de una mezcla en la mayoría
de las muestras a analizar en toxicología, las sustancias a
12
extraer se encuentran en forma de sales ionizadas para que

puedan ser extraídas es necesario que sean transformadas en
su forma libre mediante la acción de un ácido con el objeto de
recuperar la sustancia contenida en la muestra.
a. Método de extracción de los tóxicos volátiles
Se denominan tóxicos volátiles a todas aquellas sustancias

que independientemente de su estado físico pueden
separarse del material que las contiene a través de los
siguientes métodos: destilación simple destilación por
arrastre con vapor, micro difusión, espacio cabeza
Comprenden, entre otros, compuestos tales como
alcoholes primarios, aldehídos, cetonas, fenoles y
solventes orgánicos como éter, cloroformo, tetracloruro de
carbono, etc.
Dosaje etílico
Es la determinación de la concentración de alcohol etílico

realizada en muestras biológicas, cuya calificación es
reportada en gramos por litro (g/L). El valor legal se da si la
concentración es referida a muestra de sangre.
Las concentraciones halladas en ambas difieren dado su

diferente tenor en agua; la equivalencia se obtiene
mediante el uso del factor 1,31.
Análisis Preliminar o de Orientación
El sujeto sometido o a examen, debe espirar (soplar) a

través de una cánula, dentro de una solución ácida
sulfúrica de permanganato de potasio, observándose un
viraje de color, desde el punto original (violeta), pasando
13
por tonalidades intermedias, hasta el decolorado total

proporcionalmente a la concentración de alcohol presente.
Análisis Cuantitativo
Es practicado en muestras exentas de algún conservador

químico, anticoagulante, etc.
Las técnicas utilizadas son:
Método fotocolorimétrico, previo tratamiento de la muestra

con una sustancia liberante (carbonato) y temperatura para
volatilizar el alcohol, y ulterior tratamiento con mezcla
sulfocrómica, se originará un viraje de color proporcional a
su concentración. Este producto es leído en el
fotocolorímetro y determinada la concentración en una
curva de calibración preparado con estándar de etanol.
b. Extracción de tóxicos orgánicos
Esta extracción se realiza previa purificación de la muestra

ya que la muestra (sangre, hígado, pulmón, cerebro) a
analizar contiene un gran número de sustancias como
proteínas y lípidos que van a interferir en el análisis para
estos se debe hacer un tratamiento con agentes
precipitantes de proteínas (desproteinizantes) tenemos al
sulfato de amonio o tungsteno de amonio.
Tóxicos orgánicos fijos
Bajo la denominación de Tóxicos Orgánicos Fijos (TOF) o

no volátiles se incluye una gran variedad de sustancias
orgánicas, de interés toxicológico, que no pueden aislarse
por destilación de las matrices que los contienen, sino que
debe recurrirse a la acción de disolventes orgánicos (en
medio ácido o alcalino) para su separación y posterior
identificación.
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Extracción de tóxicos orgánicos de una muestras de

orina.
Como norma general, los tóxicos orgánicos se extraen con

disolventes orgánicos. Entre los más frecuentes para una
extracción general se encuentran: éter etílico, cloroformo,
diclorometano, etc.
En este proceso es fundamental el pH del medio en el que

se realiza la extracción, ya que el fundamento de la
extracción líquido - líquido consiste en la diferente
solubilidad que cada sustancia tiene en agua y/o disolventes
orgánicos en función del grado de disociación que sufre en
función del pH del medio (sin olvidar el efecto de la mayor o
menor liposolubilidad de acuerdo al coeficiente de partición)
c. Método de extracción de tóxicos minerales o

inorgánicos
Estos tóxicos se encuentran en el organismo firmemente

unidos a la albumina, lípidos o glúcidos, siendo requisitos de
destrucción de la materia orgánica para poder realizar sus
análisis. La toxicidad es una medida usada para medir el
grado tóxico o venenoso de algunos elementos. La toxicidad
puede referirse al efecto de ésta sobre un organismo
completo, como un ser humano, una bacteria o incluso una
planta, o a una subestructura, como una citotoxicidad.
Los metales pesados son un grupo de elementos químicos

que presentan una densidad relativamente alta y cierta
toxicidad para los seres humanos El término “metal pesado”
no está bien definido, se utilizan criterios como el de la
densidad, el nº atómico y el peso atómico. El término suele
estar relacionado con la toxicidad que presentan. Los
metales pesados más conocidos son mercurio, plomo,
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cadmio, talio, arsénico y selenio, cuando se habla de

contaminación ambiental se incluyen el berilio y aluminio,
plomo, arsénico, mercurio, cadmio, níquel, plata, zinc,
manganeso.
Métodos De Extracción
Mineralización: proceso por el cual se produce la destrucción de la

materia orgánica y la consiguiente liberación del toxico.
-Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia

orgánica empleando ácido nítrico- agua oxigenada,
etc.
- Destrucción de materia orgánica por vía seca
(calcinación)
-Formación de complejos y posteriormente se separa con
disolvente orgánico.
1.4. Medidas de Bioseguridad en el Laboratorio Toxicológico
Bioseguridad Se define como el conjunto de medidas, normas

y procedimientos destinados al cambio de actitudes y
conductas que controlen y disminuyan el riesgo a adquirir
infecciones que puedan existir en el medio.
El conjunto de medidas, normas y procedimientos destinados a

controlar y minimizar dicho riesgo biológico es la bioseguridad;
quedando claro que el riesgo Cero no existe. Las normas e
indicaciones que garanticen la integridad y seguridad de las
personas y los bienes involucrados en la tarea. La gran
cantidad de compuestos químicos de elevada peligrosidad, el
uso de equipamiento eléctrico y la combustión de gases con
diferentes fines corresponden a algunas de las fuentes que
pueden generar accidentes. Para evitarlos, existen reglas,
indicaciones y normas, que si se aplican y respetan
16
adecuadamente minimizan los riesgos y garantizan un trabajo

seguro.
Las medidas de bioseguridad en el laboratorio son
- Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.)

deben mantenerse alejados de las llamas de los
mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con
estos productos, se hará al baño María, nunca
directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas
se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de
paso al apagar la llama
- Cuando trabajamos con sangre y líquidos corporales
deben ser manipulados como materiales infecciosos.
- Todas las muestras de sangre y los líquidos corporales
deben colocarse en un recipiente adecuado, con una tapa
segura para evitar el derrame durante el transporte.
- Todas las personas que procesan muestras de sangre y
líquidos corporales (p. ej., quienes quitan las tapas de los
tubos con vacío) deben utilizar guantes y protección facial
(mascara, gafas), si se espera que la sangre o líquidos
corporales salpiquen.
- Las personas deben cambiarse los guantes y lavarse las
manos cuando concluyan con el procedimiento de las
muestras.
- Las superficies de trabajo del laboratorio deben
descontaminarse con las sustancias apropiadas luego de
un derrame de sangre u otros líquidos corporales y
cuando sea concluido con las tareas.
17
CAPÍTULO II
18
2. CON RESPECTO A LA MUESTRA
2.1. Selección adecuada de la muestra
El examen toxicológico se hace con mayor frecuencia en sangre y orina

(los especímenes más utilizados), pero puede realizarse en contenidos
gástricos (vómito o líquidos de un lavado gástrico), si se hace poco
después de la ingestión de la sustancia. El cabello y uñas pueden ser
examinados para detectar arsénico y mercurio.
2.1.1. Sangre
Para la toma de muestra se desinfectará la piel con alcohol, excepto en

el caso de determinación de alcoholemia (en este caso recurrir a
soluciones jabonosa, agua oxigenada, yodo povidona, etc.). Ante la
sospecha de una intoxicación de origen desconocido se deberá recoger
la muestra de sangre en dos tubos, uno de ellos con anticoagulante
(preferentemente heparina) y otro tubo sin anticoagulante (o con gel
acelerador de coagulación).
En el caso de tener que asegurar la estabilidad de la muestra, se
recomienda reemplazar la heparina por fluoruro de sodio al 1% (como
preservador antibacteriano). El volumen recomendable en cada caso
será de 5mL. La conservación de la muestra se hará en heladera de
4°C. Los recipientes que se envían deben ser tubos de polipropileno o
similar con cierre hermético. Es preferible utilizar material nuevo o
virgen, para evitar contaminación (muchas veces quedan resto de
medicamentos u otras sustancias que no se extraen con lavado casero,
provocando confusiones en el ulterior estudio analítico).
2.1.2. Saliva
Se trata de una nueva matriz biológica en estudio, especialmente para

evaluar consumo de drogas de abuso y ciertos contaminantes. La saliva,
al igual que otros fluidos corporales, constituye una vía de excreción de
19
las sustancias tóxicas. Se ha empleado saliva para la detección de

numerosos contaminantes en el ser humano, ya que existe una
asociación entre los niveles del compuesto en el plasma y en saliva para
muchos de ellos, considerando que ésta constituye un ultrafiltrado de
plasma. Aún así este tema está actualmente en revisión.
2.1.3. Orina
Este tipo de muestra es idónea para realizar un estudio de “screening”

en el caso de no reconocer el origen de la intoxicación. Otra ventaja es
que la concentración del analito puede ser mayor que en la sangre.
Además, en general, la orina está exenta de proteínas, con lo cual se
tienen menos interferencias. Es una muestra más abundante, fácil de
recolectar y de conservar.
Procedimiento para su recolección: emplear un recipiente limpio. En

algunos casos es conveniente recolectar el volumen total de 24 horas y
en otros resultan útiles las orinas ocasionales, por lo general es
conveniente conservarla en la heladera, a 4 °C.
2.1.4. Vísceras
Deben colocarse en recipientes rigurosamente limpios, sin agregado de

ningún tipo de sustancia con fines de preservación u otro motivo. Deben
disponerse de un recipiente para cada órgano. Como mínimo se deben
obtener muestra e los siguientes órganos: hígado, estómago y su
contenido, cerebro, pulmón y riñón.
2.1.5. Pelo
Forma de recolección: cortar en el sector occipital, bien al ras del cuero

cabelludo, 1 o 2 gramos de muestra (en la práctica un puñado o mechón
es suficiente). Tomar el extremo cercano al cuero cabelludo, colocarlo
sobre papel o cartón y abrochar con aplique de broches de tamaño
apropiado, colocar otro papel o cartón encima del anterior y pegar o atar
20
según corresponda. El envoltorio debe permanecer firme. Tomar vello

pubiano y axilar, cortado al ras de la piel y colocarlo en sobre de papel
común.
2.1.6. Humor vítreo
Se realiza resecando completamente el globo ocular o bien a través de

una punción del mismo con aguja y jeringa; muchas veces se remite
humor vítreo o ya que la densidad de este último hace dificultosa la
extracción; por lo tanto, debe ponerse atención cuando se envía esta
matriz.
2.1.7. Diferentes líquidos corporales
La obtención se debe realizar por punción de las cavidades donde estos

se encuentran cuidando de no contaminar un líquido con otro (líquido
ascítico, de derrame pleural, pericárdico, líquido amniótico, etc.).
2.2. Cantidad adecuada de la muestra
MUESTRA CANTIDAD ESTUDIO CONSERVAR
Adecuada para estudio toxicológico en

10 mL (adulto)
general.
SANGRE c/anticoagulante o
5mL (niños)
conservante
Heladera máximo 2 semanas

Específica para investigación de etanol,
2 mL metanol y otras sustancias volátiles.
s/cámara de aire (*)

Vivos toda
ORINA general. Recomendable para la Heladera envío
de 24 horas
s/conservante Investigación de drogas de abuso y inmediato
Muertos toda,
Fármacos.
o mínimo 150 mL
21
HUMOR VÍTREO Adecuada para la investigación de alcoholes Heladera

Todo de ambos ojos
s/cámara de aire (*) y sus metabolitos. envío inmediato
VÍSCERAS S/ CONSERVANTES

Hígado, Riñón, 50 g
general. Freezer
Bazo
envío
Recomendable para investigación de Gases y
Corazón solventes. Si las cavidades cardíacas tienen inmediato
50 g
Pulmones colección hemática, permitirá realizar un
estudio toxicológico general.
Recomendable para la investigación de

Vesícula biliar y su contenido Todo
Opiáceos.
Freezer
Cerebro 100 g Adecuada para la investigación de Sustancias
envío inmediato
liposolubles, psicotrópicos y drogas (fármacos
o drogas de abuso).
Mantener refrigerada (4 a 8 ºC) y

Para la investigación o exposición crónica de
Tejido Adiposo Subcutáneo y/o asegurar que se mantenga la
50 a 100 g fármacos liposolubles, drogas de abuso
Visceral cadena de frio hasta su llegada al
liposoluble y/o plaguicida.
IMCiF
Uñas Todas las Adecuada para investigar intoxicación crónica Temperatura Ambiente
por Arsénico y consumo crónico de drogas de
manos y pies posibles abuso. conservantes
Pelos
Mechón Adecuada para investigar intoxicación crónica
de región craneal occipital/parietal por Arsénico y consumo crónico de drogas de Temperatura Ambiente
(1-2 g) abuso.
(preferentemente)
2.3. Cadena de frio
Se define como cadena de frio a la serie de elementos y actividades

necesarios para garantizar la calidad de las muestras obtenidas desde el
laboratorio hasta el procedimiento y remisión del resultado. Este término
fue utilizado por primera vez alrededor de 1908, se define como el
conjunto de etapas sucesivas de la preservación especialmente de las
muestras, la refrigeradora es uno de los métodos más importantes para la
conservación de las muestras.
22
2.4. Normas para la recogida, embalaje y remisión de la muestra
Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses, de acuerdo con la

Ley Orgánica 19/2003, de 23 de diciembre, de modificación de la Ley
Orgánica 6/1985, de 1 de julio, del Poder Judicial, y el Real Decreto
862/1998, de 8 de mayo, por el que se aprueba el Reglamento del
Instituto de Toxicología, se configura como un órgano técnico cuya misión
es auxiliar a la Administración de Justicia.
 Las muestras destinadas al análisis toxicológico no se conservarán en

formol. No se utilizarán los tubos con gel activador de la coagulación
ante la posibilidad de que contengan tolueno.
 Los frascos destinados a contener sangre no deben tener restos de
agua para evitar la hemólisis.
 A las muestras de sangre se añadirá un agente conservante,
preferentemente fluoruro sódico, excepto cuando haya de determinarse
flúor o sodio. A los restantes tipos de muestras biológicas no se les
adicionará ningún conservante.
 Para el estudio de tóxicos volátiles, monóxido de carbono, gases
anestésicos, hidrocarburos volátiles, los envases de las muestras de
sangre deberán llenarse al máximo para evitar en lo posible la cámara
de aire.
 Para la determinación de alcohol etílico en sangre en sujetos vivos, la
extracción se llevará a cabo con jeringa desechable, no empleándose
alcohol o desinfectantes con fracciones volátiles en la desinfección de
la piel.
 El envío se realizará en condiciones de refrigeración.
23
CAPÍTULO III
24
3. CADENA DE CUSTODIA
La cadena de custodia es el conjunto de medidas que deben

adoptarse a fin de preservar la identidad e integridad de objetos o
muestras que pueden ser fuente de prueba de hechos criminales,
para su total eficacia procesal. “Debe garantizar que el elemento de
prueba o evidencia que se presenta en juicio, con el objeto de probar
una determinada afirmación, sea el que ha sido reclutado y que no
haya sufrido adulteraciones o modificaciones de parte de quienes lo
introducen o terceras personas”.
En el análisis toxicológico es de suma importancia asegurar la

identificación, la certeza y la integridad de una muestra que se
remite al laboratorio. Durante el proceso de recolección, algunos
individuos tratan de falsificar el espécimen mediante el agregado de
diferentes sustancias como, por ejemplo: sales, solventes,
sustancias enmascarantes, o bien reemplazan una muestra por otra.
Esta delicada situación se presenta especialmente con las muestras

de orina, por lo que se deben tomar ciertos recaudos que eviten la
adulteración de la misma. Ellos incluyen:
- Verificación de la identidad del donante

- Vigilancia directa del donante durante la emisión de la orina
- Evaluación del aspecto y de la temperatura de la muestra
- Medición del pH y de la densidad: permite considerar si se
alcalinizo o diluyo la muestra.
Recolección, embalaje y rotulado de los elementos materia de

prueba o evidencias
a. Definición.
Actividades que se desarrollan para la recolección, embalaje y

rotulado en forma adecuada de los elementos materia de prueba o
evidencia para ser enviados a los laboratorios toxicológicos, en
25
condiciones de preservación y seguridad que garanticen la

integridad, continuidad, autenticidad, identidad y registro, de
acuerdo a su clase y naturaleza.
b. Limites
Aplicable a los servidores públicos con funciones de policía auxiliar

o quien por vía excepcional haga sus veces, en el lugar de los
hechos.
c. Aspectos relevantes
 La policía auxiliar o quien excepcionalmente haga sus veces,

previa observación, análisis, valoración, documentación y
fijación del lugar de los hechos, confeccionará la respectiva Acta
de Secuestro, con arreglo a las normas procesales vigentes para
luego dar inicio al procedimiento de recolección, embalaje y
rotulado de los elementos materia de prueba o evidencias que
se hayan encontrado o aportado.
 Quien recolecte, embale y rotule los elementos materia de
prueba o evidencia, deberá observar las condiciones de
bioseguridad y protección (uso de guantes, barbijos, gorros,
gafas, caretas y equipos, entre otros, según la naturaleza del
elemento o evidencia en el lugar de los hechos).
 Previo a la recolección, embalaje y rotulado de los elementos
materia de prueba o evidencia, se realizará el alistamiento de los
recursos necesarios y adecuados para tal fin.
 Quien recolecte, embale y rotule los elementos materia de
prueba o evidencia, hará el procedimiento observando los
principios generales aconsejados por los laboratorios
toxicológicos.
26
Envió de los elementos materia de prueba o evidencias al

laboratorio o al depósito de secuestros.
a. Definición
Corresponde a las actividades que se desarrollan para facilitar el

envío de los elementos materia de prueba o evidencias al
laboratorio o al depósito de secuestros.
b. Limites
Aplicable a los operadores del sistema judicial de la Provincia de

Salto a los Representantes Técnicos debidamente acreditados de
las Provincias firmantes del Acuerdo de los Procuradores del NOA,
a las muestras encontradas en el lugar de los hechos. Inicia con la
disposición de estudio o almacenamiento de las muestras y termina
con la recepción de las mismas por parte del laboratorio o del
depósito de secuestros.
 El Registro de Cadena de Custodia, acompañará a las muestras

desde la recolección hasta la disposición final.
 El funcionario que hubiere recogido, embalado y rotulado las
muestras las trasladará o remitirá al laboratorio o al depósito de
secuestros; salvo en los lugares del país dónde no sea posible la
entrega personal de muestras, en cuyo caso la persona que la
secuestra, recolecta y embala, deberá hacer el traspaso de la
misma con el Registro de Cadena de Custodia al transportador
respectivo para su envío, adjuntándole el formato de registro de
cadena de custodia.
 Toda persona que debe recibir un elemento material probatorio o
evidencia física, antes de hacerlo, revisará el recipiente que lo
contiene y dejará constancia del estado en que se encuentre, en
27
el formato de registro de cadena de custodia adoptado en este

manual
Recepción y análisis de los elementos de materia prima de prueba o

de evidenciasen el laboratorio
a. Definición
Corresponde a las actividades desplegadas por los laboratorios de
toxicología para la recepción de las muestras con el fin de realizar
los estudios o análisis solicitados por la autoridad requirente.
b. Limites
Aplicable a los laboratorios de toxicología y a las personas

que intervienen en el procedimiento. Inicia con el recibo de las
muestras en la mesa de entradas o la que haga sus veces y finaliza
con la entrega del informe.
 Toda persona que deba recibir un elemento material probatorio o

evidencia física, antes de hacerlo, revisará el recipiente que lo
contiene y dejará constancia del estado en que se encuentre, en
el formato de registro de cadena de custodia adoptado en este
manual.
 El embalaje sólo se podrá abrir por el profesional designado para
su estudio o análisis.
 Previa documentación fotográfica, la apertura del contenedor se
hará por lado diferente a donde se encuentre el sello inicial.
Despejada la duda, el elemento se introducirá preferiblemente
en el embalaje inicial si las condiciones del mismo lo permiten,
en caso de utilizarse un nuevo embalaje se conservará el rótulo
y cinta de sello inicial. Para sellar el embalaje se procederá a
imprimir la firma y número de documento de identificación del
encargado de la recepción del elemento en la parte de su cierre
y sobre esta colocará la cinta de sello.
28
Documentación del sistema de cadena de custodia

a. Definición
Es la actividad por la cual se hace constar las particularidades de

los elementos materia de prueba, de los custodios, el lugar, sitio
exacto, fecha y hora de los traspasos y traslados del elemento
materia de prueba o evidencia física, entre otros; mediante el
diligenciamiento de los formatos de entrega del lugar de los
hechos, primer respondiente, rótulo y registro de cadena de
custodia, a efectos de demostrar la identificación del elemento y la
continuidad de la cadena de custodia.
b. Aspectos relevantes
 La documentación originada en la aplicación del presente.

Sistema deberá estar exenta de modificaciones o alteraciones
por raspado, borrado, lavado químico, agregados, tachadura,
enmienda, retoque o cualquier otro hecho que viole el principio
de integridad.
 En caso de recibir el custodio los elementos en mal estado o con
alguna irregularidad, deberá informar inmediatamente a la
autoridad competente y a su superior inmediato, dejando la
constancia respectiva en el formato de registro de cadena de
custodia.
 Será obligación de los servidores públicos y de las instituciones
involucradas en el manejo del sistema de cadena de custodia
garantizar el diligenciamiento del rótulo y de los formatos de
registro establecidos en el presente manual.
 El registro de cadena de custodia debe diligenciarse en
un solo ejemplar original sin copias. De la entrega del formato y
de las muestras se dejará constancia en las actas de las
diligencias respectivas.
29
CAPÍTULO IV
30
4. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
En la cromatografía en capa fina (CCF) la fase estacionaria consiste en una

capa delgada de un adsorbente (como por ejemplo gel de sílice, alúmina o
celulosa) depositada sobre un soporte plano como una placa de vidrio, o una
lámina de aluminio o de plástico.
La CCF es una técnica analítica y tiene como objetivo el análisis de una

mezcla de componentes.
El proceso es similar a la cromatografía de papel con la ventaja de que se

desarrolla más rápidamente, proporciona mejores separaciones y se puede
elegir entre diferentes adsorbente. La CCF es una técnica estándar en el
laboratorio de química orgánica. Debido a su simplicidad y velocidad, la CCF
se utiliza a menudo para monitorizar las reacciones químicas y también para
el análisis cualitativo de los productos de una reacción, puesto que permite
conocer de manera rápida y sencilla cuántos componentes hay en una
mezcla.
Cuanto más polar sea el compuesto, más retenido estará en el absorbente, y

por tanto irá más lento y el Rf será también menor. Por otra parte, los
compuestos poco polares, se consiguen desplazar a más distancia desde el
origen. La polaridad del disolvente influye en el valor del Rf, por lo que
deberemos tenerlo en cuenta. Así, para un mismo tipo de compuesto, un
aumento de la polaridad del disolvente hará aumentar su desplazamiento en
la placa y por lo tanto también aumentará su Rf.
Para elegir un eluyente, se recomienda elegir un disolvente en el que los

componentes que formen la mezcla presenten un Rf de entorno a un 0.3 ó
un 0.5. Para encontrar el eluyente ideal, es necesario probar con diferentes
disolventes con distintas polaridades o con mezclas de varios de ellos. En
estos casos, debemos cambiar a disolventes más o menos polares. En el
caso de compuestos poco polares, los cuales se desplazan del origen con
bastante facilidad, se utiliza un disolvente apolar, generalmente el hexano.
31
a) Métodos Químicos
Consisten en realizar una reacción química entre un reactivo revelador y los

componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos
reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma, o
mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido. Es preferible
pulverizar con las placas en posición horizontal. Si el reactivo revelador es
peligroso o muy corrosivo, la pulverización deberá realizarse en una vitrina
de gases bien ventilada. La pulverización se realizará poco a poco.
b) Métodos Físicos
El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente.

De tal forma que, al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y
dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas
fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos
aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes.
4.1 Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina.
- Éter de Petróleo -
- Cloruro de metileno - Metanol
- N-hexano - Cloroformo
- Acetato de etilo - Ácido acético
Iso-propanol - Ciclohexano
- Dietil-éter - Acetona
- etanol - Tolueno
- f-butil-éter
4.2. Reveladores más comunes para cromatografía en capa fina
Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las

incoloras pueden revelarse mediante:
a) Luz UV: Si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase
estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F25a ó F366), el
32
RESOLUCIÓN N°517-2010-CONAFU
número que aparece como subíndice nos indica Ia longitud de onda de

excitación del indicador utilizado.
b) La introducción de la placa en vapores de yodo
c) El rocío con una solución de agua/H2SO a 1:1 (dentro de un

compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de extracción
de gases). Después calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero.
Hasta carbonizar los compuestos.
4.3 Adsorbentes más comunes para cromatografía en capa fina.
a) Gel de sílice (se utiliza en el 80% de las separaciones):
Es una forma granular y porosa de dióxido de silicio, hecho a partir de

silicato sódico. Es un gel sólido y duro, de aspecto cristalino, poroso, inerte,
no tóxico e inodoro. Su fórmula molecular es SiO2.nH2O, casi insoluble en
agua y en cualquier otro disolvente. Es químicamente estable, sólo
reacciona con ácido fluorhídrico y con álcali.
El gel de sílice, también conocido como Silicagel, es un producto absorbente

que puede diferenciar la adsorción de diferentes moléculas, actuando como
un adsorbente selectivo en procesos de cromatografía, tanto en columna
como en placa fina.
b) Oxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica):
La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico debido a que

en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la bauxita quedan algunas
moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina, dándole a ésta un
carácter básico. No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como
el gel de sílice.
33
La alúmina puede ser tratada químicamente para conseguir alúminas ácidas,

básicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas. Es un
adsorbente de carácter polar, de tal forma que retendrá con mayor avidez a los
componentes polares.
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina):
Es un adsorbente donde los principios de la separación son los mismos que en la

cromatografía de papel pero con la ventaja de que las manchas son más definidas y
dan mejores separaciones. Se encuentra en el mercado con o sin adhesivo y con o
sin indicador fluorescente.
d) Poliamidas:
Es una resina sintética. Se utilizan dos tipos de poliamidas (6 y 11). Es comúnmente

utilizada para la separación de compuestos polares, tales como aminoácidos y
derivados, benzodiacepínicos, ácidos carboxílicos, ciclodextrinas, ácidos grasos,
flavonoides, conservantes y plaguicidas.
Para la selección del adsorbente deber tomar las siguientes consideraciones:
- Polaridad
- Tamaño de partícula
- Diámetro
- Área Superficial
- Homogeneidad Pureza
4.4. Factores que influyen en una separación por cromatografía de capa fina.
a. Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más en la fase
estacionaria.
b. La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire.
c. Limpieza de las placas. Muchas placas están contaminadas con grasa o agentes
plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala, éstas deben limpiarse
corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y después dejar secar
completamente antes de aplicar la muestra.
34
d. Pureza de los disolventes.
4.5 Aplicaciones.
a. Industria Farmacéutica: Separación y cuantificación de ingredientes activos.

b. Industria de alimentos: Cuantificación de edulcorantes, preservantes y vitaminas.
c. Materia prima: Cuantificación de pureza.
Otros: Separación de componentes en muestras botánicas, de productos naturales y

bioquímicas
PROCEDIMIENTO
Una placa de CCF es una lámina de vidrio, metal o plástico recubierta con una capa
delgada de un sólido adsorbente (gel de sílice o alúmina). Se deposita una pequeña
cantidad de la muestra problema en disolución en un punto en la parte inferior de la
placa. Entonces la placa se introduce en una cubeta cromatografía, de forma que
sólo la parte inferior de la placa queda sumergida en el líquido. Este líquido o
diluyente.
Es la fase móvil y asciende por la placa de CCF por capilaridad.
A medida que el eluyente pasa por el lugar donde está la mancha de la mezcla
problema se establece un equilibrio entre las moléculas de cada uno de los
componentes en la mezcla que son adsorbidas y las que se encuentran en
disolución.
En principio, los componentes se diferenciarán en solubilidad y en la fuerza de su

adsorción, de forma que unos componentes se desplazarán más que otros. Cuando
el eluyente llega a la parte superior de la placa, esta se saca de la cubeta, se seca, y
los componentes separados de la mezcla se visualizan.
35
CAPÍTULO V
36
5. ACTIVIDADES REALIZADAS DURANTE LAS PRÁCTICAS DE

TOXICOLOGÍA
El examen usual para detectar el consumo reciente de drogas es el análisis

de orina que se conoce como control de drogas. También se puede usar las
matrices biológicas sangre o saliva para medirla cantidad real de drogas al
momento de la toma de muestras. En estos momentos se describen en
revistas especializadas innumerables trabajos sobre el análisis de pelo, pero
todavía la comunidad científica no llega al consenso indispensable para
determinar la exactitud, confiabilidad e interpretación de los resultados. Se
requiere mayor investigación para llegar a establecer datos definitivos que
permitan diferenciar claramente la incorporación interna de la contaminación
externa.
Identificación de Cocaína
5.1.1. Origen botánico de la cocaína:
La cocaína es el principal alcaloide que se encuentra en las hojas de la

coca (Erythoxylon coca). La coca es un arbusto de la familia de las
eritroxiláceas, originaria de la zona tropical de los Andes, cuyo hábitat
cultural son los valles calientes y húmedos entre 600 y 1.500 metros sobre
el nivel del mar, sobre todo en Perú, Bolivia, Brasil y Chile, que, aunque es
originario de Sudamérica, se ha adaptado a muy diversas zonas del globo
como el norte de África, Taiwán, etc. Hojas de coca.
Componentes de la coca:
La planta de coca tiene un contenido de alcaloides entre el 0,1 y 0,8%

siendo la cocaína el principal componente utilizado en terapéutica como
anestésico local, sobre las mucosas (ojo, faringe, etc.). Las hojas de coca
son la principal parte utilizada y contienen aproximadamente 0,5 - 2% de
alcaloides totales entre las que tenemos:
37
- Derivados tropánicos: Cocaína (metil-benzoil ecgonina)

constituyendo el 50-94%; cinamil cocaína (metil-cinamil ecgonina); a y
b truxilinas (estéreo-metil ecgonina de los ácidos a y b truxílicos); tropa
cocaína (éster benzoílico de la pseudotropina).
- Derivados del Pirrol: Higrina.
- Otras sustancias encontradas en las hojas son: ácido cocatánico,
proteínas, minerales (calcio), vitaminas, ácidos grasos, aceites
esenciales, ceras, salicilato de metilo, acetona y alcohol.
5.1.2. Características físico-químicas de la cocaína:
La cocaína de fórmula C17H21O4N, es el principal componente de las

hojas de coca, y desde el punto de vista químico es la
benzoilmetilecgonina. La ecgonina es una base aminoalcohólica
relacionada con la atropina, el aminoalcohol de la atropina, es por tanto un
éster del ácido benzoico y una base nitrogenada. Tiene aspecto de
cristales blancos escamosos, solubles en disolventes.
5.1.3. Formas de presentación y consumo:
Las formas de abuso de cocaína son de gran interés toxicológico, ya que

condicionan la farmacocinética, la actividad farmacológica, la toxicidad y el
grado de adicción de la droga. Las formas de presentación de la droga para
su consumo y venta en el mercado ilícito son las siguientes:
- Hojas de coca La absorción es muy variable que depende del

contenido de las hojas, de la preparación usada y de la presentación o
ausencia de sustancias alcalinas en la boca del masticador. Se
administra por masticado o infusión oral. Contiene una concentración
de cocaína de 0,5 -1,5% y los efectos duran de 30 – 60 minutos.
38
5.1.4. Procedimiento para la identificación de cocaína

Muestra: orina 50
Filtrar y llevar a pH = 9 con NaOH al 10%
Agregar 10 mL de cloroformo y dejar a extraer por 30 minutos
Volatilizar el cloroformo hasta 1 mL en frasco vial llevando a baño María
Sembrar en las placas cromatográficas
 Muestra problema 60 picadas a más
Llevar a la fase móvil
Cloroformo….80 mL
Metanol……...20 mL
Revelar con reactivo

DRAGENDORFF
39
5.2. Identificación de Marihuana

5.2.1. Origen botánico:
La marihuana, cannabis o cáñamo es una planta herbácea.

Botánicamente sólo se reconoce una sola especie que la Cannabis sativa
L., con sus variedades Indica y Americana. Es integrante de la familia
Cannabinácea y el género Cannabis. Es una planta anual dioica (con tallo
macho y tallo hembra) típica de zonas templadas; posee una altura de
1,50 a 1,60 metros, las hojas son palmeadas con cinco a siete hojas de
color verde, alargadas y de bordes dentados.
5.2.2. Procedimiento para la identificación de marihuana
Muestra: orina 50 ml
Filtrar y llevar a pH = 3.5 a 4 con H2SO4 al 10%
Agregar 10 mL de ETER ETÍLICO y dejar extraer por 30 minutos
Concentrar la FASE ETÉREA hasta 1 mL en frasco vial llevando a baño María
 Estándar 3
Muestra problema 60 picadas
Cloroformo….80 mL
Acetona…….20 mL
40
Revelar con reactivo FAST BLUE SALT

5.3. Identificación de depresores del sistema nervioso central
5.3.1. Identificación de benzodiacepinas
Las benzodiacepinas son drogas utilizadas para la sedación prolongada

dados sus efectos hipnóticos, ansiolíticos, anticonvulsivos, capacidad para
producir amnesia anterógrada y cierto efecto relajante muscular central.
Según la vida media, se pueden clasificar como:
41
Procedimiento para la identificación de benzodiacepinas
Muestra: orina 50 mL
Estándar 3 a 5 picadas
Muestra problema 60 picadas a más
Cloroformo….80 mL
Revelar con reactivo

DRAGENDORFF
42
5.3.2. Identificación de fenotiacinas
La fenotiacina (también llamada dibenzotiacina o tiodifenilamina) es un

compuesto cristalino de color amarillento o verdoso soluble en ácido
acético caliente, benceno y otros solventes. Se compone de una estructura
de tres anillos en el que dos anillos de benceno se unen con
un átomo de azufre y de nitrógeno en posiciones no adyacentes. De modo
que es un derivado benzóico de la tiazina que se obtiene al
fusionar difenilamina con azufre. Químicamente es un compuesto orgánico
volátil y tóxico ambiental que concierne a varias agencias de protección
ambiental.
Procedimiento para la identificación de fenotiazinas
 Estándar 3 a 5 picadas
Cloroformo….80 mL
Revelar con reactivo FPN
 Ácido férrico
 Ácido perclórico 43
5.3.3. Identificación de barbitúricos
Los barbitúricos son un conjunto de medicamentos que se derivan del

ácido barbitúrico. Estos fármacos actúan sobre el sistema nervioso central
como sedantes y son capaces de generar una gran variedad de efectos
cerebrales.
a. Mecanismo de acción
Los barbitúricos son liposolubles y por lo tanto se disuelven con

facilidad en la grasa del organismo. Entonces están preparados para
traspasar la barrera hematoencefálica y alcanzar el cerebro. Una vez
en el cerebro, los barbitúricos actúan impidiendo el flujo de iones de
sodio entre las neuronas, a la vez que favorecen el flujo de iones de
cloruro. Se unen a los receptores GABA en un sitio diferente a las
benzodiazepinas y aumentan la acción de este neurotransmisor. En
bajas dosis y en ausencia de GABA no afectan a la neurotransmisión.
b. Clasificación de barbitúricos
Los barbitúricos de acción ultra corta: Producen anestesia dentro del

minuto luego de haberse administrado intravenosamente.
Categorías II de acción corta e intermedia:
 Amobarbital.
 Pentobarbital.
 Secobarbital.
 Tuinal (una combinación de amobarbital/secobarbital).
Barbitúricos de acción corta e intermedia pero de categoría III

incluyen:
44
 Butalbital.
 Butabarbital.
 Talbutal.
 Aprobarbital.
Los barbitúricos de acción prolongada categoría IV incluyen:
 Fenobarbital.
 Mefobarbital.
Procedimiento para la identificación de barbitúricos
Agregar 10 mL de ETER ETILICO y dejar extraer por 30 minutos
Concentrar la FASE ETEREA hasta 1 mL en frasco vial llevando a baño María
 Estándar 3 a 5 picadas
Cloroformo….8 mL
Acetona……...2 mL
Revelar con reactivo SWIKKER
45
5.4. Identificación de plaguicidas en muestras de hígado, cerebro, pared

gástrica
Los plaguicidas son sustancias químicas utilizadas para controlar, prevenir
o destruir las plagas que afectan a las plantaciones agrícolas. La mayoría
de estas sustancias son fabricadas por el hombre.
Procedimiento para la identificación de plaguicidas
Identificación de compuestos órganos fosforados
Muestras: hígado, riñón, pared gástrica

Llevar a fragmentos pequeños la muestra
Agregar 80 – 100 mL de agua destilada
Agregar 1 a 2 g de desproteinizante (sulfato de amonio o tungstato de sodio
Llevar a ebullición por 5 minutos
Agregar 10 mL de éter etílico y dejar a extraer por 30 minutos
Concentrar la fase etérea hasta 1 mL en frasco vial llevando a baño María
 Estándar 1 picada
Cloroformo….8 mL
Revelar con reactivo de CLORURO DE

PALADIO
46
Procedimiento para la Identificación de carbamatos
Llevar a fragmentos pequeños la muestra
Agregar 80 – 100 mL de agua destilada
Agregar 1 a 2 g de desproteinizante (sulfato de amonio o tungstato de sodio
Llevar a ebullición por 5 minutos
Agregar 10 mL de éter etílico y dejar a extraer por 30 minutos
Concentrar la fase etérea hasta 1 mL en frasco vial llevando a baño María
Estándar 3 a 5 picadas
Muestra problema 60 picadas a más
Cloroformo….80 mL
Revelar con reactivo de:
 Hidróxido de potasio al 15%

 Ácido acético en metanol al 1N
 Reactivo de FAST BLUE SALT
47
5.5. IDENTIFICACIÓN DE RODENTICIDAS (Carbonatos +

cumarina)
• Fase estacionaria
Placa de silica gel
• Fase móvil
Cloroformo --------80mL
Acetona -----------20Ml
• Revelador
H2SO4QP----------10mL
Vainilla---------1
48
5.6. Cuantificación de alcohol etílico en muestras de sangre
El alcohol etílico es la sustancia psicoactiva de mayor consumo en

el mundo y en Colombia. De acuerdo con el informe mundial
sobre el consumo de drogas de la ONU de 2004, se estima que
en el mundo cerca de 2.600 millones de personas lo consumen ya
sea en forma ocasional, habitual, abusiva o adictiva. En Colombia,
el programa presidencial RUMBOS estimó en 2001, que el 89.7%
de los estudiantes universitarios eran consumidores habituales de
alcohol etílico. Esta sustancia también es la más utilizada en
Colombia como sustancia de inicio para el consumo habitual de
otras sustancias psicoactivas.
Procedimiento para la cuantificación de alcohol etílico
Muestra: sangre
Método Sefftel modificado
0.2 mL de sangre y 0.2 mL de estándar.
Colocar en un vial 1mL de mezcla sulfocrómica
Llevar a baño maría por 10 minutos
Retirar el tapón y Agregar 8 mL de agua destilada al

frasco
Llevar a leer al espectrofotómetro a 420 nm.
49
Procedimiento para hacer curva estándar de calibración
a. Solución stock del alcohol etílico

Medir 5 mL de alcohol absoluto con ρ = 0,79 y aforar a 39.5 mL con
agua destilada
b. Solución estándar Nº 01
Tomar 0.5 mL de solución stock y aforar con agua destilada a 100
mL (1 mL= 0.50 mg)
c. Solución estándar Nº 02:
Tomar 1 mL de solución stock y aforar con agua destilada a 100
mL (1 mL= 1.00 mg)
d. Solución estándar Nº 03
Tomar 1.5 mL de solución stock y aforar con agua destilada a 100
mL (1 mL= 1.5 mg)
e. Solución estándar Nº 04
mL (1 mL= 2.0 mg)
f. Solución estándar Nº 05
Tomar 2,5 mL de solución stock y aforar con agua destilada a 100
mL (1 mL= 2.5 mg)
g. Solución estándar Nº 06
mL (1 mL= 3.0 mg)
50
5.7. Identificación de drogas ilícitas
Pasta Básica de Cocaína y Clorhidrato de Cocaína

PBC= Pasta Básica de Cocaína
CCL= Clorhidrato de Cocaína
PBC CCL
Agua Insoluble Soluble
Carbonato HCl (Efervescencia) HCl

(Efervescencia)
Almidón HCl+Lugol HCl+Lugol

(Color azul) (Color azul)
Alcaloide HCl+ Mayer HCl+ Mayer

(Precipitado lechoso) ( Precipitado lechoso)
Alcaloide de Mather Mather

cocaína (Color celeste turquesa) (Color celeste turquesa)
Marihuana
Pasos a seguir:
- Especie vegetal de 3 – 4 gts de HCl añadir y agitar

ligeramente,
- Agregar de 1 – 2 mL de reactivo de Duquenois.
Reacción: Positivo color violeta oscuro.
51
CAPÍTULO VI
52
6. TÉCNICAS DE INSTRUMENTACIÓN PARA IDENTIFICAR SUSTANCIAS

TÓXICAS
6.1. Espectrofotométricas
Espectrofotómetro de doble haz: es aquel que cuenta con dos

compartimientos para celdas de muestra que le permite medir
simultáneamente la cantidad de energía radiante absorbida por una matriz
(blanco) y la energía absorbida por la muestra compuesta por la matriz y la
especie de interés.
Espectrofotómetro de haz simple: cuenta con un único compartimiento de
celda con lo cual se debe realizar la medida de absorción del “blanco” para
poder registrar un cero (o referencia) y luego medir la absorción de la
muestra.
6.1.1. Espectrofotometría UV- Visible:
El análisis mediante el barrido al UV es utilizado para detectar una droga
específica o confirmar compuestos detectados por otras metodologías. Se
realiza un barrio espectral entre 390 y 220 nm en solución acuosa acida (HCl
al 1% o ácido sulfúrico 0,1 N) para drogas extraídas en medio alcalino, en
solución acuosa alcalina (hidróxido de amono 0,45N) para drogas extraídas
en medio acido o en solución neutra (metanol). De esta forma se obtiene
información adicional mediante el estudio de los picos de absorción máxima
y mínimos ya que muchas drogas varían su absorción al UV por cambio de
pH.
6.1.2. Métodos espectrofotométricos (UV y visibles):
Varios de los métodos cuantitativos descritos en las monografías emplean la

espectrofotometría ultravioleta (UV) (200-400 nm) o visible (40-800 nm).
Estos métodos presentan el inconveniente de la presencia en el medio de
sustancias interferentes, lo que implica en muchos casos la purificación
previa de la muestra ya sea por métodos de extracción o la separación del
analito, como, por ejemplo, por micro difusión.
Ventajas:
53
- Preparación mínima muestra.

- Posibilidad análisis mayoría materiales no reflectores, incluyendo materiales
muy opacos o poco absorbentes.
- Análisis de superficies irregulares y materiales duros.
- Alta sensibilidad (pocos ppm).
Desventajas:
- Además de los problemas de la reflexión en la superficie nos encontramos
con otros problemas:
- Está limitada principalmente a muestra en polvo.
- Si la muestra contiene agua y debido al calentamiento producido por el rayo
de luz infrarrojo, ésta se puede evaporar dando lugar a vapor de agua que
causa fuertes interferencias en el espectro.
6.1.3. Espectrofotometría de infrarrojo IR:
La espectrometría de infrarrojos (espectroscopia IV) es un tipo de
espectrometría de absorción que utiliza la región infrarroja del espectro
electromagnético. Como las demás técnicas espectroscópicas, puede ser
utilizada para identificar un compuesto o investigar la composición de una
muestra.
Esta técnica funciona casi exclusivamente en enlaces covalentes, y se usa
mucho en química, en especial en química orgánica. Se pueden generar
gráficos bien resueltos con muestras de una sola sustancia de gran pureza.
Sin embargo, la técnica se utiliza habitualmente para la identificación de
mezclas complejas.
a. Preparación de la muestra:
Las muestras líquidas pueden ser prensadas entre dos planchas de una sal
de alta pureza (como el cloruro de sodio). Estas placas deben ser
transparentes a la luz infrarroja para no introducir ninguna línea en el
espectro de la muestra. Las placas obviamente son solubles en agua, por lo
que la muestra, los reactivos de lavado y el medio deben ser anhidros (es
decir, sin agua).
54
Las muestras sólidas se preparan mezclando una cierta cantidad de muestra

con una sal altamente purificada (por lo general bromuro de potasio). Esta
mezcla se tritura y se prensa con el fin de formar una pastilla por la que
pueda pasar la luz. La pastilla necesita ser prensada a altas presiones para
asegurar que sea translúcida, pero esto no puede lograrse sin un equipo
adecuado (por ejemplo, una prensa hidráulica). Al igual que el cloruro de
sodio, el bromuro de potasio no absorbe la radiación infrarroja, por lo que las
únicas líneas espectrales provendrán del analito
a. Usos y aplicaciones
La espectrometría infrarroja se utiliza ampliamente tanto en la industria como

en la investigación científica, porque es una técnica rápida y fiable para
medidas, control de calidad y análisis dinámicos. Los instrumentos actuales
son pequeños y pueden ser transportados, incluso para tomar medidas de
campo. Con los avances en tecnología de filtrado computacional y la
manipulación de los resultados, se pueden medir con precisión las muestras
en una solución (el agua produce una banda larga de absorbancia en el
rango de interés, lo que daría un espectro ilegible sin dicho tratamiento
computacional).
Espectrofotometría de absorción atómica:
Equipo que permite la identificación de grupos funcionales de materiales

orgánicos, pinturas y determinadas estructuras de muestras sólidas y
líquidas por transmisión espectroscópica de infrarrojo por transformada de
Fourier (FTIR), en el rango espectral comprendido entre 400 y 4 000 cm-1.
Dispone de un accesorio para trabajar en reflectancia total atenuada (ATR).
La técnica también es útil para análisis cuantitativo, dado que por su gran
selectividad se puede cuantificar una sustancia en una mezcla compleja sin
la realización de mucho trabajo previo de preparación.
Las aplicaciones son múltiples: análisis de polímeros, aditivos, estudios
forenses, identificación de contaminantes ambientales, medicina, diversas
55
áreas de la química (organometálica, orgánica, inorgánica, agrícola,

industrial), etc.
a. Fundamento teórico:
El átomo consiste de un núcleo y de un número determinado de electrones

que llenan ciertos niveles cuánticos. La configuración electrónica más
estable de un átomo corresponde a la de menor contenido energético
conocido como “estado fundamental”. Si un átomo que se encuentra en un
estado fundamental absorbe una determinada energía, éste experimenta
una transición hacia un estado particular de mayor energía. Como este
estado es inestable, el átomo regresa a su configuración inicial, emitiendo
una radiación de una determinada frecuencia.
La frecuencia de la energía radiante emitida corresponde a la diferencia de

energía entre el estado excitado (E1) y el estado fundamental (Eo) como se
encuentra descrito en la ecuación de Planck:
b. Aplicaciones
La espectroscopia de absorción atómica con llama es el método más

empleado para la determinación de metales en una amplia variedad de
matrices. Su popularidad se debe a su especificidad, sensibilidad y facilidad
de operación. En este método la solución muestra es directamente aspirada
a una llama de flujo laminar. La llama tiene como función generar átomos en
su estado fundamental, de los elementos presentes en la solución muestra.
Temperaturas cercanas a los 1,500–3,000°C son suficientes para producir la
atomización de un gran número de elementos, los que absorberán parte de
la radiación proveniente de la fuente luminosa.
Otros sistemas han sido descritos con el fin de mejorar la eficiencia de la

atomización, en los cuales de deposita la muestra sólida o como suspensión
en un accesorio especial para introducirlo a la llama (navecilla de tantalio,
cubeta de Delves).
56
Desde el inicio, en 1955, de la espectroscopia de absorción atómica como

método de análisis, hubo un nuevo ímpetu de desarrollar sistemas de
atomización con llama, además de existir un interés continuo en conocer el
mecanismo mediante el cual la solución muestra es convertida a vapor
atómico en la llama.
El número de átomos generados en su estado fundamental en la etapa de

atomización determinará la cantidad de radiación absorbida. El quemador
del premezclado, que consiste en la combinación de un nebulizador con un
quemador. En este sistema continuo la solución muestra es aspirada por
arrastre con el gas comburente a través de un nebulizador para generar un
aerosol fino dentro de una cámara donde se mezcla con los gases
combustible y comburente auxiliar. Un deflector de flujo, ubicado en la
cámara de premezclado, permite que las gotitas más grandes impacten
contra él, caigan al fondo de la cámara y se escurran por el tubo de drenaje.
El aerosol compuesto por las gotitas más finas es transportado hacia el
cabezal del quemador, donde ocurre la combustión y la atomización de la
muestra. Una entrada de gas oxidante auxiliar directa a la cámara de
premezclado permite que los ajustes del flujo del oxidante sean efectuados
por medio de la línea auxiliar, mientras que el flujo a través del nebulizador
permanece constante. De esta forma la velocidad de aspiración de la
muestra es independiente de las condiciones de la llama.
Los nebulizadores pueden ser regulados para variar la velocidad de

aspiración de la solución muestra (1–4 mL/min). Estos están hechos de un
material resistente a la corrosión. Diferentes tipos de cabezales son
utilizados dependiendo del tipo de llama a emplear. Estos se construyen de
titanio para darle una resistencia al calor y a la corrosión, siendo los más
empleados de 10 cm de ranura simple (llama acetileno/aire), 10 cm de
ranura triple para soluciones con alto contenido de sólidos y cabezal de 5 cm
(llama acetileno/óxido nitroso). El tiempo necesario para la atomización de
una muestra dependerá de la velocidad de entrada de los gases en la llama
y se expresa con altura de la llama, de modo que la medición de la
57
absorbancia se debe realizar en una zona en que la atomización sea

completa.
La llama debe ser en lo posible transparente, es decir, no debe absorber

parte de la radiación proveniente de la lámpara. En general, la llama debe
poseer una lata eficiencia en la producción de átomos libres y ésta debe
evitar que ocurran reacciones del elemento a determinar con productos de la
combustión de los gases empleados o con otros componentes de la
muestra. Al respecto, la temperatura de la llama tiene un cierto grado de
importancia, siendo a veces más valiosas las propiedades reductoras u
oxidantes (según relación entre gases combustible/comburente) de ella. La
razón óptima combustible/comburente dependerá:
- Del tipo de quemador.

- De los gases (combustible/comburente).
- Del elemento a determinar.
La llama aire/acetileno es la más empleada, debido a que ofrece para

muchos elementos un medio ambiente y temperatura suficientes para la
atomización. La llama es completamente transparente y solamente muestra
auto absorción bajo los 230 nm. La introducción de la llama óxido
nitroso/acetileno (2,900 – 3,000°C) permite la determinación de aquellos
elementos que nos dejan determinar con llama aire/acetileno como Al, Si, Ti,
etc… Como producto de su baja velocidad de combustión, esta llama
energética ofrece un medio ambiente químico, térmico y óptimo favorable,
pero posee dos desventajas: numerosos elementos son ionizados y
muestran una emisión relativamente fuerte.
c. Interferencias físicas:
Este tipo de interferencias está relacionado con la efectividad con que la

solución es transportada a la llama y son causadas por diferencias en las
propiedades físicas de las soluciones: viscosidad, tensión superficial o
presión de vapor.
58
Un ejemplo de estas interferencias se observa en la determinación de Mg y

Cu en presencia de ácido fosfórico. A mayor concentración de H3PO4 la
viscosidad de la solución aumenta, disminuyendo la velocidad de aspiración
de ella y una fracción menor llega a la llama, produciéndose una
absorbancia menor de la muestra.
También la presencia de solventes orgánicos produce este tipo de

interferencias debido a un aumento en la eficiencia de la nebulización
(menor viscosidad y menor tensión superficial), lo que produce un aumento
de la absorbancia. Una forma de compensar este tipo de interferencia es
preparar las soluciones estándar con los mismos componentes de la matriz
de la solución problema.
d. Interferencias químicas:
Interferencia química es cualquier alteración en el número total de átomos

libres formados por unidad de volumen debido a la formación de compuestos
químicos termoestables. Las causas más comunes de éstas son:
Disociación incompleta de la molécula formada o formación de una sal difícil

de fundir.
El efecto del fosfato en la determinación de calcio es un ejemplo de este tipo

de interferencia. El calcio con el fosfato forma el fosfato de calcio, el cual se
transforma en pirofosfato de calcio, que es relativamente estable en una
llama aire/acetileno. Así la cantidad de átomos libres de calcio generados en
la llama será menor que la obtenida con una solución de calcio de igual
concentración, pero sin presencia de fosfato, provocando una disminución
de la señal.
Existen otros componentes refractarios que dan también una disminución de

la señal de absorción del elemento de interés. Tal es el caso de silicatos,
aluminatos y piro sulfatos de calcio, magnesio, estroncio y bario.
e. Interferencia de ionización:
59
Un átomo neutro en su estado fundamental puede ser ionizado a

temperaturas elevadas. Estos iones exhiben propiedades espectroscópicas
diferentes a un átomo neutro y no pueden ser determinados por
espectroscopia de absorción atómica. Así, el número total de átomos
disponibles para la absorción atómica. Así, el número total de átomos
disponibles para la absorción de la radiación por unidad de volumen
disminuye, lo que produce una pérdida de sensibilidad. Esta interferencia
depende tanto de la temperatura de la llama como del potencial de
ionización del elemento en estudio.
La ionización puede ser detectada notando que la curva de calibración tiene

una desviación positiva a concentraciones altas, dado que la fracción de
átomos ionizados es menor a concentraciones mayores. Estas interferencias
se pueden eliminar agregando a todas las soluciones estándar y a la
muestra un exceso del elemento que sea fácilmente ionizable en la llama,
por ejemplo: el sodio, potasio, litio o cesio, o mediante el empleo de una
llama de menor temperatura.
f. Interferencias espectrales:
En este tipo de interferencias, la radiación del elemento a determinar es

directamente influenciada, existiendo interferencias espectrales de línea e
interferencias espectrales de banda:
- Las interferencias espectrales de línea:
Ocurren cuando hay superposición de dos líneas atómicas o cuando éstas

no son resueltas por el monocromador. Un ejemplo para el primer caso se
tiene en la determinación de trazas de zinc en una matriz de hierro, debido a
que la línea de absorción del hierro (213.86 nm) se superpone a la línea de
resonancia del zinc (213.86 nm). El empleo de lámparas multi-elementales
fabricadas con una combinación inadecuada de elementos puede producir
interferencias del segundo tipo, si dentro de la banda espectral del
60
monocromador se encuentra una línea de resonancia de otro elemento junto

a la del elemento a determinar.
En general este tipo de interferencias no son frecuentes debido a la

naturaleza muy específica de la longitud de onda que se usa en
espectroscopia de absorción atómica. Si se llegan a presentar se pueden
eliminar seleccionando una segunda línea de resonancia del elemento de
interés (probablemente se obtenga mayor sensibilidad o empleando una
ranura del monocromador más angosta).
- Las interferencias espectrales de banda:
Se producen debido a la absorción de la radiación por moléculas o radicales,

y por dispersión de la radiación por sólidos. Para ambos efectos, que en
principio son distintos, se emplea el término absorción de fondo. Aquí existe
una pérdida de radiación no específica que lleva a absorbancias mayores
que la absorbancia obtenida por el analito. La señal está compuesta por la
absorción del elemento a determinar más la absorción no específica.
Este problema es más serio en la región espectral bajo los 250 nm, donde
concentraciones altas de metales alcalinos y de otras sales muestran una
alta absorción molecular. La dispersión de la luz ocurre cuando partículas de
sólidos causan una deflexión de parte de la radiación de la fuente fuera del
eje del sistema monocromador-detector. Estos problemas son relevantes
con muestras conteniendo altas concentraciones de elementos refractarios.
Los métodos más empleados en la corrección de la absorción de fondo (BG)
son:
Método de corrección de doble línea.
En este método se realiza la medición de una línea de emisión no absorbida

por el analito, cuyo valor se resta al valor de la medición obtenida a la
longitud de onda de resonancia del analito. El método tiene la desventaja
que a veces no es fácil disponer de una línea de no resonancia cercana a la
línea de resonancia del analito.
61
Método de corrección continúa de fondo.
La forma más eficaz para medir la absorción de fondo es realizar la medición

empleando una lámpara de deuterio o de hidrógeno que emite un espectro
continuo bajo los 320 nm. En estos instrumentos ambas fuentes radiantes
(lámpara de cátodo hueco (LCH) y de deuterio (LD) son moduladas a la
misma frecuencia, pero desfasadas, recorriendo el mismo camino óptico a
través de la muestra en el monocromador para llegar al detector. Este
observa alternadamente en el tiempo las dos fuentes radiantes. La absorción
de fondo disminuye la intensidad de ambas fuentes, mientras que la
absorción proveniente de la lámpara de cátodo hueco. La electrónica del
instrumento separa ambas señales y compara la absorción de ambas
fuentes entregando una señal corregida con respecto a la absorción de
fondo.
6.1.4. Espectrofotometría de masas:
La Espectrometría de Masas es una técnica micro analítica usada para

identificar compuestos desconocidos, cuantificar compuestos conocidos, y
para elucidar la estructura y propiedades químicas de las moléculas.
Requiere cantidades pequeñas de muestra y obtiene información
característica como el peso y algunas veces la estructura del analito.
En la Espectrometría de masas la muestra es ionizada (y por tanto
destruida) usando diversos procedimientos para ello. De todos ellos el más
usual y/o utilizado es la técnica denominada de Impacto Electrónico
consistente en el bombardeo de la muestra (previamente vaporizada
mediante el uso de alto vacío y una fuente de calor) con una corriente de
electrones a alta velocidad. Mediante este proceso, la sustancia pierde
algunos electrones y se fragmenta dando diferentes iones, radicales y
moléculas neutras. Los iones (moléculas o fragmentos cargados) son
entonces conducidos mediante un acelerador de iones a un tubo analizador
curvado sobre el que existe un fuerte campo magnético y conducido a un
62
colector/analizador sobre el que se recogen los impactos de dichos iones en

función de la relación carga/masa de los mismos.
Cada compuesto es único, y cada uno de los compuestos se ionizará y
fragmentará de una determinada manera, y en este principio se basa la
espectrometría de masas para identificar cada analito. Con la espectrometría
de masas somos capaces de proporcionar información acerca de la:
- Composición elemental de las muestras: de esta se encarga la
espectrometría de masas atómico.
- Composición de las moléculas inorgánicas, orgánicas y biológicas.
- Composición cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas.
- Estructura y composición de superficies sólidas.
- Relaciones isotópicas de átomos en las muestras.
Figura 1: Cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)
La cromatografía de gases es una técnica separativa que permite la

separación de mezclas muy complejas. Pero una vez separados,
detectados, e incluso cuantificados todos los componentes individuales de
una muestra problema, el único dato de que disponemos para la
identificación de cada uno de ellos es el tiempo de retención de los
correspondientes picos cromatográficos. Este dato no es suficiente para una
identificación inequívoca, sobre todo cuando analizamos muestras con un
número elevado de componentes.
63
6.2. Cromatográficas
La palabra cromatografía significa grafica de colores y fue diseñada por

Michael Tswelt en el 1903. Tswelt llevo a cabo una extracción de una mezcla
de pigmentos de hojas y luego paso este extracto a través de un tubo de
vidrio empacado con carbonato de calcio, de esta forma logro separar los
pigmentos presentes en las hojas.
Actualmente cromatografía es el nombre que se le da a un grupo de técnicas
utilizadas en las determinadas de la identidad de sustancia en la separación
de componentes de las mezclas y en la purificación de compuestos. Esta
técnica es muy efectiva y por lo tanto se utiliza tanto a nivel de investigación
como a nivel industrial.
Este método puede variar de técnicas en técnicas, pero siempre se basa en
el mismo principio. Todos los sistemas de cromatografía contienen una fase
estacionaria y una fase móvil.
La fase estacionaria puede ser un sólido o u líquido que se queda fijo en la
misma posición. La fase móvil puede ser líquido o un gas que corre a través
de una superficie y de la fase estacionaria. Las sustancias que están en un
sistema de cromatografía interaccionan tanto con la fase estacionaria como
con la fase móvil- la naturaleza de estas interacciones dependen de las
propiedades de las sustancias, así como también de la composición de la
fase estacionaria.
6.1.1. Cromatografía de columna
En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas
en base a la afinidad de las moléculas por la fase estacionaria o por la fase
móvil. Si una molécula A tiene más afinidad por la fase estacionaria que la B,
B bajará más rápido que A. Existen muchos tipos de cromatografía de
columna. En el laboratorio de hoy veremos tres tipos de ellas.
a. Filtración en gel:
En esta las moléculas son separadas por su tamaño. El gel consiste de una
cama de esferas con poros de un tamaño dado. El gel se conoce como
sefadex, el cual viene con poros de distintos tamaños. Las moléculas de
igual o menor tamaño que el poro entra a las esferas mientras que las
64
moléculas más grandes pasan rápidamente por la columna. Las moléculas

de tamaño intermedio pueden entrar las esferas, pero pasan menos tiempo
en ellas.
Aunque para efectos de este laboratorio las muestras que usaremos están
coloreadas, al hacer esta cromatografía en la vida real hay que usar otras
pruebas para determinar qué fracciones contienen las muestras de interés,
las cuales suelen ser proteínas. Estas pruebas pueden ser mediciones
fotométricas, SDS-PAGE o ensayos enzimáticos. Una vez tenemos
identificadas las fracciones con las muestras, podemos hacer un "profile" de
elución con concentración en con concentración en Y y el volumen de
elución en X. El volumen inicial es el "void volume" de la columna.
Lo que contiene es en amortiguador que estaba dentro de la columna al

empezar. Las moléculas más grandes salen inmediatamente después.
b. Intercambio iónico:
Se usa para purificar proteínas. Separa moléculas en base a su carga iónica.
La fase estacionaria presenta una matriz con carga. Al eluir una muestra, las
moléculas de igual carga salen con el amortiguador. Las moléculas de carga
opuesta se adhieren al material de empaque con distintos grados de
afinidad.
Para desprender las proteínas adheridas se usa una solución alta en cloruro
de potasio o de sodio. Esto puede hacerse usando soluciones con
incrementos moderados de salinidad, o de un solo paso, echando la solución
de mayor concentración de sal primero. Al subir la concentración poco a
poco podemos recolectar las muestras desde las que menos afinidad por la
columna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elución, la sal va
compitiendo con la proteína por las cargas de la matriz de la columna, hasta
que la desprende.
La columna puede ser de matriz negativa (intercambio catiónico) o positiva

(intercambio aniónico). El tipo de empaque dependerá de qué queremos
65
aislar. En este tipo de columna el pH es importante porque puede alterar la

carga de la columna.
c. Fase inversa:
Esta es una cromatografía de interacción en la que la fase estacionaria, con
moléculas hidrofóbicas, interactúa con moléculas hidrofóbicas en la muestra.
La matriz consiste de fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas
atraerán a las moléculas hidrofóbicas de la muestra mientras que las
hidrofílicas salen con el amortiguador. Las moléculas son eluídas de la
columna lavando con soluciones de distinta concentración de alcohol o
cualquier otro solvente no polar. Nosotros usaremos unos cartuchos con C18
e isopropanol como solvente de elución
d. Procedimiento:
La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se

llena con un soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados
son gel de sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3) La muestra que se quiere separar
se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se
llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por efecto
de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se establece
un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente
eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los
componentes de una mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase
estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes velocidades y se
conseguirá su separación. Así, de manera similar a otros tipos de
cromatografía, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través
del medio sólido se corresponden con diferencias en los tiempos de elución
por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la
muestra original, que se recogerán en fracciones diferentes.
6.1.2. Cromatografía de papel:

66
La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios

para realizar análisis cualitativos ya es sencilla de implementar y no requiere
de equipamiento sofisticado. En esta técnica la fase estacionaria está
constituida simplemente por una tira o circulo de papel de filtro. La muestra
se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de una solución de la
muestra y evaporando el disolvente luego de cada aplicación. Luego el
disolvente o mezcla de disolventes empleada como fase móvil (eluente o
eluyente) se hace ascender por capilaridad. Para esto se coloca una porción
del papel en contacto con la fase móvil dentro de un recipiente que la
contiene (cámara de desarrollo). Después de unos minutos, cuando el
disolvente deja de ascender o ha llegado al borde extremo del papel, se
retira el papel y seca. Es importante que la cámara de desarrollo
permanezca bien tapada durante el proceso de ascenso capilar de la fase
móvil (desarrollo cromatográficos), pues de lo contrario no se alcanza el
equilibrio necesario entre el líquido (fase móvil) y el vapor del líquido. Si el
disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se
deberán ver manchas de distinto color separadas a lo largo del papel.
Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a
procesos de revelado.
En la cromatografía sobre papel, las interacciones del soluto con el papel
hacen que los compuestos se desplacen a velocidades diferentes. La
cromatografía en papel requiere algún tiempo, habitualmente se necesitan
varias horas para completarse.
El cromatograma final puede ser comparado con otros de mezclas conocidas
a fin de identificar los componentes de la muestra. La cromatografía en papel
de dos dimensiones consiste en desarrollar el cromatograma en un
disolvente, girar el papel 90º y desarrollar el cromatograma en un disolvente
diferente. Es útil para separar mezclas complejas de compuestos similares.
Actualmente, la cromatografía en papel se utiliza poco y ha sido
ampliamente reemplazada por la cromatografía en capa fina. No obstante,
todavía se utiliza como una poderosa herramienta pedagógica.
6.1.3. Cromatografía de capa fina:
67
La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza para

separar moléculas relativamente pequeñas. En la biología celular se utiliza
frecuentemente para separar azúcares simples, lípidos, aminoácidos,
nucleótidos, metabolitos, y ocasionalmente para separar cadenas cortas de
polipéptidos y ácidos nucleicos. Al igual que otras cromatografías, consiste
de una fase estacionaria y una fase móvil y el principio es el mismo: la
sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria o se moverá con la
fase móvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la
afinidad por la fase estacionaria.
La fase estacionaria puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o

de un gel de silicato (vidrio molido bien fino) unido a una superficie sólida
(una placa de vidrio, aluminio, plástico o papel). Esta superficie sólida puede
ser rígida o flexible. El tipo de fase estacionaria que se utilice en un
experimento dependerá del tipo de moléculas que se quieran separar.
Incluso vienen algunas placas con indicadores fluorescentes. La fase
estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un solvente
orgánico o una mezcla de ambos.
La relación de las distancias recorridas por el compuesto y por el disolvente,

desde el punto de origen del cromatograma, se conoce como Rf, el cual
posee un valor constante para cada compuesto en condiciones
determinadas. Estas condiciones pueden ser el tipo de absorbente utilizado,
el tamaño de la cubeta, la temperatura, el disolvente, etc. Es poco factible
reproducir exactamente las condiciones experimentales, así que se suele
comparar una muestra con otra, eluyendo ambas dentro de la misma placa.
Así, para poder calcular el Rf, se sigue la siguiente fórmula:
Rf = Distancia recorrida por el compuesto / Distancia

recorrida por el disolvente
68
La distancia que recorre el compuesto se suele medir desde el centro de la

mancha, por lo cual se suelen hacer unas marcas en la placa, si dichas
manchas son extremadamente grandes, el valor del Rf será erróneo.
Así realizamos unas marcas en la placa donde depositaremos con ayuda de
una pipeta un mínimo de muestra.
Cuanto más polar sea el compuesto, más retenido estará en el absorbente, y

por tanto irá más lento y el Rf será también menor. Por otra parte, los
compuestos poco polares, se consiguen desplazar a más distancia desde el
origen. La polaridad del disolvente influye en el valor del Rf, por lo que
deberemos tenerlo en cuenta. Así, para un mismo tipo de compuesto, un
aumento de la polaridad del disolvente hará aumentar su desplazamiento en
la placa y por lo tanto también aumentará su Rf.
Para elegir un eluyente, se recomienda elegir un disolvente en el que los
componentes que formen la mezcla presenten un Rf de entorno a un 0.3 ó
un 0.5. Para encontrar el eluyente ideal, es necesario probar con diferentes
disolventes con distintas polaridades o con mezclas de varios de ellos.
Cromatografía de gas – liquido:
En la cromatografía gas-líquido (CGL) o cromatografía de gases (CG), los
componentes de una muestra que se vaporiza son fraccionados como
consecuencia de ser repartidos entre una fase gaseosa móvil y una fase
estacionaria líquida mantenidas en una columna. Instrumentos para la
cromatografía gas-líquido:
Se utilizan ordenadores para el control automático de la mayoría de los
parámetros instrumentales, tales como la temperatura de la columna,
caudales y la inyección de la muestra. A través de un software se pueden
obtener los tiempos de retención, área y ancho de los picos.
Componentes del cromatógrafo de gases:
a. Gas Portador: La fase móvil gaseosa debe ser químicamente inerte. El He

es la fase móvil más común, aunque también se emplea argón, nitrógeno e
69
hidrógeno. Estos gases se suministran en tanques presurizados. Se

requieren reguladores de presión, calibradores y medidores de flujo para
controlar la velocidad de flujo del gas.
El sistema de gas portador contiene a menudo un tamiz molecular para
eliminar el agua u otras impurezas (trampas que retiran elementos que
contaminan la fase móvil).
Con un medidor de pompas de jabón se puede medir la velocidad de flujo.
En la trayectoria del gas se forma una película de jabón cuando se exprime
un bulbo de caucho que contiene una solución de jabón, se mide el tiempo
requerido para que esta película se mueva entre dos graduaciones en la
bureta y se convierte a velocidad de flujo.
b. Sistema de inyección de muestra: Para que la columna sea eficiente, es

necesario que la muestra sea de un tamaño apropiado para que pueda ser
introducida en un "tapón" de vapor, la inyección lenta o las muestras de
tamaño excesivo causan un ensanchamiento de la banda y una resolución
pobre.
El método más común de inyección de muestra implica el uso de una micro
jeringa para inyectar una muestra líquida o gaseosa a través de un
diafragma o "septum" de silicona, en una cámara de vaporización
instantánea situada en la cabeza de columna (la cámara de muestra
normalmente está unos 50°C por encima del punto de ebullición del
componente menos volátil de la muestra). El líquido pasa a gas en forma
explosiva.
El slit permite que gran parte de la muestra escape al exterior. De no ser así
se produciría saturación, es decir, se observaría una asimetría de señales.
Lo normal de muestra es aprox. 1/200 L. El tiempo de retención es
inversamente proporcional a la concentración.
 Columnas y Fases Estacionarias: Cada fase estacionaria tiene como

característica:
70
T° mínima  A < T° que ésta se produce una constante de reparto falsa. La

viscosidad es muy grande, se crea resistencia a la transferencia de masa.
T° máxima  A > T° que ésta la fase estacionaria empieza a cambiar de
estado y se escapa. Pasa al estado gaseoso y abandona el sistema
(proceso conocido como "sangrado").
 Columnas Capilares: Las columnas capilares o capilares abiertas son de

dos tipos básicas:
- Capilares de pared recubierta (WCOT): son simplemente tubos capilares

con la pared interna recubierta de una capa fina de fase estacionaria líquida.
Los WCOT se construían de vidrio, luego se introdujeron columnas tubulares
abiertas de sílice fundida. Se fabrican a partir de sílice especialmente
purificada con un contenido mínimo de óxidos metálicos. Estos capilares
tienen las paredes muchos más delgados que sus equivalentes de vidrio. Se
recubren con un polímero para hacerla más flexible. La resistencia de los
tubos se refuerza con un recubrimiento externo protector de piliimida. Las
columnas que resultan son flexibles y pueden doblarse en forma helicoidal
con un diámetro de varios centímetros. Ofrecen ventajas como resistencia
física, una reactividad mucho menor frente a los componentes de la muestra
y flexibilidad. Asimismo, tienen menor capacidad de carga, pero son más
eficientes para sustancias volátiles.
- Capilares con soporte recubierto (SCOT): la superficie interna del capilar
está revestida de una fina capa (~ 30 m) de un material de soporte, tal
como tierra de diatomeas. Este tipo de columnas contiene varias veces la
fase estacionaria de una columna capilar de pared recubierta y por tanto,
tiene una mayor capacidad de carga (no se satura tan fácilmente). La
eficiencia de una columna SCOT es menor que la WCOT, pero es
sensiblemente mayor que una columna de relleno.
c. Columnas de Relleno (Empaquetadas): En estas la fase estacionaria

corresponde a una película delgada de líquido colocada en la superficie de
71
un soporte (empaque) sólido inerte y finamente dividido, de modo tal que el

área de la superficie expuesta a la fase móvil sea lo más grande posible. El
empaque sólido ideal consiste de pequeñas partículas uniformes, esféricas,
con buena resistencia mecánica y. Además, el material debe ser inerte a las
elevadas temperaturas y esta humedecido uniformemente por la fase líquida.
Las actuales columnas de relleno se fabrican con tubo de vidrio, metal
(acero inoxidable, cobre, aluminio) o de teflón, con una longitud
característica de 2 a 3 m y un diámetro interno de 2 a 4 mm. Ya están fuera
de uso, solo se emplean en cromatografía HPLC. El número de platos
teóricos (N) es función del largo de la columna (L). Sin embargo, N no es
propio de la columna, sino que depende también del soluto con que se
trabaja, es decir, de la naturaleza del soluto. En general, a mayor N se tiene
una mejor separación. Para mejorar la resolución, usa
- Una columna más larga (aumentaría el tiempo de retención)
- Una columna más estrecha (disminuye la capacidad de carga)
- Una fase estacionaria más fina.
- Otra fase estacionaria (cambia la interacción con el analito)
6.1.4. Cromatografía liquida de alta resolución:

La cromatografía engloba a un conjunto de técnicas de análisis basadas en
la separación de componentes de una mezcla y su posterior detección. Las
técnicas cromatográficos son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase
móvil que consiste en un fluido (gas, líquido, o fluido supercrítico) que
arrastra a la muestra con un flujo constante de presión proporcionado por
una bomba, hasta llegar al punto donde es introducida la muestra. Siguiendo
el flujo de presión la lleva a una columna donde se encuentra la fase
estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los
componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase
estacionaria y con la fase móvil. De este modo, los componentes atraviesan
la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de
haber pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado,
72
pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la
concentración y del tipo del compuesto.
El papel esencial de las bombas es impulsar a la fase móvil con presión y
flujo constante, el proceso de inyección de la muestra en la actualidad es
automática, las columnas que se utilizan normalmente son de acero
inoxidable y los detectores su papel fundamentalmente es de indicar el
momento de aparición de los diferentes componentes que constituyen la
muestra, calificarlo cuantitativamente como cualitativamente El uso de la
cromatografía ha demostrado ser muy significativo para el estudio del ácido
lipóico, un tipo de cromatografía utilizado fue el HPLC-fase inversa porque
trabaja con las polaridades de los compuestos que se van analizar en el
futuro, ya que la fase móvil es más polar que la fase estacionaria. La fase
móvil es agua con un componente menos polar como puede ser:
agua/metanol, agua/ACN.
6.3. Inmunoquímicas
En las últimas décadas se han implementado técnicas de análisis basadas

en inmunoensayos, con excelentes límites de detección para diferentes
grupos de pesticidas. Estas técnicas niveles de trazas sin la necesidad de
laboriosos anticuerpos para unirse a los antígenos determina que los
anticuerpos se conviertan en reactivos.
Las moléculas pequeñas como los pesticidas, usualmente no son
inmunogénica, es decir, no provocarán una respuesta inmune, a menos que
se encuentren acopladas a macromoléculas como las proteínas; es
frecuente además que el analito no presente grupos funcionales que
posibiliten el acoplamiento o conjugación con la proteína acarreadora; por
esta razón se hace necesario sintetizar el hapteno (moléculas miméticas del
analito). Los inmunoensayos son rápidos, simples y económicos, lo que los
convierte en una herramienta altamente conveniente para el estudio de gran
cantidad de muestras en un período corto de tiempo. En este artículo se
presenta una revisión del estado actual del arte en este tipo de técnicas de
análisis.
73
6.1.1. Radioinmunoanálisis (RIA)

Esta técnica fue desarrollada por Salomon A. en 1960 para determinar la
concentración de insulina en el plasma sanguíneo. Por este motivo Rosalyn
Yalon recibió en nobel de medicina en 1977. Hoy en día esta técnica se
utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en
cantidades muy pequeñas y mezcladas con muchas otras. Es por tanto una
técnica muy sencilla y muy específica. Utilizando anticuerpos de gran
afinidad se pueden detectar hasta pico gramos de antígenos.
El radioinmunoanálisis se basa en una reacción antígeno-anticuerpo. Los

anticuerpos deben ser específicos contra la substancia que queremos
determinar, y tener una gran afinidad. La cantidad de anticuerpo añadida al
análisis es limitada, e inferior a la cantidad de antígeno total. Por lo que va a
quedar saturado con él. El antígeno es la hormona (de la muestra) que
queremos determinar, (antígeno frío).
Además del antígeno (hormona) presente en la muestra problema, se va a
añadir una cantidad constante y conocida de antígeno pero marcado
(antígeno caliente). Los antígenos marcados se forman sustituyendo algunos
de los átomos normales del antígeno por los correspondientes isótopos
radiactivos (H3=tritio, P 32), o introduciendo radioisótopos extraños en la
molécula (yodo=I125 unido a un resto de TYR). Los dos tipos de antígenos,
frío y caliente, van a competir, en igualdad de condiciones, por unirse con el
anticuerpo disponible.
Las concentraciones del antígeno marcado y del anticuerpo son constantes,
la única variable del sistema es la concentración de antígeno no marcado
(muestra problema). Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno frío en la
muestra problema, este desplazará al antígeno caliente y por tanto se fijarán
al anticuerpo cantidades menores de antígeno marcado. Así pues, la
formación de complejos radiactivos (Ag*-Ac) varía en función de la
concentración del antígeno no marcado: a mayor concentración de antígeno
no marcado, mayor formación de complejos antígeno-anticuerpo no
marcados, y menor formación de complejos radiactivos, y viceversa.
74
Separación de las fases ligada y no ligada Tras la reacción antígeno-

anticuerpo, en el tubo de reacción encontraremos:
- Las fracciones libres, constituidas por antígeno frío y antígeno marcado ·
- Las fracciones ligadas formadas por complejos antígeno-anticuerpo y
antígenos marcado-anticuerpo.
Sin embargo, la radiactividad total en el tubo permanece constante antes y
después de la reacción, por lo que hay que separar la fase ligada de la no
ligada y contar la radiactividad en una de ellas, sin interferencia de la otra.
Hay diferentes métodos de separación están basados en las distintas
propiedades del antígeno libre y del complejo antígeno-anticuerpo: ·
- Adsorción: Con carbón activo, dextrano o resinas. Adsorben (se unen)
específicamente la fase libre (antígenos frío y caliente) pero no se unen a los
complejos antígeno-anticuerpo que quedarían en solución. Tras
centrifugación, el carbón sedimenta en el fondo del tubo con la fase no
ligada mientras que la fase ligada queda en el sobrenadante, que se aspira o
decanta. Este método se utiliza cada vez menos.
- Precipitación química: Hay substancias como el etanol, el propilenglicol o
el sulfato amónico que alteran la solubilidad de las proteínas provocando su
precipitación. Precipitan los complejos ligados. Tras centrifugación, quedan
los complejos ligados en el sedimento y la fracción libre en el sobrenadante,
que se elimina por aspiración o decantación.
- Precipitación inmunológica: Se utiliza un segundo anticuerpo contra el
anticuerpo del sistema. La unión del segundo anticuerpo al complejo
antígeno anticuerpo da lugar a un complejo de gran tamaño, en general
insoluble y fácilmente precipitable. Tras incubación y centrifugación, la fase
libre queda en el sobrenadante y se separa por aspiración o decantación.
Este método es muy utilizado en RIA.
- Fase sólida: Consiste en inmovilizar al anticuerpo a un soporte sólido, que
puede ser la propia pared del tubo, bolitas de vidrio, partículas de Sephadex
Ò (polímero). La separación se consigue simplemente aspirando el medio de
incubación. Este método tiende cada vez más a utilizarse por ser sencillo,
75
práctico, más corto y requiere menos manipulación, e incluso permite su

automatización.
El fundamento es muy sencillo:
- Se mezcla una cantidad constante de antígeno marcado radioactivamente y

una cantidad constante de un anticuerpo para ese antígeno.
- Se produce la reacción entre antígenos (Ag) y anticuerpos (Ac)
- Se separa la fracción de antígenos que se ha unido de la que permanece
libre (hay varias formas de hacerlo.).
- Se determina la radioactividad
- Si la muestra contiene además antígenos frio (no marcado), este competirá
con el marcado para unirse al anticuerpo, y se observar un descenso en la
medida de la radioactividad
- Este descenso es proporcional a la concentración de antígenos frio en la
muestra.
6.1.2. Enzimoinmunoanálisis:
Son técnicas Inmunoquímicas cuantitativas basadas en reacciones antígeno
anticuerpo como en el RIA, y siguiendo un protocolo experimental similar. La
diferencia consiste en que, en este caso, el marcaje se hace con un enzima
en vez de con un isótopo radiactivo. Se puede marcar tanto el antígeno
como el anticuerpo (hay distintas estrategias). La cuantificación se hace, por
tanto, basándose en la medida de la actividad del enzima marcador. Tras la
formación del complejo antígeno-anticuerpo, en el momento adecuado, se
añade un sustrato que es catalizado por el enzima transformándose en un
compuesto coloreado lo que permite la medida de la actividad enzimática
con ayuda de un espectrofotómetro. Esta medida de la actividad nos servirá
para calcular la concentración de la molécula problema. Al igual que en el
caso del radioinmunoanálisis es necesario elaborar una curva patrón. Con
objeto de aumentar la sensibilidad de este análisis es frecuente utilizar el
sistema biotina-streptavidina, que actúa como mecanismo multiplicador. Así,
por ejemplo, el anticuerpo está unido a varias moléculas de biotina
(vitamina). Cada molécula de biotina se une específicamente a varias
76
moléculas de streptavidina (similar a la avidina de huevo, pero de origen

bacteriano y mayor afinidad).
La enzima está unido a la streptavidina. De esta forma se consigue un efecto
multiplicador de la señal. (Ej. 3 moléculas de biotina por anticuerpo x 4
moléculas de streptavidina, cada una con un enzima, se unen a cada
molécula de biotina 12 enzimas en vez de una). Las técnicas enzimáticas
presentan numerosas ventajas respecto al radioinmunoanálisis (RIA): no
utilizan compuestos radiactivos lo que facilita la manipulación y evita la
necesidad de instalaciones y licencias específicas) reactivos de larga
duración posibilidades de automatización (estaciones automáticas ELISA).
6.1.3. Inhibición de la hemoaglutinación (IH):

Las hemoaglutininas presentes en la superficie del virión pueden ser
bloqueadas en su función por la presencia de anticuerpos dirigidos contra los
determinantes antigénicos específicos responsables de su unión a glóbulos
rojos. Por lo tanto, el fenómeno de la hemoaglutinación no es evidente y en
la policubeta se visualiza la sedimentación de los glóbulos rojos formando el
característico botón rojo.
Es una técnica altamente sensible y específica, debido a que únicamente

mide aquellos anticuerpos dirigidos contra la hemoaglutininas viral. La
rapidez, sensibilidad, especificidad y costo mínimo de la técnica hace que
sea empleada en muchos laboratorios para la caracterización de virus y/o
anticuerpos.
6.4. Microscópicas
Es un instrumento que sirve para ver objetos demasiados pequeños para ser
vistos con claridad por el ojo humano (objetos microscópicos). Aunque el
hombre tenga el sentido de la vista, no pueden ver objetos correctamente
demasiados pequeños sin la ayuda de un microscopio. El microscopio que
nosotros vamos a estudiar es el llamado microscopio óptico o de luz, que se
77
sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto mediante
lentes.
En general, suele atribuirse la paternidad del microscopio simple a Anton
Van Leeuwenhoek (1632-1723), un comerciante holandés sin apenas
estudios. Van Leeuwenhoeck construyó muchos microscopios a lo largo de
su vida, que según cuentan, no prestó nunca a nadie. Son conocidos sus
descubrimientos pioneros sobre los protozoos, los glóbulos rojos, el sistema
de capilares y los ciclos vitales de los insectos.
Partes del microscopio
- Ocular: donde acercas los ojos para ver.

- Platina: es esa especie de pequeño plato, donde se coloca el portaobjeto,
donde está lo que quieres observar.
- Foco: Este control sirve para enfocar el objetivo, para tener mejor nitidez y
observar los detalles.
- Condensador: Es el lente que está debajo de tu objetivo, sirve para
concentrar la luz sobre el mismo.
- Lentes: Están justo encima del objetivo. Según el modelo de microscopio

puede tener un revolver, con distintos valores de aumentos para seleccionar.
78
CONCLUSIONES
1. Se aplicó los conocimientos compartidos en la aulas de la universidad

y se obtenió nuevas experiencias durante la practicas en el laboratorio
de toxicología de la Universidad Privada de Huancayo Franklin
Roosevelt, teniendo en cuenta los protocolos utilizados en cada
procedimiento de identificación.
2. Se cumplió las normas de bioseguridad que se rigen dentro y fuera

del Laboratorio de Toxicología de la Universidad Privada de Huancayo
Franklin Roosevelt para protegerse evitando riesgos de posibles
accidentes.
3. Se conoció los procedimientos y normas de la cadena de Custodia

como la recolección, rotulado, embalaje, envió, recepción y análisis de
las muestras.
4. Se diferenció y se conoció los métodos de extracción de las

sustancias tóxicas.
5. Se aprendió los procedimientos en el proceso de identificación de las

sustancias toxicas (cocaína, marihuana, benzodiacepinas,
barbitúricos, fenotiacinas y plaguicidas) en el organismo y la
determinación de alcohol.
79
RECOMENDACIONES
- Se recomienda que los analisis quimicos toxicologicos, la diversidad

de muestras y elementos que los componen, es necesario que el
documento que acompaña a la muestra se indique claramente el tipo
de examenes requerido de acuerdo a lo que se debe esclarecer ,asi
como alcanzar referencias sobre dicho caso en materia de
investigacion .
- Se recomienda que para manipular los equipos el personal debe tener

los conocimientos previos acerca del uso de los reactivos e
instrumentos.
- El personal debe tener amplio conocimiento acerca de la bioseguridad

del laboratorio de toxicología para evitar los accidentes.
- Se necesita una campana extractora de gases para las prácticas.
- Se requiere mayor espacio en el laboratorio ya que es muy pequeño.
80
GLOSARIO DE TÉRMINOS
- Dosis terapéutica (Dt): cantidad mínima de sustancia que

careciendo de efectos tóxicos presenta una acción favorable
- Dosis tóxica (DT): cantidad de sustancia capaz de manifestar un
efecto tóxico Dosis tóxica mínima (DTm): cantidad más baja de
sustancia capaz de manifestar un efecto tóxico
- Dosis letal (DL): cantidad de sustancia que resulta mortal al ser
administrada Dosis letal mínima (DLm; DL01): cantidad mínima de
sustancia que resulta mortal al ser administrada.
- Dosaje etílico: Es la determinación de la concentración de alcohol
etílico en una muestra biológica reportado en gramos por litro de
sangre (g/L).
- Exposición: Situación que hace posible la penetración o absorción de
una sustancia tóxica por un organismo vivo.
- Espectrofotometría: es la medición de la cantidad de energía
radiante que absorbe o transmite un sistema químico en función de la
longitud de onda; es el método de análisis óptico más usado en las
investigaciones químicas y bioquímicas.
- Cromatografía: es un método físico de separación en el que los
componentes que se han de separar se distribuyen entre dos fases,
una de las cuales está en reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras
que la otra (fase móvil, F.M.) se mueve en una dirección definida.
- Cadena de frío: es una cadena de suministro de temperatura
controlada. Una cadena de frío que se mantiene intacta garantiza al
consumidor que el producto de consumo que recibe se ha mantenido
dentro de un intervalo de temperaturas durante la producción, el
transporte, el almacenamiento y la venta.
- Cadena de custodia: es el procedimiento mediante el cual se
asegura la integridad de la muestra desde su toma hasta la emisión
del informe.
81
- Incautación: Apropiación por parte de la autoridad competente de un

objeto, mercancía o bien propiedad de una persona
- Microscópica: Todo aquello que no se puede ver a simple vista y que
para poder verlo es necesario aumentar la forma de verlo mediante un
microscopio. Según esta definición un cuerpo es microscópico cuando
solo es posible verlo mediante un microscopio.
- Moléculas polares: Son uniones covalentes en las que dos o más
átomos comparten electrones hasta tener ambos ocho en su último
orbital. Las polares se dan entre elementos con distinta
electronegatividad o capacidad de atraer electrones, como ocurre por
ejemplo en el caso del H2O (agua). Las no polares se dan entre
átomos del mismo elemento, ya que tienen igual electronegatividad.
Un ejemplo de ellas es el O2 (oxígeno).
- Peligro: Posibilidad que tiene una sustancia de provocar un efecto
adverso, una vez dentro del organismo
- Residuos patológicos: Es aquel que posee características
infecciosas que pueden generar enfermedades en la persona.
- Riesgo: Frecuencia con la que cabe esperar que se presenten los
efectos indeseables que proceden de la exposición a un agente tóxico
(probabilidad) Toma: cantidad que se ingiere de una sola vez Dosis:
cantidad (g o mg) que se absorbe en 24 h por unidad de peso corporal
(Kg) en una o varias tomas Nivel sin efecto observable (NISEO):
Máxima cantidad de sustancia a la que no se detecta ningún tipo de
actividad.
82
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Aldeir C. Toxicología Ambiental. México. Editorial Diana; 2011.

2. Frank D. Introducción a la Toxicología de Alimentos. 2da ed. México:
Editorial Limusa; 2014.
3. David P. Manual de Procedimientos Analíticos Toxicológicos para
Laboratorios de Baja Complejidad. Argentina: Editorial Limus; 2011.
4. Emma J, Morris A. Lo Esencial en Toxicología, 2da ed. Argentina.
Buenos Aires: Editorial La Alameda; 2008. p. 1050-1075.
5. Curtis H. Barnes N, Schnek A, Massarini A. Farmacognosia, 7ma ed.
Argentina. Buenos Aires: Editorial Panamericana; 2008.
6. Guzmán A. Manual de Criminalística, Editorial Ebdef, Buenos Aires.
Argentina; 2014.
7. Álvarez A. Toxicología Forense. [Internet] 2011 [Consultado el 1 de
setiembre del 2019]. Disponible en:
https://alvarezunahvs.files.wordpress.com/2011/07/toxicologiaforense
1.pdf.
8. Manes B. El Pelo como Elemento Diagnóstico en Toxicología
Forense. [Internet]: Editorial Laboratorio de Toxicología del Poder
Judicial de la Nación; [Consultado el 1 de setiembre del 2019].
Disponible en:
http://www.ub.edu.ar/revistas_digitales/Ciencias/Vol11Numero6/Articul
o.pdf.
9. William H. Toxicología Forense. [Internet]. México: 2012. [Consultado
el 1 de setiembbre del 2019]. Disponible en:
http://Toxicologíadn.blogspot.com/2010/06/.HTML.
83
ANEXOS
84
IDENTIFICACIÓN DE COCAÍNA
Midiendo el pH de la muestra Alcalinizamos la orina con

de orina Hidróxido de Amonio hasta
alcanzar pH de 9
Extraemos por 30 minutos en

una pera de decantación la
muestra y más 10 mL de
cloroformo
85
Concentramos la fase
Sembramos la muestra
clorofórmica hasta 1 mL
concentrado y la muestra
estándar de alcaloide de
cocaína en las placas (fase
estacionaria)
En la fase móvil
Revelando con reactivo
Dragendorff
86
RESULTADO: POSITIVO
Fondo amarillo
Manchas anaranjados
IDENTIFICACIÓN DE MARIHUANA
Midiendo el pH de la muestra Llevando la orina a 3.5. a 4

de orina de pH
87
Dejando extraer con éter etílico Concentrando la fase etérea

por 30 minutos
Sembramos la muestra
Haciendo corrido en la fase
concentrado y el muestra
móvil de las placas
estándar de alcaloide de
cromatográficas
cocaína en las placas (fase
estacionaria)
88
Revelado de las placas cromatográficas con

el reactivo de FAST BLUE SALT, teniendo
como resulta manchas de color rojo carmín
con fondo verde lechuga indicando positivo
la muestra
IDENTIFICACIÓN DE DEPRESEORES DEL SISTEMA NERVIOSO

CENTRAL
IDENTIFICANDO BENZODIACEPINAS
Midiendo el pH de la muestra
Llevando a un pH 9
de orina
89
Agregando 10 mL de Dejando extraer con el

cloroformo para la extracción cloroformo por 30 minutos
Concentrando en frasco vial Sembrando el estándar de la

hasta alcanzar 1 mL BENZODIACEPINA
90
Sembrando muestra problema Revelado con reactivo

de la BENZODIACEPINA DRAGENDORFF, teniendo
como resulto mancha de color
anaranjado con fondo amarillo,
indicando positivo la muestra
IDENTIFICANDO FENOTIAZINAS
Midiendo el pH de la muestra
Llevando a un pH 9
de orina
91
Agregando 10 mL de Dejando extraer con el

cloroformo para la extracción cloroformo por 30 minutos
Revelado con FPN, teniendo

Sembrando la muestra de
como resultado mancha
fenotiacina
morado en forma de corazón
indicando positivo
92
IDENTIFICACIÓN DE PLAGUICIDAS EN MUESTRAS DE HÍGADO,

CEREBRO
Muestra hígado y cerebro
Muestra triturado
Agregar a la muestra 80 a 100 Filtrar la muestra

mL de agua destilada, 1 g de
desproteinizante y llevar
ebullición por 5 minutos.
93
Llevar a pH 3.5. a 4 Agregar 10 mL de éter etílico.

Dejar extraer por 30 minutos
Decantando la muestra Concentrando la muestra
94
IDENTIFICANDO ORRGANOS FOSFORADOS
Revelado del compuesto órgano fosforado con

reactivo de CLORURO DE PALADIO, teniendo
como resultado 2 manchas amarillo y 1 mancha
marrón indicando positivo la muestra
IDENTIFICANDO CARBAMATOS
Revelado del carbamato con reactivo de

HIDROXIDO DE POTASIO AL 15%, ACIDO
ACÉTICO EN METANOL AL 1 N Y REACTIVO DE
FAST BLUE SALT, teniendo como resultado mancha
naranja de la muestra problema
CUANTIFICACIÓN DEL ALCOHOL ETÍLICO EN MUESTRAS DE

SANGRE
MÉTODO DE SEFFTEL
Preparando la mezcla sulfocrómica 1

mL
95
Retirar la tapa y agregar 8 mL de

Llevar a baño maría por 10 minutos
agua destilada
Leer en el espectrofotómetro a 420

nm. Y reportar la absorbancia
96
RESULTADO DE LA IDENTIFICACIÓN DE ALCOHOL SEGÚN EL METODO DE

SHEFTEELL EN EL ESPECTROFOTOMETRO (CURVA A ESTANDAR)
IDENTIFICACIÓN DE DROGAS ILÍCITAS
97
RESULTADO
DROGA VEGETAL
Se observa la formación de un anillo color

violacio
98

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“AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCION E INPUNIDAD”

UNIVERSIDAD PRIVADA DE HUANCAYO FRANKLIN ROOSEVELT

ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA

PRÁCTICAS DE PRIMER NIVEL (C) EN

LUGAR DE PRÁCTICAS : LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA DE LA

UNIVERSIDAD PRIVADA DE HUANCAYO FRANKLIN

ASESORA : Q.F. ESTHER NANCY QUISPE QUISPE.

PRESENTADO POR : ARCOS SAMANIRGO, CECILIA YANET

FECHA DE INICIO : 09 DE AGOSTO DEL 2019

FECHA DE TÉRMINO : 06 DE SETIEMBRE DEL 2019

Q.F. ESTHER NANCY QUISPE QUISPE.

La toxicología puede ser definida como la ciencia de los venenos o de las

El presente informe final fue elaborado en base a formato y conocimientos

Dichas prácticas nos permitieron ampliar los conocimientos adquiridos dentro

El presente informe consta de seis capítulos, en donde se demuestra los

 Aplicar el desarrollo de los conocimientos, habilidades compartidas en

1.2. Clasificación de los tóxicos……………………………..…….……..9

1.3. Métodos de extracción de los tóxicos……………..…..…...……..12

1.4. Métodos de bioseguridad en el laboratorio de toxicología……..

2. CON RESPECTO A LA MUESTRA……………………………...…………19

2.1. Selección adecuada de la muestra……………………..………….19

2.2. Cantidad adecuada de la muestra……………………………...…..21

2.3. Cadena de frio……………………………………………….………...22

4. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA…………………………….………31

5. ACTIVIDADES REALIAZADAS DURANTE LAS PRÁCTICAS DE

6. TÉCNICAS DE INSTRUMENTACIÓN PARA IDENTIFICAR SUSTANCIAS

La toxicología es el estudio de los venenos o, en una definición más

1.2. Clasificación de los tóxicos

Un tóxico es cualquier sustancia, elemento o compuesto químico que,

a. Según su estado fisico

b. Según la vía de entrada

Los criterios de clasificación de toxicidad de la

GRADO DE TOXICIDAD DOSIS LETAL PROBABLE

II Ligeramente tóxicos 5-15 g/kg

III Medianamente 0.5-5 g/kg

IV Muy tóxicos 50-500 mg/kg

V Extremadamente 5-50 mg/kg

VI Súper tóxicos Menos de 5 mg/kg

d. Según estructura química

Obedece a la gran cantidad de compuestos químicos que

2.Pseudometales 10. Esteres

3. Azufre y sus derivados 11. Ácidos orgánicos

4. Halógenos 12. Hidrocarburos

5. Derivados del nitrógeno 13. Fenol y derivados

6. Alcoholes 14. Acetales

7. Aldehídos y acetales 15. Cianuros y nitrilos

8. Glicoles 16. Plásticos

e. Según sus efectos en el organismo

La clasificación de tóxicos según los daños que producen

 Neurotóxicos: Son sustancias que se fijan en el tejido

 Cardiotóxicos: Afectan al corazón y a los grandes

 Carcinogenéticos: producen tumores malignos en

1.3. Métodos de extracción de los tóxicos

La extracción es una técnica que se emplea para separar un

extraer se encuentran en forma de sales ionizadas para que

a. Método de extracción de los tóxicos volátiles

Se denominan tóxicos volátiles a todas aquellas sustancias

Es la determinación de la concentración de alcohol etílico

Las concentraciones halladas en ambas difieren dado su

Análisis Preliminar o de Orientación

El sujeto sometido o a examen, debe espirar (soplar) a

por tonalidades intermedias, hasta el decolorado total

Es practicado en muestras exentas de algún conservador

Las técnicas utilizadas son: